Recherche appliquée

Des candidats médicaments fournis par des clients, de nature et d'effets secondaires inconnus du laboratoire qui les teste, vont être administrés à des souris dont un uretère est ligaturé pour provoquer une fibrose du rein. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Après la chirurgie de 5 minutes sous anesthésie, elles reçoivent les molécules jusqu'à 14 jours, selon une voie et un rythme propres à chaque protocole, et subissent des prises de sang, avec ou sans anesthésie, puis un prélèvement terminal sous anesthésie. Le porteur indique qu'elles vont "ressentir les symptômes" de la fibrose, un rein perdant sa fonction pendant que l'autre compense. Aucun test statistique ne fixe l'effectif, et l'équipe dit retenir 12 souris par groupe en s'appuyant sur des publications et sur sa "forte expérience en expérimentation animale".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur la fibrose rénale dans un modèle d’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chez la souris.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.

Procédures

Les animaux vont subir une chirurgie très rapide (5 min) sous anesthésie pour induire le modèle pathologique d’insuffisance rénale (ligature urétérale). Ils vont également être traités par des candidats médicaments pendant 14 jours maximum (voie, fréquence dépendantes de chaque protocole expérimental). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront très rapides (30 sec-1 min). Les animaux pourront avoir des prélèvements de sang intermédiaires sur animal vigile ou non et un prélèvement plus important terminal sur animal anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux vont subir une chirurgie qui peut provoquer des nuisances à ces derniers (douleurs, gène dans les mouvements…). De plus, nous induisons une fibrose rénale aux animaux donc ces derniers vont ressentir les symptômes de cette pathologie à savoir perte de la fonction rénale sur un rein et compensation de la filtration par l’autre.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements tissulaires seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la fibrose rénale. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Ce modèle se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 12 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type igloo, aspen brick, carré de coton…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères et un antalgique sera administré avant toute chirurgie ainsi que l’utilisation d’un gel oculaire pour éviter la sécheresse des yeux pendant les anesthésies. De plus, après la chirurgie, des croquettes seront directement mises dans la cage des animaux afin de faciliter leur alimentation. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle expérimental chez la souris est largement décrit dans la littérature et est considéré comme un bon modèle expérimental de fibrose rénale. Des souris adultes entre 7 et 12 semaines seront utilisées. Si les souris sont utilisées trop jeunes le développement des néphrons n’étant pas achevé le développement de la pathologie UUO serait différente et ne correspondrait plus au timing que nous recherchons.

La suspension tumorale greffée aux lapins est prélevée sur deux ou trois d'entre eux, déjà porteurs de la tumeur VX2, pour quinze receveurs. 80 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit cinq anesthésies générales, une mini-laparotomie pour la greffe intrapéritonéale, trois cœlioscopies pour aérosoliser de la chimiothérapie sous pression, une dernière pour la mise à mort et les prélèvements. Le porteur décrit un abdomen qui gonfle sous l'ascite et un transit perturbé, et borne pour cette raison la manipulation à onze semaines. Il écarte la souris, trop petite pour supporter la surpression de la cœlioscopie, et retient le lapin pour son anatomie abdominale proche de celle de l'humain.

Objectifs

Des modèles existants de lapins présentant des métastases après injection de tumeur VX2 (carcinome à cellules squameuses de lapin transplantables) vont être traités par chimiothérapie intrapéritonéale pressurisée par aérosol par voie coelioscopique (PIPAC) via des dispositifs médicaux ou des traitements. L’objectif principal est d’évaluer la réponse histologique après la 3ème PIPAC entre les groupes de lapins avec métastases péritonéales (MP) traitées. Les objectifs secondaires consistent en l’évaluation comparée des critères suivants sur ces mêmes groupes : la réponse radiologique, le peritoneal cancer index (PCI), le volume d’ascite, la réponse immunitaire (immunomarquage), la profondeur de pénétration de la chimiothérapie au sein des MP dans les tissus et analyse 3D de l'environnement tumoral par microscopies multiphotonique et électronique.

Bénéfices attendus

Aucun résultat ne peut être prédit en faveur de l’une ou l’autre buse de pulvérisation. Néanmoins, un dispositif médical a été retiré du marché en France récemment pour défaut et risque de toxicité pour le patient. Il est nécessaire de faire une étude objective réalisées par des scientifiques et médecins sans conflit d’intérêt pour répondre à cette question polémique qui est souvent abordée dans les congrès et groupes de recherche.Les buses actuelles ont eu toutes un marquage CE mais elles n’ont pas été comparées entre elles sur un modèle animal avec métastases péritonéales. De même, nous espérons que la réduction du temps de pause puisse permettre une efficacité identique. L’assistance avec electrothérapie devrait apporter une meilleure régression tumorale. Enfin, des molécules chimiothérapeutiques innovantes sont régulièrement mises sur le marché pour une efficacité anti-tumorale améliorée (nanoparticules, nouvelles molécules) de même que de nouveau protocole de traitement (adjonction de chimiothérapie systémique lors de la PIPAC) Nous souhaitons évaluer l’efficacité de chaque plan expérimental sur un modèle animal avec métastases péritonéales. Ainsi, la réponse histologique, radiologique, le score PCI seront analysés pour répondre à cet objectif. L’impact de cette étude sera réel si les résultats conduisent à une différence d’efficacité de l’un des protocoles. Au-delà de la valorisation scientifique, les applications en santé humaine seront facilement transposables en raison de l'absence d'études dans ce domaine.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à 5 anesthésies générales d'une durée totale d’envrion 1h30. La 1ere : Greffe des cellules VX2 en intrapéritonéale : mini-laparotomie médiane, greffe d’une suspension tumorale de VX2 issue de lapins porteurs (2 ou 3 lapins porteurs pour 15 receveurs), sur différents sites péritonéaux (Péritoine viscéral et pariétal). Phase de traitement : tous les lots de lapins bénéficient des mêmes gestes chirurgicaux (incision, insertion de trocart, biopsie et aérosolisation) durant les 3 autres anesthésies par coelioscopie pour chaque PIPAC. La seule différence est le type de dispositif médical d’aérosolisation/le traitement/la procédure PIPAC (ePIPAC) utilisée, le type de molécules chimiothérapeutiques (Intrapéritonéale ou systémique) ou sérum physiologique, le temps de pause de la PIPAC… Une dernière et 5ème anesthésie générale aura lieu en fin d'expérimentation (pour euthanasie).

Impact sur les animaux

Une anorexie et une perte de poids peuvent apparaître, ainsi qu’une altération de l’apparence physique et du comportement en conséquence. Une augmentation du diamètre abdominal est à prévoir en raison de l'accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier les dernières semaines post greffe, d'où la décision de limiter la durée de la manipulation jusqu’à 11 semaines maximum. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé (selles liquides).

Devenir

À l'issue de la procédure, les animaux sont euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, de biologie moléculaire ou de microscopie.

Remplacement

Des études in vitro ont déjà été effectuées sur ce sujet mais ont montré leurs limites. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques, et encore moins en prenant en compte l'environnement tumoral (une métastase en 3 dimensions ne répondra pas aux traitements chimiothérapeutiques de la même façon qu'une culture en 2 dimensions) et la coopération avec le système immunitaire. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles de lapins de MP sont bien décrits (Mei et al 2010) et permettent de mimer le phénomène observé chez l’Homme.

Réduction

Le modèle de MP est maitrisé par l’équipe et les porteurs de ce projet, ce qui permet de limiter des étapes de mises au point. Pour chaque étude, de 3 à 5 lapins seront utilisés par condition (pour un dispositif et/ou par traitement testé). Ce nombre prend en compte la fréquence potentielle d’échec du modèle et de la procédure (qui reste faible). Nous estimons avoir besoin de 80 lapins afin de tester 20 conditions expérimentales différentes (suivies d'analyses de la variance). De plus, nous travaillons en étroite collaboration avec l'entreprise qui maîtrise et commercialise le modèle de lapin avec greffe de tumeurs VX2 et métastases dans différents sites (gastrique, intrapéritonéal, ovarien, ...). Des expériences in vitro ont déjà permis de définir les valeurs de la gamme de concentration des cellules selon leur cinétique de croissance. Les expériences in vivo sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Une attention particulière sera apportée à l'hydratation des animaux pour surveiller d'éventuels troubles du transit. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis ou lampe chauffante pendant la chirurgie, analgésique post opératoire). Les animaux seront suivis quotidiennement et évalués selon une grille de score décrite dans le document annexe. Des points limites ont été définis et justifieront d’une intervention (troubles du comportement, signes d’occlusion intestinale (arrêt du transit), troubles respiratoires...)

Choix des espèces

Pour l’étude des métastases péritonéales, la souris est l’animal le plus couramment utilisé. Néanmoins, la coelioscopie et la surpression dues à la PIPAC ne sont pas compatibles avec la taille de la souris à ce jour. Le modèle de lapin est ainsi le plus approprié pour étudier les métastases péritonéales gastriques. Le lapin est un animal avec une durée de vie plus longue que la souris, ce qui permet de réaliser des plans expérimentaux répétés sur de plus longues périodes. Il a une anatomie abdominale et une physiopathologie péritonéale proche de celle de l’homme, ce qui en fait un modèle stratégique en cancérologie digestive. Il s’agit ici d’un projet intégrant plusieurs études exploratoires permettant de fournir des éléments de faisabilité, de comparaison et de sécurité de la procédure PIPAC. Nous utiliserons des jeunes lapins adultes pour de meilleures conditions de santé et éviter de cumuler avec d'autres pathologies liées au vieillissement.

Pour corriger l'hyperexcitabilité cérébrale associée à la maladie d'Alzheimer, 918 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un prélèvement d'oreille pour le génotypage, une chirurgie cérébrale de vingt minutes suivie d'une heure de pose d'électrodes, puis quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré vingt-quatre heures sur vingt-quatre. Des tests sont répétés chaque mois pendant une semaine, dix minutes trois fois pour la mémoire et une heure en arène pour les mouvements, sans que le porteur nomme les épreuves employées. Il annonce de nombreux critères permettant de détecter une détresse et d'arrêter la procédure, sans en citer un seul.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux pour le génotypage auront unprélèvement d'un bout d'oreille (3mm maximum). Les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement un léger stress lors de la contention et une douleur légère pendant le prélèvement. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles génétiquement modifiésont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Pour savoir si les animaux sont porteurs du gêne d'intérêt, une biopsie d'oreille sera faite entre 7 jours et 15 jours après la naissance Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés. Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

1 280 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles subissant sept séances d'ouverture de la barrière sang-cerveau par ultrasons et quatorze injections intraveineuses sous anesthésie. S'y ajoutent, pour d'autres, une chirurgie cérébrale de trente minutes, un prélèvement de queue vers le dixième jour de vie, et vingt et un essais de nage de quatre-vingt-dix secondes dans un bassin circulaire répartis sur six jours. Le porteur reconnaît que ces souris développent vers sept ou huit mois une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement lié aux difficultés d'accès à la nourriture, et que l'épreuve de piscine peut provoquer une hypothermie. Les retombées annoncées pour les malades d'Alzheimer restent au conditionnel et à long terme, quand la paralysie, elle, est programmée par le génotype des animaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. L’autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients et s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, une technologie de molécules thérapeutiques de petites tailles, appelée « nano-anticorps » a été développé, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Par ailleurs, un moyen d’ouvrir cette barrière a récemment été décrit par l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, permettant de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autoriser la pénétration de molécules thérapeutiques. De plus, le développement des thérapies géniques a aussi ouvert de nouvelles opportunités pour surmonter les limitations dues à la présence de cette barrière sang-cerveau. En conséquence, ce projet vise à combiner ces technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. En particulier, l’utilisation de nano-anticorps visant les agrégats de protéines Abéta et tau, associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau ou à l’emploi d’une thérapie génique, pouvant permettre de freiner la propagation de ces agrégats d’une aire cérébrale à une autre. Ce projet sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine Abéta et tau, caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante combinant les technologies de nano-anticorps visant les agrégats des protéines Abéta et tau, et celles des thérapies géniques. L’efficacité de cette première stratégie sera comparée avec l'utilisation de nano-anticorps associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau pour faciliter leur passage. Les multiples tentatives d’utilisations d’anticorps classiques dirigés contre les protéines Abéta et tau pour traiter la maladie d'Alzheimer ont montrées, jusqu'à présent, une efficacité clinique limitée. Cela est dû à la grande taille des anticorps et à l’existence de la barrière sang-cerveau qui réduit leur efficacité. Les nano-anticorps sont beaucoup plus petit que des anticorps classiques et ont un potentiel plus élevé de traverser cette barrière et atteindre des cibles thérapeutiques dans le tissu cérébral. Par ailleurs, plusieurs études récentes chez l’animal ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons et de microbulles, favorisant le passage d’anticorps anti-Abéta et montrant une diminution des dépôts dans le cerveau. De plus, plusieurs équipes de recherches ont récemment montrées que l’utilisation de thérapies géniques pouvait permettre de libérer à long terme des molécules thérapeutiques ciblant les agrégats de protéine tau directement dans le cerveau. L’utilisation de nano-anticorps en combinaison avec l’ouverture de la barrière sang-cerveau ou produits dans le cerveau par thérapie génique pourrait donc être une stratégie probante afin de délivrer des molécules thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques sont des modèles de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces (entre 5 et 7 mois selon les souris). Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée du projet (examen et pesée 1-2 fois par semaine). -Tous les animaux produits auront un prélèvement d'un fragment de queue à l'âge de 7 à 10 jours pour définir leur génotype (patrimoine génétique) (moins d’une minute par animal, une fois) -Pour une partie des animaux une chirurgie cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes environ et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux des séances d'ultrasons seront effectuées pour ouvrir transitoirement et sans effets secondaires la barrière sang-cerveau et faciliter l’accès des thérapies au cerveau. 7 séances d’ouveture (10 minutes par séance) couplée à deux injections intraveineuses (14 injections au total, durée de chaque injection : 30 secondes), le tout sous anesthésie générale et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux, on procédera à des tests de mémoire non-invasifs sur une durée de 9 jours : 1) une observation du comportement spontané dans une enceinte carrée (3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours) et 2) une observation d’un comportement inné de nage dans un bassin circulaire (21 essais de 90 secondes max. distribués sur 6 jours de tests). Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse vigile (1 minute par animal, une fois) A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 7-8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur génotype. Les chirurgies sous anesthésie générale sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. L’inoculation intra-cérébrale de matériel accélérant la propagation des lésions neuropathologiques pourrait également favoriser l’apparition d’effets indésirables à un âge où ils ne sont normalement pas observés (entre 4 et 6 mois). Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané et inné de l’animal, impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement et un stress plus important lors de l’épreuve de nage en piscine, pouvant également induire une hypothermie.

Devenir

A l’issue de toute les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.

Remplacement

L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études « vitro », dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permi ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux produits (1280) et maintenus sur site est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature.

Raffinement

L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes ou en trio (cages de reproducteurs) et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme de suivi rapproché de nos lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé à partir de 4-5 mois et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale. Les étapes chirurgicales du projet (inoculations intracérébrales et ouvertures de la barrière « sang-cerveau ») sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, déshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. Les chirurgies d’inoculation intra-cérébrale pourraient de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant à priori pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel envirronnment avant les tests pour minimiser le stress induit.). Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris. En fin d’étude toutes les souris seront euthanasiées par des méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux reproducteurs pour générer nos lots expérimentaux seront utilisés de 2 mois à 8 mois maximum. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 6 mois). Les traitements thérapeutiques seront eux aussi initiés à 3 ou 4 mois (début des lésions) sur une durée de 6-7 semaines avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 5 ou 7 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.