Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude de l’efficacité de nouvelles molécules pour traiter ou prévenir l’inflammation intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une colite est induite par voie orale au DSS chez 1 200 souris, dont 900 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 300 d'un niveau modéré. Le porteur annonce dès l'induction une perte de poids, de la diarrhée, des pertes de sang et des douleurs intestinales. Le détail des procédures ne porte pourtant que sur les prélèvements sanguins, jusqu'à 0,2 mL par semaine à la veine caudale ou jugulaire, sans revenir sur l'induction elle-même. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever des tissus et mesurer la motilité intestinale post mortem.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. L'objectif thérapeutique et préventif évolue vers la recherche d'une "rémission physiologique". Malgré les avancées des thérapies biologiques, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les effets pléiotropiques des molécules et les enjeux thérapeutiques sous-jacents rendent indispensables l’utilisation de modèles in vivo. Le modèle d’inflammation intestinale est indispensable pour étudier les effets d’une molécule sur un organisme entier et pour accélérer le passage en clinique chez l’homme. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou préventives pour les MICI chez la souris. Dans ce modèle préclinique, l'inflammation est induite oralement par le DSS chez la souris. En ce qui concerne le choix d’un modèle aigu ou chronique, il dépendra d’une part du mécanisme d’action de la molécule à tester et d’autre part de la cible thérapeutique. De la même façon, la fréquence, la voie et le volume des administrations seront variables puisque dépendants des molécules. Celles-ci seront effectuées en total respect de la directive européenne 2010/63/UE.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. Malgré les avancées des thérapies, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives. La validation de molécules anti-inflammatoires dans des modèles de MICI murins serait un premier pas vers des tests chez l'humain et la possible commercialisation de molécules pouvant soulager ces millers de personnes en France atteintes de MICI.
Procédures
Selon la molécule à tester, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront de l'étude. Cependant, les prélèvements seront effectués en total respect de la réglementation internationale et européenne. A savoir, pour une souris de 25 g, un volume inférieur à 0.2 mL (10% du volume sanguin circulant) sera prélevé 1 fois par semaine ou bien un volume inférieur à 0.3 mL (15% du volume sanguin circulant) sera prélevé 1 fois toutes les 3-4 semaines. Le site de prélèvement sera soit la veine caudale soit la veine jugulaire (sous anesthésie gazeuse : 3% pour induction-1.5% pour maintien). Un prélèvement tissulaire post-mortem, à la fin de l’expérience, sera réalisé.
Impact sur les animaux
Dès l’induction de la pathologie, les animaux pourront avoir une perte de poids, de la diarrhée, perte de sang, douleur intestinales.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanaisés à la fin de chaque procédure afin de réalisé des prélèvements tissulaires et l'étude de la motilité intestinale post-mortem.
Remplacement
Le modèle murin de colite induite au DSS est très proche de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. De plus, le nombre d'animaux a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement signfiicatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Tout au long des différentes procédures les animaux seront observés et pesés. La présence de sang dans les selles et le comportement/aspect général de l'animal seront également analysés. Cette méthode non-invasive permettra donc de suivre au cours du temps, sur un même animal, l'évolution de la pathologie. Ce projet permettra de réaliser 30 études sur 5 ans.
Raffinement
De la ouate et des igloos seront ajoutés, permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.
Choix des espèces
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’inflammation au niveau du colon sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et préventive pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, l'inflammation est une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Le modèle murin a été choisit de part la prédominance de cette espèce dans les publications concernant les MICI et la validité des modèles utilisés dans cette étude. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. De plus, c'est l'âge utilisé classiquement dans la litterature pour ces modèles.
Caractérisation de la migration de retour en mer des anguilles argentées des marais salés
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturées au verveux et laissées piégées jusqu'à quatorze heures, 900 anguilles européennes sont ensuite versées dans une cuve, endormies au bain d'anesthésique, mesurées, puis équipées d'une puce injectée dans la cavité abdominale. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et c'est au nom de sa sauvegarde que le porteur prévoit d'en marquer 300 par an pendant trois ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Il décrit le marquage comme un stress de moins d'une minute et l'anesthésie comme une nuisance de moins de cinq minutes, le temps de piégeage restant la contrainte la plus longue. Toutes les anguilles marquées sont remises à l'eau, le bac de réveil étant versé directement dans le fossé à poissons.
Objectifs
L’anguille européenne (Anguilla anguilla) est un poisson migrateur amphihalin (espèce migrant entre le milieu marin et le milieu d'eau douce) classé en danger critique d’extinction. Afin d'assurer sa sauvegarde, un plan de gestion national a été validé en 2010 pour mettre en place des mesures de reconstitution du stock d'anguilles européennes. Les actions se font sur les différents habitats (estuaire, marais, fluvial) et dans une démarche de suivi de l’évolution de la population des entrées de civelles (recrutement) aux sorties d’argentées (échappement). Le projet vise la migration de dévalaison (retour en mer) des anguilles sortant des marais salés. L’étude se fera sur une entité hydraulique indépendante, appelé localement fossé à poissons, alimenté en eau salée par les marées par un ouvrage unique d’entrée et de sortie et sans arrivée d’eau douce. Nous suivrons la cinétique de dévalaison des anguilles dans leur phase argentée, c’est-à-dire lorsqu’elles sont prêtes à retourner en mer pour effectuer leur migration de reproduction. Les anguilles seront capturées dans le fossé à poissons. Elles seront marquées avec une puce afin de suivre en continue leur dévalaison par la sortie unique qui sera équipée d’un système d’antennes de détection de marques automatique qui permettra de repérer l’identité et les horaires de passage des individus. Le projet permettra de connaître la cinétique de dévalaison des anguilles afin de caractériser notamment la vitesse du processus ainsi que les mécanismes qui l’expliquent. Le principal objectif est d’analyser les fréquences de sortie des anguilles en lien avec les facteurs déclenchants cette migration (par exemple la luminosité, les conditions hydroclimatiques, la température, les coefficients de marée…). Par ailleurs, le suivi permettra de vérifier les périodes favorables de dévalaison pour proposer, le cas échéant, des mesures de gestion et connaitre le temps de transformation des anguilles jaunes en anguilles argentées dans ce type de milieu salé très particulier.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des connaissances sur la phase d’argenture des anguilles une fois leur croissance effectuée en marais salé. Également, il permettra de caractériser la cinétique de migration de dévalaison (retour en mer) et notamment, les périodes, la vitesse du processus ainsi que les mécanismes qui l’expliquent. L’aspect important du projet vise à mettre en avant l’apport des marais salé pour la production de géniteurs d’anguilles et de promouvoir sa conservation et sa gestion pour arriver à une sortie efficace de ces individus et au final un échappement en mer pour la reproduction. La production d’anguilles argentées est la première cible à atteindre (Plan de gestion national de 2010). Aussi, les résultats de ce suivi permettront de sensibiliser les propriétaires de fossés à poissons au fort potentiel de leur marais en production de géniteurs et à proposer une optimisation de la gestion des ouvrages de vidange.
Procédures
Les anguilles seront capturées en une seule fois avec un engin de pêche dans un fossé à poissons. Elles resteront piégées dans l’engin de pêche pendant maximum 14 heures. Puis, l’engin de pêche sera vidé directement vers un bac de stabulation composée d’une cuve cylindrique de 50L, et les anguilles seront prélevées par groupe de 20 avec une épuisette de taille adaptée à la taille de l'individu capturé (épuisettes en filet non abrasif) pour être déposées dans un bac contenant de l’anesthésiant. Une fois anesthésiés, elles seront prélevées une par une à la main (mains humides) et déposées sur un linge humide pour être mesurées et marquées avec une puce magnétique d'un poids permettant de respecter le ratio inférieur à 2% du poids de l'individu (marquage bref de quelques secondes). Elles seront ensuite déposées dans un bac de réveil avant d'être libérée directement dans le milieu naturel une fois réveillées. Afin de limiter la manipulation des individus, ils sont relâchés en versant le bac de réveil directement dans le milieu naturel, les anguilles repartent naturellement à l’eau.
Impact sur les animaux
La capture des anguilles constitue un premier moment stressant pour les individus d'une durée de 14h maximum. L'anesthésie constitue également une nuisance d'intensité légère de courte durée moins de 5 min. Le marquage constitue un autre moment stressant d'une durée très brève (moins d'une minute).
Devenir
Tous les poissons marqués seront conservés vivants et relâchés dans le milieu naturel.
Remplacement
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique des déplacements dans le fossé à poissons donc en milieu naturel, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes de plus de 20 cm et argentées) afin d’obtenir des données pertinentes.
Réduction
L'objectif du projet est d’enrichir les connaissances scientifiques sur le comportement de la migration de dévalaison des anguilles argentées en marais salé. La bibliographie montre une estimation d’anguilles argentées de 44 kg/ha soit 30% du stock total (120 kg/ha) avec des individus de 25-35 cm. Le fossé à poissons étudié est suivi depuis 2007. Nous pouvons estimer un stock en place dans ce fossé de 1500 anguilles. En prenant le pourcentage de 30% pour la quantité d’argentées produites sur le premier hiver, on obtient un nombre d’argentées estimées de 450 individus. Pour comprendre la cinétique de sortie des argentées sur ce fossé sur les 3 années du suivi, nous prévoyons de marquer chaque année les anguilles argentées mais également les anguilles jaunes qui pourront s’argenter. Pour avoir des résultats robustes et avec la pose de 5 verveux nous pouvons estimer une capture autour de 20% du stock en place, soit une capture de 300 anguilles. Sur ce lot de 300 individus, 200 seraient anguilles jaunes et pourront se transformer en argentées, et 100 seraient anguilles argentées et prêtent à dévaler. L’objectif est de marquer 300 anguilles chaque année et de le répéter pendant 3 ans afin d’avoir des statistiques robustes. Ce choix de marquer 900 individus sur la durée du projet correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités intra-spécifique (sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif) et les paramètres environnementaux impliqués dans la phase de migration (saisonnalité, débit, température, blocages…). Ce nombre de poissons représente une part extrêmement faible de prélevement sur l’ensemble des fossés à poissons du marais (surface totale de plus de 9000 Ha, estimation à 0,025% de prélèvement du stock en place).
Raffinement
Pour la phase de capture, l’oxygène et la température sont mesurés à la pose des verveux. Les verveux sont vidés délicatement dans des cuves cylindriques de 50 L pleines d’eau prélevées dans le même milieu que celui de capture des anguilles. L’opération sera faite à l’abri du soleil pour protéger les anguilles d’une exposition lumineuse trop forte. Un couvercle sera disposé sur les bacs pour éviter de stresser les anguilles. La stabulation des individus a lieu pendant un temps réduit (moins de 2h). La teneur en oxygène sera mesurée, un bulleur sera ajouté dans les bacs et l’oxygène sera contrôlé régulièrement. Si la teneur en oxygène est inférieure à 3 mg/L les anguilles ne seront pas manipulées ni marquées. Les individus présentant des pathologies externes ou amaigris sont écartés de la manipulation et remis à l’eau directement. Des lots de 20 anguilles maximum sont ensuite prélevés à l’aide d’épuisette nylon de maille 1,5 mm pour ne pas abimer les anguilles, pour être placées dans un bac noir avec couvercle contenant l'anesthésique. L’eau est claire et une vérification des différentes phases de l’anesthésie des individus est effectuée. Le stade d’anesthésie recherché est l’immobilisation. Une fois anesthésiée, les marques stériles sont insérées par injection dans la cavité abdominale. Le marquage se fera à l'abri du soleil et prendra quelques secondes. Puis les anguilles seront placées dans un bac de réveil de contenance 50 L rempli avec l’eau du milieu naturel du fossé. L’oxygène de ce bac est vérifié en permanence. Un bulleur sera placé pour améliorer la teneur en oxygène. Une vigilance des opérateurs sera apportée au raffinement dans toutes les étapes de la procédure : • Acclimatation à l’eau de la rivière (contrôle de la température et de l’oxygène dans les bacs), • Marquage de poissons sains, • Capture avec épuisette réduite, • Cuve de réveil avec l’eau du milieu de libération pour observer le comportement du poisson marqué, • Surveillance des poissons pendant toutes les phases, de la capture au lâcher.
Choix des espèces
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique de dévalaison des anguilles en milieu naturel dans les fossés à poissons de marais salé, il est indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes et argentées). Nous utiliserons les anguilles jaunes de plus de 20 cm et les anguilles argentées afin d’analyser les cinétiques de migration de dévalaison dans un fossé à poissons de marais salé en connexion avec l’estuaire.
Modèles préclinques de cancer ovarien.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées de cellules de cancer ovarien humain, 800 souris immunodéficientes reçoivent ensuite un candidat médicament, jusqu'à une fois par jour pendant quatre semaines, avec quatre prises de sang sous anesthésie et une imagerie hebdomadaire. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue, pour caractériser l'effet du traitement sur leurs organes et sur la tumeur. Le laboratoire réalise ces essais comme prestataire, pour des partenaires publics ou privés, et met en avant la reproductibilité et la robustesse de ses modèles. Il écrit dans le même paragraphe que ces modèles "demandent à être améliorés" et que les thérapies innovantes qu'ils laissent espérer relèvent d'un "futur proche".
Objectifs
Malgré les progrès de la chirurgie et de la chimiothérapie, le cancer de l'ovaire reste l'une des principales causes de décès par cancer chez les femmes, avec le cancer du poumon et le cancer du sein. Le cancer de l'ovaire développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé. La mise en œuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments innovants.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules tumorales ovariennes humaines (1 injection durant 1 min / animal) puis recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Une partie des animaux subira des prélèvements sanguins (au maximum 4) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 7 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une pathologie tumorale humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 4) et à l’imagerie optique (hebdomadaire) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir caractériser ex-vivo l’effet de l’administration des candidats médicaments sur les organes et/ou la tumeur.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le role du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et qui permet en plus de faire un suivi de l’évolution du développement tumoral par des mesures cinétiques non invasives par bioluminescence.
Réduction
Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie volatile. L'hébergement des animaux est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. De plus, afin de respecter leur instinct grégaire et d'assurer une absence de peur et d'anxiété, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de dômes en carton et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, de blessure ou de maladie nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.
Suivi calcique lors d’une crise d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 104
Dès qu'une convulsion tonique apparaît, ou si l'état épileptique dure plus de vingt minutes, l'animal est anesthésié ou tué. 104 souris et 104 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue parce que les deux chirurgies et les crises peuvent affecter durablement leur qualité de vie. Chacun subit deux opérations du crâne à une semaine d'intervalle, l'une pour injecter un vecteur viral, l'autre pour poser un implant, puis reçoit une substance convulsivante et porte un miniscope sur la tête pendant deux heures et demie. Le porteur indique que ces modèles de crises induites chimiquement sont "recommandés" pour tester l'efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché.
Objectifs
A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. L'objectif du projet consiste à mieux caractériser les modèles d'épilepsie chez le rongeur et évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. L’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, fait partie des signaux précurseurs avant l’apparition de décharges électriques et de la crise d’épilepsie comportementale. Cette augmentation en calcium peut mener à des modifications transitoires ou permanentes sur la plasticité et la mort neuronale. La compréhension du rôle du calcium dans l’induction de l’épilepsie pourrait permettre de nouvelles avancées thérapeutiques pour traiter cette maladie. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les convulsions cloniques sont des secousses musculaires incontrôlées alors que les convulsions toniques correspondent à un raidissement et une contraction soudaine des muscles du corps et des membres inférieurs et supérieurs accompagnés d'un arrêt respiratoire, qui peut conduire à la mort dans certains cas. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte. Des fourmillements, picotements ou encore secousses musculaires incontrôlées au niveau d'un membre peuvent être observés chez l'Homme. Les épilepsies peuvent être non-convulsives, on parle alors de crises d'absence. Elles affectent principalement les enfants et correspondent à une perte de conscience (avec un regard dans le vide). Le projet consiste en la mise en place d’une technique de suivi calcique intracérébrale lors d’une crise d’épilepsie généralisée ou partielle, avec ou sans mesure de l’électroencéphalogramme chez le rongeur. Une fois la technique établie, ces modèles pourront être utilisés pour évaluer l'efficacité de substances pharmacologiques en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux caractériser certains modèles d’épilepsie induits par une substance chimique par la mesure du calcium intracellulaire au niveau cérébral. L’évaluation de ce nouveau paramètre sur le flux calcique, en plus des décharges électriques et du comportement convulsif chez l’animal, sera utile pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Les modèles de crises généralisées et partielles induites par une substance chimique sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements).
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les animaux sont opérés deux fois avec un intervalle d’une semaine pour injecter le vecteur viral (45 minutes, 1 fois) puis réaliser la pause d'implant (90 à 150 minutes, 1 fois). Pour les études d’efficacité, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Pour chaque procédure, une substance réactive est administrée par bolus rapide, une fois, sur quelques secondes ainsi qu’une substance anti-épileptique, administrée de la même manière, en fonction des symptômes observés. Le comportement de l'animal sera évalué immédiatement après l’injection de la substance réactive (pendant 30 minutes à 2 h30). Pendant le test, un miniscope sera placé sur la tête de l’animal pour permettre le suivi calcique intracérébral. En fonction de la procédure, l’électroencéphalogramme sera évalué en activant l’implant télémétrique. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (a minima 24 heures avant le test) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux seront opérés deux fois à un intervalle d'une semaine. La phase d'anesthésie peut induire un léger stress et la phase chirurgicale peut entraîner des douleurs post-opératoires au niveau du crâne de l'animal. Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Pendant le test, un miniscope de quelques grammes sera placé sur la tête de l'animal pour une durée maximale de 2h30. Les crises partielles peuvent conduire à l'apparition d'un état épileptique permanent (supérieur à 25 minutes), caractérisé par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l’animal et une perte d’équilibre. Dans les tests modélisant des crises généralisées, des convulsions cloniques peuvent être observées. Ces crises correspondent à une perte d'équilibre de l'animal avec des mouvements incontrolés des membres antérieurs et postérieurs dont la durée n’excède pas quelques minutes.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les 2 interventions chirugicales ainsi que les crises épileptiques (convulsives ou non) peuvent affecter durablement leur qualité de vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer l'effet de traitements sur les variations de calcium intracellulaire lors de l'ajout d'une substance chimique sur des cultures primaires de neurones. Ces tests permettent de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (température corporelle par exemple).
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir mettre en place la technique de manière fiable et évaluer plusieurs paramètres en parallèle (intensité moyenne du suivi calcique, électroencéphalogramme et comportement). Le nombre d’animaux est également adapté pour évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données: variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour chaque phase chirurgicale, une analgésie est assurée par l’administration d'analgésiques injectés par voie systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Un gel ophtalmique est également appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle est surveillée pendant toute la durée de l'anesthésie jusqu'au réveil de l'animal. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant). Les animaux sont hébergés deux par deux, et systématiquement avec un enrichissement adapté (bois à ronger et frisure). Dès l’apparition de convulsions cloniques, une substance antiépileptique sera administrée. De la même manière, l’animal recevra une substance antiépileptique si un état épileptique persiste au-delà de 20 minutes. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique ou la persistance d'un état épileptique.
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives induites par une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur après sevrage jusqu'à l'âge adulte (souris et rat) car les crises chez l'humain sont également détectées chez des sujets jeunes et adultes. Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer l'efficacité de nouveaux candidats médicaments dans le cadre de l'épilepsie.
Évaluation de nouveaux traitements contre la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 600
Greffés de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus, 2 500 souris et 600 rats développent une maladie du greffon contre l'hôte, avec perte de poids, perte de poils, diarrhées, mobilité réduite et défaillance d'organes pouvant les tuer. S'y ajoutent des gavages, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, des prises de sang répétées et des mesures de température par sonde rectale. Le porteur ouvre le paragraphe des effets en parlant de nuisances "modérées", avant d'y ranger, quelques lignes plus loin, la mortalité par défaillance d'organes qu'il qualifie de sévère. Tous les animaux sont tués à l'issue, l'évaluation des candidats médicaments réclamant l'analyse des tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur des modèles de la maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD : Graft versus Host Disease) peut survenir après une greffe de moelle osseuse réalisée dans le cadre du traitement d’une leucémie. Les lymphocytes T contenus dans le greffon vont attaquer les cellules du patient greffé, conduisant à des lésions des tissus sains. La maladie du greffon contre l’hôte est une complication grave, parfois mortelle. Elle survient lorsque les cellules du donneur présentent une incompatibilité immunologique avec celles du receveur, et perçoivent ces dernières comme étrangères. Dans ce cas, les lymphocytes T du donneur, dits « alloréactifs », vont alors détruire les cellules et tissus sains de l’hôte. Ce phénomène survient chez environ 20 à 50 % des patients greffés, rapidement après l’intervention ou plus tardivement. Il peut être très difficile à traiter. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
La maladie du greffon est contrôlée à l’aide de médicaments immunosuppresseurs qui atténuent le conflit immunitaire entre les cellules du donneur et celles du receveur. Ces traitements peuvent durer plusieurs mois, voire plusieurs années. Cependant beaucoup de patients sont réfractaires aux corticoïdes et de nouveaux traitements sont nécessaires puisque la maladie du greffon contre l’hôte est une cause de mortalité et de morbidité majeure. Les traitements biologiques récents sont très couteux et peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d’efficacité due à la production d’anticorps neutralisants par le patient. Les études qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes (y compris des thérapie cellulaires et fécalothérapie). A court terme, elles permettront de confirmer l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies de la GvHD. A plus long terme, ces études constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées d'un animal vigile, pendant 30s jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Mesure de la température corporelle d'un animal vigile ou sous anesthésie générale via une sonde rectale pour rongeur pendant 30s. • Les prélèvements de sang via la veine caudale seront réalisés soit sur animal vigile, soit sur animaux anesthésié à l’isoflurane pendant 30 à 60s. Les prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque seront effectués sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 30 à 60s. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n’excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l’animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu’à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voir orale (gavage à l’aide d’une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée ou via la veine caudale) pendant une durée de 15 à 30s : Sur animaux vigiles. • Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine) pendant 15 à 30s.
Impact sur les animaux
Cette procédure induira chez l’animal un certain nombre de nuisances modérées : injection de cellules, , administration de traitement par gavage ou injection (ip, iv, sc) pendant plusieurs jours ainsi qu’une préhension accompagnant ces administrations. De plus, les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations de composés (voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous cutanée) et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent générer également des nuisances. Les effets indésirables attendus (suite à une xénogreffe) sont une perte de poids, une perte de poils, une piloérection, une réduction de la mobilité, des diarrhées, des douleurs qui selon la gravité justifierait une mise à mort immédiate (modéré). Une GvHD peut entrainer une mortalité selon le type de greffe, notamment lors de xenogreffe qui peut entrainer une défaillance des organes de l’hôte . ‘sévère
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire en fin d'étude.
Remplacement
Il existe des modèles de peau humaine isolée qui permettent de détecter avec une grande précision la possibilité pour un patient de développer une GvHD (compatibilité donneur/receveur). Cette méthode a aussi été utilisée avec des peaux de rats pour des études de transcriptomiques et recherche de biomarqueurs. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peuvent pas à ce jour constituer un environnement fiable pour des études de pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Chaque étude comprendra en moyenne 60 animaux (10 animaux par groupe : Ctrl-Naif, Vehicle et 4 groupes traités avec des composés). Chaque projet de développement nécessite en moyenne l’évaluation de 5 entités thérapeutique expérimentale. Nous estimons réaliser 2 projets par an dans le domaine de la GvHD. Le nombre d’animaux est donc 60 (animaux par étude) x 5 (composé par projet) x 2 (projet par an) x 5 ans. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire (3100 animaux estimés).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin de satisfaire la manifestation de leur comportement naturelle (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture,..). Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique à minima journalière sur la durée des procédures. Les locaux d'hébergement et les systèmes d’hébergement suivront un programme d’hygiène et sanitaires (programme sanitaires) afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adaptés sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car Le stress lié à la manipulation peut être une nuisance pour l’animal, et aussi avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris qui sont communément utilisées en pharmacologie. De nombreuses données sur les modèles de GvHD chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent clairement que les rats (4-5 semaines) et les souris adultes (7-8 semaines) représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine de la GvHD car ils doivent disposer d'une système immunitaire mature
Modèle de Maladie de Parkinson chez la Souris : approche thérapeutique par transfert de gène dans un modèle de souris inoculée par des fibrilles d’alpha-synucléine.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une trentaine de minutes de chirurgie crânienne, répétée trois mois plus tard pour près de la moitié d'entre elles, puis six séries de tests moteurs étalées sur un an. 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des fibrilles d'alpha-synucléine leur sont injectées dans le cerveau pour y provoquer une maladie de Parkinson, avec ralentissement des mouvements et perte d'équilibre attendus trois à six mois plus tard chez les souris non traitées. Le porteur nomme les tests, rotarod pour la coordination, épreuve de balance, mesure de force musculaire, et retient la souris parce que son petit cerveau favorise la diffusion des fibrilles, avec des animaux inoculés à 12 mois et suivis jusqu'à 24 mois pour reproduire l'âge tardif de la maladie humaine.
Objectifs
Notre objectif est d’évaluer l’effet thérapeutique d’un vecteur viral de type adénovirus (AAV) dans le cadre d’un projet de thérapie génique ciblant la maladie de Parkinson, en utilisant un modèle de souris âgées de plus de 12 mois atteintes de la maladie de Parkinson. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par la mort d’un certain type de neurones (dopaminergiques) et dont la fréquence augmente chez des personnes de plus de 60 ans. Cette affection provoque des difficultés motrices importantes voire invalidantes. Même s’il existe des traitements qui peuvent améliorer les symptômes, il n’existe pas à ce jour de traitement curatif de la pathologie. L’accumulation dans certains neurones d’agrégats de protéines composés d’alpha-synucléine est un mécanisme central de la maladie humaine qui conduit à la mort des neurones. Pour mettre au point une thérapie génique innovante, notre objectif est de créer un modèle d’étude de la maladie pertinent, pour cela nous utiliserons le modèle souris, dans lequel nous inoculerons des agrégats (fibrilles) d’alpha-synucléine dans le cerveau. Deux études ont déjà pré-établi la faisabilité de ce type de modélisation. Pour mimer la phase la plus sévère de la maladie, nous devrons recréer les conditions pathologiques chez des souris assez âgées. Nous inoculerons donc les fibrilles chez des souris âgées de 12 mois, pour mimer l’âge tardif de survenue chez l’homme. Nous étudierons les effets de transfert des gènes thérapeutiques introduits via des vecteurs viraux dans le cerveau de ces souris, pour contrecarrer les mécanismes de la maladie. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique sur les paramètres pathologiques, cliniques, cellulaires et biochimiques, des souris-modèles ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement chez l’homme. En résumé, l’objectif du projet est d’établir un modèle préclinique pour tester un nouveau vecteur de thérapie génique, constituant ainsi la première étape d’une démarche translationnelle en direction de la maladie humaine. Cette démarche nécessite l’établissement d’une preuve de concept thérapeutique dans l’espèce souris.
Bénéfices attendus
La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme (plus de 2000 patients, atteints de diverses maladies, ont reçu des vecteurs AAV). Elle est considérée comme un des principaux espoirs de traitement curatif, à condition de prouver ses effets, dans un premier temps, dans des modèles animaux pertinents. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère dont la fréquence augmente chez les personnes de plus de 60 ans. Elle n’a pas de traitement curatif et son évolution est invalidante. Cette maladie est caractérisée par la mort de neurones dopaminergiques entraînée par l’accumulation anormale d’agrégats de protéines riches en alpha-synucléine (une protéine présente normalement sous forme non agrégée dans les neurones). Pour tester un traitement innovant notre objectif est de créer un modèle d’étude pertinent de la maladie chez la souris, en inoculant des fibrilles d’alpha-synucléine dans le cerveau. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.
Procédures
Chirurgie : Préparation de l’acte chirurgical et de l’anesthésie -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Acte chirurgical : injection de fibrilles et/ou de vecteur thérapeutique et/ou d’une solution saline -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par souris et par jour, durant 5 jours consécutifs Tous les 2 mois, 6 fois au total Tests comportementaux : Trois types de tests comportementaux seront réalisés tous les 2 mois après l’injection de fibrilles sur afin d’évaluer la balance, la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le cerveau des souris pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Parkinson. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour cad 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de balance Durée : 20 minutes par jour Répétition : 4 jours consécutifs Test 3 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 3 jours consécutifs Ces trois types de tests seront réalisés au total 6 fois au maximum pour tous les animaux.
Impact sur les animaux
Les complications liées à aux chirurgies sont rares mais peuvent entrainer : - une altération grave du comportement, - des séquelles de traumatisme non-résolues par traitement, - un incident d’anesthésie avec séquelles (troubles respiratoires, fausse déglutition), - une hémorragie sévère en cours de chirurgie, - une perte de poids au cours de la semaine suivant l’intervention. L’injection de fibrilles d’alpha-synucléine entrainera un développement progressif de la maladie de Parkinson qui se traduira par des déficits moteurs (ralentissement des mouvements, perte d’équilibre). Ces symptômes devraient apparaitre environ 3 à 6 mois après l’injection de fibrilles dans le groupe des souris non traitées par vecteur thérapeutique. Une perte de poids peut en découler.
Devenir
A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d'effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques. Les cerveaux et les foies de ces animaux seront prélevés. Le but est de regarder l’effet des vecteurs thérapeutiques sur les marqueurs de la maladie de Parkinson.
Remplacement
Toutes les constructions génétiques (vecteurs viraux) utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité des constructions génétiques pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées nous permettant d’obtenir des données statistiquement significatives pour évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une large recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche bibliographique nous a permis d'optimiser nos procédures et le nombre d'animaux à utiliser afin d'obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum. Ce nombre, validé par le un logiciel spécialisé, permettra de fournir un résultat fiable et statistiquement analysable pour chaque sous-groupe.
Raffinement
Pour l'administration des fibrilles et du vecteur thérapeutique, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure. Nous surveillerons l’état de santé des souris tout au long de l’expérience, et de manière accrue en post-opératoire. Cela permettra une intervention immédiate et de appropriée si des signes de souffrance apparaissent et les points limites sont atteints. Tout au long de l’expérience un suivi précis des souris sera mis en place : pesées et observations hebdomadaires des animaux. L'application de critères de points limites permettra de veiller au bien-être des animaux. Afin de suivre l’apparition des signes cliniques de la maladie de Parkinson et d’évaluer l’effet du vecteur thérapeutique sur la maladie, un suivi précis des animaux sera mis en place à + 2 mois post-opératoire, âge à partir duquel les premiers signes cliniques de la maladie de Parkinson devraient apparaître : mise en place de tests de comportement tous les 2 mois afin de suivre une éventuelle modification du comportement de l’animal et le développement de déficits moteurs. Les souris seront habituées progressivement aux protocoles comportementaux et aux examinateurs. Cela permettra d’avoir un suivi régulier et proche des animaux. Enfin, nous assurerons le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation en limitant leur angoisse grâce au suivi des conditions d’hébergement, et d’utilisation de cages proposant un environnement riche.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’établissement d’un modèle original chez la souris de la maladie de Parkinson à un stade avancé permettra des études des mécanismes de la maladie et permettra également de tester des traitements ; - l’existence de modèles souris de maladie peu sévère basés sur l’inoculation de fibrilles établit la faisabilité de notre projet ; - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer secondairement chez le primate ; - la petite taille du cerveau de souris est propice à la diffusion étendue des fibrilles, ainsi qu’à la diffusion du vecteur thérapeutique à partir de son point d’injection ; - la maitrise par notre équipe des tests moteurs chez la souris permet une étude fine des défauts neurologiques. Nous avons déjà testé des vecteurs comparables dans des souris modèles d’autres maladies. Nous utiliserons des souris âgées de 12 mois au moment de l’injection des fibrilles accompagnée ou non d’une injection de vecteur thérapeutique. Cela permettra de mimer l’âge avancé de la maladie humaine. Le comportement de ces souris sera étudié entre l’âge de 14 et 24 mois.
Evaluation de l’effet de trois doses de spironolactone sur un modèle d’excès de minéralocorticoïdes chez le chat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Pour déterminer la dose d'un médicament vétérinaire, la spironolactone, 15 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une hormone en intramusculaire puis le produit par voie orale, subit deux ponctions de vessie à l'aiguille sur animal éveillé à six heures d'intervalle, reste à jeun douze heures et passe vingt-quatre heures seul dans un box divisé en deux. Le porteur reconnaît que la contention et les ponctions peuvent provoquer du stress et de la douleur, et indique que les chats ont été entraînés deux semaines à s'y soumettre. Aucun n'est tué à l'issue, tous restant disponibles, après un temps de repos, pour une autre procédure expérimentale.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la spironolactone à trois doses différentes 0.6-3-et 6 mg/kg et de mesurer l'effet de ces doses sur le modèle d'excés de minéralocorticoïdes chez le chat. Ce modèle se traduit par un désordre dans les électrolytes sodium /potassium présents dans des échantillons d'urines aprés une administration d'aldostérone. Ce désordre d'électrolytes dans les échantillons d'urine sont également présents dans les pathologies cardiaques comme les cardiomyopathies. L'objectif est donc de montrer quelle est la dose de spironolactone qui convient le mieux pour retrouver le niveau basal au niveau des électrolytes sodium/ potassium avant l'administration d'aldostérone chez le chat.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est de pouvoir démontrer quelle est la meilleure dose de spironolactone à administrer (faible, moyenne ou forte dose) pour pouvoir retourner au niveau basal sur le modèle d'excès en minéralocorticoïdes chez le chat. Cela permettra de conduire des études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le traitement de certaines maladies cardiaques chez le chat.
Procédures
Les nuisances ou effets indésirables attendus: - Les animaux seront hébergés en conditions individuelles pendant une durée d'environ 24 heures. Alimentation et recueils d'urine par miction spontanée en condition individuelle. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. - Les animaux auront 2 prélèvements d'urine par cystocentèse espacés de 6h. Ces prélèvements se feront sur animal vigile, par un vétérinaire expert. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute. Les animaux auront un entraînement à la contention pendant au moins deux semaines avant le début de ce projet. - Les animaux seront mis à jeun 12h avant la première cystocentèse. Distribution d'1/3 de la ration alimentaire 1h avant et le restant distribué 6h aprés. Les animaux auront également un entraînement de 2 semaines avant le début de ce projet. Administrations intramusculaire et orale : Soit 2 administrations au maximum par animal et par période. Durée d'une administration de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus : - Les animaux seront hébergés en conditions individuelles pendant une durée de 24 heures au maximum. Cela peut engendrer un stress pour l'animal. - Deux recueils d'urine par cystocentèse échoguidée seront réalisés par animal : cela peut engendrer du stress pour l'animal liée à la contention, peut être aussi de la douleur. Les animaux seront soumis à l'administration d'une hormone, il s'agit d'une administration intramusculaire. La contention manuelle de l'animal peut engendrer un stress et peut être une gène au niveau du site d'injection. La solution à trois concentrations différentes sera administrée par voie orale, la contention pourra également engendrée un stress pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de déterminer la meilleure dose de spironolactone qui permettra de revenir au niveau basal aprés un excés de minéralocorticoïdes chez le chat. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de mimer les désordres d'électrolytes dans l'excrétion urinaire il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble.
Réduction
D'un point de vue statistique et pour avoir des résultats scientifiques interprétables , 3 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour conduire des analyses statistiques. D'un point de vue scientifique et réglementaire il est necessaire d'avoir 5 groupes d'animaux, un groupe animaux contrôle négatif, un groupe contôle positif, puis une faible, moyenne et forte dose pour la spironolactone. Pas de test statistique réalisé au préalable
Raffinement
Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3 pendant la periode d'acclimatation de 14 jours. Puis les animaux seront en condition d'hébergement individuel aprés chaque administration pour chaque période pour une durée maximale de 24h. L'herbergement en individuel se fait dans le même box, seule une séparation est placée pour séparer le box en 2. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin, corde) sera présent dans chaque box autant que possible. Les animaux devront manger 1/3 de la ration alimentaire journalière dans l'heure qui précède la cystocyntèse. Les animaux auront un entraînement durant les 2 semaines précédentes. Un entraînement des animaux est également prévu pour la contention, pour faire les prélèvements d'urine par cystocentèse. L'entraînement se fera durant les 2 semaines précédentes. Les prélèvements d'urine par cystocentèse seront échoguidés et réalisés via l'utilisation d'un doggy relax (gouttière en mousse). Si un animal présente une douleur au moment du recueil d’urine par cystocentèse, une douleur abdominale, ou un signe d’inconfort alors l’animal sera pris en charge par les vétérinaires du site. Les animaux seront observés a minima quotidiennement. Les analgésiques, anesthésiques, anti inflammatoires, antibiotiques sont à disposition des vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Le chat est l’espèce cible pour ce produit vétérinaire Pour ce projet il est nécessaire d'avoir des chats adultes pour avoir des reins matures et fonctionnels.
Evaluation de l’effet bénéfique de myokines sur les îlots pancréatiques de Rat post isolement.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tués pour que leur pancréas soit prélevé, 2 400 rats vont être utilisés comme source d'îlots pancréatiques, opérés sous anesthésie et jamais réveillés. L'intervention dure cinq minutes et comporte un risque hémorragique lors du cathétérisme du canal cholédoque, les animaux étant habitués à la contention une minute par jour la semaine précédente. Le laboratoire cherche des îlots frais pour y tester des myokines, ces facteurs sécrétés par le muscle dont l'un, déjà breveté, a montré un effet sur la survie des cellules à insuline. Le porteur explique que les îlots humains sont difficiles à obtenir parce qu'ils vont en priorité aux greffes de patients diabétiques, et que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas au glucose, d'où un recours aux rats qu'il juge "indispensable".
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique grave qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (hormone hypoglycémiante), ou lorsque les organes cibles de l’insuline ne sont pas capable de l’utiliser correctement pour stocker et/ou utiliser le sucre. Il en résulte alors une augmentation du sucre dans le sang, c’est l’hyperglycémie. Un diabète non maîtrisé, peut, au fil du temps, provoquer de graves lésions cardiaques, vasculaires, oculaires, rénales et nerveuses. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme afin de stocker le glucose circulant. De plus, le muscle squelettique est un organe qui peut sécréter de multiples facteurs, appelés myokines, pouvant avoir un impact favorable ou défavorable sur le fonctionnement des organes/tissus. En effet, nous avons mis en évidence une nouvelle voie de communication entre le muscle squelettique et le pancréas qui est susceptible de contribuer au bon fonctionnement des cellules à insuline et à la prévention du diabète. Lors d'études antérieures menées sur cellules musculaires saines et diabétiques, un ensemble de myokines sécrété par le muscle a été identifié et pourrait constituer des molécules d'intérêts pour traiter le diabète. L'une d'entre elles, IL-V001, a démontré son efficacité et un brevet est déposé. Ainsi, les autres myokines identifiées pourraient constituer les traitements de demain pour le patient diabétique et doivent être étudiées. L'objectif de cette demande est de déterminer l’effet des myokines identifiées sur le fonctionnement des îlots pancréatiques contenant, notamment, les cellules à insuline et d'étudier les mécanismes impliqués. Cette étude sera réalisée sur 5 ans et au maximum 2 myokines seront étudiées par an.
Bénéfices attendus
Nous avons démontré que les myokines constituaient des facteurs thérapeutiques d'intérêt pour traiter le diabète. Plus particulièrement, nous avons montré qu'IL-V001 (breveté), une myokine sécrétée par le triceps, améliorait la survie et la fonction des cellules β et des îlots pancréatiques in vitro mais également in vivo dans le cadre d'une transplantation intraportale d'îlots chez le rat rendu diabétique. Ainsi, l'étude des autres myokines également identifiées avec ILV-001, permettrait de sélectionner d'autres candidats thérapeutiques du diabète pouvant avoir des effets bénéfiques sur les îlots pancréatiques.
Procédures
Seul une chirurgie sans réveil (prélèvement de pancréas) d'une durée de 5 min sera réalisée sur animal sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont: - Stress lors de la prise en main de l'animal. - Risque hémorragique lors de la cathétérisation du canal cholédoque. - Stress et douleur légers de courte durée pour injection intrapéritonéale et sous-cutanées d’anesthésiques/analgésiques. - Hypothermie due à l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour la collecte des îlots pancréatiques afin de tester nos molécules et analyser les résultats obtenus.
Remplacement
L’îlot pancréatique est la source première de toute étude concernant la thématique du diabète. Par ailleurs, au vu de la pénurie d’organe, il est, à ce jour, difficile de travailler sur les îlots humains, qui sont prioritairement utilisé pour les greffes de patients diabétiques (îlots ou pancréas entier). Enfin, les lignées cellulaires connues aujourd'hui (Rinm5F, INS-1, Min-6), ne répondent pas à une stimulation au glucose en terme de sécrétion d'insuline. Ainsi, le recours à des îlots pancréatiques, et donc à des animaux, est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et sur notre longue expérience obtenue au cours des nombreuses études in vitro réalisées sur les cultures primaire d’îlots pancréatique. Cette étude nécessitera 2400 rats.
Raffinement
Le raffinement intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites (En accord avec le responsable de la mise en oeuvre du projet et la SBEA). En accord avec cette grille, des points limites prédictifs ont été déterminé afin de soustraire les animaux de la procédure expérimentale prévue. La semaine avant le début des expérimentations, les animaux seront habitués à la contention pendant 1 min tous les jours. Enfin, le prélèvement de pancréas sera réalisé sous anesthésie / analgésie profonde.
Choix des espèces
Le rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses études sur le diabète. Les rats employés pour ces études seront de souche Wistar, Sprague Dawley (souche non consanguine) ou Lewis (souche consanguine) classiquement utilisées pour les études menées sur l'îlot pancréatique. Ils ont été préférés aux souris à cause de leur taille qui permet une aisance de manipulations et facilite les interventions chirurgicales. Par ailleurs, l’ensemble des protocoles réalisés jusqu’à présent au laboratoire nous ont permis de caractériser, de comprendre et de maîtriser ce modèle et sa physiopathologie. Les rats seront utilisés à un stade jeune adulte âgés de 8 semaines. Ce choix est justifié d’un point de vue anatomique, puisque c’est à partir de cet âge que le canal cholédoque possède une taille suffisamment grande pour réaliser facilement la cathéterisation permettant l’injection de l’enzyme utilisée pour la digestion du pancréas. Cela permettra d’obtenir un rendement d’isolement optimal. Les rats seront utilisés à un stade jeune adulte âgés de 8 semaines. Ce choix est justifié d’un point de vue anatomique, puisque c’est à partir de cet âge que le canal cholédoque possède une taille suffisamment grande pour réaliser facilement la cathéterisation permettant l’injection de l’enzyme utilisée pour la digestion du pancréas. Cela permettra d’obtenir un rendement d’isolement optimal.
Évaluation de l’intérêt thérapeutique de vecteurs AAV codant pour des cytokines d’intérêt dans le domaine des cancers
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe de cellules tumorales, des injections de vecteurs viraux dans la tumeur et deux prélèvements de sang sous anesthésie, la taille de la tumeur étant mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les cellules injectées peuvent former des métastases, entraîner une perte de poids importante et dégrader l'état général, et que les vecteurs peuvent déclencher une inflammation générale. Sur le remplacement, il affirme que seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre cellules immunitaires et cellules tumorales, et qu'une nouvelle approche thérapeutique "ne peut se faire que chez l'animal".
Objectifs
L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients ayant ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie beaucoup selon les cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il apparait que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies doivent être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. On sait que l’efficacité d’une réponse inflammatoire dépend de la qualité et de la quantité de médiateurs inflammatoires tels que cytokines et chimiokines produites dans le microenvironnement tumoral (MET). Dans ce contexte, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semblent un outil idéalement adapté à des approches de vaccination/immunothérapie. L'objectif du projet est d’utiliser de nouveaux AAV codant pour des cytokines d’intérêt afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Nous avons développé des AAV codant pour l’une des 4 cytokines murines suivantes : IL-12sc (protéine de fusion entre les sous-unités IL-12p40 et IL-12p35) qui module l’activité des lymphocytes T et cellules NK, IFN-α ayant des activités anti-tumorales, GM-CSF (facteur stimulant granulocytes et macrophages) et IL-15sushi (protéine de fusion entre le domaine sushi de la chaine α du récepteur à l’IL-15 avec la cytokine IL-15) dont le rôle anti-tumoral est établi. Nous pensons que l’injection intra-tumorale des AAV codant pour une cytokine donnée ou plusieurs (combinaison d’AAV codant pour des cytokines différentes ou un AAV codant pour plusieurs cytokines à la fois) entrainera une production locale et aiguë de ces cytokines favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires dans le MET, ce qui permettra de générer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace permettant une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet de la tumeur. Nous envisageons également de combiner cette stratégie thérapeutique avec 1) les immunothérapies utilisant des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (CTLA-4 et PD-1/PDL1) et 2) avec des AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique (ou mort cellulaire inflammatoire capable d'induire la stimulation du système immunitaire).
Bénéfices attendus
L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénéficiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codant pour les différentes cytokines (IL-12sc, IFN-α, GM-CSF et IL-15sushi), induise une réponse immunitaire permettant un rejet de la croissance tumorale et l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codant pour ces différentes cytokines seule, mais aussi en combinaison avec d’autres immunothérapies déjà bien connues (tels qu’un anti-PD1, anti PD-L1 ou anti-CTLA-4) et/ou en cours de développement dans le laboratoire (l’utilisation d’AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique et de permettre l’initiation d’une réponse immunitaire antitumorale), aura pour but : (1) d’apporter des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire amplifiée et (2) de permettre le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. Les vecteurs AAVs possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux Etats-Unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme, si nos stratégies se montrent convaincantes.
Procédures
- Prélevements de sang sur souris anesthésiées : 2 prélevements par souris à 10 jours d'intervalle, 15 secondes - Injections de cellules tumorales et de vecteurs AAV sur souris anesthésiées, 10 secondes - Mesures de la taille de la tumeur au pied à coulisse sur souris vigile, 45 secondes
Impact sur les animaux
Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet écueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenté dans la littérature, minimisant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent aussi induire une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV pourrait induire une inflammation systémique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant, nous limitons cet effet secondaire par une injection intra-tumorale avec un volume d'injection limité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse. Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.
Remplacement
Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, de la buprénorphine sera administrée (0,05 mg/kg). Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressants dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début du protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.
Comparaison des effets anti-leucémiques des cellules CAR-iNKT versus CAR-T dans un modèle de leucémie aigue myéloïde EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Irradiées sur tout le corps à 2 Gy, 166 souris au système immunitaire déficient reçoivent des cellules leucémiques humaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sans anesthésie une ou deux injections dans la veine, une injection dans l'abdomen chaque semaine et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang, puis sont toutes tuées au plus tard 80 jours après les injections, plus tôt si un point limite est atteint. L'équipe compare deux types de lymphocytes équipés d'un récepteur qui cible la tumeur, les CAR-iNKT et les CAR-T, contre la leucémie aiguë myéloïde. Les effets néfastes déclarés se limitent à la piqûre, présentée comme une douleur légère de courte durée, et à la leucémie, qui réduit l'activité des souris, les fait maigrir et peut former de petites tumeurs dans l'abdomen. L'irradiation n'y figure pas.
Objectifs
Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.
Procédures
-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.
Impact sur les animaux
La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.
Devenir
Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.
Choix des espèces
La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.
Evaluation des biomatériaux pour la réparation de tissu cardiaque dans un modèle d’infarctus chez le rat 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Le thorax ouvert et une artère coronaire ligaturée pour provoquer un infarctus, puis rouverts une semaine plus tard par le sternum pour qu'un patch soit collé sur la zone lésée, 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chaque opération dure trente à quarante minutes, les prises de sang s'échelonnent aux jours 1, 7, 30, 60 et 90, les échographies aux jours 5, 30, 60 et 90, chacune sous anesthésie. Le projet évalue un biomatériau censé imiter la matrice extracellulaire cardiaque, faute de traitement curatif de l'insuffisance cardiaque. Le porteur présente des interventions menées sous anesthésie "pour le confort des animaux" et annonce par ailleurs une mortalité post-opératoire de 30 %.
Objectifs
L'ischémie cardiaque, un problème où le coeur manque d'oxygène, est la principale cause de décès dans le monde depuis deux décennies. Ce manque d'oxygène entraîne des dommages au coeur, conduisant à une maladie chronique appelée insuffisance cardiaque. Récemment, des scientifiques et des médecins se sont intéressés à des thérapies alternatives basées sur l'ingénierie tissulaire pour réparer le coeur. Une méthode récente qui a attiré l'attention des chercheurs et des médecins est l'utilisation d'une structure appelée matrice extracellulaire native, obtenue à partir de tissus dépourvus de cellules. Cependant, cela présente des défis tels que le manque de donneurs, le risque d'infection, et des déséquilibres chimiques et physiques qui peuvent affecter les tissus et les cellules. Dans ce contexte, notre équipe de recherche vise à développer un biomatériau imitant les caractéristiques de la matrice extracellulaire cardiaque pour être utilisé comme une sorte de "squelette" actif dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. Notre idée est de combiner différents matériaux dans un patch cardiaque unique, avec des propriétés physiques et chimiques contrôlées, ainsi que la matrice extracellulaire naturellement sécrétée contenant les éléments nécessaires à la réparation des tissus. Nous pensons que cette approche fournira un environnement optimal aux cellules cardiaques, favorisant ainsi la réparation du coeur après une ischémie cardiaque. Nous prévoyons de démontrer l'efficacité de ce patch en évaluant la réparation cardiaque chez le rat, en analysant les tissus grâce à des techniques d'imagerie médicale et de mesure morphologique après l'implantation du patch dans un modèle chirurgical simulant l'ischémie cardiaque.
Bénéfices attendus
Aujourd'hui, il n'existe malheureusement aucun traitement curatif pour l'insuffisance cardiaque causée par des lésions chroniques du coeur. Les solutions actuelles se concentrent principalement sur le soulagement des symptômes pour améliorer la qualité de vie des patients. De plus, ces traitements sont souvent associés à des effets indésirables. La transplantation cardiaque reste une option thérapeutique, mais elle est souvent réservée en dernier recours en raison de ses contraintes importantes. Heureusement, des avancées récentes ouvrent la voie à des thérapies alternatives pour traiter la perte de tissu cardiaque, en évitant la formation de cicatrices et le remodelage du coeur. Une approche prometteuse utilise ce qu'on appelle la matrice extracellulaire (MEC) native, obtenue par un processus de décellularisation des tissus. Cette MEC agit comme un matériau biologique pour réparer le coeur, et certains produits basés sur cette technologie sont déjà disponibles sur le marché. Les avantages de la MEC sont nombreux, car elle présente des propriétés physiques favorables et des composés qui régulent le comportement des cellules cardiaques et leur communication. Cependant, l'utilisation de MEC d'origine animale a ses limites, notamment en raison du nombre restreint de donneurs, des risques d'infection et des différences physiques et chimiques qui peuvent affecter la physiologie des tissus et des cellules. Notre projet innovant vise à créer un patch cardiaque qui offre un environnement propice aux cellules cardiaques, permettant ainsi une amélioration de la fonction cardiaque après un épisode d'ischémie. Cette avancée pourrait représenter une percée majeure dans le traitement de l'ischémie cardiaque, offrant de nouvelles perspectives d'amélioration de la santé cardiaque.
Procédures
Des animaux participeront à une étude simulant une crise cardiaque. Tout d'abord, ils seront traités avec des antidouleurs et placés sous anesthésie et seront ventilés mécaniquement, puis une incision sera pratiquée sur le côté de leur poitrine. En utilisant un fil spécial, une ligature sera placée autour d'une artère importante du coeur pour provoquer une crise cardiaque simulée. Cette procédure durera entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie pour le confort des animaux. Une semaine plus tard, ces mêmes animaux recevront un traitement sous forme d'un patch cardiaque. Encore une fois, ils seront ils seront traités avec des anti-douleurs et placés sous anesthésie et respiration assistée, puis une petite incision sera faite au niveau de la poitrine (sternum) pour exposer la zone du coeur touchée. Le patch sera fixé à cette zone à l'aide d'une colle médicale. Cette intervention durera également entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie. Pour évaluer l'efficacité des traitements, des prises de sang seront effectuées aux jours 1, 7, 30, 60 et 90 pour examiner les changements dans leur santé (durée de l'intervention: 5 minutes). Des images du coeur seront également prises aux jours 5, 30, 60 et 90 à l'aide d'une échographie cardiaque, le tout sous anesthésie (durée de l'intervention: 10 minutes). À la fin de l’étude, une perfusion sera réalisée sous anesthésie, sans que les animaux se réveillent, pour évaluer le fonctionnement du coeur. Ces évaluations permettront de suivre la récupération du coeur après les différentes interventions.
Impact sur les animaux
Induction de l'ischémie cardiaque, une procédure simulant une crise cardiaque, sera réalisée en pratiquant une incision sur le côté gauche de la poitrine et en ligaturant une artère importante du coeur. Les animaux ressentiront une douleur post-opératoire modérée. Des prélèvements sanguins seront effectués aux jours 1, 7, 30, 60 et 90, avec une douleur modérée. L'implantation du patch cardiaque, réalisée par une incision sur le thorax, peut entraîner une douleur post-opératoire. La mortalité post-opératoire après induction de l'ischémie cardiaque et implantation du patch cardiaque est de 30 %. Les animaux peuvent ressentir du stress en raison des anesthésies répétées. Il y a également un risque d'infection au niveau des sutures et un risque de cicatrisation déficiente.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés après 7, 30, 60 ou 90 jours suivant l'implantation du patch. Cette mesure sera prise dans le but d'analyser les tissus du coeur, en évaluant des aspects tels que la présence de cicatrices, le nombre de cellules, leur multiplication, l'intégration du patch, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et les changements dans la matrice extracellulaire. Ces informations nous aideront à mieux comprendre l'efficacité du traitement et son impact sur la récupération du coeur.
Remplacement
Actuellement, il n'est pas possible de reproduire avec précision l'action des patchs cardiaques dans un tissu cardiaque en laboratoire ou par simulation informatique. Il n'existe pas de modèle fiable, que ce soit in vitro (dans une boîte de culture) ou in silico (simulation numérique), pour imiter une crise cardiaque. De nombreuses études scientifiques se basent sur des modèles expérimentaux d'ischémie cardiaque chez le rat, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie chez l'homme. Pour étudier les changements au niveau cellulaire, des analyses des tissus sont nécessaires, impliquant malheureusement l'euthanasie des animaux. Cependant, au cours des deux dernières années, des expériences ont été menées in silico (modélisation 3D) et in vitro (culture de cellules cardiaques) au sein de notre unité. Ces travaux ont permis de réduire le nombre de biomatériaux à tester in vivo (dans des organismes vivants) et d'établir un processus de fabrication robuste des patchs cardiaques. Ces avancées sont essentielles pour mieux comprendre et traiter les problèmes cardiaques dans le futur.
Réduction
Nous utilisons des méthodes d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, qui nous permettent de suivre les changements chez les mêmes animaux au fil du temps. De plus, nous avons effectué des calculs statistiques pour déterminer le nombre optimal d'animaux nécessaires à nos études, visant à obtenir des résultats significatifs sans avoir à utiliser un grand nombre d'animaux. Ces calculs ont été réalisés à l'aide d'un test spécifique, et pour détecter une différence significative entre les groupes d'étude et les groupes témoins. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés pour garantir la fiabilité de nos conclusions.
Raffinement
Nous nous assurons que les conditions de vie des animaux sont optimales. Ils sont placés en petits groupes de trois dans des cages et nous enrichissons leur environnement. Nous respectons également leur rythme jour-nuit et leur accordons le temps nécessaire pour s'acclimater avant toute procédure. Nous avons mis en place des normes strictes pour garantir le bien-être des animaux. Nous utilisons des techniques d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, et nous recourons à l'anesthésie et à des analgésiques pour toutes les procédures afin de minimiser tout inconfort. Les animaux seront surveillés quotidiennement, avec un suivi clinique réalisé chaque jour pendant la première semaine, puis deux fois par semaine par la suite. Cette surveillance sera effectuée en se basant sur une grille spécifique permettant d'identifier précocement les signes de douleur. En fonction de l'état des animaux, des mesures seront prises pour minimiser la douleur au maximum. Cela peut inclure l'application de soins locaux au site opératoire, l'administration d'analgésiques, et dans les cas de souffrance sévère, l'euthanasie sera envisagée pour mettre fin à la douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi avec soin le modèle animal pour nos recherches, en optant pour des rats, une sélection basée sur les publications scientifiques les plus pertinentes dans le domaine. L’implantation de patchs cardiaques et le modèle d’ischémie cardiaque chez le rat ont été décrites dans de nombreuses publications internationales de prestige. Les dimensions du coeur du rat permettent l’induction de l’ischémie, l'implantation du patch et l'analyse en imagerie. Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des ischémies cardiaques est relativement âgée. Les animaux seront utilisés à 9 semaines de vie ce qui correspond à un stade adulte.
Rôle du microenvironnement dans les pathologies inflammatoires et intestinales
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatorze jours, deux prises de sang et une injection dans le sinus rétro-orbitaire avant la mise à mort : 4 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 600 d'entre elles et modéré pour 3 480. Le projet porte sur les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et sur les cancers qu'elles favorisent. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue s'agissant de la faim, de la soif, de la peur, de la détresse, de la douleur ou de la maladie, puis énumère les effets possibles, poils hérissés, difficultés à s'alimenter, perte de poids, sang dans les selles, prostration, gêne respiratoire, difficulté à se déplacer et inflammation péri-anale. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées du fait de la pathologie chronique qu'on leur a provoquée.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies intestinales chroniques. Malgré le succès de certains traitements, les maladies chroniques inflammatoires intestinales restent encore aujourd’hui très fréquentes et peu soignables, par exemple la maladie de Crohn et les rectocolites inflammatoires. Ce terrain inflammatoire peut également favoriser le développement des cancers intestinaux. Ces pathologies ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de certaines pathologies et le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux pathologies intestinales inflammatoires et tumorales. Notre étude permettra de mieux comprendre les processus impliqués, dans le but de proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des maladies chroniques intestinales.
Procédures
Prélèvement sanguin : quelques secondes, 2 fois pendant la procédure à une semaine d’intervalle Injections péritonéales : quelques secondes, 1 fois /jour pendant la période analysée (max 14 jours) Injections dans le sinus rétro-orbitaire : quelques secondes (1 fois avant mise à mort sur souris anesthésiée)
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu de nuisances ou effets indésirables concernant les libertés individuelles de l’animal concernant la faim/soif, peur/détresse, stress physique/thermique, douleur/lésion/maladie, environnement (stabulation). L’impact sur les animaux pourra se traduire par des poils hérissés, des problèmes d’alimentation, une perte de poids, du sang dans les selles, une prostration, une difficulté de respiration, une difficulté de mobilité, ou une inflammation locale péri-anale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des répercussions sur leur bien-être si pas de mise à mort.
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement intestinal, y compris les cellules immunitaires, endothéliales, et épithéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Afin de limiter l’inconfort, nous pratiquerons des méthodes de raffinement en mettant en place des points limites spécifiques et précoces selon la procédure, chauffer les cages si besoin lors d’analgésie, renforcer l’enrichissement des cages, et assurer un traitement adéquat d’analgésie selon les procédures appliquées et points limites établis.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies intestinales car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans l’inflammation chronique et sont semblables dans les pathologies intestinales humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux au moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 4 à 30 semaines car nous étudierons ces pathologies dans le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte