Recherche appliquée

Le développement de médicaments vétérinaires génériques passe ici par 200 chiens, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et remis ensuite à disposition pour d'autres protocoles. Chaque étude leur impose 12 à 30 prélèvements sanguins, avec jusqu'à 14 en 24 heures, des administrations réglées sur la posologie du fabricant, et 3 à 6 prélèvements d'urine par ponction de la vessie sous échographie, l'animal n'étant qu'anesthésié localement. Les chiens sont mis à jeun jusqu'à seize heures avant l'administration pour standardiser l'absorption. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour ce type de test et présente le passage par l'espèce cible comme une "étape obligatoire" pour la mise sur le marché du générique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouvelles formulations vétérinaires chez le chien et de comparer cette cinétique à des produits déjà commercialisés dans le cadre de développement de génériques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de médicaments vétérinaires génériques permettant de pallier à la rupture de stock de certains produits.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la cinétique (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement d’urine par cystocentèse échoguidée sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la cinétique.

Impact sur les animaux

Aucune réaction sévère n’est attendue, le principe actif étant déjà commercialisé, les éventuels effets secondaires sont déjà connus. Les nuisances attendues liées aux prélèvements des animaux sont celles liées au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du générique doit être comparée avec celle du produit de référence afin d’être commercialisé avec le même champs d’action. L’étude sur l’espèce cible est donc une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché du générique vétérinaire.

Réduction

Le nombre d'animaux sera justifié par le Donneur d’Ordre dans le protocole de chaque étude. Il sera basé sur le nombre nécessaire pour avoir la plus grande amplitude de variabilité et/ou de différence dans les moyennes des résultats. Lorsque le risque d’exclusion d’animaux est élevé (perte de produit à l’administration ou vomissement), des animaux supplémentaires pourront être inclus afin de maintenir une puissance statistique appropriée et ne pas avoir à renouveler l’étude. Le nombre d’animaux sera minimisé grâce au cross-over mis en place après un temps de repos suffisant. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude pourra être réduit par la conduite d’étude exploratoire préliminaire permettant d’évaluer la variabilité des résultats inter-individus, et donc d’ajuster au mieux le nombre d’animaux à inclure pour obtenir des résultats interprétables. Ce projet incluant 200 animaux permettra de réaliser 1 à 2 études par an.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à de l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les conditions d’alimentation des animaux seront standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront le bien-être des animaux en fonction de la voie d’administration. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique sévère chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du générique doit être comparé à celle du médicament de référence pour le bon développement du nouveau générique. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens d'âge correspondant à celui indiqué pour le traitement.

Une injection intrapéritonéale de quelques secondes, avec la souche RH de Toxoplasma gondii, dix souris par semaine. 2 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exploitées comme culture vivante du parasite. Les toxoplasmes ainsi multipliés alimentent un test de lyse employé par un laboratoire expert pour dater une infection chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Le porteur écrit que cette souche tue une souris en moins de quinze jours quels que soient le mode et la voie d'inoculation, et affirme dans le même temps que les animaux sont tués "bien avant que les points limites ne soient atteints".

Objectifs

La toxoplasmose est une maladie parasitaire humaine et animale cosmopolite due à Toxoplasma gondii. Généralement bénigne, elle peut être grave pour le foetus en cas d'infection de la mère pendant la grossesse et chez les patients immunodéprimés. Le diagnostic de l’infection toxoplasmique est donc essentiellement réalisé chez les femmes enceintes (dépistage systématique) et chez les nouveaux-nés en cas de suspicion de toxoplasmose congénitale. En effet, en France, il existe un programme officiel de prévention et de dépistage de la toxoplasmose congénitale. Le diagnostic est aussi pratiqué chez des sujets suspects de toxoplasmose oculaire ou présentant des signes cliniques pour la différencier d’autres infections, chez des sujets immunodéprimés (SIDA, transplantés d’organes solides, greffés de moelle osseuse ...), chez les patients en état de coma dépassé pour le don d’organes. La sérologie (recherche d’anticorps sécifiques dans le sérum des patients) représente la base du diagnostic de la toxoplasmose. De nombreuses techniques commerciales automatiées sont actuellement disponibles, cependant leur fiabilié est variable. Le biologiste est donc souvent confronté à des difficultés d’interprétation des résultats et dans ces cas une investigation complémentaire effectuée par un laboratoire expert est indispensable pour confirmer ou infirmer les résultats. Par exemple, chez la femme enceinte, c’est des conclusions de l’analyse sé́rologique que dé́coule toute la conduite à tenir à la fois chez la maman pendant la grossesse et chez le bébé après la naissance. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de maintenir la production de tachyzoîtes vivants de Toxoplasma gondii in vivo chez la souris dont nous avons besoin pour réaliser le test de Lyse des toxoplasmes qui reste la technique de référence et qui représente un outil diagnostique précieux, extrêmement sensible et spécifique, pour mesurer les taux d’anticorps de façon plus précise.

Bénéfices attendus

Les laboratoires polyvalents utilisent pour le diagnostic sérologique de la toxoplasmose des techniques dites de 1ère ligne dont la fiabilité est très variable. Ainsi, pour les dossiers complexes, le biologiste fait appel à un laboratoire expert de la toxoplasmose qui dispose de techniques dites de confirmation et qui a l’expertise de l’interprétation des résultats. C’est dans ce contexte que nous réalisons le Test de Lyse des toxoplasmes qui associé à d’autres techniques diagnostiques complémentaires nous permet en général de conclure dès le premier sérum. Nous sommes ainsi capables de différencier une infection récente d’une infection ancienne (30% des femmes enceintes), de déterminer précisément la date de l’infection, de dépister une réactivation de la maladie chez l’immunodéprimé, de dépister une transmission passive d’anticorps par une transfusion, de confirmer l’immunité d’une patiente en cas de valeur limite ce qui permet d’éviter jusqu’à 10% des suivis de grossesse inutiles. La datation précise de la primoinfection chez la femme enceinte est indispensable puisqu’à partir de la 18ème semaine d’aménorrhée et au moins 4 semaines après la date supposée de la contamination, une amniocentèse sera pratiquée pour faire le diagnostic avant la naissance de la toxoplasmose congénitale. Un traitement précoce maternel antiparasitaire dans les 4 semaines suivant la contamination réduit le risque de lésions intracrâniennes. Le test de lyse est également utilisé pour le diagnostic après la naissance de la toxoplasmose congénitale, réalisé par la surveillance sérologique du nourrisson durant la première année de vie, en raison de sa grande sensibilité et du faible volume de sérum nécessaire pour sa réalisation. Dès que la toxoplasmose congénitale est prouvée, l’enfant est traité pendant 1 ans et suivi cliniquement jusqu’à l’adolescence. Chez l’immunodéprimé, un diagnostic précoce de réactivation ou de primo-infection est important car la maladie est constamment mortelle en l’absence de traitement adapté.

Procédures

Les animaux vigiles subissent une injection intrapéritonéale qui dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

L' injection intra-péritonéale peut engendrer une légère douleur au niveau du site d'injection. Les différentes contentions peuvent être source de stress pour les souris.

Devenir

La souche RH de type I de Toxoplasma gondii est caractérisée par une virulence importante chez la souris. Quels que soient le mode et la voie d’inoculation, une souris infectée par un parasite meurt en moins de 15 jours. C’est pourquoi, à l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés bien avant que les points limites ne soient atteints.

Remplacement

Le Test de Lyse réalisé́ à partir de tachyzoîtes cultivés in vitro n’offre pas les mêmes performances diagnostiques avec notamment une perte importante de sensibilité (faux négatifs). Ceci est en partie expliqué par une perte rapide de virulence de la souche entretenue in vitro et une diminution de la taille des tachyzoïtes lors du passage en culture cellulaire. Il n'existe donc pas à l'heure actuelle d'alternative à la méthode in vivo pour la production de toxoplasmes vivants. Nous ne sommes pas pour le moment en mesure de remplacer les expériences in vivo.

Réduction

Afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés, nous avons amélioré notre démarche diagnostique pour réserver le Test de Lyse aux seuls sérums pour lesquels il est jugé comme absolument indispensable à l’obtention de résultats fiables et à la prise en charge des patients. Le Test de Lyse ne sera donc réalisé qu’une seule fois par semaine. Nous avons alors optimisé le protocole d’entretien du parasite in vivo pour éviter toute répétition inutile et ainsi réduire le nombre d'animaux à 10 par semaine alors qu’il en fallait 15 lors de la précédente demande d'autorisation de projet.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte depuis leur naissance jusqu'à leur mort. Ils sont hébergés par groupe de 5 individus et jamais isolés dans des cages ventilées de manière à maîtriser l’environnement sanitaire. Leur environnement est enrichi avec des cabanes. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié et une grille de points limites adaptés sera mise en place. Si certains signes d’inconfort ou de souffrance apparaissent, les animaux bénéficieront d'une surveillance accrue, d'un enrichissement supplémentaire (nid végétal) et de nourriture humidifiée au sol et si leur état ne s'améliore pas au bout de 24h, ils seront mis à mort. Cependant si les étapes de la procédure et les temps de prélèvement sont respectés, les points limites ne seront que très rarement atteints.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour la culture de T. gondii. C'est en effet le plus petit mammifère utilisable en animalerie de classe 2 permettant le développement des tachyzoites. A noter que la souris est un hôte intermédiaire habituel de ce parasite. Les animaux sont utilisés au stade « jeunes adultes » entre 8 et 13 semaines pour avoir une taille compatible avec la manipulation expérimentale.

Une dent arrachée sous anesthésie générale, l'implant dentaire posé dans la foulée, trente minutes à une heure d'intervention, puis des semaines d'observation ponctuées de prises de sang et d'examens du site d'implantation sous anesthésie. 120 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur liste les suites possibles, douleur, perte d'appétit, gêne à la mastication, infections bactériennes et saignements du site opératoire, puis conclut qu'il n'est pas possible de maintenir les animaux en vie, les tissus autour de l'implant devant être prélevés pour histologie. Il rappelle que le rat ne remplit pas tous les critères recommandés pour ce type de test, hygiène orale et maturité squelettique, et que l'essai est commandé par un donneur d'ordre en vue d'une mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé d’implantologie et de chirurgie dentaire (exemple : implant, vis, ciment, ...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en chirurgie dentaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour l’extraction dentaire, puis l’implantation du dispositif à tester dans la foulée . Ces interventions peuvent durer de 30 minutes à 1h environ et ont lieu sous anesthésie générale et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non (

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont les suivants : -douleur et stress liés à la chirurgie. -perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -gêne à la mastication et la prise alimentaire pouvant entrainer une perte de poids à plus long terme -les infections bactériennes liées à la chirurgie. -les saignements au niveau du site opératoire.

Devenir

Pour répondre aux objectifs du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les tissus et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé dentaire. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou design d’étude le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et Aavant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (produit de nidification : coton), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (analgésie post-opératoire, désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée si nécessaire en cas de signes cliniques…). Les prises de sang peuvent être réalisées si nécessaire sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous anesthésie locale, ou encore sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie préalable, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle.

Choix des espèces

Il n’existe pas de modèle animal validé pour tester les dispositifs médicaux dentaires, mais les textes de référence recommandent l’utilisation d’animaux dont : -les mâchoires sont de taille adéquate pour permettre l’accès chirurgical et l’implantation du dispositif, -il existe la présence de dents opposées, -la maturité squelettique est atteinte, -l’hygiène orale peut être contrôlée, -l’alimentation est omnivore et qui présentent des mouvements de mastication. La littérature scientifique reporte l’utilisation du rat comme un modèle de choix dans l’évaluation préliminaire des dispositifs médicaux à visée dentaire. Cependant cette espèce ne remplit pas tous les critères citées plus haut tel que la maturité squelettique difficilement objectivable (pas de fermeture des plaques de croissance osseuse + non nécessaire selon la littérature) et hygiène orale difficile à contrôler. Néanmoins, l’espèce rat constitue un modèle de choix car certaines similarités physiologiques sont observées entre l’implantation chez l’humain et chez le rat (structure osseuse, mécanismes de cicatrisation…). Ainsi ce modèle permet d’ obtenir des données préliminaires et contribuer au développement d'interventions sûres et efficaces pour l'implantation dentaire chez l'Hommeutiles pour les étapes de développement du produit.

Une incision à la queue, puis le chronomètre jusqu'à l'arrêt du saignement, c'est la prestation vendue aux commanditaires de candidats médicaments. 240 souris et 260 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à l'issue du test ou plus tôt si le produit testé provoque des effets indésirables. Le test se déroule sous anesthésie et dure de quatre à soixante minutes, parfois précédé d'une chirurgie de pose de cathéter de vingt à quarante-cinq minutes, et les prises de sang peuvent atteindre cinq par jour chez la souris et huit chez le rat. Une partie des rongeurs est génétiquement modifiée pour reproduire l'hémophilie A, l'hémophilie B ou la maladie de Willebrand, le porteur ajoutant que les effets des produits ne sont pas prévisibles à l'ouverture du projet.

Objectifs

Le but de ce projet est de déterminer les capacités pro- ou anticoagulantes d'un candidat médicament par le test du temps de saignement à la queue chez le rongeur. Ce test constitue un outil pour évaluer la fonction plaquettaire et l’efficacité de la coagulation après administration d'un candidat médicament chez le rongeur sain ou présentant un trouble de la coagulation sanguine. Avant ou après l’administration du candidat-médicament et éventuellement du véhicule qui a servi à préparer la formulation de la molécule testée, l'animal est anesthésié et analgésié et une incision est réalisée au niveau de la queue. L’écoulement du sang est observé jusqu’à son arrêt. Un cathéter intraveineux ou carotidien peut être placé sous anesthésie, pour administrer le produit ou prélever du sang avant et pendant le test du temps de saignement. Un ou des prélèvements sanguins pourront être réalisés avant ou après le test pour déterminer la concentration plasmatique du produit et/ou ses métabolites.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les pathologies de la coagulation, un éventail de pathologies humaines touchant près de 1 125 000 personnes dans le monde. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : une administration de produit par différentes voies, avec moins de 3 minutes par administration. Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal vigile ou anesthésié (environ 2 minutes par prélèvements). Ces expériences (administration et prélèvements de sang) pourront être réalisées sur animal vigile ou anesthésié, à raison de 5 prélèvements maximums par jour chez la souris et 8 chez le rat, en respectant un volume maximal de prélèvement dans la limite des volumes autorisés. Chirurgie d'implantation de cathéters (pour prélèvements et/ou administration) sous anesthésie et analgésie générale. Cette chirurgie durera environ 20-45min. Le test du temps de saignement à la queue sera réalisé sous anesthésie et analgésie générale (durée entre 4 et 60 min maximum) suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie pourra être éventuellement réalisé (durée entre 4 et 6 minutes).

Impact sur les animaux

Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint : pour d'éventuels prélèvements de sang, pour l'administration du composé à tester, et à chaque fois pour induire l'anesthésie avant la pose de cathéters et/ou le test du temps de saignement à la queue. Ces contentions peuvent donc engendrer un stress mineur à l'animal. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations et lors des prélèvements sanguins. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables font l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.

Devenir

Euthanasie des animaux à l'issue du test de temps de saignement de la queue et/ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pro ou anti-coagulants d’une nouvelle molécule sur l'homme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou des effets secondaires d'un candidat médicament. A ce jour, le rongeur est l'espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d'étude (temps de saignement).

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 10 / par groupe. Sur la période du projet ( 5 ans), il est prévu de réaliser entre 10 à 12 études avec les rongeurs.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole anesthésique adapté pour le test de saignement de la queue, • La mise en groupe des animaux

Choix des espèces

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Le rongeur est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets pro ou anti coagulante d'un candidat médicament, notamment par sa facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Les rongeurs génétiquement modifiés susceptibles d’être utilisés dans le test de temps de saignement reproduisent les caractéristiques des pathologies de la coagulation humaine (Hémophilie A, Hémophilie B, maladie de Willebrand) par inhibition ou mutation des gènes responsables de la production des facteurs de coagulation. Ces modèles sont utilisés pour tester l'efficacité de nouveaux traitements, comme l'administration de facteurs de coagulation recombinants ou les thérapies géniques visant à corriger le défaut génétique. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Pour humaniser leur foie, des souris d'une souche immunodéficiente, porteuse d'une mutation qui permet de faire mourir leurs propres cellules du foie, reçoivent des cellules hépatiques humaines. 7 850 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux injections d'un composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules ou d'implants, des candidats médicaments administrés par voie pulmonaire, digestive, cutanée, tumorale ou par injection, des prises de sang, et parfois des jeûnes jusqu'à 12 heures par semaine. L'effectif permet par exemple 80 études de 50 souris, l'humanisation ne réussissant que chez la moitié des souris environ, et le porteur indique l'avoir fixé en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial". 200 souris sont déclarées réutilisées dans une formation interne aux gestes techniques, sous réserve d'un avis vétérinaire favorable, et les 7 650 autres sont tuées, le porteur estimant qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.

Procédures

1 ou 2 injections(s) de composé induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, la greffe des cellules, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 7850 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 80 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 50 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 45 souris pour l’évaluation de l’efficacité du patch.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Pour tester sur la peau des molécules dont l'établissement dit ignorer la composition, celles de ses clients, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis les produits sont appliqués une ou deux fois par jour pendant seize jours. Huit mesures d'épaisseur de peau au pied à coulisse ou par imagerie, et une prise de sang hebdomadaire sous anesthésie gazeuse, complètent le protocole. Les points limites retenus donnent la mesure des atteintes possibles, perte de plus de 20 % du poids sur 72 heures, hypothermie persistante, plaie nécrosée ou purulente, arrêt de l'alimentation pendant 24 à 48 heures.

Objectifs

La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.

Procédures

Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).

Impact sur les animaux

L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.

Remplacement

L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'escipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.