Recherche appliquée

900 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à 33 tests de comportement, 112 administrations du composé et 108 prélèvements de sang sur neuf semaines. Le modèle d'Alzheimer est installé par une intervention chirurgicale de vingt à trente minutes, et l'un des tests, dit d'évitement passif, repose sur l'application de chocs électriques. Ces quinze études réparties sur cinq ans doivent servir à trier des molécules et à mesurer la capacité du modèle à prédire ce qui se passera chez l'être humain. Aucun rat ne sortira vivant, une partie étant tuée pour les prélèvements, l'autre parce qu'elle a reçu des substances dont les effets à long terme sont inconnus.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative qui entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions cognitives et notamment de la mémoire. Elle conduit à un état de démence qui est extrêmement destructeur pour les patients et leurs familles et qui représente un coût très élevé pour la société. Il n’existe à ce jour aucun traitement qui stoppe la progression de la maladie. Seuls 4 médicaments sont indiqués dans la maladie d’Alzheimer et ils traitent principalement les troubles de la mémoire. Les causes de la maladie demeurent mal connues et plusieurs hypothèses sont avancées par la communauté scientifique. La recherche actuelle vise à améliorer les connaissances fondamentales sur les désordres moléculaires et cellulaires conduisant à la maladie et aux démences apparentées, sur les causes et déterminants possibles de cette maladie, et sur cibles potentielles pour une intervention thérapeutique. Plusieurs modèles d’animaux transgéniques ou non sont actuellement à la disposition de la communauté scientifique, chacun présentant des avantages et des inconvénients. L’objectif de ce projet est de mettre en œuvre un de ces modèles pour tester des nouvelles molécules en développement.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter la maladie d’Alzheimer. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale (20-30 min) sous anesthésie, l’administration du composé à tester se fera sur animal vigile (sauf dans certains cas qui est faite sous anesthésie) pour une durée maximale de 9 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 33 tests de comportement (moins de 10 min chacun) sur animaux vigiles. En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 112 fois, la durée est de moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement mnésique, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 108 prélèvements sanguins sur la période de 9 semaines en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang durent 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, l’intervention chirurgicale peut induire une douleur transitoire, des signes d’inflammation, d’infection et une perte de poids. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Lors du test d’évitement passif, l’application de chocs électriques induit une réaction aversive et un stress. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des capacités cognitives nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 12 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 15 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en groupe pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous enrichissons leur milieu avec un tunnel en carton afin de leur permettre de se cacher et des boules de bois permettant les comportements de jeu et de grignotage. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Lors de l’opération la prise en charge de la douleur commence 30 minutes avant l’opération par l’administration d’un analgésique, puis les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse et ils auront un anesthésique local. Les animaux seront placés sur des tapis chauffés durant toute la chirurgie et pendant la phase de réveille. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques à nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 6 semaines et 200-250g au moment de la chirurgie). Ce choix est basé sur le fait que la pathologie est induite par chirurgie et ne dépend donc pas de l’âge des animaux. De plus les jeunes adultes supportent mieux les interventions chirurgicales, ce qui nous permet de réduire les risques liés à la chirurgie, de leur assurer une récupération plus rapide et de meilleure qualité.

Trois formulations de patchs brevetés vont être testées sur des plaies ouvertes creusées dans le dos de 40 rats, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est opéré sous anesthésie pour l'induction de la plaie, puis endormi de nouveau deux fois par semaine pendant trois semaines au maximum pour l'observation et le renouvellement du patch. Il est ensuite isolé en cage individuelle pendant toute la durée du protocole afin qu'aucun congénère ne lui arrache son pansement, avant un prélèvement de sang terminal et la mise à mort pour analyse de la peau et des organes. La rubrique consacrée à la réduction du nombre d'animaux reprend mot pour mot celle du remplacement, et l'effectif de 40 n'y est justifié nulle part.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France avec près de 500 000 patients concernés. Leur prise en charge induit des coûts importants, les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez le rat l’efficacité du traitement de plaies cutanées avec de nouveaux dispositifs médicaux sous forme de patchs. 3 formulations de patchs contenant chacun un principe actif favorisant la cicatrisation et combinant une activité anti-microbienne et anti-inflammatoire seront ainsi évalués. Des études effectuées sur modèles cellulaires et modèles de peau reconstruite ont permis de démontrer des activités pro-cicatrisante, anti-microbienne et anti-inflammatoire des principes actifs sélectionnés qui composeront les 3 formulations de patchs à évaluer. Ce projet constituera la toute première évaluation in vivo sur un modèle de plaie cutanée chez le rat des ces formulations de patchs "actifs", en comparaison avec une formulation de patch neutre, dépourvu de principe actif, et avec une matrice de référence utilisée pour le traitement de plaies cutanées chez l’Homme. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci, avec un renouvellement des patchs 2 fois par semaine. A l’issue de l’étude, des analyses biologiques seront effectuées sur le sang, la peau cicatrisée et des organes vitaux. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la formulation de patch ayant la meilleure efficacité pour en poursuivre son développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales, les ulcères du pied chez le diabétique… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux expérimentaux brevetés se présentant sous forme de patchs, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques et infectées ou non chez le rat sain et diabétique. Ces nouveaux dispositifs médicaux pourraient ainsi à terme, être utilisés chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 40 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis 6 heures après celle-ci, et si nécessaire 12 voire 24 heures après. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées 2 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète, sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. La cicatrisation complète sera obtenue en 3 semaines maximum pour l'ensemble des animaux. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines maximum, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement de couverture et surtout les patchs placés dans les plaies cutanées mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde après cicatrisation complète des plaies cutanées et avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Le renouvellement des traitements, effectué également sous anesthésie générale de courte durée, environ 10 minutes, n’engendrera quant à lui aucune douleur. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le le pansement de couverture et surtout les patchs placés dans les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes ouvertes, permettant à chaque rat de voir, sentir et entendre au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 40 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés par injection intrapéritonéale d’une surdose d’euthanasique effectuée sous analgésie préalable puis anesthésie profonde, et un prélèvement de peau au large de la région cicatrisée et d’un ensemble d’organes sera effectué pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, 2 à 3 semaines selon notre expérience du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, 2 à 3 semaines selon notre expérience du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors du renouvellement de chaque traitement. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine lors de chaque renouvellement de traitement et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des briques en bois et du papier kraft seront placés dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille et de celle des dispositifs médicaux qui vont être évalués, du modèle de plaie cutanée infectée validé chez le rat qui pourra être utilisé par la suite, et également en raison de sa facilité de manipulation. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8-9 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-10 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

576 souris sont opérées pendant une demi-heure pour se faire implanter des électrodes, puis enregistrées six heures par semaine pendant un mois afin de détecter leurs crises d'épilepsie. 1 728 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal ionique humain, elles peuvent présenter des déformations articulaires, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires, des troubles du sommeil, une constipation sévère et une léthargie qui gêne leur alimentation. Le porteur annonce que 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif pendant six mois, sans dire lesquels.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal calcique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.

Procédures

Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.

Devenir

L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.

Remplacement

Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal calcique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.

Raffinement

Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant des mois une eau contaminée au césium, reçoivent pour certaines un régime riche en lipides, subissent jusqu'à sept échocardiographies de trente minutes sous anesthésie, des jeûnes de douze heures en cage individuelle, et jusqu'à vingt minutes en tube de contention pour la mesure de leur radioactivité. L'objet est de chercher un seuil de dose à partir duquel apparaissent des atteintes des petits vaisseaux du cœur et du cerveau, en simulant l'exposition de personnes vivant sur un territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que ni le césium ni le régime gras n'entraînent "de douleur ni d'effet secondaire pour les animaux", alors que les 104 souris sont toutes déclarées en souffrance modérée.

Objectifs

L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une contamination interne chronique à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition interne unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), et permettra l’apport de nouvelles connaissances sur l’effet de faibles doses sur la microvascularisation cérébrale très peu étudié auparavant sur un modèle pré-clinique.

Procédures

Les animaux seront exposés en chronique à des faibles doses internes de rayonnements ionisants (Césium à une concentration de 500 KBq/L déjà utilisés dans des projets passés). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour les échocardiographies (10 animaux par lot soit 40 animaux), elles sont non invasives et effectuées sous anesthésie (au maximum 7 échographies par animal, durée maximale par échographie de 30 minutes). Pour les tests métaboliques (10 animaux par lot soit 40 animaux) : - 1 administration orale ou 1 administration intrapéritonéale selon le test, - 7 ou 8 prélèvements d’une goutte de sang à la queue (suffisant pour la mesure avec l’aide d’un glucomètre) sur animal vigile. Ce type de prélèvement dure 3 à 4 secondes. - ou 1 prélèvement de 75 microlitres de sang sous anesthésie Ces tests nécessitent une mise à jeun au préalable (avec eau à disposition) en hébergement individuel pendant maximum 12 heures. Pour les mesures de zooradiamétrie (10 animaux par lot soit 26 animaux), la mesure se fait sur animal vigile maintenu en tube à contention (temps maximum en tube à contention 20 min). L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.

Impact sur les animaux

L’exposition à de faibles concentrations de Césium dans l’eau de boissons (débit de dose 6µGy/h), de même que le régime gras (modérément riche en lipides) n’entrainent pas de douleur ni d’effet secondaire pour les animaux. Seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impacte pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids. Il peut exister un inconfort au point d’injection lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline et un stress lié à la contention des animaux lors de prélèvements de sang en vigile ou lors des mesures de zooradiamétrie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.

Réduction

Au total, 104 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 à 5 souris par cage) et l’isolement est évité. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids constituent un point limite.

Choix des espèces

Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature.

Les premiers essais de chirurgie se feront sur des souris récupérées à la sortie d'autres projets, pour que les expérimentateurs maîtrisent le geste avant de l'appliquer aux animaux dédiés. 1 320 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une stéréotaxie de 45 minutes pour recevoir des cellules de gliome directement dans le cerveau, puis jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie, six prélèvements sanguins sur animal vigile, des injections répétées de composés à tester, et une ponction intracardiaque terminale suivie d'une dislocation cervicale. Le porteur fixe le point limite à 20 % de perte de poids et une durée maximale de 100 jours, et annonce que 320 souris serviront à mettre au point huit modèles tumoraux avant même le début des tests d'efficacité.

Objectifs

Les différents types de gliomes sont des cancers au pronostique sombre qui touchent préférentiellement les enfants et adolescents (cancer pédiatrique). Le gliome a pour origine les cellules gliales du cerveau et est représenté par 3 types majeurs : l'astrocytome, l'épendynome et l’oligodendrogliome. Le glioblastome est une des formes agressives du gliome malin dérivant du sous- type astrocytome à un stade 4. Le gliome est un cancer localisé dans le cerveau ce qui confère une difficulté supplémentaire de part cette localisation pour l’accès des traitements à la zone malade. La thérapie du gliome/glioblastome repose sur une ablation chirurgicale aussi étendue que possible, une radiothérapie et, pour certaines tumeurs, une chimiothérapie. L'exérèse de la zone tumorale est rarement curative et nécessite de poursuivre la thérapie. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, les composés de recherche sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs humaines greffées sous la peau pour y déterminer leur activité et leur efficacité anti-tumorale vis-à-vis de la cible. Pour autant, la localisation des gliomes ajoute une complexité thérapeutique qui est de passer la barrière hématoencéphalique. En complément, un modèle orthotopique de greffe de cellule (différentes lignées de type gliomes ou glioblastomes) dans le cerveau sera induit par stéréotaxie de manière à complexifier le modèle d’étude et recréer une tumeur dans son site primaire. Cette localisation spécifique constitue une barrière physique aux traitements et permet aussi l’ajout du microenvironnement tumoral spécifique de ce type de tumeur. Ce projet sera réalisé avec différentes lignées tumorales rendues bioluminescentes (exprimant la luciférase) de manière à obtenir des modèles d’études pertinents et dont la croissance est compatible avec le suivi des traitements. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée sur ces différents modèles à l’aide d’un suivi par un système d’imagerie in vivo permettant de visualiser la bioluminescence appelé IVIS. La mise en place d’un ou plusieurs modèles orthotopiques de gliomes va permettre d’évaluer de manière plus pertinente des candidats médicaments pour ce type de tumeurs dont la localisation est un frein au progrès thérapeutique.

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques pour les pathologies du gliome et du glioblastomes sont réalisées sur de modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à ces pathologies qui sont localisées dans le cerveau. Notamment il existe une différence au niveau du microenvironnement tumoral mais également au niveau de la sélection des médicaments car sur des modèles sous cutanés il n’est pas possible de sélectionner la capacité des médicaments à passer la barrière hématoencéphalique et aller interagir avec la cible au site de la pathologie. En complément de ses modèles de routine néanmoins utile, la greffe de cellules tumorales de type gliomes/glioblastomes dans le cerveau de souris permet d’enrichir le microenvironnement tumoral, d’ajouter la barrière physique qu’est la barrière hématoencéphalique et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Il est bien décrit que le modèle orthoptique montre une bonne réponse aux traitements actuellement administrés aux patients que sont la chimiothérapie et la radiothérapie. L'objectif est de compléter les modèles existants qui seront gardés pour les premières phases de tests des produits (efficacités ou activité) et permettront de ne sélectionner que les produits prometteurs à tester sur ce modèle orthotopique. Le modèle orthotopique est essentiel pour évaluer l'activité et l'efficacité des produits candidats dans un contexte de passage de barrière hématoencéphalique. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Procédures

Intervention chirurgicale (stéréotaxie) sous anesthésie générale gazeuse et locale avec analgésie (45 min de la préparation de l’animal et fin de chirurgie) – 1 fois Imagerie IVIS sous anesthésie gazeuse (20min) – 1 fois par semaine jusqu’à 6 fois au cours de l’étude Prélèvement sanguin vigile (microsampling) jusqu’à 6 fois durant 2 min de contention et 30s de prélèvement Injection d’analgésie, anesthésique et de produit à tester en IP (intrapéritonéale), SC (sous-cutanée), PO (orale), IV (intravéneuse) vigile pouvant aller jusqu’à plusieurs jours consécutifs, durant 30s, 2 min pour IV Prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque sous anesthésie gazeuse, puis dislocation cervicale – 1 fois Prélèvement final (perfusion du cœur) sous anesthésie générale injectable (Ketamine Xylazine), analgésie – 1 fois

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur légère à modérée peut provenir lors : − Douleur modérée : de la phase chirurgicale (stéréotaxie)nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 30 minutes) et du suivi post-opératoire. - Douleur modérée : de la phase de pousse de la tumeur. Un suivi quotidien permettra de mettre en évidence l’éventuelle douleur et les points limites comme la perte de poids qui sera limitée à 20% maximum du poids de l’animal (100 jours maximum). − stress et douleur légère : de l’administration de composés testés réalisée par voie sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse ou per os. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. − stress et douleur légère : des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. − des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). - de l’anesthésie gazeuse pour l’évaluation de la taille de la tumeur par de l’imagerie (IVIS) d’une durée de 20 min hebdomadaire maximum. - des injections d’analgésiques lors du sacrifice de fin d’étude réalisées en SC, IP. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress.

Devenir

Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes (si d’intérêt pour analyse). Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique chez la souris de cellules tumorales de cellules de la glie. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau permettant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l'activité vivo un screen vitro sur BBB (Blood Brain Barrier dit barrière hématoencéphalique en français) test de passage de la barrière hématoencéphalique sera réalisé. Des campagnes d'environ 10 composés seront réalisés et les produits capables de passer la barrière seront sélectionner pour être testés vivo sur des modèles orthotopique pour vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. Cela permettra de diminuer le nombre de produits à tester in vivo.

Réduction

• Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la robustesse des designs de ces études à sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. • Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris non utilisées sorties d’autres études (issues d’autres projets) afin de maitriser le/les site et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur expérimenté à la chirurgie et à la stérotaxie afin de réduire le nombre d’animaux. Ensuite le second expérimentateur sera formé par le premier sur des animaux issus des 320 cités pour mise en place des 8 modèles (en plus des souris non utilisées sorties d'études). • De plus, afin d’inclure toutes les souris greffées nous utiliserons l’imagerie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure du développement de la tumeur sur la base d'un volume tumoral similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés au maximum sur 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.

Raffinement

•La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec à un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. •Les souris seront placées en hébergement seule après la chirurgie jusqu’au lendemain matin suivant la chirurgie (max 18h) afin de suivre individuellement leur récupération post chirurgie vis-à-vis du processus de nidification. •L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger (bâtonnet de bois), se réfugier (tube ou dôme) ou nidifier (cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. •Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique (comme la perte de poids et le dos vouté), le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement permet de mettre en évidence le changement de comportement à la suite du développement de la tumeur cérébrale. Pour certains modèles de glioblastomes les signes cliniques connu en plus de la perte de poids sont une démarche modifiée, la rotation ou l'inclinaison de la tête et des étapes de ralentissement des mouvements. Changements capturables par les cages connectés dont l’analyse des résultats permettra une meilleur documentation des modèles et des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans procéder à l’examen macroscopique de la tumeur en systématique. Les tumeurs sont mesurées par l’IVIS 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites Des prélèvements par microsampling peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations complémentaires comme le profil d’exposition plasmatique.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le cerveau chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souches utilisées seront des souris immunodéprimées présentant un phénotype dommageable pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

Corriger la fonte musculaire que provoque le sémaglutide, médicament anti-obésité déjà commercialisé, pour permettre de le prescrire plus longtemps : 58 souris mâles rendues obèses par douze semaines de régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit treize injections intrapéritonéales et quarante-deux injections sous-cutanées, subit trois prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures, deux tests de force des pattes avant et une session de tapis roulant de trente à quarante-cinq minutes. Le porteur note que l'obésité induite réduit déjà leur capacité de mouvement. Il justifie le passage par l'animal en invoquant une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier des premiers essais chez l'humain.

Objectifs

Le sémaglutide est utilisé comme médicament antidiabétique et anti-obésité. Son efficacité s'avère excellente, et son emploi relativement sûr. Cependant, outre la perte de masse grasse qu'ils induisent, les traitements chroniques à la sémaglutide sont également associés à une importante fonte musculaire, qui est considérée comme un effet indésirable. Le composé X a été initialement développé comme un médicament visant le muscle dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment sa capacité a compenser les effets délétères de la sémaglutide sur la masse musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris obèse.

Bénéfices attendus

La Sémaglutide est aujourd'hui autorisée et utilisée en tant que médicament anti-obésité et anti-diabétique. Néanmoins ce composé à pour inconvénient d'induire une perte de masse et de force musculaire lors de traitements prolongés, réduisant la possibilité de son utilisation sur des périodes prolongées. Le développement du composé X permettrait, en co-administration, de bloquer totalement ou partiellement cet effet délétère de la sémaglutide, autorisant son utilisation sur des périodes plus prolongées et ainsi, une meilleure prise en charge thérapeutique des troubles métaboliques chez l'humain.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (10 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de composés par voie intrapéritonéale (13 administration; durée : 1 minute); 3) Administrations de composés par voie sous-cutanée (42 administrations; durée : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Test de la force des pattes avant (2 tests, durée du test : 10 min); 7) Test d'exercice sur tapis roulant (1 session, Durée de la session : 30 à 45 min); 8) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les tests de la force des pattes avant et tests sur tapis roulant pourront également être source de stress et de fatigue pour les animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux, contre 12 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-3 souris / cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Ce modèle est sensible aux effets anti-obésité de la sémaglutide et présente également les effets secondaires de fonte musculaire observée chez l'humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, âgés de 18 semaines à la réception (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 12 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur afin d'induire le phénotype obèse.

Pour mettre au point un vaccin contre la grippe administré par le nez plutôt que par injection, 522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe leur administre du liquide dans le nez ou dans le pharynx sous anesthésie générale, deux à trois fois à dix jours d'intervalle, puis infecte une partie d'entre elles par plusieurs souches du virus grippal. Le porteur indique que ces administrations peuvent provoquer une gêne respiratoire temporaire et que l'infection peut faire perdre jusqu'à 15 % du poids. Une grille de score fixe le seuil au-delà duquel les souris sont tuées par anticipation, et toutes les autres le sont en fin de procédure pour prélever poumons et ganglions.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer un vaccin contre la grippe administré par voie respiratoire car cette voie induit une forte réponse immunitaire dans les poumons. La plupart des vaccins contre la grippe sont administrés par injection intramusculaire et vont induire une protection contre un nombre limité de souches du virus, car celles-ci évoluent d’une année sur l’autre. D’une part, ce projet analysera la capacité du vaccin à activer le système immunitaire et à induire une mémoire immunologique dans le nez et les poumons des souris vaccinées. D’autre part, ce projet étudiera la capacité du vaccin à protéger ces souris contre une ultérieure infection par plusieurs souches du virus de la grippe. La mise en place d’une mémoire immunologique lors d’une vaccination est un processus complexe qui nécessite l’utilisation d’un modèle souris pour son étude. La souris est un animal qui permet de modéliser de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine respiratoire par le virus de la grippe.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour vocation d’établir un vaccin contre la grippe qui sera administré par voie respiratoire (sans injection) pour induire une mémoire immunitaire au niveau des poumons et qui protégera contre différentes souches du virus de la grippe. Cette stratégie de vaccination pourrait également être utilisée pour la conception de nouveaux vaccins contre d’autres pathogènes respiratoires.

Procédures

Administration dans le nez sous anesthésie générale (2-3 min), 2 fois à 10 jours d’intervalle ou 3 fois pour les souris infectées. 1 prélèvement du sang sur souris vigile (1 min). Administration dans le pharynx sous anesthésie générale (5 min), 2 fois à 10 jours d’intervalle et 1 fois administration dans le nez sous anesthésie générale (2-3 min) pour les souris infectées. 1 prélèvement du sang sur souris vigile (1 min).

Impact sur les animaux

L’administration de liquide dans le nez ou dans le pharynx sous anesthésie générale peut provoquer une gêne respiratoire temporaire. Les anesthésiques seront administrés par injection intrapéritonéale, ce qui est légèrement douloureux pour l'animal au moment de l'injection. Le prélèvement de sang provoque une douleur locale modérée au site de prélèvement. À la suite d'une infection par le virus de la grippe, l'animal peut perdre jusqu'à 15 % du poids qu'il avait avant l’infection.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure car nous avons besoin d’analyser la réponse immunitaire dans plusieurs organes tels que les poumons et les ganglions par des techniques qui précisent le prélèvement de l’organe.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire lors d’une vaccination est un processus complexe qui implique plusieurs acteurs et qui ne peut pas être recréée in vitro. Nous utilisons donc un modèle de souris qui permet l’utilisation de nombreux outils disponibles pour l’exploration immunologique du modèle. De plus, l’infection par voie respiratoire du modèle souris fait intervenir de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine que nous ne pouvons pas reproduire par le biais de techniques in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été calculé sur la base des données existantes dans la littérature et de l'utilisation d'un logiciel statistique permettant d'estimer le nombre de souris par groupe.

Raffinement

L’administration des produits par voie respiratoire sera effectuée sous anesthésie générale (mélange d’anesthésique et d’un antidouleur). Un gel ophtalmique sur chaque œil sera appliqué pour éviter le dessèchement de ceux-ci pendant les anesthésies. Les souris seront placées sur tapis chauffante jusqu’au réveil pour limiter l’hypothermie lors des anesthésies. Le raffinement sera assuré par un suivi clinique des animaux (observation et pesée) deux fois par semaine après administration du vaccin, puis un suivi clinique quotidien après infection pendant la période critique. Ce protocole inclut des points limites qui seront évalues à l’aide d’une grille de score. Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée.

Choix des espèces

Le modèle souris, largement utilisé en laboratoire, est utilisé pour sa praticité et la bonne connaissance de son système immunitaire. Nous avons les outils necessaires pour l’analyse des réponses immunitaires du modèle. Animaux adultes livrés à 6-7 semaines d’âge, âge constituant un bon compromis entre une maturité suffisante du système immunitaire. Ils seront utilisés à 7-8 semaines (début de procédures).