Recherche appliquée

Jusqu'à neuf injections par animal pour 390 d'entre elles : 980 souris au système immunitaire affaibli vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prélevées sur des patients atteints de cancer du poumon, du foie, des reins, du côlon ou du pancréas, puis des produits de thérapie cellulaire dont l'effet antitumoral est mesuré. Le porteur attend une perte de poids, des troubles de la mobilité et des troubles du comportement liés à la croissance de la tumeur. Il retient des souris immunodéficientes pour éviter le rejet des cellules humaines, en présentant cette absence de rejet comme épargnant aux souris un choc cytokinique.

Objectifs

La chimiothérapie, la radiothérapie, les anticorps et depuis peu les thérapies cellulaires font partie de l'arsenal thérapeutique actuel pour traiter le cancer. Les thérapies cellulaires sont composées de cellules humaines capables de cibler puis détruire les cellules cancéreuses. Il est possible d'améliorer leur effet en les associant avec des anticorps. L’objectif de ce projet est d'évaluer l'effet anti-cancéreux de ces produits. Des cellules cancéreuses collectées chez des patients atteints de cancer du poumon, du foie, des reins, du colon ou du pancréas seront greffées chez la souris. La capacité des produits à cibler et détruire ces cellules ainsi que leur non toxicité seront évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont scientifiques et humains. Premièrement, les résultats obtenus seront diffusés à la communauté scientifique. Par conséquent, ils permettront d'améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des thérapies cellulaires. Si les résultats sont positifs et que nos produits sont efficaces comme attendu, ces données permettront de poursuivre leurs développements afin de pouvoir, dans le futur, proposer de nouveaux traitements efficaces et non toxiques aux patients atteints de cancer.

Procédures

135 animaux seront soumis à 1 injection (la durée de l'injection est d'1 minute). 455 animaux seront soumis à 2 injections (la durée de chaque injection est d'1 minute). 390 animaux seront soumis à 9 injections (la durée de chaque injection est d'1 minute). Pas de chirurgie ou de prélèvements, seulement des prélèvements post-mortem (après anesthésie puis euthanasie).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés au stress lors des injections ainsi que de potentielles douleurs ressenties au site d’injection. Les animaux greffés avec des cellules humaines cancéreuses seront également sujets à des effets pouvant être induits par la croissance de la tumeur. Ces effets sont connus allant de la perte de poids jusqu’à des problèmes de mobilité ou encore des problèmes comportementaux. Dans tous les cas, les animaux seront étroitement suivis et examinés tout au long des expériences selon notre fiche de suivi clinique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure (toutes les procédures) afin de réaliser les analyses et les prélèvements d'organes.

Remplacement

L’alternative non animale, pour étudier les nouveaux traitements contre le cancer, consiste à les tester sur des cellules en culture. Cependant, cette méthode reste artificielle et loin des effets pouvant être observés chez un animal. En effet, par cette méthode, les produits anti-cancer sont mis en présence de cellules cancéreuses sans autres paramètres extérieurs (pas d’autres cellules, pas de barrières à traverser, pas d’organes et tissus dans lesquels migrer …). Il est donc reconnu et validé par la communauté scientifique, que même si l’utilisation d’animaux doit être réduite et si possible évitée, celle-ci reste une étape obligatoire dans le développement des produits contre le cancer. Les modèles de cancer chez la souris sont donc les seuls aujourd’hui permettant d’évaluer l’efficacité de ces nouveaux traitements.

Réduction

Ce projet, d’une durée maximale de 5 ans, impliquera l’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli (nombre total maximal d’animaux = 980). Ce nombre d’animaux est le nombre maximal que nous envisageons d’utiliser. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons décidé de commencer par des études préliminaires avec le plus faible nombre d’animaux possible. Ces études permettront non seulement de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour les études suivantes mais également, de s’assurer des conditions expérimentales optimales pour les réaliser.

Raffinement

A réception des animaux, une première phase d’acclimatation et d’habituation à la manipulation (1 semaine), permettra d’atténuer tout stress lié au transport et de s’assurer du retour à l’état normal de l’animal. Cette période servira également pour habituer les animaux à la méthode de distribution des aliments et de l’eau et à leur nouvel environnement. Le fait d’habituer les souris à être manipulées permettra également de réduire les répercussions nuisibles de la manipulation. L’observation des animaux et de leur environnement se fera quotidiennement (pendant la période d’acclimatation et pendant les différentes études) afin d’évaluer leur santé et leur comportement. Un score clinique complet sera calculé pour déterminer la conduite à tenir. Toute souris présentant un score cumulé supérieur à 6 ou une perte de poids supérieure à 20% sera mise à mort. Pour toute souris présentant des blessures ou dont le score cumulé est supérieur à 3, elle sera isolée et nous procèderons à un enrichissement de la cage.

Choix des espèces

Pour tester l'effet d'un nouveau traitement contre le cancer, la greffe de cellules cancéreuses chez la souris est l'expérimentation standard et la plus pertinente. L’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli garantira l’absence de rejet des cellules cancéreuses humaines greffées et l’absence de souffrances associées pour les souris (choc cytokinique, inflammation au site d’injection, …). Souris adultes (6 - 7 semaines à la réception pour une entrée dans l’étude à 7 - 8 semaines) – âge standard pour 1- greffer des cellules cancéreuses et 2- évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-cancer

Évaluer pour un laboratoire l'efficacité de composés contre le psoriasis, l'acné et la rosacée conduit à utiliser 10 010 souris et 900 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inflammation cutanée est provoquée par dix injections sous-cutanées quotidiennes sur deux semaines, puis deux à trois injections intradermiques ou des applications sur la peau, avant l'administration des composés à tester jusqu'à trois fois par jour. Le porteur décrit des atteintes possibles (érythème, œdème, épaississement de la peau, lésions, croûtes, saignements) ainsi qu'une inactivité, une absence de réaction aux stimuli et des vocalisations, qu'il qualifie de transitoires. Il rappelle par ailleurs que ces maladies sont le plus souvent bénignes et provoquent surtout une "gêne esthétique".

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés dans des modèles rongeurs mimant la physiopathologie humaine de maladies inflammatoires cutanées telles que le psoriasis, l’acné et la rosacée. Ces pathologies sont le plus souvent bénignes, elles affectent pour le psoriasis et la rosacée 2 à 3% de la population alors que l’acné vulgaire affecte 80% des adolescents et concerne plus de la moitié des consultations en dermatologie. Ces pathologies inflammatoires chroniques progressent par poussée d’intensité variable et de période de rémission inconnue et engendre ainsi du fait de leurs symptômes une gêne esthétique. Par ailleurs, elles peuvent également dans certains cas évoluer vers des formes modérées voir sévères conduisant à des rhumatismes psoriasiques (20% des cas de psoriasis) ou des hypertrophies au niveau du visage dans 5% des cas de patients atteint de rosacée. De nombreux modèles animaux ont été générés pour mimer la physiopathologie de ces maladies inflammatoires cutanées. Ils ont permis de développer des traitements visant à réduire les symptômes (démangeaisons, rougeurs, présence de squames de pustules, d’œdèmes, …), la gêne occasionnée et ainsi d’améliorer la qualité de vie des patients. Néanmoins aucun traitement curatif n’est à ce jour disponible. Notre objectif premier consiste à développer des modèles de choix permettant de reproduire le plus fidèlement possible la pathologie humaine afin d’évaluer l’efficacité de thérapies innovantes ou de nouvelles combinaisons thérapeutiques. En effet, la découverte récente de nouveaux acteurs cellulaires et moléculaires, l’influence du microbiote cutanée, impliqués dans les diverses phases de la réponse inflammatoire ouvre de nouvelles perspectives de traitement. Notre second objectif sera d’identifier, grâce à ces modèles de choix translationnels avec la clinique, de nouveaux biomarqueurs systémiques ou cutanés, de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouvelles voies de signalisation permettant d’adapter les futures thérapies.

Bénéfices attendus

A ce jour il n’existe pas de traitements curatifs de l’acné, de la rosacée ou du psoriasis. Les traitements actuels sont utilisés pour réduire les symptômes ou la gêne esthétique. Par ailleurs, des récidives aux traitements actuels ou des complications observées dans le cadre des thérapies biologiques soutiennent la recherche de solutions thérapeutiques innovantes. Notre projet s’inscrit dans le cadre d’une recherche innovante et translationnelle. L’utilisation de modèle de choix récapitulant la physiopathologie humaine, nous permettra de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans ces pathologies. A plus long terme, les données générées seront utilisées pour déterminer les doses efficaces qui seront évaluées chez les patients dans les phases d’investigation cliniques. L’identification de nouveaux biomarqueurs permettra d’adapter les nouvelles thérapies ou réaliser des combinaisons de traitements efficaces menant ainsi à de la médecine personnalisée pour des patients atteints de formes sévères ou récidivant aux thérapies actuelles.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : •Immunisation: 10 administrations sous-cutanées quotidiennes sur 2 semaines, durée 30 secondes par administration; •Induction du modèle : 2 à 3 administrations intra-dermiques (durée 30 secondes), séparées de 24h à 72h, ou une application cutanée (durée 30 secondes) une fois par jour, sur une semaine maximum, selon les modèles •Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. •Mesures d’épaisseurs cutanées quotidiennes : durée de 4 minutes maximum sous anesthésie générale, maximum 7 fois. •Mesure de la dilatation des vaisseaux : durée de 1 minute sous anesthésie générale •Prélèvements de sang sur animal vigile ou anesthésié : Durée 30 secondes à une minute; maximum 4 prélèvements par animal sur la durée de la procédure et des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu'à une semaine. •Administrations de composés à potentiel thérapeutique : durée 30 secondes par animal sur animaux vigiles. Fréquence selon voie d’administration, 1 à 3 fois par jour sur une semaine.

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer chez quelques individus une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement animal (inactivité, absence de réaction aux stimuli, des vocalisations), des atteintes cutanées sévères (érythème, œdème, épaississement de la peau, lésions, croutes, saignements, …) et une perte de poids. Ces effets surviennent suite au développement de pathologies inflammatoires chroniques cutanées suite à l’application continue de substances maintenant cette inflammation. Néanmoins ces effets sont transitoires. Des points d'intervention anticipés et des points-limites adaptés sont appliqués pour limiter au maximum l'inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des études. Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent d’évaluer une potentielle efficacité thérapeutique de composés dans des pathologies inflammatoires cutanées. Seul un modèle animal peut permettre de mimer de manière séquentielle le développement de la pathologie et contenir tous les acteurs cellulaires et moléculaires nécessaires à ces diverses étapes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d'animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles. Des tests d’analyses de puissance seront utilisés pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. A posteriori des analyses de puissance rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée Ce dernier sera révisé pour les futures études en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire, ou les animaux seront mis à mort selon les méthodes règlementaires et recommandations internes à l'établissement. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipés seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles de pathologies inflammatoires cutanées chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (doses de l'agent inflammatoire, effets de molécules de références etc.) Des souris seront utilisées en majorité car c'est l'espèce la plus décrite et pour laquelle les outils d'analyse sont les plus nombreux. Des rats seraient utilisés si la souris s'avérait ne pas être adaptée pour un projet (par exemple une différence significative d'homologie de séquence de la protéine cible entre la souris et l'homme). Le stade adulte est utilisé : Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine des pathologies inflammatoires cutanées.

Pour tester deux molécules censées prévenir les troubles du rythme cardiaque, 288 souris porteuses d'une mutation provoquant une cardiomyopathie dilatée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sept gavages, douze échocardiographies sous anesthésie, six électrocardiogrammes sur animal vigile et trois prises de sang, entre l'âge de 28 jours et 7 mois. Le porteur décrit un phénotype qui débute à 4 mois par une cardiomyopathie légère, évolue vers l'insuffisance cardiaque à 7 mois et s'accompagne d'une cyphose et d'une perte de poids d'environ 20 %. Aucun point limite intermédiaire n'interrompt cette évolution, les souris étant mises à mort systématiquement à 7 mois pour prélever leurs organes.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde avec près de 18 millions de morts chaque année et constituent des facteurs de comorbidité pour de nombreuses autres maladies. Malgré l’amélioration des méthodes de diagnostic, de la prise en charge des personnes et de la prévention sur les facteurs de risques tels que la consommation de tabac, les maladies cardiovasculaires restent un groupe d’affections fortement mortelles. Parmi les maladies cardiovasculaires, les cardiomyopathies sont des atteintes du muscle cardiaque qui causent des dysfonctionnements électriques et/ou mécaniques. Parmi les maladies cardiovasculaires, la cardiomyopathie dilatée se caractérise par une augmentation de la masse du coeur, une dilatation des ventricules et une augmentation de la fibrose interstitielle. Avec une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la cardiomyopathie dilatée sont l’insuffisance cardiaque (70 pour cent) et les arythmies cardiaques (30 pour cent). Le but de ce projet est de tester un traitement pharmacologique préventif des arythmies cardiaques. L'inhibition d’une enzyme impliquée dans développement du cœur, prévient la cardiomyopathie dilatée. Bien que ce traitement ait un effet bénéfique sur le remodelage cardiaque, son impact sur les arythmies et les défauts de conduction reste à étudier. Nous supposons qu'un traitement avec un inhibiteur de lenzyme d'interet agirait à la fois sur les défauts de conductions directs et sur ceux induits par la fibrose. Nous proposons dans ce projet de traiter un modèle murin de cardiomyopathie dilaté avec deux molécules inhibitrices de l'enzyme concernée et d’en étudier l’impact, sur la fonction cardiaque, remodelage et activité électrique, in-vivo. Nous étudierons aussi l’impact du traitement sur les voies de signalisations moléculaires et cellulaires qui participent à l’apparition des défauts de conductions et des arythmies associés la cardiomyopathie dilatée.

Bénéfices attendus

Les données générées par ce projet collaboratif contribueront à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée. Ces résultats seront utilisés comme une preuve de principe qui permettra de proposer un essai clinique pour les jeunes patients. Étant donné que la cardiomyopathie dilatée partage de nombreuses caractéristiques communes avec d'autres cardiomyopathies à l'éthologie différente, nos résultats ouvriront des perspectives thérapeutiques pharmacologiques pour traiter celles ci.

Procédures

Les animaux subiront 6 interventions différentes. 1. Un gavage sur une période de 3 semaines. Les molécules thérapeutiques sont diluées dans l’eau de boisson. Elles sont bien tolérées par l’organisme et n’entrainent pas d’effets indésirables à la concentration fixée dans ce protocole. Les animaux seront traités 7 fois, de 28 jours à 49 jours d'âge. Chaque intervention dure une trentaine de seconde. 2. Une échocardiographie sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis tous les 15 jours à partir de 2 mois jusqu’a 7 mois, soit un total de 12 échocardiographies par animal. Chaque intervention dure entre 5 et 10 minutes. 3. Un électrocardiogramme sur animaux vigiles. Chaque animal sera évalué de 2 mois à 7 mois tous les mois, soit un total de 6 électrocardiogrammes par animal. Chaque intervention dure entre 2 et 4 minutes. 4. Un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse. L’intervention est réalisée une fois et dure 10 minutes. 5. Un prélèvement sanguin. Les animaux seront prélevés trois fois à un moi d’intervalle. L’intervention dure environ 2 minutes. 6. Une chirurgie sous anesthésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois cette chirurgie, soit un prélèvement d’organe sous anesthésie et analgésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois ce prélèvement.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable des souris débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. L’ensemble des procédures liées à ce projet peuvent générées un stress lié à la manipulation de l’animal. De plus certaines de ces procédures peuvent engendrées de légères irritations, des lésions et des hémorragies avec risque d’infection. Les procédures avec anesthésie comportent un risque de stress thermique (refroidissement de la température de l’animal) et dans de rares cas de détresse respiratoire. La chirurgie peut induire une douleur et des risques d'infection.

Devenir

Tous les animaux (n = 288) seront euthanasiés pour prélèvement d’organe à 7 mois. Le prélèvement d'organe est indispensable pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de l'expérimentation.

Remplacement

Les études précliniques nécessitent une validation sur des modèles animaux qui ne peut pas être remplacée par des modèles cellulaires. De plus, les cardiomyocytes (cellules cardiaques) adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Bien qu’il existe des lignées cellulaires, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal. D'autre part, aucun modèle cellulaire ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte, ni récapitule dans son ensemble les caractéristiques d’un cœur entier dans son environnement physiologique.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, commerciaux et atteints de cardiomyopathie dilatée. Les fonds génétiques des animaux commerciaux et transgéniques sont identiques. La lignée développant la cardiomyopathie dilatée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux commerciaux seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet (288), nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Afin de diminuer la douleur et le stress des animaux, une analgésie et/ou une anesthésie sera réalisée pour les procédures le nécessitant. L’isolement des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable. Le phénotype dommageable débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable, une fiche de scoring est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype et les animaux sont mise à mort systématiquement à l’âge de 7 mois.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Pour les traitements, les animaux seront utilisés à 28 jours (âge auquel les animaux passe à une alimentation entièrement solide). Pour obtenir un effet optimum, l’âge de début du traitement doit être le plus précoce possible. Pour l’exploration fonctionnelle du cœur, les animaux sont utilisés entre 2 et 7 mois.

Trois prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbitaire, onze mesures de tumeur, trois injections dans la veine de la queue en tube de contention et trois sessions de mesure de l'haleine de 30 à 60 minutes : 63 souris athymiques nude vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-neuf d'entre elles reçoivent en plus une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses du col de l'utérus. Le projet teste un promédicament censé libérer un anticancéreux dans la tumeur et, du même coup, une molécule volatile expirée dans l'haleine qui signalerait que le traitement agit. Le porteur écrit que ces souris immunodéprimées ont un phénotype dommageable, tout en affirmant que les conditions d'hébergement empêchent ce phénotype de s'exprimer.

Objectifs

Le cancer représente un problème de santé publique mondial et les outils thérapeutiques actuels ne permettent pas encore d’éradiquer sélectivement et efficacement les tumeurs solides. De plus, il est difficile de suivre l’efficacité d’une molécule anticancéreuse en temps réel, quel que soit la nature du cancer traité. La conception de molécules capables de traiter cette pathologie tout en émettant un signal témoignant de l’efficacité du traitement représente une alternative extrêmement prometteuse. Dans ce projet, nous souhaiterions introduire un nouveau concept qui repose sur un système d’administration d’un promédicament appelé le vecteur 1. Ce dernier est capable de se lier avec certaines molécules du sang de manière stable et il sera sélectivement activé par une enzyme présente en concentration élevée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides, libérant l’agent anticancéreux. L’agent anticancéreux libéré pénètre dans les cellules tumorales pour exercer son effet cytotoxique alors que la substance volatile est exhalée dans l’haleine des animaux. La mesure de la molécule volatile dans l’haleine et le sang des animaux traités pourrait constituer un traceur attestant la libération de l’agent anticancéreux. Afin de connaître le potentiel thérapeutique du vecteur 1, il est nécessaire d’évaluer ce concept sur des modèles animaux sains ou des individus ayant subi une greffe de cellules tumorales. Les modèles animaux sont indispensables à l’application de notre étude car la méthode de détection des substances volatiles dans l’haleine et le sang témoignant de l’efficacité de l’agent anticancéreux n’a nul équivalent in vitro ou in silico. La mesure simultanée du sulfure de carbonyle et une corrélation positive dans l’air expiré et dans le sang permettra de vérifier qu’une augmentation de sulfure de carbonyle libérée dans l’un ou l’autre compartiment est bien liée à l’activation de l’agent anticancéreux. Nous émettons l’hypothèse que l’administration intraveineuse du vecteur 1 permettra (1) le traitement sélectif des tumeurs grâce à la libération intratumorale de l’agent anticancéreux et (2) l’évaluation de l’efficacité du traitement au cours du temps par mesure des niveaux de molécules volatiles dans l’haleine et le sang des animaux. Ces deux aspects devraient uniquement être détectés chez les souris malades possédant un environnement tumoral riche en enzyme retrouvée autour de la plupart des tumeurs solides et absents chez les souris saines.

Bénéfices attendus

Notre étude menée in vivo démontrera à court terme que le suivi de la molécule volatile dans l'haleine et le sang des animaux permettra (1) la discrimination des souris porteuses de tumeurs par rapport aux individus sains, (2) la preuve de l'activation des vecteurs dans les tumeurs par l’enzyme retrouvée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides, (3) la prédiction de l'efficacité du traitement anticancéreux et (4) l'identification des animaux guéris ainsi que ceux avec une tumeur résiduelle tout au long du protocole thérapeutique avec le vecteur 1. Notre étude pourrait être profitable dans le domaine de la santé humaine car la molécule volatile ainsi que l’enzyme intratumorale étudiées dans ce projet constitueront des traceurs caractéristiques de l'état de santé du patient ce qui offrira de nombreux avantages. Ainsi, il sera possible de (1) suivre et d’expliquer les variations des niveaux de substance volatile présente dans l’air expiré des patients et dans la circulation sanguine en fonction du stade d’évolution de la maladie et (2) le concept global sera également étudié à des fins pronostiques.

Procédures

Une injection sous cutanée de cellules tumorales (J0) et 11 mesures de masses tumorales (2 fois par semaine) et 3 prélèvements sanguins seront réalisées sur les animaux greffés (39 souris) sous anesthésie gazeuse avec une durée de 5 min par acte. De plus, la pose d’une bague sur l’oreille (pour l’identification des souris) sera réalisée sur tous les lots d’animaux (63 souris) sous anesthésie gazeuse avec une durée de 5 min par acte. La totalité des animaux vigiles (63 souris) seront pesés 2 fois par semaine avec une durée de moins de 1 min par pesée. De plus, 3 injections intraveineuses dans la veine de la queue seront réalisées sur tous les lots d’animaux vigiles (63 souris) sous anesthésie locale dans des tubes de contention avec une durée de 5 min par acte. La substance volatile retrouvée dans l’haleine des animaux sera mesurée pendant 30 à 60 min 3 fois sur tous les animaux vigiles (63 souris) au cours de l’étude.

Impact sur les animaux

Les souris athymic nude immunodéprimées ont un phénotype dommageable. Néanmoins, les conditions d’hébergement de notre animalerie sont adaptées et compatibles pour le maintien de ces animaux génétiquement modifiés, ce qui permet que le phénotype dommageable ne s’exprime pas. La protubérance de la tumeur sous- cutanée peut être responsable d’une légère gêne dans la locomotion des animaux greffés. Les données récoltées au cours des précédentes études in vivo menées dans le laboratoire révèlent que la greffe de cellules tumorales du col de l’utérus n’entraîne aucune perte de poids chez les animaux. De plus, l’anesthésie gazeuse nécessaire lors de la greffe, des prélèvements sanguins et des mesures de la masse tumorale peut entraîner un stress léger et transitoire au cours du réveil des animaux. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress passager et des lésions potentielles du système veineux rétro-orbitaire qui sera réduit par la réalisation du geste sous anesthésie gazeuse et après application d’un anesthésiant local oculaire (tétracaïne 1%) avant le geste et ils seront espacés de 7 jours en alternant l’œil prélevé, permettant 15 jours de repos pour chaque œil. La pesée des animaux vigiles peut également engendrer un léger stress transitoire mais ce dernier n’est pas une nuisance car les animaux vont s’habituer aux manipulateurs pendant 15 jours avant le début de l’étude. Les injections vigiles seront réalisées en utilisant des tubes de contention ce qui pourra entraîner un stress passager pour les animaux. Néanmoins, les injections dureront 3 à 5 min, elles seront espacées au minimum de 7 jours et elles seront réalisées dans la veine de la queue en présence d’un anesthésique local (lidocaïne à 2%).

Devenir

Mise à mort sous anesthésie gazeuse pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé tous les tests in vitro indispensables à la validation du concept en mesurant la réponse des cellules cancéreuses du col de l’utérus (cellules KB) au vecteur 1. En effet, nous avons stimulé ces cellules avec des doses croissantes de vecteur 1 et les résultats démontrent une baisse importante de la survie des cellules cancéreuses proportionnelle à la concentration de vecteur utilisée. De plus, nous avons pu détecter la présence de la molécule volatile en utilisant une fibre sur des cellules cancéreuses stimulées avec le vecteur 1. Enfin, nous avons identifié la présence de l’agent anticancéreux dans les cellules tumorales lorsque ces dernières sont en présence du vecteur 1. A présent, les expériences in vivo sur souris sont indispensables à la réalisation de notre projet scientifique. En effet, il n’existe pas de test in vivo ou in silico pour confirmer l’action de ce médicament « nouvelle génération ».

Réduction

Certaines études antérieures confirment que les vecteurs sensibles aux enzymes sont stables et non toxiques lorsqu’ils sont dans le sang. De plus, ils sont sélectivement ciblés au contact de l'enzyme retrouvée dans l'environnement de la plupart des tumeurs solides pour permettre la libération des agents anticancéreux. Il n’est donc pas nécessaire de réaliser une étude de toxicité en amont ni d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires dans ce projet. Les données recueillies lors de ces précédentes expériences ont été utilisées pour affiner au mieux les procédures expérimentales. La « Règle des 3R » établie par Russel et Burch a été prise en compte et un test statistique a été réalisé afin de réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en assurant un nombre suffisant pour une étude optimale dans le but d’éviter de reproduire ces expériences.

Raffinement

Les souris athymic nude sont des animaux possédant un système immunitaire déficient. Les conditions d’hébergement contrôlées de l’animalerie sont compatibles et adaptées pour le maintien du statut sanitaire de ces animaux immunodéprimés, ce qui va permettre la non expression du phénotype dommageable. De plus, les actes chirurgicaux effectués sur les souris seront réalisés en conditions stériles pour éviter toute contamination. Les souris seront hébergées dans un environnement de température et d’hygrométrie répondant à la réglementation afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long de l’étude. Pour satisfaire leurs interactions sociales, elles seront maintenues en groupe de 5 individus par cage ventilée (500 cm²) dans un milieu enrichi avec des structures (nids...) et des outils adaptés (jouets, rognage de matériaux) afin de satisfaire leurs exigences comportementales. Avant de débuter les expérimentations, une période d’acclimatation de 15 jours permettra d’habituer les animaux aux expérimentateurs et au matériel. La fibre nécessaire à la mesure de la molécule volatile sera située en hauteur dans la cage et elle sera non invasive pour les animaux. Au cours de ce projet, la majorité des actes effectués sur les animaux (implantation des cellules cancéreuses, pose de la bague d’identification à l’oreille, mesure de la masse tumorale, prélèvements sanguins) seront réalisés sous anesthésie gazeuse en condition de température contrôlée (tapis chauffant) afin de réduire au maximum le stress et la douleur ressentis par les animaux. De plus, pour les prélèvements sanguins, un anesthésiant local oculaire sera administré en plus de l’anesthésie gazeuse pour limiter la douleur et ils seront espacés de 7 jours en alternant l’œil prélevé, permettant 15 jours de repos pour chaque œil. Les injections seront réalisées sur les animaux vigiles (veine de la queue) sous anesthésie locale pour minimiser la douleur. En effet, certains tests ont montré que le gaz utilisé lors de l’anesthésie perturbe les mesures de molécules volatiles. Tout au long de l’étude, l’état de chacun des animaux et leur comportement seront scrupuleusement vérifiés lors de visites quotidiennes en se référant à une grille d’évaluation des signes cliniques gradés établie pour chacun des individus permettant de définir des points limites suffisamment précoces pour prendre en charge l’apparition de signes de souffrance et de mal-être.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler avec l’espèce souris car le développement tumoral est rapide et bien caractérisé chez ces animaux. Nous avons choisi de travailler avec le modèle des souris athymic nude car ces animaux se caractérisent par la présence d’une mutation qui engendre une déficience immunitaire, ce qui permet de limiter les réactions de rejet lors de la greffe des cellules tumorales. De plus, c’est un modèle de choix pour ce projet car d’après les résultats obtenus précédemment, ces souris immunodéprimées expriment des concentrations élevées d’enzyme retrouvée dans l’environnement de la plupart des tumeurs solides qui est indispensable à l’activation du promédicament (vecteur 1). Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines que nous allons acclimater aux manipulateurs et au matériel qui sera utilisé lors des expérimentations pendant 15 jours supplémentaires dans l’animalerie. Dans ces conditions et à cet âge de 10 semaines, les animaux auront fini leur croissance et se seront remis du stress du transport permettant ainsi d’avoir un poids stable qui est un critère important témoignant de leur état de santé.

316 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules tumorales pancréatiques leur donne des métastases au pancréas, aux poumons et au foie, avant jusqu'à neuf scanners sous anesthésie, quatre prises de sang et trois injections intraveineuses sur animal vigile. Le porteur signale une possible insuffisance respiratoire ou hépatique liée aux métastases, ainsi qu'une irritation de l'œil après prélèvement rétro-orbitaire. Sur le remplacement, il écrit que seul un modèle vivant reproduit la complexité de la réponse immunitaire antitumorale et conclut au caractère "nécessaire" du recours aux animaux non-humains.

Objectifs

D’un point de vue épidémiologique, le cancer du pancréas est projeté pour devenir, d’ici à 2040, la 4ème cause de décès par cancer. La majorité des patients présentent donc des pathologies avancées ou avec progression métastatique au moment du diagnostic. La survie globale à 5 ans des patients est inférieure à 10%. La plupart des approches thérapeutiques actuellement disponibles ciblent directement les cellules tumorales. Or d’un point de vue clinique, les cellules tumorales sont entourées par un tissu très dense appelé stroma tumoral, dont l’impact a été sous-évalué. Récemment, la présence de ce stroma massif a émergé en tant qu’acteur et contributeur à la fois à l’initiation et à la progression tumorale. Notre hypothèse est que le remodelage du stroma pourrait représenter une nouvelle opportunité thérapeutique dans le cadre du cancer du pancréas métastatique. Les objectifs de notre étude sont donc les suivants (1) Évaluer la croissance tumorale, caractériser le stroma tumoral et l’infiltrat immunitaire dans deux modèles murins métastatiques (2) Évaluer le potentiel thérapeutique d’une combinaison d’anticorps dans ces modèles métastatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices du projet sont multiples : (1) Élucider les mécanismes impliqués dans la formation et le maintien du stroma tumoral dans le cancer du pancréas (2) Démontrer le remodelage du stroma tumoral via l’utilisation d’anticorps thérapeutiques (3) Proposer une nouvelle opportunité thérapeutique dans les cas de cancer du pancréas métastatique en démontrant l’impact du remodelage du stroma dans la prévention des mécanismes d’échappement. A long terme, les objectifs de ce projet ont pour but de conduire au développement de nouvelles thérapies dans le contexte préclinique et clinique appliqué à l’immuno-oncologie. En effet, le développement de modèles murins pour le cancer du pancréas en préclinique permet une meilleure représentativité de la pathologie en clinique et ainsi favorise la transposition d’informations scientifiques entre la préclinique et la clinique.

Procédures

Les animaux pourront subir le(s) effet(s) indésirable(s) suivant(s) : - Injection de cellules tumorales induisant des métastases pouvant entraîner une atteinte des organes cibles (pancréas, poumons, foie) - Prélèvements sanguins, sous anesthésie (durée maximale 2 minutes, une fois par semaine, 4 répétitions maximum) - Examens d’imagerie (scanner), sous anesthésie (durée maximale de 10 minutes, une fois par semaine, 9 répétitions maximum) -Injection intra-veineuse sur animaux vigiles (durée maximale 2 minutes, une fois par semaine, 3 répétitions maximum)

Impact sur les animaux

Les deux anticorps thérapeutiques, déjà utilisés dans de précédents protocoles pour d’autres types tumoraux n’induisent pas d’effet secondaires indésirables. Les nuisances attendues sont l’apparition de métastases pouvant induire une insuffisance respiratoire ou hépatique. Le prélèvement rétro-orbitaire pourra aussi provoquer une irritation de l’œil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier la capacité tumorigénique et l’impact de traitements. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro à l’aide de lignées de cancer du pancréas métastatique. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas de reproduire la complexité de la réponse immunitaire antitumorale observée in vivo, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté de points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des animaux. Dans le cadre du présent projet l'apparition de signes généraux (par exemple : difficultés respiratoires, hypothermie, perte de poids >20% du poids maximal) constituent des points limites qui conduirais à la mise à mort afin de limiter toute souffrance des animaux. Nous évaluerons l’état de bien être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du cancer du pancréas. Bien qu’il existe des différences entre l’immunologie murine et humaine, de nombreuses découvertes effectuées chez la souris sont transposables chez l’homme. Dans le cadre de ce projet, des souris âgées entre 6 et 7 semaines seront utilisés car ce stade de développement est standard pour les études visant à comprendre des mécanismes au niveau du système immunitaire.