Recherche appliquée

896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement prédisposées à développer des tumeurs du tube digestif, elles reçoivent à six semaines un gavage de bactéries Escherichia coli productrices de colibactine, puis deux prélèvements sanguins, et vivent avec leurs tumeurs jusqu'à la mise à mort au 65e jour. Le porteur attend une baisse d'activité, une perte de poils, une posture voûtée, une anémie visible aux pattes blanches, un amaigrissement, des diarrhées, du sang dans les selles et un prolapsus. À court terme il s'agit de savoir si un acide aminé, la sérine, conditionne l'effet pro-cancérogène de ces bactéries, les régimes appauvris en sérine administrés en prévention à des personnes à risque restant renvoyés au long terme.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine, nommée : « Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) », dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectaux accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer. Les résultats préliminaires semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide aminé (sérine) dans l’activité pro-carcinogène des souches CoPEC. Ainsi, nous proposons premièrement d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en sérine sur l’effet pro-carcinogène de la souche CoPEC. Ensuite, nous souhaitons également vérifier la spécificité des besoins en sérine de cette souche, en étudiant une souche incapable d’utiliser la sérine. Pour cela, nous évaluerons l’effet de la toxine, la colonisation bactérienne, la perméabilité intestinale et le développement tumoral à un stade précoce et/ou tardif dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes de l’interaction bactéries/hôte/nutrition sur la carcinogénèse colique. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant les personnes les plus colonisées par ces bactéries. Ce projet permettra de mettre au point des traitements curatifs afin d’empêcher la bactérie d’utiliser la sérine et ainsi diminuer le développement tumoral. Également, des alimentations déplétées en sérine pourront être administrées en prévention chez les personnes susceptibles de développer un cancer colorectal, ou en curatif chez les patients opérés afin de limiter la réimplantation des CoPEC.

Procédures

Une injection (gavage) sera réalisée à J0, soit lorsque la souris a 6 semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J9 et en pré-mortem sous anesthésie gazeuse. Les gestes techniques seront réalisés rapidement en quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après la reproduction ou à la fin de l'expérience. A la fin de l'expérience, les animaux sont sacrifiés afin de réaliser des prélèvements tissulaires. Lors des reproductions, seul les animaux d'intérêt sont conservés.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effets pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique sur des cellules en culture.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de superficie adaptée, avec des cabanes pour se cachées et des enrichissements à ronger. Des croquettes seront également mis à disposition dans le fond de la cage et les tétines des biberons allongées si les douleurs empêchent l'animale de grimper sur la grille. Enfin certains animaux pourront être isolés si leur état général le nécessite.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, le modèle animal APC présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène APC est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau du tube digestif -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Ainsi, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien être animale (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les femelles adultes âgées de 6 semaines (20g au gavage). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérience est estimée à 65 jours post-gavage.

Quatre injections dans le sinus rétro-orbitaire et cinq prélèvements sanguins à la queue par animal, à raison d'une séance par semaine pendant quatre semaines : 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque intervention se déroule sous anesthésie profonde, et le porteur indique qu'une réaction pseudo-allergique peut suivre l'injection de l'enzyme, un antihistaminique étant administré 48 heures avant en cas de réaction lors de la première expérience. Le projet compare des formulations d'encapsulation d'une enzyme utilisée contre la maladie de Pompe, dont la majorité des patients traités développent des anticorps qui la dégradent. Le porteur annonce une meilleure prise en charge de ces patients, quand l'étape réellement engagée ici mesure l'immunisation de souris et la distribution du produit dans leur rate et leur foie, prélevés après mise à mort.

Objectifs

L’alpha-glucosidase, une enzyme, est responsable de la dégradation du glycogène en glucose, en particulier au niveau des muscles. Dans le cas de la maladie de Pompe, un déficit de l’enzyme alpha-glucosidase (GAA), entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes. L'accumulation de glycogène entraîne des conséquences graves dans de nombreux organes, en particulier les muscles et le système nerveux avec l’apparition d’une faiblesse musculaire et des troubles respiratoires. Le principal traitement de la maladie de Pompe se base sur l'administration en intra-veineux de l’alpha-glucosidase, permettant alors la dégradation du glycogène en glucose. Pour autant, ce traitement n’est pas sans complications étant donné que la majorité des patients traités développent des anticorps contre cette enzyme, ce qui entrainent sa dégradation et donc une diminution de l’efficacité de la thérapie. Il existe aujourd’hui des systèmes d’administration de médicaments basés sur l’encapsulation dans une paroi de phospholipides permettant la protection d’un médicament encapsulé contre le système immunitaire, l'amélioration de sa persistance chez l’Homme et la réduction des effets indésirables. Il serait intéressant de développer un tel système d’administration dans le cadre de la maladie de Pompe afin de réduire la résistance au traitement des patients. Ce projet vise donc à évaluer l’activation du système immunitaire par l’enzyme encapsulée ainsi que sa persistance chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les patients qui nécessitent une thérapie basée sur l’injection de l’enzyme alpha-glucosidase dans le traitement de la maladie de Pompe, sont susceptibles de développer une réaction immunitaire face à ce traitement, ce qui le rend à terme moins efficace. Les bénéfices attendus de ce projet sont ; une diminution de l’activation du système immunitaire par le médicament encapsulé et une amélioration de la persistance et de la distribution du médicament chez l’Homme. In fine, ce projet permettra une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Pompe.

Procédures

Les animaux seront soumis au total à quatre injections par voie rétro-orbitale ainsi qu'à quatre prélèvements sanguins au niveau de la queue. Ces interventions seront réalisées une fois par semaine sur quatre semaines sur des animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement à la queue suivi directement de l'injection en rétro-orbitale ne dépassera pas les 15 minutes. Un prélèvement de sang final sera également réalisé à la fin de la procédure sur animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement final n'excédera pas les 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur les animaux sont une immunisation des souris à l'enzyme alpha-glucosidase injectée et une diminution de cette immunisation ainsi qu'une meilleur absorption grâce à la nouvelle formulation de l'enzyme. Les effets indésirables attendus pour les deux procédures expérimentales sont : un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. Il peut également survenir un possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (durée de 30 secondes avant endormissement). Une réaction pseudo-allergique peut également être attendue suite à l’injection de l’enzyme.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, car le prélèvement sanguin est terminal et car les organes (rate et foie) doivent être récupérés afin d'analyser la distribution de la nouvelle formulation de l'enzyme.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’activation du système immunitaire par les différentes formulations d’encapsulation de l’enzyme alpha-glucosidase afin de diminuer la réponse immunitaire et d’améliorer l’efficacité du traitement. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires et tissulaires (cellules immunitaires, cellules musculaires…) il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 15 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de collyre sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil • Par traitement des animaux avec un antihistaminique, 48h avant l’injection de l’enzyme en cas de réaction allergique lors de la première expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

Puisque nous souhaitons observer les différences de réactions immunitaires en fonction de la formulation de l’enzyme alpha-glucosidase, le recours à l’animal est nécessaire, car l’activation du système immunitaire est un phénomène complexe qui implique plusieurs types cellulaires et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, les cellules immunitaires, les cellules musculaires et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro. Les similarités connues entre le système immunitaire de la souris et de l’homme, et en particulier les cellules impliquées dans les procédés d’immunisation font de la souris un modèle de choix. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères présentant un système immunitaire mature et ne présentant pas encore de vieillissement.

Huit disques de péricarde bovin sont implantés dans les muscles de chaque jeune lapin de huit semaines, et y séjournent deux à trois mois. 144 lapins vont être utilisés sur trois ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués par injection intracardiaque pour récupérer les disques. Le porteur signale des douleurs postopératoires dans la zone lombaire et un hébergement individuel qu'il reconnaît comme source de stress. Multiplier les implants par animal est présenté comme une mesure de réduction des effectifs, ce qui revient à concentrer sur chaque lapin ce qui aurait été réparti sur plusieurs.

Objectifs

Un cœur sain bat environ 100 000 fois par jour pour alimenter l’organisme avec un sang riche en oxygène. Le cœur se compose de quatre cavités : 2 oreillettes (droite et gauche) ; deux ventricules (droit et gauche) et de quatre valves. Lorsque les valves cardiaques fonctionnent normalement, elles assurent un écoulement efficace du sang entre les cavités du cœur. En revanche, les valves malades ne peuvent pas s’ouvrir ou se fermer correctement, et finissent par se rigidifier et se calcifier progressivement. Le traitement de choix pour les patients est le remplacement de la valve cardiaque par une valve artificielle mécanique ou par une bioprothèse valvulaire d’origine animale. Les bioprothèses valvulaires d’origine animale sont composées de péricarde bovin ou porcin. La mise au point des techniques pour leur préservation a révolutionné les indications de remplacement valvulaire en clinique humaine. De nombreuses études ont démontré les avantages significatifs des bioprothèses valvulaires par rapport aux prothèses mécaniques, en particulier la diminution du risque de maladie thromboembolique et donc l’absence d’utilisation d’anticoagulants avec une morbidité et une mortalité per-opératoire et post-opératoire moindres. Néanmoins, l’une des limitations principales à l’utilisation des bioprothèses valvulaires, est la survenue plus ou moins tardive de calcifications, c’est l’inconvénient majeur nécessitant un nouveau remplacement valvulaire. L’objectif de ce projet est de modifier les traitements de la bioprothèse valvulaire, afin de diminuer les calcifications qui apparaissent après implantation chez l’homme et de prolonger la durée de leur fonctionnement. Ces nouveaux traitements seront testés et analysés après implantation intramusculaire de péricarde bovin chez les jeunes lapins âgés de 8 semaines. Pour ce projet, 144 jeunes lapins seront nécessaires pour une durée de 3 ans. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail vont nous permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes de calcification et une meilleure sélection parmi les différents traitements chimiques proposés. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie. Il s'agit d'une implantation intramusculaire de disques de péricarde bovin pendant 2 à 3 mois. La durée de l'intervention est de 10 minutes par lapin. 2) Deux injections intramusculaires pour l'anesthésie et l'analgésie avant la chirurgie d’implantation. 3) Une injection intramusculaire pour l'anesthésie et une injection intracardiaque pour la mise à mort avant la chirurgie d’explantation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le stress et les douleurs associés aux injections des anesthésies et potentielles douleurs post-opératoire dans la zone lombaire après la chirurgie. L'hébergement individuel est une source de stress.

Devenir

La mise à mort des lapins avant l’explantation de péricarde est nécessaire pour récupérer les disques afin d'effectuer des tests, dosages et immunohistochimie.

Remplacement

L’étude de la prévention de la calcification des bioprothèses valvulaire nécessite le recours aux animaux. Il n’existe pas de modèle in vitro capable de réunir tous les facteurs biologiques, immunologiques ou mécaniques responsables de la calcification des bioprothèses.

Réduction

La diversité des traitements et des tests nécessite un grand nombre de groupes tests et chaque groupe doit contenir un grand nombre d’échantillons nécessaires pour nos études statistiques. Dans l’intention de réduire le nombre d'animaux au maximum, chaque jeune lapin recevra 8 disques de tissu péricardique. Le nombre des jeunes lapins par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique adaptée. Cela permet de comparer les moyennes de calcification de chaque groupe, tout en prenant en compte le fait qu'un même animal puisse avoir plusieurs groupes.

Raffinement

Pour réduire la douleur, souffrance ou angoisse ressenties par les jeunes lapins : notre étude sera effectuée sous anesthésie générale profonde et l’injection intra musculaire d'un analgésique. Les lapins sont hébergés dans des cages (portoirs de 3 cages), avec un accès à l’eau et à la nourriture en granulé sans restriction et dans un milieu d'enrichissement adapté. Durant toute la procédure nous surveillerons les animaux. La surveillance sera quotidienne durant toute la période d’implantation plus la visite hebdomadaire d’un vétérinaire. Des points limites ont été définis et leur atteinte entrainera la mise mort du lapin.

Choix des espèces

Les calcifications observées chez le lapin correspondent à celle observées chez l’homme, ainsi le lapin est le modèle préférentiel pour cette étude. Pour l’implantation en intramusculaires chez le jeune lapin, nous utiliserons de jeunes lapins de 8 semaines ± 1 semaine, à cet âge les processus de calcification sont plus rapides que chez l’animal adulte, ce qui permet d’écourter l’expérimentation

4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des cellules tumorales injectées dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, les autres portent des tumeurs sous-cutanées, et toutes passent par une irradiation localisée de cinq minutes, réalisée sur animal vigile maintenu en contention un quart d'heure. Le porteur décrit l'irradiation comme indolore et annonce une perte de poids inférieure à 5 % liée au passage des rayons sur l'intestin ou l'œsophage. Le bénéfice avancé, réduire les doses de radiothérapie chez des patients, est renvoyé à un transfert clinique lointain, quand les tumeurs greffées et les mini-chirurgies pulmonaires, elles, sont immédiates.

Objectifs

Le cancer du poumon est l'un des cancers les plus répandus. La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire et du microenvironnement tumoral de l’hôte. Nous voulons évaluer un nouveau traitement.Nous pensons que la combinaison radiothérapie + traitement spécifique peut s’avérer être très efficace. Par ailleurs, de nombreuses données précliniques et cliniques suggèrent que la combinaison de radiothérapie + traitement classique est prometteuse. Toutefois, les données cliniques en faveur sont encore parcellaires et de nombreux modèles murins restent résistants à ce traitement. Nous évaluerons donc la triple combinaison radiothérapie + traitement classique+ traitement spécifique pour voir si l’ajout ce traitement spécifique peut sensibiliser les tumeurs au traitement radiothérapie + traitement classique. Il a été observé que la radiothérapie pouvait induire des effets antitumoraux « abscopaux », c’est-à-dire en dehors du champ d’irradiation. Ainsi, l’irradiation d’une tumeur primaire peut entraîner un effet antitumoral sur une tumeur secondaire ou une métastase placée hors du champ d’irradiation. Cet effet « abscopal » est augmenté par les modulateurs de l'immunité. Nous testerons la triple combinaison thérapeutique dans un contexte de tumeurs multisites (plusieurs tumeurs portées par le même hôte) pour évaluer si le traitement spécifique peut augmenter l’effet abscopal.

Bénéfices attendus

50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostic de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet à distance induit par l’irradiation qui provient du système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.

Procédures

Les souris pourront avoir des injections (1 à 4) sous anesthésie locale, durée 1 minute maximum. Injection de cellules tumorales dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, n=1, durée 1 minute. Irradiation localisée sur souris vigiles, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée. Elle a lieu sans anesthésie pour les tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété légers et transitoires. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse pour l’irradiation du thorax dans le cas des tumeurs pulmonaires. L’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée et à dose raisonnable, elle n’induit pas une perte de poids conséquente (perte de poids de moins de 5% due à l’irradiation d’une partie des intestins ou de l’œsophage qui sont proches de la tumeur). L’administration traitements peut engendrer un stress transitoire léger. Les tumeurs peuvent gêner la souris modérement. L Pour les prélèvements de sang, les souris seront d’abord anesthésiées ce qui peut générer un stress léger et transitoire. La principale nuisance réside dans l’implantation en orthotopique des cellules cancéreuses pulmonaires qui se fait au cours d’une mini-chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures, ou pour respecter les points limites dans le cadre des études d'efficacité.

Remplacement

Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et le système immunitaire. Ceci permet donc l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement naturel. Ces interactions jouant un grand rôle dans les effets de la radiothérapie, il apparaît donc indispensable d’avoir une évaluation sur un modèle animal pour déterminer exactement les effets de ces immunomodulateurs avant d’envisager un passage en thérapie humaine. Aucun modèle in vitro ne permet actuellement d’obtenir la complexité présente dans un animal vivant (immunité, vascularisation, organo-dépendance,…).

Réduction

Uune analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives de croissance tumorale. L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes, suivie d’un test de comparaisons multiples pour tester la significativité du traitement triple combinaison par rapport aux doubles combinaisons. La dernière procédure ne sera menée que si les résultats des procédures précédentes sont prometteurs.

Raffinement

Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections, un anesthésique local sera utilisé. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. La chirurgie pour l’implantation du tumeur dans le poumon se fera sous anesthésie gazeuse, également par une personne très entraînée et un analgésique sera administré avant et après le geste opératoire pour limiter au maximum la douleur induite. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Un complément alimentaire énergétique sera donné en cas de perte de poids. De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines. Souris après sevrage.

Après une période d'acclimatation, chacun des six macaques à longue queue reçoit par voie intraveineuse, à quatre reprises espacées d'une semaine, des doses croissantes de molécules destinées à activer les récepteurs Toll-like. Des prélèvements de sang jalonnent le protocole, complétés par des prélèvements de nœuds lymphatiques sous anesthésie, après une mise à jeun pouvant atteindre seize heures. Le porteur mentionne des hématomes, des œdèmes, des douleurs au site de prélèvement et, plus rarement, une réouverture de plaie ou une infection, le tout classé d'un niveau de souffrance modéré. Les six animaux sont tués à la fin pour récolter leurs organes et mesurer la distribution et la toxicité des trois candidats-médicaments.

Objectifs

Cette étude permettra d’évaluer la toxicité aigue de trois molécules capables d’activer les récepteurs « Toll-like » (TLR) des cellules immunitaires administrés par voie intraveineuse à dose croissante chez le singe cynomolgus. Ce projet s'incrit dans le cadre du développement de plusieurs candidats médicaments novateurs capables d’imiter les acides nucléiques d'un rétrovirus afin d’activer la stimulation des cellules immunitaires du patients. Cette activation va permettre d’obtenir une réponse systémique des cellules anti-tumorales. À terme, l’objectif est de combiner l'immunothérapie utilisée contre les cancers avec une ou plusieurs de ce molécules améliorant ainsi la réponse des patient contre le cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché de nouveaux médicaments humain pour des indications tels que les cancers de la peau, de l'estomac, du colon etc… De plus, ces études génèrent des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles de futures études règlementaires sur le macaque. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux macaques.

Procédures

Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation. Ils recevront à quatre reprises un candidat médicament à doses croissante par voie intra veineuse avec un temps de repos d’une semaine entre chaque administration. Des prélèvements de sang, et un suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’effet du candidat médicament aux différentes doses. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les prélèvements de nœuds lymphatiques seront réalisés sous anesthésie et courverture analgésique après une période de mise à jeun. Les administrations des candidats médicaments et les prélèvements de sang sont moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Une sédation pourra être envisagée en cas de besoin.

Impact sur les animaux

Des réactions locales au niveau des sites d'administration peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations répétées (hématome, œdème léger, etc). La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de nœuds lymphatiques peuvent provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candicats médicaments.

Remplacement

Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex: in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux inclut dans cette étude sera réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. 3 lots de 2 animaux seront utilisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats fiables, interprétables et transposables.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager ; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine ; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plusieurs semaines sera mise en place avant le début de l'étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associées à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale...). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou que son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. De plus, ces médicaments ont pour objectif de stimuler des cellules agonistes des récepteurs TLR. Or, contrairement aux rongeurs, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l’Homme en termes d’expression de ces récepteurs, de cinétique de réponse, de voie de signalisation en aval ainsi que d’activation du complément. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces candidats médicaments. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Trois jours après le réveil, l'animal qui n'a pas repris de poids, dont le poil est hérissé, qui ne se toilette plus ou reste prostré est tué. 1 200 souris et 300 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie abdominale de quinze minutes sous anesthésie, puis jusqu'à quatre tests de mémoire pendant cinq semaines, dont un conditionnement de peur reposant sur un stimulus aversif, et un à trois prélèvements de sang. Il s'agit de tester des molécules du laboratoire contre le déclin cognitif que 10 à 13 % des patients de plus de 65 ans présentent trois mois après une opération, et aucun animal n'est gardé vivant, une réutilisation risquant de fausser les tests de mémoire suivants.

Objectifs

Chez la personne âgée, une des complications liée à un acte chirurgical se traduit par un déclin cognitif qui peut se prolonger au delà de 6 mois (mémoire, compréhension, sociabilité, problèmes d'attention...). Ces séquelles neurologiques postopératoires peuvent, 3 mois après l'opération, concerner 10 à 13% des patients âgés (+ de 65 ans). Elles sont liées au geste chirurgical en soi et non pas au type d'anesthésie qui peut être générale ou locale. Un des mécanismes probables à l'origine de ces troubles cognitifs est une propagation au système nerveux central de l'inflammation périphérique provoquée par la chirurgie. Le projet a pour but de reproduire les conditions d'une chirurgie chez l'animal et d'ensuite d'étudier les conséquences cognitives à l'aide de plusieurs tests comportementaux. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouvelles molécules ayant pour cible le système nerveux central. Ainsi au cours de ce projet l'objectif sera de tester les effets de nos nouvelles molécules sur les performances cognitives d'un modèle animal de déclin cognitif postopératoire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de fournir des données précliniques sur l’efficacité potentielle de nouvelles molécules pour réduire les troubles cognitifs postopératoires. A long terme, ce projet pourrait donc conduire à un bénéfice en clinique notamment chez les personnes âgées qui est une population présentant le plus de risques de développer des troubles cognitifs après une intervention chirurgicale.

Procédures

Les souris ou les rats vont subir sous anesthésie un geste chirurgical d'une durée maximale de 15 minutes et ensuite passer pendant 5 semaines une série de maximum quatre tests de mémoire. Ces tests de mémoires basés sur des phases apprentissage et d'oubli spontanné pourront durer entre 1 à 5 jours chacun. Un à trois prélèvements sanguins pourront être réalisés dans les 5 semaines qui suivent la chirurgie. Des molécules à tester pourront être administrées par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intramusculaire.

Impact sur les animaux

Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, même s'il y a administration d'analgésiques nous ne pouvons exclure à minima une gêne voire une douleur résultant du geste chirurgical au niveau de la paroi abdominale. Dans une moindre mesure on aura le stress de la courte contention liée à l'administration des composés à tester par voie orale, voie intrapéritonéale, voie intramusculaire ou voie sous-cutanée qui pourront également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, le passage dans les différents tests comportementaux peut être source de stress voire source de douleur passagère dans le cadre du test de conditionnement de peur au cours duquel les animaux reçoivent un stimulus aversif.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanismes de mémorisation, toutes réutilisations des animaux dans d'autres études comportementales pourraient être biaisées par les tests précédemment réalisés.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire suite à un geste chirurgical il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe que la mémoire mettant en jeu de multiples zones du cerveau ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De plus, les nouvelle molécules à tester peuvant aussi bien avoir une action périphérique qu'une action au niveau du système nerveux central devront être testées sur un animal entier.

Réduction

En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire pour la robustesse des tests statistiques. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant qu'un seul groupe recevant une molécule de référence. 5 groupes d'animaux seront nécessaires par expérimentation : 1 groupe non opéré et 4 groupes d'animaux opérés pouvant recevoir un véhicule, un traitement de référence, et 2 nouvelles molécules à tester ou une seule molécule à tester mais à 2 doses différentes. Nous prévoyons 4 expérimentations par an avec des souris soit un total de 240 souris par ans, 1200 sur 5 ans et 1 expérimentation par an avec des rats soit un total de 300 rats sur 5 ans.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu et avec accès libre à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu'aucune action puisse corriger ces déviations alors la mise à mort de l'animal sera envisagée. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec administration d'analgésiques en local (lidocaïne) et en systémique (buprénorphine). Dans le suivi postopératoire est prévue une administration de buprénorphine de manière systématique toutes les 10 à 12 heures, cependant si 3 jours après le réveil, l'animal présente des signes de mal-être (non reprise de poids, poil hérissé, absence de toilettage, prostration, absence de fèces....) alors il sera euthanasié. Si nous constatons une réouverture de la plaie dans les 3 jours qui suivent la fin de la chirurgie, des soins et des sutures pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisées et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, leur taille permet d'effectuer un geste chirurgical dans des conditions satisfaisantes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Les troubles cognitifs postopératoires concernant essentiellement des personnes âgées, les effets de nos nouveaux composés pourront être évalués sur des animaux plus âgés (maximum 18 mois).

576 souris subiront une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'électrodes, puis six heures d'enregistrement électroencéphalographique par semaine pendant un mois, avec un hébergement individuel de sept jours après l'opération. 1 728 souris au total vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome humain rare, elles peuvent présenter déformations articulaires, faiblesse musculaire, difficultés respiratoires, crises d'épilepsie, troubles de l'équilibre et constipation sévère. 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif étalés sur six mois, sans que le résumé indique lesquels.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal sodique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.

Procédures

Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.

Devenir

L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.

Remplacement

Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal sodique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.

Raffinement

Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.

10 800 souris vont recevoir une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des molécules radioactives fournies par des clients, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, soit à la fin de l'étude, soit dès qu'un point limite est atteint. Le protocole prévoit jusqu'à sept pesées par semaine, trois tontes, jusqu'à quatre administrations du composé et jusqu'à quatre prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, le dernier étant terminal. L'effectif n'est pas fixé par le laboratoire mais par le client selon sa molécule, et le porteur précise que 10 800 représente le maximum réalisable en fonction des demandes reçues.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles animaux sont encore aujourd’hui indispensables en cancérologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapies innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainsi leur destruction par l’émission de rayonnements ionisants) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Notre projet vise donc à quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au médicament d’y accéder et in fine de les détruire.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de tester différentes molécules thérapeutiques couplées à des radioéléments et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques ciblées et spécifiques de certaines cellules tumorales afin de les transférer en clinique en fonction de leur efficacité.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 s) ; Administration de composés thérapeutiques en SC , IP ou en gavage (maximum 1 fois /jour et 4 fois, 15 s) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 1 min) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (3 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composés thérapeutique en IV (maximum 1 fois/ jour ; maximum 4 fois, 15 s) ;

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous cutanées ; stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiothérapeutiques en sous cutanée, gavage oral ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessitent d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Il n’est pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro, l’animal semble donc être un modèle pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

Toutes les molécules évaluées dans cette étude ont été au préalable testées dans des modèles in vitro. De nombreuses molécules ont donc été mises de ce côté à cette étape. La pousse tumorale a été caractérisée dans des études vivo préalables. Le nombre d'animaux utilisé par groupe est donc déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenu avec sa molécule d'intérêt et du modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs SC). Ce nombre est réduit au minimum utilisable afin d'obtenir des données statistiquement relevantes. Enfin ce nombre est un maximum que nous pouvons réaliser en fonction des demandes de nos clients.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.