Recherche appliquée

Les porcs qui manifestent des signes cliniques graves sont mis à mort avant le terme prévu. 90 porcs de six semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour rechercher des lésions et quantifier le virus dans leurs tissus. Trente d'entre eux reçoivent par voie intranasale un virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin, puis subissent onze prises de sang et huit écouvillonnages nasaux sur animal vigile, les 54 sentinelles étant exposées à l'air qu'ils respirent. L'enjeu déclaré est la maîtrise d'une infection présente dans plus de 60 % des élevages porcins bretons, décrite d'abord par son impact économique pour la filière.

Objectifs

Le Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) est une maladie virale spécifique des suidés, à fort impact économique pour la filière porcine. L’infection par le virus du SDRP (SDRPV) induit des troubles de la reproduction chez les femelles gestantes et des problèmes respiratoires et retards de croissance chez les porcelets. En raison de son caractère immunodépresseur, ce virus favorise les co-infections virales et bactériennes au niveau respiratoire. Le SDRP est une maladie a distribution mondiale qui est particulièrement présente dans les zones à forte densité de production porcine. Ainsi, en France cette infection est présente dans plus de 60% des élevages de porcs en Bretagne. Il existe deux espèces du virus, le SDRPV-1 présent surtout en Europe et le SDRPV-2 présent en Amérique et en Asie. La transmission du virus se produit essentiellement de manière horizontale par contact direct entre un porc infecté et un porc sensible. La transmission verticale peut également se produire de la truie infectée aux fœtus au cours du dernier tiers de gestation. La transmission indirecte du virus peut se produire via du matériel ou des résidus contaminés. La transmission par les bioaérosols a également été démontrée pour les souches de SDRPV-2, avec une transmissibilité d’autant plus importante que la souche de SDRPV-2 est virulente. En ce qui concerne les souches de SDRPV-1, il n’existe quasiment aucune donnée sur la possibilité d’une transmission aéroportée. Cette question est d’autant plus intéressante à explorer que du génome du SDRPV-1 a été détecté dans des bioaérosols collectés dans ou à proximité de fermes infectées par ce virus. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude est d’évaluer en conditions expérimentales et sur des porcs d’élevage, la transmission aéroportée de 3 souches de SDRPV-1 de niveau de virulence variable (souche de virulence modérée, souche de faible virulence et souche d’origine vaccinale). Si la transmission aéroportée est démontrée pour au moins une des souches, un système d’assainissement d’air (filtration) sera évalué vis-à-vis de sa capacité à prévenir la transmission aéroportée du SDRPV-1. Etant donné que nous n’avons pas de données sur l’infection expérimentale de porcs d’élevage par la souche de SDRPV-1 de niveau de virulence modéré que nous souhaitons utiliser dans ce projet, nous mettrons en place un pré-essai (procédure n°1) visant à caractériser la virulence de cette souche et ses capacités de transmission directe.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de démontrer la capacité de transmission aéroportée pour les souches de SDRPV-1 qui est pour le moment seulement suspectée. Si cette transmission aérienne est avérée, elle pourra être prise en compte dans les mesures de prévention et de contrôle du SDRPV mise en place sur le terrain. Par ailleurs, l’évaluation d’un système d’assainissement de l’air par fitration pourrait permettre, s’il donne des résultats satisfaisants, de proposer une solution pour prévenir la transmission aéroportée de ce virus.

Procédures

Les animaux des groupes inoculés (n total = 30) recevront à J0 par voie intranasale du virus du SDRP ; une inoculation intranasale prend moins de 30 secondes par animal. Ces animaux seront soumis à un total de 11 prises de sang et 8 écouvillonnages nasaux sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes. Les animaux sentinelles (n total = 54) seront soumis à 11 prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes. Les animaux contrôle (n = 6) seront soumis à 3 prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes.

Impact sur les animaux

- Lors des inoculations intranasales de virus, les animaux subiront un stress dû à la contention. Ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère. - Suite à l’infection par le virus SDRPV de faible virulence, les animaux développeront une maladie d’intensité légère (fièvre modérée, légère diminution d’activité) qui durera 2 à 3 jours - Suite à l’infection par le virus SDRPV de virulence modérée, les animaux développeront une maladie d’intensité modérée (fièvre, apathie, baisse d’appétit, troubles respiratoires modérés) qui durera 3 à 5 jours - Lors des prélèvements (prise de sang et/ou écouvillons nasaux), les animaux subiront : + un stress dû à la contention. Ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère. + une douleur liée au prélèvement. Cette douleur sera d’intensité légère et de courte durée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’évaluer la présence de lésions induites par l’infection des différentes souches de SDRPV et de quantifier le virus présent dans différents tissus prélevés lors de l’examen nécroscopique.

Remplacement

Il existe des modèles d’infection in vitro ou bien ex vivo pour le virus du SDRP. Cependant ces modèles ne permettent pas de recréer le processus d’infection tel qu’il se produit à l’échelle de l’animal. Par ailleurs ces modèles ne permettent pas non plus d’évaluer la transmission du virus. Ainsi le recours au modèle animal est-il indispensable. Dans la mesure où seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le SDRPV, le modèle porc reste obligatoire.

Réduction

Tous les lots comporteront 6 animaux chacun de façon à avoir une puissance statistique suffisante. Pour l’étude de transmission directe ou indirecte, le nombre de 6 animaux sentinelles permet d’estimer les taux de transmission avec une précision satisfaisante.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables (mordilles, boules en matière plastique, tourniquets et tubes à relever et à abaisser) qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation). Afin de limiter les contraintes liées aux prélèvements, les écouvillons nasaux seront stoppés à partir de J21 puisqu’après cette date notre expérience montre que le génome du SDRPV n’est plus détecté dans ces prélèvements. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves (atteinte d’un point limite), ils seront mis à mort après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du SDRPV. Le virus étant spécifique de cette espèce, il n’est pas possible d’utiliser un autre modèle animal. En effet il n’existe pas d’autre modèle animal (ex : modèle murin) sur lequel le virus du SDRP a été adapté A 3 semaines d’âge, les animaux seront sevrés et transférés dans nos installations. Ils seront inoculés à 6 semaines d’âge. Cet âge correspond à la période de post-sevrage, à un moment transitoire où le système immunitaire devient mature, période propice aux infections SDRPV.

Cinq injections quotidiennes pour déclencher des polypes intestinaux, puis pour d'autres lots une greffe de polype sous la peau ou une injection de cellules tumorales dans le rectum irrité ou le cæcum : 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce des mises à mort avant l'apparition de gros polypes susceptibles d'altérer la santé, tout en reconnaissant que ces polypes peuvent provoquer un mal-être plus tôt que prévu. Il affirme par ailleurs que ces deux lignées transgéniques ne développeront jamais de cancer, alors que le projet vise à repérer les polypes capables de se transformer en cancer et de métastaser au foie. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs intestinales, et immédiatement si un point limite est atteint.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser de façon très approfondie l'hétérogénéité des polypes (tumeur benigne) intestinaux pré-cancéreux afin d'identifier des marqueurs de prédiction de leur progression ou non en cancer. Pour ce projet, nous utiliserons des modèles de souris qui développent spontanément des polypes dans l'intestin. Ces modèles sont très pertinents pour la bonne réalisation de notre projet grâce ils représentent très bien ce qu'il se passe chez l'homme. Dans un premier temps, nous caractériserons les différences entre les polypes selon leur localisation et leur taille. Certains polypes seront utilisés pour l'étude de l'expression de gènes, d'autres seront utilisés pour la caractérisation de la présence de vaisseaux sanguins et lymphatiques, de fibroblastes et de cellules immunitaires. Dans un deuxième temps, nous identifierons le profil de facteurs protéiques produits localement par ces polypes ainsi que ceux libérés dans la circulation sanguine. Puis, nous avons pour objectif d'identifier quels sont les polypes qui ont la capacité à se transformer en cancer et à migrer dans d'autres organes vitaux tels que le foie, site préférentiel de métastases dans le cancer du côlon.

Bénéfices attendus

Grâce à la caractérisation approfondie de l’hétérogénéité des polypes intestinaux avec l’identification de signatures géniques, l’infiltration inflammatoire et de facteurs protéiques solubles locaux mais aussi dans la circulation, nous espérons identifier un ou des marqueurs sanguins spécifiques qui permettront de distinguer les polypes qui ont ou non le potentiel de se transformer en cancer. Ce projet est très pertinent en cancérologie puisqu’à l’heure actuelle, il n’y a pas de marqueurs sanguins spécifiques qui permettent de différencier les polypes à faible risque de ceux à haut risque de progresser en cancer du côlon. Si nous arrivons à mettre en évidence un ou des marqueurs sanguins qui permettent de savoir si le patient est en train de développer un adénome qui a le potentiel de se transformer en cancer, cela permettra d’éviter des coloscopies de dépistage inutiles et sûrement une compliance plus importante grâce à ce test de dépistage sanguin, pas seulement par rapport à la coloscopie mais aussi par rapport au dépistage Hemocult. D’après la littérature et les cliniciens, il y a un réel besoin de trouver une méthode alternative de dépistage précoce qui sera rapide, non invasive, peu couteuse et qui pourra être utilisée sur une plus grande population, pour dépister un adénome douteux même chez des patients asymptomatiques.

Procédures

Les animaux trangéniques (nous utilisons 2 modèles différents, 330 animaux au total) vont recevoir des injections d'une molécule à des doses non toxiques afin d'induire le développement de polypes spécifiquement dans l'intestin (durée de l'injection par animal : 10 sec). Les animaux recevront 5 injections au total, 1 par jour pendant les 5 premiers jours. Afin de déterminer le potentiel des polypes à se transformer en cancer et à former des métastases, les souris contrôles vont être soumis à des procédures chirurgicales de quatre types différents : Injection sous la peau de cellules issues de polypes (50 souris, chirurgie de 10-15min), greffe sous la peau d'un polype entier (50 souris, chirurgie de 10-15min), injection de cellules issues de polypes dans le rectum" irrité" (100 souris, chirurgie de 10-15min) et finalement injection de cellules de polypes dans le cecum (100 souris, chirurgie de 10-15min) (25-30min).

Impact sur les animaux

Le développement de polypes dans l'intestin sera induit chez les souris transgéniques qui seront euthanasiées avant que les souris ne commencent à développer de gros polypes qui peuvent vraiment altérer la santé de l'animal. Mais la présence de ces polypes dans l'intestin peuvent induire chez certains animaux un mal être plus tôt que prévu. La molécule aux doses utilisées n'est pas toxique pour les animaux mais son injection va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les injections de cellules de polypes en sous-cutanée va induire un léger stress et une douleur de courte durée au point d'injection. Les autres nuisances proviendront des actes chirurgicaux : des douleurs pré et post-chirurgicales. Si les cellules de polypes poussent et se transforme en masse ou tumeur, cela peut induire de la douleur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour effectuer les prélèvements nécessaires au projet tels que les tumeurs intestinales. Si un des points limites est observé avant le temps suggéré pour chaque procédure, l'animal sera immédiatement euthanasié. Une grille de scoring pour chaque procédure sera mise en place.

Remplacement

L'utilisation des modèles murins de tumorigenèse intestinale précoce tels que les modèles décrits dans ce projet, est le seul moyen pour répondre au mieux aux questions posées dans ce projet. Il n'existe pas aujourd'hui de modèle in vitro pouvant récapituler l'hétérogénéité et la complexité des adénomes.

Réduction

Le nombre de souris que nous devons inclure dans nos expériences a été calculé rigoureusement pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée. Pour le projet, nous avons besoin de prélever plusieurs adénomes sur la même souris, des adénomes de tailles différentes et surtout à des localisations différentes dans l'intestin dans les 2 modèles animaux transgéniques. Parfois certaines souris développent moins d'adénomes que d'autres ou sont localisées à un certain endroit de l'intestin et moins dans les autres. Pour l'étude de la progression tumorale, nous avons des mises au point à faire pour déterminer quel modèle sera le plus adapté pour étudier la progression tumorale (injection de cellules ou greffe d'adénome en sous-cutanée) et métastatique (caecale ou rectale). Cependant, si nous voyons qu'une procédure fonctionne et est appropriée pour répondre à notre question pour le projet, nous arrêterons les autres procédures et n'utiliserons pas toutes les souris demandées. De plus, pour ce projet, nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.

Raffinement

En plus des bonnes conditions d'hebergement, nous éviterons les animaux isolés et si un mâle doit être isolé, une femelle de compagnie agée sera rajoutée dans la cage. Une grille de scoring avec des points limites adaptés à chaque procédure sera utilisée pour éviter des douleurs inutiles aux animaux. Pour les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques (locaux et sous-cutané) en pré- et post-opératoire.

Choix des espèces

Notre projet utilisera deux modèles de souris transgéniques car il sont les plus pertinents pour répondre à nos questions. Dans ces 2 modèles de souris, les animaux vont développer des polypes spécifiquement dans l'intestin et ne développeront jamais en cancer. C'est pour cela que nous avons choisi ces 2 modèles qui sont très proches de ce qu'il se passe chez l'homme pour essayer de déterminer un ou des marqueurs de prognostique de risque à développer un cancer. Les animaux recevront la molécule pour induire les polypes à 8 semaines (quand l'intestin est mature) et seront ensuite utilisées pour le projet 5 mois après l'administration du produit. Concernant les chirurgies, les souris contrôles seront utilisées entre 6 et 8 semaines.

260 souris vont être utilisées, chacune passant onze échographies cardiaques sous anesthésie entre deux et sept mois, et 120 d'entre elles recevant en plus 75 gavages, un tous les deux jours pendant cinq mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à sept mois, le cœur prélevé lors d'une chirurgie terminale. La lignée utilisée développe à partir de quatre mois une cardiomyopathie dilatée qui évolue en insuffisance cardiaque, avec une cyphose, environ 20 % de perte de poids et une espérance de vie réduite. Le porteur écrit que la complémentation alimentaire testée "ne provoque aucune nuisance" et devrait plutôt être bénéfique, sur des animaux dont la maladie est justement ce qui les rend utiles.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre la contribution d’une voie de signalisation moléculaire à la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) et d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques. La CMD se caractérise par une dilatation du ventricule gauche, une réduction de la fonction systolique possiblement associée des arythmies. Malgré l'efficacité des traitements classiques de l'insuffisance cardiaque, la CMD présente un taux élevé d'hospitalisations qui impose une charge financière aux systèmes de santé, liée à l’implantation de stimulateurs cardiaques et/ou des procédures de transplantation. Il est donc nécessaire de poursuivre l’étude des mécanismes physiopathologiques pour identifier des cibles thérapeutiques actionnables afin d’arrêter ou inverser le cours de cette maladie cardiaque. Plusieurs études ont montrées que la modulation la voie de signalisation moléculaire étudiée à l’aide de petites molécules présentent un intérêt croissant pour le traitement de la CMD. Si un nombre important de ces études expliquent les effets bénéfiques par l’activation de voies cellulaires connues, peu d'entre elles ont exploré l'impact de cette voie de signalisation dans la CMD. Des recherches complémentaires sont nécessaires pour comprendre dans quelle mesure cette voie de signalisation moléculaire étudiée joue joue un rôle dans le développement de la CMD. Nous proposons d’identifier l’ensemble des protéines impliquées dans cette voie de signalisation dans le cœur d’un model murin de CDM, d’identifier les protéines d’intérêt et d’étudier le rôle de ces protéines dans la CDM. Pour y parvenir, nous administrerons des molécules régulatrices de cette voie de signalisation par gavage ou injection intraveineuse. La fonction cardiaque des animaux sera évaluée en échographie. Apres traitement nous procèderons à l’analyse protéomique, biochimique et moléculaire des cœurs extrait des animaux traités.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette étude est de mettre en évidence un nouveau mécanisme de signalisation moléculaire impliqué dans le développement de la cardiomyopathie dilatée. L’identification de ce nouveau mécanisme ouvrira la voix à de nouvelles perspectives thérapeutiques qui seront étudiées à la suite de ce projet. La cardiomyopathie dilatée à une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la CMD proviennent d’insuffisance cardiaque (70 pourcent) et d’arythmies (30 pourcent). Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc d’un intérêt majeur en matière de politique de santé publique.

Procédures

Evaluation de la fonction cardiaque en échographie. 260 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tout les quinze jours sur animal anesthésié. Soit 11 échographies par animal. Chaque échographie dure environ 5 minutes. Traitement par gavage. 120 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tous les deux jours sur animal vigil. Soit 75 gavages par animal. Chaque gavage dure environ 30 secondes. Injection intra péritonéales. 164 animaux à l’âge de 7 mois sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Injection intraveineuse. 160 animaux, une fois à l’âge de 3-5 jours sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie: 164 animaux à l’âge de 7 mois. Soit une fois par animal. Une chirugie dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable qui débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois. Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Le régime alimentaire des animaux sera complémenté par un composé impliqué dans la voie de signalisation moléculaire d’intérêt. Cette complémentation ne provoque aucune nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux à long terme et devrait plutôt avoir un effet bénéfique. Toutefois, la méthode de délivrance par gavage peut générer un stress et une légère irritation au niveau de l’œsophage. Les injections nécessaires à ce projet peuvent générées un stress et une légère douleur lors de l’injection intraveineuse et en post injection pendant quelques jours.

Devenir

L'ensemble des animaux (260) sera euthanasié pour prélèvements d'organes. Le prélèvement des organes et notamment le cœur est indispensable pour effectuer les analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique abordée dans ce projet.

Remplacement

Les cardiomyocytes adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Les cardiomyocytes adultes se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires derivée de cellules souches, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. La lignée mutée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux sauvages seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Le fait d'injecter les virus chez des souriceaux entre 3 et 5 jours de vie nous permettra d'exploiter toutes les naissances, quel que soit le jour de la semaine où elles surviennent du fait des accouplements continus (pas d'injection le week-end) et ne pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Au total nous utiliserons 260 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Les points limites seront évalués régulièrement. Si un animal dépasse ces points limites, il sera euthanasié. Afin de prévenir au maximum l’irritation liée au gavage, nous utilisons des sondes de gavage en plastique souple dont la longueur et le diamètre sont adaptés à la morphologie de l’animale. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous privilégierons les injecterons par voie systémique afin d’éviter une chirurgie cardiaque lourde. Dans le but de limiter au maximum le nombre de manipulations réalisées sur les souriceaux, leur stress ainsi que celui de leur mère pour favoriser leur survie, nous identifierons par tatouage les souriceaux injectés. Pendant tout le temps que durera l'injection d'une portée, les souriceaux seront séparés de leur mère et gardés ensemble dans un peu de litière provenant de leur cage, puis ils seront rendus ensemble à leur mère en les déposant hors du nid. Nous vérifierons qu'ils sont bien repris en charge par la mère et ramenés au nid. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives. Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place pour tous les animaux impliqués dans la procédure de chirurgie sans réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant la mutation d'intérêt responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire de cardiomyocyte dérivés de cellules souches, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des souris à différents stade de la progression de la pathologie étudiée (3, 5, et 7 mois) afin d’avoir une analyse complète du phénomène. De plus nous utiliserons des souriceaux pour l’injection de molécules d’intérêts. Cela présente l’avantage de diffuser ces molécules à l’ensemble des organes de l’animal, de limiter la réponse immunitaire et d’éviter un acte chirurgical lourd dans le cas de l’utilisation d’animaux plus âgés.

Mesurer la valeur nutritionnelle de matières premières pour trois sociétés clientes fabricantes d'aliments : 210 coqs adultes vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 42 par an, renouvelés chaque année. Ils sont enfermés en cages individuelles pour que la totalité de leur ingéré soit contrôlée et la totalité de leurs fientes collectée sur des plateaux, les nuisances attendues étant des modifications de consistance des fientes et des régurgitations. En fin d'essai, certains partent chez des particuliers pour finir en basse-cour, les autres à l'abattoir, le taux d'adoption variant selon les années. Le porteur qualifie ce dispositif d'"indispensable" pour mettre à jour les tables d'alimentation qui servent aux fabricants d'aliments français et étrangers.

Objectifs

L'objectif du projet consiste à pouvoir mesurer la valeur nutritionnelle des matières premières destinées à l'alimentation animale. En connaissant plus précisément les valeurs nutritionnelles des matières premières, cela permet aux experts de la nutrition animale de mieux répondre aux besoins physiologiques des animaux d'élevage, de mieux utiliser les matières premières disponibles sur le marché. Ainsi, nous optimisons les aliments qui nourrissent plusieurs millions de volailles chaque année en France et dans le monde au travers de nos clients fabricants d’aliments. Si une matière première est mal évaluée nutritionnellement, elle sera mal valorisée par l’animal : il faudra plus d’aliment pour le nourrir, les rejets dans les fèces seront plus importants, ce qui augmente l’impact sur l’environnement. L’animal peut même être malade car il digèrera mal ce qu’on lui donne à manger. Pour formuler les aliments, les nutritionnistes utilisent des tables d’alimentation et des matrices qui caractérisent les matières premières utilisées. Pour une formulation de précision, il est indispensable de mettre à jour régulièrement cette matrice car elle doit prendre en compte les variabilités annuelles des matières premières, les nouvelles origines, les nouveaux co-produits industriels. Si ce travail n’est pas réalisé, la table d’alimentation sera vite périmée et la formulation sera mal réalisée avec les conséquences précisées ci-avant.

Bénéfices attendus

Ce dispositif est indispensable pour mesurer des digestibilités et ainsi évaluer les matières premières : cela permettra ensuite de compléter des tables de valeurs qui permettent de formuler les aliments des volailles d'élevage (aliments qui correspondront mieux aux besoins de l'animal). C’est le seul dispositif qui permet de maîtriser les consommations individuelles et de réaliser une collecte totale des fientes. Concrètement, afin de mesurer la digestibilité des matières premières, nous contrôlons l’ingéré alimentaire, nous récupérons l’excrété et par différence, nous mesurons les nutriments absorbés par l’animal. Les chercheurs réalisent une veille en permanence pour savoir ce qui est fait ailleurs dans le domaine public. Tous nos travaux sont réalisés pour 3 sociétés différentes et concurrentes sur le marché, ce qui permet de mutualiser certains savoirs (et de ne pas démultiplier les essais). De plus, nous collaborons avec d'autres instituts de recherche. Ainsi, certains de nos travaux sont intégrés dans des tables de composition et de valeur nutritive des matières premières destinées aux animaux d’élevage, qui servent à tous les fabricants d’aliment français voire étrangers.

Procédures

Les coqs sont peu sollicités, il n'y a pas de prélèvements sur animaux ou de procédures chirurgicales de réaliser. Les coqs sont d'abord placés dans les cages et entrent en phase d'adaptation (pendant laquelle aucune mesure n'est réalisée); afin que les coqs s'adaptent à leur nouvel environnement et à leur nouvel animalier. Les animaliers passent plusieurs fois par jour pendant les périodes de mesures pour collecter les fientes sur des plateaux sous les cages ou mesurer la consommation d'aliment dans les mangeoires, ce qui ne nécessitent pas de contact direct avec les animaux.

Impact sur les animaux

En fonction des matières premières testées, les nuisances attendues peuvent être des modifications de consistance de fientes ou des régurgitations.

Devenir

Soit les animaux poursuivent leur vie chez des particuliers (qui les élèvent ensuite dans leur basse-cour) soit ils sont envoyés en abattoir dans des conditions identiques à des volailles élevées sur le terrain et donc conformes aux standards d'élevage de l'espèce. Le taux d'adoption dépend des années. Les coqs sont remplacés une fois par an.

Remplacement

Les évaluations de ces matières premières à partir d’analyses chimiques restent problématiques et les techniques in vitro utilisant des préparations enzymatiques sont encore délicates à mettre en œuvre. De plus, elles demeurent imprécises quand on cumule l’incertitude des modèles de prédiction à celle associée à la variabilité analytique. L'objectif de ce projet est d'évaluer des matières premières pour les utiliser dans l'alimentation animale (notamment en volailles), c'est pourquoi il est nécessaire de faire appel à des oiseaux. Nous utilisons des coqs adultes pour effectuer les mesures sur un animal en entretien et ne pas avoir le biais des animaux en croissance. Cela permet de mesurer une énergie métabolisable à bilan azoté nul (ni gain, ni perte de poids).

Réduction

La méthodologie utilisée s’appuie sur la publication d'une méthode européenne qui fait référence en la matière dans le domaine. Cette méthode de référence permet de déterminer l’énergie métabolisable des matières premières sur des coqs adultes. Il s’agit d’une méthode de référence qui détermine l’énergie métabolisable des matières premières sur des coqs adultes. Pour ce faire, nous récoltons la totalité des excrétas (fèces et urine grâce à des plateaux sous les modules) pour récupérer la totalité de la fraction non digérée correspondant à la totalité de l’ingéré alimentaire que nous avons mesuré en parallèle. Nous mesurons ainsi l’énergie disponible pour le métabolisme (entretien et production) de l’animal. Compte tenu de la variabilité animale, environnementale et de la précision que nous recherchons pour le calcul des valeurs nutritionnelles, 8 coqs /régime sont nécessaires. 42 coqs / an x 5 ans = 210 coqs. Les coqs sont renouvelés chaque année. Pour chaque essai, nous testons 5 régimes alimentaires, 1 régime correspondant à une 1 matière première testée. 1 régime = 8 coqs, soit 40 coqs en tout. Nous avons 42 coqs en tout de façon à avoir 2 coqs de remplacement en cas de besoin. En effet, en fonction des points limites (tableau ci-après), un coq peut être retiré d’un essai. Ce nombre a été calculé afin de pouvoir observer des différences significatives (pour une valeur de probabilité de 5%, soit une chance sur 20 que notre hypothèse soit fausse) sur la digestibilité entre les groupes. Ce nombre a été déterminé par un test statistique de puissance de notre dispositif expérimental (avec calcul de la ppds = plus petite différence significative que le dispositif permet de détecter entre les groupes).

Raffinement

Au minimum, deux fois par jour le comportement (Chant, position, attitude, boiterie) est observé. A chaque début d’essai ces critères sont évalués en suivant la grille de notation présente en annexe. -Si la note cumulée est >= à 3, on retire l'animal de l'essai : distribution d’un aliment standard (entretien) et on installe un repose patte plastique disposé dans la cage si présence de boiterie (ce que nous n’avons jamais vu mais si cela devait arriver, voici la mesure qui serait prise), -si la note est >= à 6, l'animal est euthanasié.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible (mesures de digestibilité de matières premières destinées à l'alimentation animale et notamment des volailles). Nous utilisons des coqs adultes pour effectuer les mesures sur un animal en entretien et ne pas avoir le biais des animaux en croissance. Cela permet de mesurer une énergie métabolisable à bilan azoté nul (ni gain, ni perte de poids).

Tuées à la fin de l'étude pour que leurs artères et la prothèse implantée soient examinées au microscope, 12 brebis adultes de cinq à huit ans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent quatre anesthésies générales, une chirurgie des carotides, quatre scanners avec produit de contraste et une échographie hebdomadaire pendant trois mois, entre deux établissements séparés par cinq heures de route. La liste des atteintes attendues comprend la douleur postopératoire, les infections, les risques hémorragiques ou thrombotiques et le stress du transport. Le porteur indique que le dispositif a déjà été testé sur simulateurs, et affirme que la complexité du système cardiovasculaire "impose" désormais l'essai sur un animal.

Objectifs

En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artérielles étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation, ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3 à 4,1 %, et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artériel, qui est employé pour la prise en charge de ces pathologies vasculaires. Cette étude sera réalisée dans deux établissements utilisateurs différents car les deux établissements ont des spécificités, des matériels et des expertises différentes nécessaires aux différents stades de l’étude.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.

Procédures

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Dans l'établissement utilisateur EU1, tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Dans l'établissement utilisateur EU2, les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28 (de l'EU1 vers l'EU2), après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport (de l'EU2 vers l'EU1) sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont le stress, la douleur, les infections, et les risques hémorragiques ou thrombotiques. Mise à jeun la veille le l'intervention (stress). Isolement des animaux pour l'induction de l'anesthésie (stress). Contention des animaux (stress) lors des manipulations, soins, traitement et échographies doppler réalisées sur animal vigile. Mise en place d'une perfusion veineuse (hématome, saignement, inconfort au passage de la peau) : douleur, infection, Intubation, mise sous respiration mécanique et anesthésie générale. Incision des zones opératoires, pose des prothèses artérielles, sutures au niveau des incisions : douleur, risque hémorragique, risque d'occlusion vasculaire en post opératoire. Injection de produit de contraste iodé lors des scanner (réaction allergique). Douleur post opératoire. Transport des animaux entre les établissements utilisateurs (stress).

Devenir

Tous les animaux (n=12) du projet seront mis à mort à la fin de l'étude. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Le dispositif a été testé au préalable sur des simulateurs. Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de finir la validation de la mise en œuvre technique et appréhender l’efficacité et les risques associés à plus long terme. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La procédure a été préalablement sécurisée par la réalisation d’études ex vivo sur banc d’essai et d’études préalables sans réveil ou courte sur un nombre restreint d’animaux. Cette étude sera réalisée sur 6 brebis . Cependant, en cas de mort prématurée d'un animal en cours d'intervention chirurgicale ou lors de la phase de suivi, ou dans le cas ou une amélioration du dispositif apparaitrait comme nécessaire, cette étude pourra être reconduite sur un maximum de 6 animaux. Ils ne seront commandés qu'après étude et analyse des résultats sur les six premiers animaux.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux arriveront et seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2 par box) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés dans un box sur litière (fibre de bois ou paille) avec des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5 jours sera respectée avant le début de la procédure. Les gestes interventionnels (chirurgie, imagerie doppler avec injection de produit de contraste, imagerie par échographie doppler) seront toujours réalisés par du personnel formé permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Les contrôles effectués pour le suivi de l’efficacité du dispositif tout au long de la procédure se feront par imageries médicales (échographie doppler, scanner) qui sont des approches non invasives, et qui ne sont pas source de douleur. Au temps basal puis à 7 jours, 21 jours, et 4 mois après chirurgie par scanner sous anesthésie générale avec administration de produit de contraste; et de 1 mois à 4 mois (tous les 7 jours) par échographie doppler sur animal vigile. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille d'évaluation de la douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations bi-quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place d'une perfusion, l’échographie doppler, les administrations des traitements est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress.

Choix des espèces

La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période de suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diamètre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.

930 souris vont être utilisées, chacune recevant cinq injections en dix jours puis deux par semaine pendant dix semaines, avec un prélèvement de sang au coin de l'œil sous anesthésie chaque semaine du traitement. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, pour l'analyse de leur système immunitaire et de leurs organes. La plupart développent spontanément un lupus, avec des atteintes rénales possibles dans les formes avancées, un autre groupe recevant une injection d'huile pour déclencher la maladie. Le porteur indique que le nombre d'animaux nécessaire à la puissance statistique est de dix par groupe, sans expliquer comment il parvient à 930.

Objectifs

Pour qu'un cancer puisse se dévelloper les cellules tumorales doivent produire des composés inhibant le système immunitaire. Partant de ce constat notre équipe a réussi à isoler, à partir de secretion de cellule tumorale, des composés ayant des capacités inhibitrice de l'immunité et permettre de trouver de nouveau outils thérapeutiques dans les maladies caractérisé par un excés d'activation de l'immunité contre son hote, les maladies auto-immune. Un composé a démontré une efficacité particulierement efficace dans des systèmes simplifié de l'immunité notamment sur les lymphocytes B. Le but de se projet et de montrer l'efficacité de cette molécule dans des modèles plus complet récapitulant toute la complexité du système immun. Afin de mieux comprendre les mécanismes d'actions de ce composé les souris seront vacciné contre différentes substance, le but étant d'induire différent type de réponse vaccinal et voir quelles types de cellules sont impactés par ce composé et comment est modulé la réponse vaccinale. Du fait de son potentiel sur les lymphocytes B nous allons nous concentré sur le lupus qui est une maladie auto-immune ou l'implication des lymphocytes B n'est plus a démontré. Le lupus étant une maladie complexe dépendant d'énormément de facteur nous allons utilisé différent modèle murins de lupus permettant de modéliser different aspect de la maladie et essayer de les traiter avec notre composé.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront d’une part de comprendre les mécanismes par lesquelles les cellules tumorales peuvent inhiber le système immunitaire et proliférer et potentiellement développer de nouvelle thérapeutique afin de lever cette inhibition. D'autre part la description des ces mécanismes permettront de dévellopé de nouveaux outils thérapeutiques pour pathologies avec un excès d'activation du système immunitaire tel que les pathologies auto-immunes. En effet les thérapies actuellement disponibles, non spécifiques ou spécifiques du lymphocytes B vont engendrer de sérieux effets secondaires mais ont aussi un coût socio-économique non négligeable. Il y a donc une nécessité à développer de nouvelles voies thérapeutique à cibler.

Procédures

L'injection dans le ventre, dite intra-péritonéal est un moyen efficace pour diffuser un produit dans le système de la souris en n'entrainant quasiment pas d'incomfort et peut donc être effectué sur souris vigile. C'est cette voie qui est prévilégié pour toutes les injections dans nos différentes expériences. Pour la partie vaccination, les souris seront injecté 1 fois avec le vaccin et traité avec 5 injections pendant 10 jours. La majorité des souris vont dévellopé spontanément un lupus, cependant l'un des modèles va nécessiter une fois l'injection d'une huile pour induire un lupus. Les souris seront traité par notre composé par 5 injections pendant 10 jours puis 2 fois par semaines pendant 10 semaines. De plus afin de suivre l'évolution de la maladie le sang des souris sera prélévé 1 fois par semaine pendant toutes la durée du traitement. Ce prélévement se faisant au niveau du sinus au coin de l'oeil et pouvant être désagréable pour les souris, ils seront effectué sur souris sous anethésie générale par des professionnels formés. De plus afin de limité toutes séquelles sur l'animal une altéranance d'oeil gauche-droite sera effectué.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent entraîner une legère douleur de courte durée. Les modèles murins de lupus vont modéliser différents aspects de la maladie avec des degrés de sévérité variables en fonction des modèles. Dans les cas les plus avancé de la pathologie les souris peuvent dévelloper des atteintes rénales. Les souris seront prélevées une fois par mois pour l'urine sur la souris vigile et pour le sang par prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale. Ce geste peut entraîner une legère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasié afin de permettre d'une part une analyse détaillé du système immunitaire et évaluer l'inflammation ainsi que l'activité de la maladie et les atteintes d'organes.

Remplacement

Des études préliminaires de culture cellulaire in vitro ont été mises en place afin de minimiser au maximum l’utilisation de souris. Cependant seuls des modèles in vivo permettront d’une part d’étudier l’effet de ces nouvelles thérapeutique sur un organisme complet. D’autre part seuls des modèles in vivo permette de récapituler la dérégulation d’un système immunitaire complet ainsi que le phénotype délétère des pathologies auto-immune et donc de pouvoir d'évaluer l’intérêts thérapeutiques de ces nouveaux outils.

Réduction

Les test statistiques approprié seront utilisé pour comparer les différents groupes. et le nombre d’animaux nécessaires pour avoir la puissance statistique necessaire est de 10. La cinétique des réponses immunitaires ainsi que les modèles murins de lupus présentent de la variabilité expérimentale, elles seront répétées pour renforcer l'approche statistique. Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux à utiliser afin de pouvoir conclure avec une confiance suffisante. Afin d’éviter tout biais expérimentaux les cohortes seront randomisées et afin d’éviter les effet cage les animaux d’une même cage recevront des traitements différents en fonction des groupes expérimentaux. De plus afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux tous les organes d’intérêt seront recueillis à chaque fois et utilisé ou congelé.

Raffinement

Le principe de raffinement décrit au second de l'article R. 214-105 du code rural et de la pêche maritime sera appliqué. Le bien-être des souris sera prise en compte tout au long de la procédure expérimentale. Les souris seront hébergées dans des cages de 2L à 5 animaux par cage. Chaque cage recevra un enrichissement du milieu de type nids de woodwoll. Pour réduire la douleur et la souffrance, les gestes techniques effectués sur les animaux seront réalisés par du personnel habilité et chevronné. De plus tout le long des procédure l’état générale des animaux sera évalué selon une grille de score objective permettant d’évaluer le stress et la détresse des animaux.

Choix des espèces

Les modèles murins de lupus sont les seuls disponibles permettant de récapituler certains aspects de la physiopathologie humaine. De plus, les modèles murins offrent le meilleur équilibre entre la capacité de produire des résultats satisfaisants et la susceptibilité à induire de la douleur, du stress ou des dommages durables. Les stades de développement ont été choisis afin de modéliser différents moments dans l'évolution de la maladie. Ainsi, dans certains cas, des souris jeunes seront utilisées afin de modéliser l'apparition de la pathologie, tandis que pour modéliser des états plus avancés de la pathologie, nous utiliserons des souris âgées.

Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.

Objectifs

Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.

Devenir

Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.

Choix des espèces

Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

Immunodéprimées pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de carcinome à cellules de Merkel leur sont injectées sous la peau, suivies d'une injection intrapéritonéale quotidienne pendant quatre semaines, molécule testée ou solvant. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé lors des études précédentes. Toutes sont tuées à l'issue, la pesée finale des tumeurs imposant leur mise à mort.

Objectifs

Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané agressif avec une survie estimée à 50 ans de seulement 40%. Il survient principalement chez le sujet agé de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffes d'organe, infection par le VIH). Dans 80% des cas les CCM sont dit viro-positifs et sont dus à l'intégration du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCpV), les 20 % restants sont dis viro-négatifs et sont principalement dus aux expositions UV. Actuellement, au stade métastatique inopérable, une seule option thérapeutique efficace est disponible, l'Avelumab, mais des phénomènes de résistances primaires et acquises à ces traitements entrainent une réponse objective durable chez seulement 25% des patients, soulignant la necessité d'identifier des nouvelles stratégies thérapeutiques dans ce domaine. Des méthylations abérrantes de l'ADN ont été démontré comme étant des modifications importantes et fréquemment retrouvées dans les cellules cancéreuses. Il a été démontré dans plusieurs types de cancers que l'utilisation de molécules hypométhylant l'ADN permettait de reprogrammer les cellules tumorales vers un état "normal", re sensibilisant ces cellules à la chimiothérapie et à l'immunothérapie. Par exemple, les premières générations d'agent hypométhylant l'ADN, tel que l'azacitabine et la decitabine sont utilisés en routine pour le traitement des leucémies myeloïdes. Une nouvelle molécule hypométhylante, la guadecitabine, est actuellement en essai clinique. Nos données préliminaires démontrent que cette molécule est capable in vitro de diminuer la prolifération cellulaire et la viabilité des CCM. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer in vivo l'efficacité anti tumorale de cette molécule sur les CCM.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d'évaluer l'efficacité anti tumorale d'un agent hypométhylant, la guadecitabine, dans l'indication Carcinome à cellules de Merkel. Actuellement, au stade métastatique inopérable, seul l'immunothérapie, Avelumab est efficace, mais l’utilisation de ce traitement, du fait des mécanismes de résistance innés ou acquis, ne permet d’obtenir une réponse objective durable que chez 25% des patients. La capacité à ré induire une expression des immunes check point, tel que PDL-1, cible de l'immunothérapie par l'Avelumab, sera également évaluée. Ainsi la guadecitabine pourra ensuite être évaluée en combinaison avec des inhibiteurs d'immune checkpoint (Avelumab) dans le cas du CCM.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de CCM (carcinome à cellules de Merkel) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés 1 fois par jour en intrapéritonéal avec la molécule ou le véhicule pendant 4 semaines. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutané et une contention quotidienne pour l'injection en intrapéritonéale. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intrapéritonéale. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes. Une sédation avec injection en intrapéritonéal d'acépromazine sera effectuée avant la mise à mort par élongation cervicale afin de limiter toutes douleurs chez l'animal.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité de la guadécitabine a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de CCM. L'obtention de l'efficacité de la molécule sur ces différentes lignées et les données déjà publiées sur des molécules similaires de première génération dans l'indication des CCM, limitent le nombrer de souris à utiliser, en nous permettant de tester une dose unique de guadécitabine. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de l'efficacité de cette nouvelle molécule sur la réponse anti-tumorale et sur sa capacité à re sensibiliser les cellules à de l'immunothérapie. Ces éléments, essentiels pour la validation de l'utilisation de cette molécule dans l'indication CCM nécessitent le passage par un modèle in vivo.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les injections en intrapéritonéales sont rapides et peu douloureuse, le geste technique est déjà maitrisé par les personnes qui manipuleront les souris. De plus, bien que les injections soient quotidiennes, elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d'engendrer des douleurs répétées au même point d'injection. Une friandise sera proposée aux souris après chaque injection en intrapéritonéal. Tout au long de l'étude, le bien être des animaux sera évalué à l'aide d'une grille de score, si les animaux atteignent les points limites définis antérieurement, ils seront sortis de l'étude afin de limiter toutes souffrances. De plus, pour éviter tout stress inutile, lors de la mise à mort un sédatif, sera injectée en intrapéritonéal avant l'euthanasie.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Colite provoquée par un produit dans l'eau de boisson, par sensibilisation de la peau suivie d'une administration rectale, ou par injections répétées pendant douze semaines : 6 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement d'organes entiers. Certaines lignées ont un système immunitaire déficient, ce qui les rend plus sensibles aux infections. La douleur liée à l'inflammation intestinale est estimée "légère à modérée au maximum", dans un texte qui décrit par ailleurs un risque de péritonite lié à la répétition des injections abdominales. Le porteur indique recourir en première intention aux organoïdes et aux systèmes d'intestin artificiel, puis conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".

Objectifs

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Elles représentent un fardeau majeur pour les populations occidentalisées. En effet, leur incidence et prévalence ont augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières décennies. Les thérapies actuelles ne sont que partiellement efficaces et principalement basés sur des immunosuppresseurs (médicaments affaiblissant le système immunitaire). Celles-ci sont associés à des effets secondaires, notamment des infections et des cancers. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons observé chez les patients atteint de MICI, une altération dans l’une des voies métaboliques qui est directement corrélé à l’inflammation. L'hypothèse principale du projet est de caractériser l'effet de cette enzyme dans les MICI afin de pouvoir développer l’enzyme humaine comme un candidat thérapeutique. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les MICI.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un programme de recherche complet et ciblé sur le métabolisme dans le contexte de la santé et des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). En France, les MICI concernent aujourd’hui près de 300 000 personnes (données 2021). L'approche que nous proposons est complètement nouvelle et basée sur des découvertes concernant le rôle des certains métabolites dans les processus inflammatoires. Notre approche est basée sur la modulation de certaines voies métaboliques, perturbées dans les maladies inflammatoires, afin de restaurer la production normale de métabolites anti-inflammatoires tout en diminuant la production de métabolites pro-inflammatoires. Ce projet multidisciplinaire intègre plusieurs facettes de l'immunité et métabolisme. Les études décrites dans le projet devraient améliorer notre compréhension des mécanismes délétères impliqués dans les MICI tout en identifiant une nouvelle stratégie thérapeutique utilisable chez les patients.

Procédures

Certains modèles subiront un traitement préalable pour induire le modèle transgénique à raison d’une injection intrapéritonéale quotidienne sur animal vigile (moins de 10 secondes) pendant 5 jours consécutifs. Certains modèles animaux utilisés dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Par la suite, nous mettrons en œuvre les différents modèles de colites mimant les aspects des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Les souris pourront être suivre au choix selon les groupes et questions scientifiques : i) Une colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) par jour pendant 7 jours à 12 jours. ii) Une colite induite par sensibilisation de la peau sous anesthésie (5 minutes) suivi d’une administration rectale sous anesthésie (5 minutes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) ou un gavage intragastrique (moins de 10 secondes) pendant 3 jours. iii) Une colite induite une injection intrapéritonéale de cellules (moins de 10 secondes) et/ou une injection intrapéritonéale sur animal vigile (moins de 10 secondes) au maximum une fois par jour pendant un maximum de 12 semaines. Afin de vérifier la composition du microbiote, les selles fraiches de chaque animal seront recueillies régulièrement sans contrainte pour l'animal. Les animaux seront simplement placés dans des pots transparents permettant aux animaux de bouger librement, et après quelques minutes (maximum 5 minutes) les animaux produisent des fèces spontanément. Afin de vérifier l’état métabolique des souris, les animaux subiront un prélèvent de sang de faible volume sur animal vigile par simple contention par une personne formé avec un matériel adapté en moins de 30 secondes. Les animaux seront ensuite euthanasiés selon une méthode réglementaire au temps prévu pour effectuer les différents prélèvements nécessaires pour répondre aux questions scientifiques du projet.

Impact sur les animaux

Le projet comprend différentes techniques d’administrations (gavages, injections intra-péritonéales) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. La répétition des injections au niveau abdominal peut entrainer un risque de péritonite (très rare). Nous réalisons des recueils réguliers de selles fraiches sans contrainte (animal libre de ses mouvements) qui ne devraient induire de nuisance ou tout au plus un léger stress lié au changement d’environnement durant quelques instants. Nous réaliserons également des prélèvements sanguins de faible volume pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère à modérée au maximum. Pour l’un des modèles de colite, une anesthésie est nécessaire et pourrait induire dans de rare cas, une mauvaise réaction (stress thermique, difficulté respiratoire, arrêt cardio-respiratoire). De plus, certains modèles utilisés dans le projet disposent d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.

Remplacement

Malgré le développement et l’utilisation en première intention de modèle non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation normale et inflammatoire. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu, un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.

Réduction

Ce projet impliquera donc un maximum de 6840 animaux. Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Devant la variabilité biologique inhérente à ce type d’expérience, les expériences seront réalisées deux à trois fois pour s’assurer de la robustesse des résultats obtenus. Néanmoins nous ne répéterons l’expérience que si les résultats vont dans le sens de l’hypothèse de travail et que la puissance statistique n’est pas encore atteinte.

Raffinement

permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (grille de suivi, point limite) et des soins adaptés. De plus, les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris non transgéniques mais également des lignées murines simples, doubles et triples transgéniques (toutes sur le même fond génétique). Justification des stades : Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 12 semaines de vie. Cet âge est couramment utilisé dans la littérature pour les modèles de colites. Justification du sexe : Nous utiliserons des mâles et femelles selon les productions en interne car nous étudierons les deux sexes qui sont relevant pour la pathologie en question.