Recherche appliquée

Quatre anesthésies générales, deux incisions de dix centimètres au niveau des carotides, treize séances d'échographie doppler en contention et deux transports routiers de cinq heures entre établissements : 12 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le prélèvement des artères et de la prothèse sert à confirmer par histologie ce que les images ont montré. L'objet du projet est la validation d'un instrument chirurgical destiné aux pontages artériels périphériques pratiqués sur des patients âgés. Le choix de la brebis tient au diamètre de ses artères, stable avec l'âge, contrairement au porc qui atteindrait 300 kg et rendrait le suivi impossible.

Objectifs

En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artérielles étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation, ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3 à 4,1 %, et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artériel, qui est employé pour la prise en charge de ces pathologies vasculaires. Cette étude sera réalisée dans deux établissements utilisateurs différents car les deux établissements ont des spécificités, des matériels et des expertises différentes nécessaires aux différents stades de l’étude.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.

Procédures

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28, après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Impact sur les animaux

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Dans l'établissement utilisateur EU1, tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Dans l'établissement utilisateur EU2, les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28 (de l'EU1 vers l'EU2), après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport (de l'EU2 vers l'EU1) sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Devenir

Tous les animaux (n=12) du projet seront mis à mort à la fin de l'étude. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Le dispositif a été testé au préalable surdes simulateurs. Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de finir la validation de la mise en œuvre technique et appréhender l’efficacité et les risques associés à plus long terme. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La procédure a été préalablement sécurisée par la réalisation d’études ex vivo sur banc d’essai et d’études préalables sans réveil ou courte sur un nombre restreint d’animaux. Cette étude sera réalisée sur 6 brebis . Cependant, en cas de mort prématurée d'un animal en cours d'intervention chirurgicale ou lors de la phase de suivi, ou dans le cas ou une amélioration du dispositif apparaitrait comme nécessaire, cette étude pourra être reconduite sur un maximum de 6 animaux. Ils ne seront commandés qu'après étude et analyse des résultats sur les six premiers animaux.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux arriveront et seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2 par box) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés dans un box sur litière (fibre de bois ou paille) avec des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5 jours sera respectée avant le début de la procédure. Les gestes interventionnels (chirurgie, imagerie doppler avec injection de produit de contraste, imagerie par échographie doppler) seront toujours réalisés par du personnel formé permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Les contrôles effectués pour le suivi de l’efficacité du dispositif tout au long de la procédure se feront par imageries médicales (échographie doppler, scanner) qui sont des approches non invasives, et qui ne sont pas source de douleur. Au temps basal puis à J7, J21, et M4 par scanner sous anesthésie générale avec administration de produit de contraste, et de M1 à M4 (tous les 7 jours) par échographie doppler sur animal vigile. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille d'évaluation de la douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations bi-quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place de la voie veineuse jugulaire externe, l’échographie doppler, les administrations des traitements est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress.

Choix des espèces

La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période de suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diamètre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.

Pour vérifier si la caille peut remplacer le poulet de chair comme modèle d'infection, 96 cailles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La bactérie Enterococcus cecorum, d'origine clinique ou intestinale, est vaporisée trente secondes sur la coquille des œufs ou sur le duvet des cailleteaux à la naissance, puis les oiseaux sont observés jusqu'à quatre semaines de vie avant d'être tués pour dénombrement bactérien. L'enjeu déclaré est sanitaire et économique pour une filière produisant 1,2 million de tonnes de poulet par an, la bactérie provoquant des lésions osseuses et articulaires et jusqu'à 10 % de mortalité en élevage. Le porteur annonce la boiterie comme seule nuisance attendue et indique que les points limites seront "affinés" après la première partie de l'expérience, donc fixés une fois l'infection déjà provoquée.

Objectifs

En moins de 20 ans, Enterococcus cecorum est devenu l’un des agents pathogènes majeurs dans les élevages de poulets de chair au niveau mondial. Cette bactérie du système digestif (microbiote intestinal) des volailles est responsable de pathologies locomotrices pouvant entrainer jusqu’à 10% de la mortalité dans les élevages. Elle est à l’origine d’une dégradation du bien-être animal, d’une utilisation accrue d’antibiotiques et de pertes économiques. Actuellement, aucun modèle d'infection ne permet de distinguer les bactéries cliniques des non cliniques ni d'étudier le processus de la maladie. Le développement de solutions préventives contre E. cecorum est donc conditionné à l’accès d’un modèle pré-clinique plus accessible. La caille est un modèle expérimental pour de nombreux travaux sur le développement, la toxicité, le comportement mais aussi sur les conséquences des modifications du microbiote intestinal sur la susceptibilité aux infections. Sa petite taille permet de l’élever en isolateur et ainsi de contrôler son microbiote. La caille et le poulet d’élevage appartenant à la même famille, notre objectif est d’évaluer si la caille est un hôte adapté pour reproduire le processus infectieux de E. cecorum. L’objet de ce projet est de déterminer la sensibilité de la caille à l’infection par E. cecorum et de déterminer l’effet du microbiote intestinal sur cette sensibilité. Pour ce faire nous comparerons le potentiel infectieux d’un groupe de bactérie d’origine clinique et d’un groupe d’origine commensal provenant d’un élevage non infecté chez la caille en présence ou non d’un microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

En France, la production annuelle de poulet de chair s’élève à 1,2 millions de tonnes équivalent carcasses. E. cecorum est décrit aujourd’hui dans les trois premières maladies infectieuses les plus problématiques dans cette production. Les connaissances zootechniques (rendre les animaux plus résistants), épidémiologiques et fondamentales sur la physiologie et la pathogénèse de E. cecorum doivent impérativement être renforcées pour à terme proposer des mesures de prévention et de maitrise de la maladie. La compréhension des voies de transmission et de contamination des élevages implique de disposer d’outils de détection rapide permettant de différencier les bactéries cliniques et non-cliniques. Le développement d’un modèle animal robuste reproduisant au moins la phase précoce de l’infection est nécessaire pour comprendre l’interaction de E. cecorum avec les bactéries du système digestif et son hôte.

Procédures

Toutes les cailles seront colonisées avec la bactérie E. cecorum d’origine clinique ou du système digestif par vaporisation sur la coquille d’œuf ou sur le pelage des cailleteaux à la naissance pendant 30 secondes. Les cailles seront ensuite observées jusqu’à 4 semaines de vie des animaux.

Impact sur les animaux

Si la caille s’avère sensible à Enterococcus cecorum, la bactérie pourrait provoquer une infection osseuse ou articulaire générant des troubles locomoteurs. Les nuisances attendues sont éventuellement la présence de boiterie. Les points limites et les nuisances seront affinés après la réalisation de la première partie de la procédure qui concerne l’évaluation de la sensibilité de la caille à l’infection par E. cecorum.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses pour dénombrement bactérien et études histologiques.

Remplacement

Les animaux sont des modèles expérimentaux permettant d’étudier des questions d’intérêt biologique très variées. Ils représentent des outils expérimentaux intégrant la multitude des interactions cellulaires et des processus physiologiques qui se produisent dans leur organisme. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites en totalité dans un modèle in vitro. Pour suivre l’évolution de l’infection par la bactérie E. cecorum et déterminer les interactions hôtes-microbiote (bactéries du système digestif), il est indispensable d’utiliser le modèle animal.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats.

Raffinement

Il y aura une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (ajout de copeaux sur le caillebotis etc…) et de la pesée, et une observation quotidienne accrue de l’état général de l’animal afin de surveiller l’apparition d’éventuels symptômes de lésions squelettiques entrainant des troubles locomoteurs. Des points limites adaptés à la pathologie sont mis en place. De plus, les animaux seront manipulés dès leur naissance afin de les habituer aux manipulateurs. Les cailles sont hébergées dans des isolateurs pour préserver leur statut microbien. Elles sont hébergées en groupe, en liberté dans l'isolateur, sur un caillebotis recouvert de litière. Nourriture et eau stériles sont distribuées à volonté. Ces conditions laissent une liberté de mouvement aux animaux, la litière leur permet d'exprimer leur comportement fouisseur et améliore le confort par rapport à un caillebotis nu. Des boites en plastiques retournées sont placées dans l’isolateur afin de leur servir de perchoir.

Choix des espèces

La caille est un bon modèle expérimental pour de nombreux travaux sur les conséquences des modifications du microbiote intestinal (ensemble des bactéries du système digestif) sur la susceptibilité aux infections. Pour notre projet, la caille est un modèle adéquat car elle fait partie de la même famille que le poulet d’élevage qui est l’objet de l’étude. Les cailles sont utilisées de la naissance jusqu’à 4 semaine de vie afin de suivre l’évolution de l’infection par E. cecorum.

Une lésion du nerf sciatique ou une injection d'agent inflammatoire installe chez 180 souris une douleur persistant plus de six semaines, avec allodynie mécanique, hyperalgésie au chaud et au froid et douleur spontanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant envisageable après la chirurgie. Chaque animal passe trois séances d'IRM d'une heure sous anesthésie et des tests comportementaux de deux heures, deux jours par semaine, pour cartographier les régions du cerveau activées selon le type de douleur. Le porteur écrit qu'en dehors de la douleur induite aucune procédure n'entraîne d'effet indésirable majeur, et présente la mise à mort finale comme un moyen d'éviter aux souris "toute souffrance inutile".

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux subiront une analyse par IRM de leur activité cérébrale. Les animaux seront analysés par IRM fonctionnelle pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 6 à 12 semaines, chaque séance durant environ 1h. Chaque animal subira 3 sessions d'IRM, espacées de 10 jours chacune, afin d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. Ces tests comportementaux permettront d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. Chaque session de comportement dure environ 2h. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des procédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeurs. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio- dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistantes. La douleur induite par les modèles de douleurs inclut : -une allodynie mécanique statique et dynamique persistante -une hyperalgésie thermique au chaud et au froid persistante -une douleur spontanée persistante. L'expérience du laboratoire avec ces modèles reporte que ces douleurs persistent environ 1 semaine dans le modèle CFA, et plus de 6 semaines dans le modèle SNI.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant subi une procédure chirurgicale, il n'est pas envisageable de les réutiliser dans un autre projet. Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par MEMRI.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans des cages contenant au maximum 4 males ou 5 femelles dans une pièce thermorégulée (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein d'une plateforme d'imagerie ayant une expérience reconnue dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation du manganèse est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modèle souris en lien avec les données préliminaires obtenues au laboratoire. Nous utiliserons des souris adultes pour comparaison avec les autres données de la littérature

792 souris vont être utilisées, toutes tuées au quatorzième jour pour examens histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sept injections intrapéritonéales d'anticorps humains, subit un test d'effort, deux microprélèvements sanguins sous anesthésie et une opération du mollet destinée à mesurer la perte de tonus musculaire. La maladie est provoquée par transfert d'autoanticorps prélevés chez des patients atteints de myopathie nécrosante auto-immune, et le porteur souligne que les souris malades ne montrent aucun signe visible, la faiblesse n'étant détectable qu'à l'appareil de mesure. Le compte de 792 découle du protocole retenu, 22 souris rendues malades et 22 témoins par modèle, appliqué aux neuf molécules candidates.

Objectifs

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux anticorps thérapeutiques permettant de soigner des pathologies autoimmunes du muscle. Celles-ci sont dues à un dérèglement du système de défense du corps impliquant des protéines . Il est donc important de neutraliser l'attaque du système immunitaire contre ces deux constituants pour relancer la fabrication de fibres musculaires solides et saines. Dans le cadre du remplacement, les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans cette maladie. Aujourd’hui, nous devons confirmer l’aspect préventif et/ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de la pathologie. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux bio-médicaments permettant de soigner les pathologies autoimmunes du muscle.

Procédures

Chaque animal subira : 7 Injections intra-péritonéales d'anticorps humain d’une durée de 30 secondes chacune, 1 test d'effort d’une durée de 1 à 2 minutes et enfin 1 intervention chirurgicale pour l'évaluation de la perte du tonus musculaire au niveau du gastrocnémien d’une durée maximum de 10 minutes. Les animaux seront soumis à 2 microprélèvements de sang (J0 et J7), prélèvements sous anesthésie, durée de l'acte moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris présenteront une perte de force musculaire symptomatique de la maladie. Dans de rare cas une fonte musculaire et donc une perte de poids seront observées.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie jusqu'à j14 où ils seront mis à mort pour examens histologiques.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro de fibres isolées, d’organoïdes ou de myoblastes en culture. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans les MNAI. Aujourd’hui nous devons confirmer l’aspect préventif et ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de MNAI. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Réduction

Nos modèles de maladies du muscle expérimentales chez la souris ont été optimisés et calibrés. Par expérience nous savons qu’il faut utiliser 22 animaux induits et 22 animaux témoins pour obtenir un résultat significatif et fiable pour chaque modèle de maladies du muscle. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement . Dans le but de réduire au maximum les animaux utilisés pour chacune de nos 9 molécules d’intérêt thérapeutique nous commencerons le test par le pouvoir préventif dans l’induction de maladies du muscle. En cas d’échec la capacité curative ne sera pas testée. En effet, selon le principe de fonctionnement de nos molécules, notre expertise nous permet de prévoir qu'il n'y aura pas d'effet thérapeutique.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement, notre unité a développé deux modèles de maladies du muscle expérimentales modérées en utilisant des autoanticorps issus de patients . La maladie se développe en 7 jours et présente des atteintes modérées au niveau des muscles squelettiques. Les animaux malades ne présentent aucun signe visible de la maladie et nécessite l’utilisation d’appareils de mesure de force non invasif pour détecter la maladie . Pour étudier l’aspect préventif de nos molécules les animaux seront traités à J-1 avant l’induction et la perte de force musculaire sera évaluée à J7 et J14. Pour l’effet curatif les animaux seront traités à J7 post induction et la force sera évaluée à J7 post traitement. La durée de la pathologie ne sera donc que de 7 jours afin de limiter au maximum tout inconfort de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 dans des cages adaptées avec un enrichissement à base de nids cartonnés et de tampons de ouate. De la nourriture sous forme de bouillie sera distribuée en plus des granulés afin de soulager toute atteinte des muscles masticateurs. Une surveillance quotidienne basée sur le grimace scale sera effectuée du début à la fin de l’expérimentation. Le grimace scale est un système d’évaluation de l’état de stress d’inconfort et de la douleur ressentie pour chaque espèce animale. Il est basé sur l’observation de 5 critères : Contraction orbitaire, gonflement du nez, gonflement des joues, position des oreilles et position des moustaches. Pour chaque item un score de 0 à deux est appliqué en fonction de l’état. Il permet d’obtenir des scores cliniques chiffrés. Au delà de 4 les animaux concernés seront sortis de l'étude et mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en sous-cutané).

Choix des espèces

La souris est un animal de choix pour l’étude des maladies auto-immunes. Les lignées établies en consanguinités permettent d’obtenir des modèles de pathologies calibrées et reproductibles. De plus un nombre important d’outils tel que les anticorps dirigés contre les différents marqueurs de populations hématopoïétiques nous permettent de « décortiquer » les phénomènes immunologiques qui interviennent dans la maladie. De plus nous avons développé depuis peu un modèle murin standardisé et optimisé de maladies du muscle par transfère d’autoanticorps issus de patients. Les souris seront agées de 8 à 10 semaines (en début de protocole) pour posséder un systême immunitaire complet et pleinement actif.

Tuées une heure, trois heures ou vingt-quatre heures après l'injection pour que leurs organes soient prélevés, 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une injection intraveineuse unique de nanoparticules censées acheminer un médicament directement vers un caillot cérébral, puis sont mises à mort selon le délai assigné à leur groupe. Le porteur indique que l'injection peut être douloureuse et que les nanoparticules peuvent provoquer une inflammation du rein, de la rate, du foie ou du poumon. Des tests sur cellules et globules rouges humains n'ont révélé aucune toxicité, ce qui n'empêche pas le porteur de conclure qu'un "organisme vivant complexe" reste "nécessaire" pour observer la distribution du produit.

Objectifs

Cette étude est un projet fondamental dans le domaine de la santé publique. L’accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause mondiale de mortalité. En particulier, 80% des cas d’AVC sont caractérisés par la formation d’un caillot (thrombose) dans une artère cérébrale provoquant une diminution voire une suppression du flux sanguin dans une région du cerveau. L’hétérogénéité des causes de ces thromboses, la complexité et la sensibilité du cerveau font encore de l’AVC une pathologie complexe à traiter et des règles standards de traitements sont difficiles à établir. La première action thérapeutique consiste à rétablir le flux sanguin le plus rapidement possible afin d’éviter des séquelles irréversibles. Le traitement de référence reste le même depuis les années 1980 ; l’injection d'un médicament qui entraine la destruction du caillot. Toutefois, les critères d’inclusion des patients restent très limités, notamment à cause des effets secondaires: saignements, toxicité cérébrale. Le but de ce projet est d'étudier des nanoparticules (particules de taille nanométrique) pour apporter des médicaments directement au caillot, et ainsi éviter ces effets secondaires et diminuer les doses employées. Ce projet expérimental regarde spécifiquement l'innocuité du traitement proposé avec les nanoparticules et leur devenir dans le corps après injection.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, l'absence de toxicité d'un nouveau traitement pour les AVC dus à des caillots sanguins pourra être évaluée, avec en particulier: la mise à disposition des médecins d'un traitement plus complet pour résorber les caillots à l'origine de l'accident, avec une minimisation des effets secondaires (saignement, toxicité cérébrale), une diminution des doses employées et donc une utilisation potentielle pour plus de patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique par voie intraveineuse de nanoparticules sous anesthésie de l'animal (durée inférieure à 10 min), puis après un temps fixé (1 h, 3 h ou 24 h), les animaux seront euthanasiés pour observer la biodistribution des nanoparticules (c'est-à-dire leur distribution dans leurs organes).

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles sont une douleur liée à l'injection, une toxicité éventuelle des nanoparticules, ou une éventuelle inflammation dans les organes responsables de l'élimination des nanoparticules: rein, rate, foie, poumon.

Devenir

Afin de pouvoir observer la distribution des nanoparticules dans les différents organes des animaux, ceux-ci doivent être euthanasiés pour récupérer leurs organes et réaliser l'analyse des tissus biologiques.

Remplacement

Des expériences préliminaires visant à déterminer l'innocuité de ces nanoparticules ont été réalisées, incluant des tests sur cellules humaines ainsi que des sur des globules rouges humains, et ne permettant pas de déceler de toxicité. Ces expériences apportent donc une première réponse au regard de la toxicité sans utiliser d'expérimentation animale. Il n'existe cependant pas de moyen permettant de déterminer une toxicité dans un organisme vivant complexe ainsi que la distribution des nanoparticules dans les organes avec ces premières expériences. Ce projet nécessite donc l'utilisation de modèles animaux pour les étudier.

Réduction

Des études préliminaires ont permis de déterminer les doses de nanoparticules à injecter pour garantir un effet thérapeutique, et permettent donc de ne sélectionner que deux doses à tester dans ce projet, réduisant donc le nombre d'animaux à utiliser. Pour anticiper une éventuelle mortalité du traitement, un nombre maximum de 8 animaux par groupe est prévu comme le minimum nécessaire pour garantir au moins 5 animaux utilisables par groupe et donc garantir la représentation de la variabilité inter-individus.

Raffinement

Avant la procédure: le temps d'acclimatation des animaux sera d'une semaine. Les animaux bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de bien-être et l'absence de signes de stress ou de détresse. Durant la procédure, les animaux seront placés sous anesthésie pour l'injection de nanoparticules. Après réveil, les animaux seront remis dans leur cage, et une vérification visuelle une heure après procédure du site d'injection sera effectuée (absence de lésion) et de l'état général de l'animal sera faite en accord avec une grille de score des points limites (critères objectifs pour déterminer le niveau de bien-être ou mal-être des animaux). Les animaux seront finalement sacrifiés sous anesthésie et le prélèvement sanguin réalisé post mortem pour minimiser les gestes sur l'animal vigile.

Choix des espèces

Les expériences de biodistribution chez la souris sont abondamment décrites dans la littérature scientifique pour des injections intraveineuses de nanoparticules, en particulier pour l'utilisation de nanoparticules à but thrombolytique (c'est-à-dire visant à détruire un caillot sanguin) dans le cadre de maladies cardiovasculaires. les animaux utilisés seront adultes (5-8 semaines), pour obtenir des résultats sur des animaux matures au regard de l'immunité et de la formation des organes, et pertinents vis-à-vis d'une pathologie qui affecte majoritairement des individus adultes.

Confrontées chaque jour pendant dix jours à un mâle sélectionné pour son agressivité, des souris développent l'évitement social, l'anxiété, la perte de motivation et les troubles du sommeil recherchés par le protocole. 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Huit tests comportementaux, cinq semaines d'antidépresseur par voie orale et des séances d'imagerie TEP de soixante minutes sous anesthésie servent à caractériser les altérations du système dopaminergique dans ce modèle de dépression. Le porteur présente la TEP comme une méthode idéale, qui ne nécessite pas la mise à mort et permet la réutilisation des animaux, alors que le cerveau de toutes les souris est prélevé à l'issue.

Objectifs

Les troubles liés au stress tels que le trouble de stress post-traumatique et la dépression sont des maladies souvent chroniques et associées à de fortes incapacités et souffrances qui peuvent avoir un impact dramatique sur la santé, les relations sociales, les performances professionnelles et la vie quotidienne. Malgré ces résultats, les mécanismes cognitifs et biologiques qui sous-tendent leurs causes et leur physiopathologie restent mal compris. De plus, alors que les traitements actuels peuvent généralement être bénéfiques, une part importante des patients est résistante aux traitements actuels. Une explication peut venir du fait que ces troubles comprennent une multitude de profils potentiels et rassemblent donc des patients avec le même diagnostic mais avec une forte hétérogénéité de causes, de processus physiopathologiques et des manifestations cliniques. C’est dans ce cadre que ce projet a été développé et cherche a exploré l’implication de réseaux cérébraux qui ont par le passé été moins étudiés dans ces troubles mais qui pourraient être impliqués à différents niveaux : de la vulnérabilité au stress, à la sévérité des troubles et à la réponse au traitement. L’objectif sera ici de caractériser les altérations du système dopaminergique dans un protocole de stress social chez la souris capable de modéliser la vulnérabilité et la résilience au trouble dépressif et à sa réponse au traitement. En effet le système à la dopamine pourrait être impliqué dans la manifestation de profils cognitif et motivationnels qui sont engagé dans l’adaptation au stress, et des dysfonctions de ce système lors de conditions de stress pourrait potentiellement être à l’origine d’altérations cognitives favorisant ces troubles et la résistance aux traitements. Toutefois, très peu d’articles se sont concentrés sur des marqueurs du système dopaminergique dans ces modèles. A ces fins, nous emploierons une méthode de neuroimagerie non-invasive : la tomographie par émission de positons (TEP) avec des traceurs ciblant 2 composants différents du système dopaminergique : le [18F]LBT-999 et le [18F]-Fallypride. Ces études seront réalisées chez des souris témoins non stressés, et des souris stressées résilientes au stress, susceptibles au stress (= dépressives), la moitié de chaque groupe étant traitée avec un antidépresseur pendant 4 semaines à la suite du modèle de stress social et avant les tests et la séance d’imagerie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet vont nous apporter des éléments précieux pour compléter et vérifier les hypothèses de l’implication du système dopaminergique et ses altérations dans la dépression, un aspect décisif dans la compréhension de ces troubles et dans l’émergence de nouvelles stratégies préventive, diagnostique ou thérapeutiques. Les résultats obtenus pour cette étude, vont également nous permettre de prendre des décisions sur les stratégies à suivre dans nos futurs projets de recherche. Par exemple, l’utilisation de nouvelles technologies d’imagerie calcique miniaturisée nous permettant d’enregistrer l’activité calcique mais également en parallèle l’activité de la dopamine. Le but sera de déterminer au niveau neuronal la précision de l’activation du signal dopaminergique dans l’adaptation comportementale et cognitive dans des tâches de mémoire et de stress. La finalité étant de comprendre comment le système dopaminergique et sa précision d’activité est altérée dans la dépression. Et enfin, cela nous permettra de voir si l’on est capable de rétablir un fonctionnement normal de ces processus dopaminergiques par différents traitements.

Procédures

Mise en contact de mâles et femelles pour la sélection de mâles agressifs pendant 5 à 10 minutes par jour pendant 10 jours ; 8 tests comportementaux seront réalisés 2 seule fois par animal et durent entre 5 ou 30 minutes suivant le test ; un traitement antidépresseur sera administré par voie orale 1 fois par jour pendant 5 semaines ; Les souris seront anesthésiées par voie respiratoire pour les imageries TEP qui durent environ 60 minutes ; Certaines souris seront ensuite perfusées sous anesthésie générale ce qui entrainera leur mort.

Impact sur les animaux

Modèle de stress sociale : Le risque principal de ce modèle est un stress et dominance physique sur la souris lors de l’interaction avec une souris dominante (En cas de blessure, la souris est prise en charge par les expérimentateurs) Nous attendons également des répercussions psychiques et observables sur le comportement de la souris et permettant de modéliser la dépression : Augmentation des comportements de type évitement social et anxiété, persistance tout au long du protocole et quelques semaines après la fin. Perte de motivation ou plaisir, altération du poids et troubles du sommeil.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle. Si les résultats de l’imagerie TEP ne montrent pas d’effet du modèle alors la deuxième partie du projet utilisant un antidépresseur ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire (injection de sérum physiologique pour l’hydratation, nourriture appétente). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. La neuroimagerie TEP est une méthode de nécessitant pas de mise à mort des animaux, c’est une méthode idéale permettant un suivi longitudinal et une réutilisation des animaux dans une autre expérience. Cette procédure est intégralement réalisée sous anesthésie afin de diminuer le stress que pourrait engendrer le dispositif. De plus, cette procédure est réalisée en collaboration un personnel hautement spécialisé dans l’imagerie TEP sur petit animal.

Choix des espèces

Le choix de la souris est un modèle pertinent pour notre problématique. L’étude du cerveau de la souris s’avère être un modèle très puissant pour l’étude des fonctions cognitives, troubles mentaux du cerveau humain. En effet, il y a une grande homologie génétique dans le développement du cerveau, se traduisant également par une analogie des aires cérébrales et des mécanismes neurobiologiques. Dans cette étude nous utiliserons de souris adultes.

Des dispositifs médicaux injectables, solutions aqueuses plus ou moins visqueuses, sont implantés sous la peau ou dans le derme de rats, de lapins et de porcs pour en évaluer la tolérance locale et la résorption, en vue de leur marquage CE. 300 animaux non-humains, 200 rats, 50 lapins et 50 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des injections sous anesthésie générale, des prises de sang possibles jusqu'à une par semaine pendant un mois puis plus espacées, et jusqu'à 20 biopsies de peau sous anesthésie générale chez les porcs. La plupart sont tués pour prélever les sites d'injection, une partie des porcs biopsiés peut être gardée en vue d'une réutilisation, et 10 des 300 animaux non-humains sont déclarés réutilisés. Le porteur écrit que l'emploi de ces espèces est "rendu obligatoire par le règlement Européen", et prévoit aussi des "études non réglementaires".

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables, ainsi qu'au comportement de ces derniers au sein des tissus, notamment en ce qui concerne leur résorption et leur intégration.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits.ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatiblesen solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme 10993-6. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.