Recherche appliquée

Des souris génétiquement modifiées pour que le gène PPARa et ceux de deux autres protéines ne fonctionnent plus dans leur foie sont soumises, selon les groupes, à deux semaines de régime cétogène, à 20 heures de jeûne ou au gavage d'une molécule qui libère une grande quantité de graisses dans leur sang. 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur annonce la mise à mort de toutes à la fin des procédures pour récolter leur sang et leurs organes. Le jeûne peut faire chuter leur glycémie et leur température corporelle, le régime cétogène leur faire perdre du poids, et chaque souris subit juste avant sa mise à mort une prise de sang à la veine sous-mandibulaire, sous contention. Le porteur écrit aussi qu'un individu qui atteint un critère d'arrêt sera "replacé en conditions d'hébergement standard après examen par la vétérinaire référente", sans dire ce qu'il devient ensuite.

Objectifs

Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. Les animaux seront pesés chaque semaine. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Des souris nude dépourvues de système immunitaire et des rats ZDF porteurs d'une mutation qui les rend diabétiques dès le plus jeune âge : le projet repose sur des animaux construits pour être malades. 80 souris et 208 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des hydrogels implantés sous la peau, les rats subissent une craniotomie de trente minutes avec pose d'un implant osseux, et une partie d'entre eux une thoracotomie terminale que le porteur qualifie lui-même de geste douloureux. Tous sont tués pour retirer les implants et prélever les calvarias, afin de mesurer la formation osseuse et la vascularisation autour du matériau.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est un problème de santé publique. On compte 537 millions de personnes diabétiques dans le monde et environ 4 millions en France. Outre plusieurs complications cliniques, les patients atteints de DT2 présentent une fragilité osseuse avec un risque accru d’ostéoporose, de fracture osseuse et d'altération de la réparation osseuse. Parallèlement à l'augmentation de la prévalence du DT2, on observe une augmentation du nombre de patients atteints de DT2 nécessitant et subissant des interventions chirurgicales orthopédiques/orofaciales, avec un taux élevé de complications et une augmentation inévitable de la charge et des coûts socio-économiques. À ce jour, la réparation osseuse dans l'environnement compromis du DT2 reste très difficile, et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer des stratégies efficaces, y compris des thérapies cellulaires. Les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier à des cellules qui forment l’os (ostéoblastes) et /ou par des facteurs qu’ils secrètent (sécrétome et vésicules extracellulaires) et qui stimulent la formation des vaisseaux sont proposées pour réparer des défauts osseux. Cependant, le diabète caractérisé par un taux élevé de glucose dans le sang, perturbe la fonction de ces cellules et la réparation de l’os. L’utilisation de ces cellules pour réparer et l’intérêt de leur produit de sécrétions dans la réparation de l’os diabétique restent peu étudiés. L’objectif du projet répond au besoin scientifique et clinique de mieux connaitre et optimiser la réparation de l’os diabétique. Il vise à évaluer la capacité à former l’os (potentiel ostéoformateur) et des vaisseaux sanguins (potentiel angiogénique) du sécrétome et des vésicules extracellulaires de cellules stromales mésenchymateuses dans le but d’améliorer la réparation osseuse chez le rat diabétique. L'hypothèse sous-jacente au projet de recherche proposé est que cela constitue une alternative de choix à la thérapie cellulaire pour réparer l’os diabétique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en biothérapie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de réparation osseuse chez le diabétique de type 2. Par ailleurs, il fournira des informations sur l’effet bénéfique ou pas du sécrétome et des vésicules extracellulaires comparé à celui des cellules stromales mésenchymateuses dans la réparation de l’os diabétique. A long terme un tel projet permettra de mettre sur pieds des stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients diabétiques qui présentent des accidents du squelette avec une perte osseuse importante ou nécessitant la pose d’implants.

Procédures

Pour les souris: 1-Implantation sous cutanées (72 + 8 souris de marges) d'hydrogels ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie (24 + 8 souris de marges) micro-scanner in vivo (4X; durée 15 min) Pour les rats : 1- craniotomies avec implantation d’un hydrogel ostéoinducteur (168 rats ZDF + 10 rats ZDF imprévus et 24 rats ZL + 6 rats ZL imprévus) (1X, durée 30 min) ; 2- Imagerie (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) micro-scanner in vivo (5X; durée 15 min) ; 3- Infiltration du réseau vasculaire (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

L’implantation sous cutanée chez les souris nudes peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, oedème. La chirurgie sur calvaria de rat peut également entrainer un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire et post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). Une complication éventuelle est l’infection cutanée, susceptible d’entrainer de la douleur et de la souffrance chez les animaux. Elle constitue un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). L’anesthésie chez les souris et les rats, nécessaire à l’imagerie non invasive en microscanner va également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort et les explants retirés pour évaluer la réponse tissulaire (formation osseuse, inflammation et angiogenèse) en site sous cutané (ectopique) afin d’identifier les conditions pertinentes à tester en site osseux (orthotopique). Les rats seront tous mis à morts aux temps terminaux et les calvarias seront prélevées pour l’étude de la formation osseuse, de la vascularisation et de l’inflammation au niveau des défauts osseux. Justification de la mise à mort : prélèvement des implants pour évaluer la réponse tissulaire et la formation de l’os autour de ces implants.

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel, orchestré et complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages ostéoblastes/ cellules endothéliales par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Cependant ces modèles sont dénués de système vasculaire. Or, la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier l’apport de cellules souches et le sécrétome dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir des résultats valident en respectant le principe de réduction des 3 R est de 6 animaux /groupe /temps / type d’analyse. Pour tenir compte des éventuelles pertes lors des procédures ce chiffre est porté à 8 animaux/groupe /temps/ type d’analyse. Pour étudier le potentiel à former des vaisseaux sanguins et de l’os en sous cutané, quatre implants seront posés par animal afin de réduire le nombre total de souris nécessaire pour obtenir des groupes de 8 par condition. Par ailleurs, l’inflammation et l’angiogenèse seront étudiés sur les mêmes animaux, permettant de réduire leur nombre et de maximiser la contribution de celles-ci. Dans la même visée de réduction du nombre d’animaux, seules les conditions pertinentes (meilleur potentiel ostéoinducteur et faible inflammation) seront testées pour les procédures chez le rat. De plus, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. Par ailleurs, la réparation osseuse et la vascularisation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans les protocoles expérimentaux. Au cours des chirurgies (avec champs et instruments stériles) un gel oculaire sera appliqué dans les yeux des animaux pour éviter leur dessèchement. Ils seront placés sur tapis chauffant pour limiter les pertes thermiques. Pour les implantations sous-cutanées, une analgésie préventive sera mise en place par injection sous cutanée (SC) 20 minutes avant la chirurgie. Les animaux seront ensuite anesthésiés par injection intra-péritonéale (IP) puis le dos sera rasé et désinfecté avec une solution antiseptique à large spectre. Une analgésie post-opératoire se fera par injection SC pendant 2 à 3 jours après l’opération. Pour les implantations intra-osseuses, une analgésie pré- et post-opératoire se fera par une injection SC ainsi qu’une antibiothérapie préventive. Après chirurgie, les animaux seront hébergés, seuls en cage jusqu’au lendemain matin dans une pièce dédiée avec température ambiante à 26° puis remis en conditions standards d’hébergement. Pour l’imagerie micro-scanner in vivo, les souris et les rats seront anesthésiés par voie gazeuse et seront surveillés jusqu’à leur réveil. À la suite des procédures chirurgicales, les expérimentateurs observeront les animaux deux fois par jour les 3 premiers jours post-opératoires puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des critères définis et scorés au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à la procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures retenues pour les atténuer et/ou les supprimer seront appliquées si nécessaire. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée par les zootechniciens. Pour un groupe d’animaux, l’injection d’un agent de contraste intracardiaque en point terminal nécessitera une thoracotomie qui est un geste douloureux. En conséquence, les rats recevront une prémédication analgésique par injection SC avant anesthésie par voie gazeuse jusqu’à immobilité totale de l’animal puis une IP d’un anesthésique générale couplé à un analgésique.

Choix des espèces

La souris nude nRI de 9 semaines sera utilisée pour l’évaluation en dehors d’un site osseux du potentiel des cellules souches mésenchymateuses et de leurs produits de secrétions à induire la formation des vaisseaux sanguins et de l’os. Possédant un système immunitaire déficient, la souris nude est la candidate de choix pour apprécier les mécanismes d’intégration d’implant sans crainte d’une réaction de rejet immunitaire. Nous étudions le diabète de type 2 (incidence élevée chez l’Homme) pour lequel les modèles animaux proposés ne présentent pas de surmortalité, et ne requièrent pas de soins spécifiques. Afin de garantir l’homogénéité et la reproductibilité, nous avons opté pour un diabète d’origine génétique à savoir le rat ZDF (Leptr -/-) de 24 semaines, car ce modèle de diabète mime fidèlement le diabète de type 2 comme chez l’humain, depuis son mode d’installation jusqu’aux complications associées incluant les complications osseuses. De plus, nos études précédentes sur le même modèle animal ont montré qu’ils pouvaient vivre en animalerie jusqu’à un âge avancé sans nécessiter des soins particuliers et qu’ils supportaient relativement bien les procédures du protocole. Les rats Zucker LEAN (ZL) de 24 semaines ne présentent pas de mutation Leptr -/- et ne développent pas spontanément de diabète ils sont des contrôles de choix.

Injectées de cellules tumorales puis traitées tous les deux jours, une partie des souris subit aussi deux irradiations à trois jours d'intervalle, calibrées pour détruire leur moelle osseuse. 4 871 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi les immunothérapies échouent chez une partie des patients. Toutes sont tuées, y compris les témoins sans tumeur, parce que l'étude porte sur les cellules contenues dans leurs organes. Le porteur écrit que ses procédures n'impliquent pas l'arrivée des animaux aux points limites, après avoir décrit une gêne respiratoire, une nécrose tumorale et une baisse de tonicité dans les derniers stades de la maladie.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier le mode d’action des immunothérapies (IT) afin de mieux appréhender les échecs de ces traitements chez les patients/cancers non répondeurs. Dans cet objectif, il est dans un premier temps nécessaire de mieux comprendre les réactions immunitaires ayant cours durant les cancers et la façon dont elles sont modifiées par les IT. Cela devrait permettre de mettre en évidence les types cellulaires qui sont impliqués dans l’élimination de la tumeur et la façon dont ces cellules immunitaires tuent les cellules tumorales. En particulier, ce projet s’articule autour de 4 objectifs principaux : - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient les cellules immunitaires infiltrant la tumeur - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient la génération des cellules du SI à distance dans la moelle osseuse - Identifier les types cellulaires essentiels au fonctionnement des IT - Identifier les mécanismes d’action utilisés par le système immunitaire (SI) et activés par les IT pour lutter contre la tumeur Ce projet nécessite l'utilisation de plusieurs procédures censées reproduire a minima la diversité des cancers observés chez l’être humain. Nous nous focalisons sur trois types principaux de cancer à savoir le cancer du poumon, le cancer de la peau et les lymphomes. Ces cancers sont bien modélisés chez le petit animal et les traitements utilisés chez l'être humain fonctionnent sur les animaux. Cela permet de modéliser avec précision le contexte immunitaire de l’animal avec une certitude convenable que les effets puissent être, au moins en partie, similaires chez l’humain. Hautement translationnel, ce projet permet de tester rapidement la cohérence des résultats obtenus sur les modèles murins avec les observations réalisées sur deux cohortes de patients atteints de cancers et traités par IT. Ainsi, ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi une fraction significative de patients/cancer ne répondent pas aux IT, malgré les résultats très prometteurs observés chez les patients répondeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Premièrement, la description de nouvelles cellules dans le cancer du poumon permettra d’établir de nouvelles pistes pour le ciblage thérapeutique des immunothérapies dans cette pathologie. Deuxièmement, la compréhension des mécanismes de fonctionnement des immunothérapies permettra de mieux comprendre la réponse des patients au traitement. Ici, nous estimons qu’il est probable que nous puissions proposer un biomarqueur circulant chez les patients permettant d’évaluer rapidement leur réponse au traitement (en 1 à 2 semaines) contrairement à 2 à 3 mois actuellement. Troisièmement, la description de nouvelles molécules et mécanismes des cellules myéloïdes impliquées dans la lutte contre les cancers permettra de proposer des traitements de synergie avec les immunothérapies visant spécifiquement les cellules myéloïdes. Ces traitements pourraient grandement améliorer la réponse des patients aux immunothérapies. Dans l’ensemble, ce projet tire sa cohérence de l’approche globale qu’il propose vis-à-vis du fonctionnement des immunothérapies. Ce projet est suffisamment diversifié pour résister à l’échec potentiel d’une sous-partie.

Procédures

Les animaux anesthésiés ou vigiles pourront être injectés une fois en sous-cutané, intra-péritonéal, ou intra-veineux d’une solution de cellules tumorales. L’anesthésie prend quelques minutes à agir et l’injection quelques secondes. Les animaux pourront subir des injections intra-péritonéales (animaux vigiles ou anesthésiés) ou intra-veineuses de traitement tous les deux jours. Du sang pourra être prélevé une fois sur les animaux anesthésiés avant leur mise à mort. Ce prélèvement se fera en quelques secondes. Les animaux ne se réveilleront pas entre le prélèvement et la mise à mort. Dans certains cas, une goutte de sang pourra être prélevée deux fois à huit jours d’intervalle. Pour certaines procédures, les animaux seront irradiés (deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle; leur durée sera mise au point durant le projet, elle doit pouvoir conduire à une myélosuppression).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Néanmoins, la fréquence des injections peut tout de même entraîner une nuisance, de même que les prélèvements. Nous n’utilisons pas d’animaux ayant un phénotype dommageable, hormis une lignée qui sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux sains, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie selon un tableau de suivi des points limites. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales sont comme suit : - Pour les tumeurs pulmonaires : gène à la respiration, baisse de la tonicité générale et perte de poids dans les derniers stades du cancer. - Pour les tumeurs sous cutanées : Nécrose de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie. Les procédures que nous utilisons, hormis l’étude de la survie, n’impliquent pas l’arrivée des animaux aux points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et devons nécessairement mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous le ferons, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Cependant, ni la modélisation mathématique, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier les effets du développement tumoral et les réponses immunitaires anti-tumorales induites par les tumeurs ou la vaccination. Nous nous intéressons à des cellules nouvelles non encore décrites et dont nous ne connaissons par les progéniteurs ni l’origine. Il est donc impossible de ne pas travailler sur l’animal. Dès que les cellules auront été décrites et les progéniteurs identifiés, nous tâcherons de mettre au point des méthodes de cultures in vitro pour en étudier la fonctionnalité au plus près sans impliquer les animaux dans des procédures expérimentales.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animal. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistique. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques. En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées. Deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle.

Raffinement

Dans la mesure du possible, les animaux ne seront pas laissés seuls dans leur cage. Les expériences impliquant le développement de tumeurs seront pratiquées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Afin de minimiser l'impact des procédures, nous allons anesthésier les souris avant d'injecter les tumeurs. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués tous les 3 jours afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pour éviter des lésions sur les tumeurs palpables, de la litière à base de cellulose sera utilisée dans les cages, dès que la taille ou l’aspect de la tumeur le nécessitera. Du Gel hydrique et/ou des réhydratations en sous-cutanée seront donnés aux animaux ayant du mal à se nourrir, s’abreuver ou avec des poils hérissés (signe d’un défaut d’alimentation). Si les animaux présentent des signes d’hypothermie, les cages seront chauffées. Des maisonnettes en carton ou des tubes (carton ou plastique) pourront être introduits dans les cages de stabulation en guise d’enrichissement. La lignée immunodéprimée à phénotype dommageable sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’être humain. Cette espèce a une reproduction facilement manipulable avec un temps de gestation court et plusieurs individus par portée, donc des conditions d’élevage optimales. De plus, ce modèle étant très étudié, il y a une vaste expertise technique et scientifique autour de son utilisation et de nombreux outils sont déjà disponibles (anticorps, molécules inhibitrices/activatrices, modèles de souris génétiquement modifiées…). La souris est donc le modèle le plus pertinent pour notre étude. Les animaux seront mis en expérimentation à l'âge adulte à partir de 8 semaines après leur naissance et jusqu’à 25 semaines environ. Cela permettra d’étudier un système immunitaire mature proche de celui de l’être humain.

Deux à trois cents ovocytes prélevés chaque semaine sur un même animal, six prélèvements par an pendant cinq ans : 30 xénopes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque prélèvement passe par une immersion de quarante à quarante-cinq minutes dans un bain anesthésiant, une incision abdominale d'un centimètre et demi et une suture. Le porteur qualifie la technique de méthode alternative permettant de s'affranchir de manipulations in vivo, alors que ces manipulations sont exactement ce qu'il décrit, l'ovocyte servant de support pour étudier des canaux ioniques humains. Le champ structuré du devenir ne déclare aucun animal maintenu en vie, quand le texte indique que les xénopes sont réutilisées d'un projet à l'autre et gardées jusqu'à leur mort naturelle.

Objectifs

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est centrale dans nos thématiques de recherche dont les objectifs principaux sont les suivants : ​études pharmacologiques cellulaires et moléculaires, caractérisation du mode d’action de ligands naturels ou synthétiquec des canaux ioniques, étude du mode d’action de médicaments ou de toxines, caractérisation de l’impact fonctionnel par approche in vitro de variants de gènes de canaux ioniques, suspectés associés à des pathologies humaines ,​ études des relations structure-fonction des canaux ioniques (caractérisation des domaines fonctionnels), études toxicologiques (évaluation de l‘activité de certaines substances ou molécules sur des canaux ioniques, reflétant leur toxicité au niveau cellulaire, neurotoxicité, cardiotoxicité...).​

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter des connaissances scientifiques dans différents domaines, tels que : 1) mieux comprendre les effets bénéfiques ou averses d'agents pharmacologiques actifs sur les canaux ioniques (médicaments, toxines, toxiques...), 2) caractériser les impacts fonctionnels par une approche alternative, de mutations desgènes de canaux ioniques causant des pathologies parfois graves. La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Procédures

Les xénopes sont anesthésiés par immersion dans un bain d'anesthésie pendant 40 à 45 minutes. Après induction de l’anesthésie, une incision de 1,5 cm maximum est réalisée pour accéder aux sacs ovariens. Après prélèvement, la plaie est suturée immédiatement; cette étape durant environ 10 minutes. Pour préserver la bonne santé des animaux, chaque prélèvement sur un même animal doit être espacé de 2 mois.

Impact sur les animaux

La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Devenir

200-300 ovocytes prélevés sur un animal par semaine. Après prélèvement, les xénopes sont mis au repos pendant 2 mois. Nous avons une utilisation continue des xénopes : avec 6 prélèvements annuels, durant 5 ans . Les xénopes ont une longévité de 15 ans en moyenne.

Remplacement

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est incontournable pour l’investigation au niveau cellulaire et moléculaire des effets toxiques, du mode d’action de médicaments, voire de l’impact de certains variants sur la fonction des canaux ioniques. ​Cette technique permet également de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Cette approche constitue une méthode alternative à l’utilisation des rongeurs pour réaliser des cultures primaires de neurones, par exemple. ​

Réduction

​Pour un projet visant à caractériser l’impact fonctionnel d’une mutation ou l’effet d’une molécule, les analyses statistiques nécessitent l’utilisation de 10 ovocytes par mutation ou concentration de molécule, provenant de 3 animaux différents. Etant données nos activités de recherche, ceci implique l'utilisation de 30 xénopes pour 5 ans au maximum. Les animaux sont préservés jusqu‘à leur mort naturelle. Ils sont utilisés ou réutilisés dans plusieurs projets. Un vétérinaire les examine 1 fois par an au minimum pour vérifier leur état de santé.

Raffinement

​​Le prélèvement est réalisé sur des animaux anesthésiés. Les sutures sont réalisées avec un fil résorbable. Les animaux sont ensuite réveillés progressivement par rinçage à l’eau claire, et surveillés avant d’être replacés avec leurs congénères. Les aquariums sont enrichis avec des pots en terre cuite qui leurs servent de cachettes.

Choix des espèces

Les xénopes produisent des ovocytes de grande taille (1-1,5 mm) qui facilitent leur transfection par injection intracellulaire de matériel génétique. L’ovocyte de xénope constitue un système d’expression hétérologue incontournable pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques des récepteurs et des canaux ioniques, depuis 1990. L’utilisation de ce modèle cellulaire est très pratique pour des études pharmacologiques in vitro, assez simple à réaliser, et permet de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Les animaux sont utilisés au stade adulte (1-5 ans) correspondant à un stade où les femelles produisent de nombreux ovocytes.

Les tremblements sont retenus comme point limite déclenchant la mise à mort. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent une injection de Shiga-toxine qui reproduit un syndrome hémolytique et urémique, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil sous anesthésie. Le porteur écrit que ces injections n'induisent "pas de traumatisme ou de douleur" tout en décrivant des yeux mi-clos, des diarrhées, un poil piqué et des tremblements, et présente l'utilisation des animaux comme "indispensable" pour comparer deux traitements.

Objectifs

La Shiga-toxine (STx2) est produite par une bactérie de la famille Escherichia coli et est la cause d’une maladie infectieuse grave (SHU) le plus souvent d’origine alimentaire. Le SHU appartient à une famille de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. La STx2 entraîne d’une part l’inflammation et la mort cellulaire massive, et d’autre part l’activation du système du complément, qui participe aux mécanismes de défense naturels. Le traitement de ces pathologies comprend des traitements non spécifiques et des traitements spécifiques ciblant système du complément, comme l'anticorps anti-C5, le premier traitement approuvé pour le SHU chez les patients pédiatriques et adultes. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires dans les cellules et dans des modèles de souris infectées. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de la clusterine et de l’anticorps anti-C5a dans le SHU afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.

Bénéfices attendus

Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance rénale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.

Procédures

1/ L’Injection intra péritonéale sera utilisée pour les 4 lots de souris. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 2/ L’Injection intra veineuse sera utilisée pour 2 lots de souris. Elle concerne 40 au total, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 3/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée pour les 4 lots de souris. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 4/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée pour les 4 lots de souris. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner les 80 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal.

Impact sur les animaux

L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. Le poil pourra présenter un aspect piqué, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.

Réduction

Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (80) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Les souris seront placées par nombre de 4 par cage. L’alimentation et l’abreuvement seront fournies ad libitum tout le long de l’hébergement. Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro- orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.

Remplacer une hormone d'extraction dont l'approvisionnement devient difficile : 120 cochettes pré-pubères vont être utilisées pour tester une molécule qui déclenche l'ovulation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont abattues en fin de protocole pour prélever les ovaires et l'utérus et compter les embryons. Sur onze jours, chaque animal subit une prise de sang de 10 mL par jour, soit 110 mL au total, une injection intramusculaire, jusqu'à neuf échographies, l'introduction d'un verrat deux fois par jour pendant une semaine pour détecter les chaleurs, puis deux inséminations artificielles. Le porteur écrit que 120 cochettes "seront nécessaires", justifie l'espèce par le fait qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'état physiologique d'une cochette pré-pubère, et rattache l'enjeu à la production porcine.

Objectifs

Nous développons une molécule capable de remplacer les traitements actuels d'induction de l'ovulation chez les animaux de rente. L'efficacité et la toxicité de cette molécule ont déjà été testées dans différentes espèces, dont la cochette pubère. Nous souhaitons dans cette nouvelle saisine tester son efficacité chez la cochette pré-pubère. En effet, actuellement, la puberté est induite chez ces animaux par l'utilisation de PG600, qui est un mélange de hCG (human chorionic gonadotropin) et de eCG (equine chorionic gonadotropin), hormones extraites dont l'approvisionnement devient problématique. Au total, 120 cochettes pré-pubères seront nécessaires pour ce projet.

Bénéfices attendus

Cette expérience permettra de démontrer l'efficacité de RPV à induire l'ovulation chez les cochettes pré-pubères, et sa capacité à remplacer des hormones d'extraction telles que le PG600.

Procédures

Tous les actes se feront sur animal vigile. Prélèvements de sang : 10 ml de sang seront prélévés, 1 fois par jour, pendant 11 jours (J1, J2, de J4 à J10, J14 et J16), soit un volume total de 110 ml par animal. Injection de produit : 1 fois par animal, en intra-musculaire. Echographie transabdominale : 9 fois par animal maximum sur 10 jours. Détection des chaleurs par introduction du verrat dans la stabule : 2 fois par jour pendant une semaine. Insémination artificielle : 2 fois par animal, 12H et 24H après la détection des chaleurs.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendus sont le stress lié à la manipulation des animaux, la douleur et les hématomes liées aux prises de sang, la douleur liée à l'injection intra-musculaire.

Devenir

Tous les animaux seront abattus en fin de protocole. Les ovaires et l'utérus seront prélevés comptage de corps jaunes, et du nombre d'embryons totaux et viables.

Remplacement

L'efficacité de cette molécule a déjà été démontré chez la vache et la cochette pubère. Cette expérimentation vise à démontrer son éfficacité chez la cochette pré-pubère qui représente un état physiologique particulier, pour induire la première ovulation. Un modèle in vitro ou un autre modèle animal ne peuvent donc refléter l'état physiologique d'une cochette pré-pubère.

Réduction

Le nombre de cochettes nécessaire à l'expérimentation a éré calculé en fonction des résultats précédemment obtenus chez la génisse et la cochette pubère.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, et non en loge individuelle afin de limiter le stress. Un système de récompense est utilisé : elles recevront un aliment appétent après chaque acte (type smarties® ou de l'aliment pour porcelet). Les interventions seront réalisées par du personnel compétent, dans le calme avec récompense alimentaire et un suivi de l’état de l’animal sera mis en place dans les heures qui suivent. Ainsi, pendant le jour de la prise de sang, et un jour après, les animaux feront l'objet d'une surveillance particulière sur les points suivants : - Surveillance de comportements anormaux tels que la prostration, ou l’agressivité. - Surveillance d'apparition d'hématome sur les lieux de prélèvements : mise en place du suivi de la résorption de l'hématome. - Hyperthermie dans les 24h qui suivent les prélèvements : en cas de fièvre (+2°C) par rapport à la température de référence, un antalgique sera administré à l’animal. Notre procédure sera raffinée en minimisant nos interventions et en favorisant les interactions positives avec les animaux. Les animaux voient plusieurs fois par jour les animaliers qui surveillent attentivement leur comportement. Une phase de simulation, durant plusieurs semaines, de prise de sang est réalisée à la porcherie afin d’entrainer l’animal à coopérer pendant l’acte. Pour ce faire, nous distribuons du jus de pomme à la seringue tout en appuyant avec le doigt sur la zone de prélèvement. Le but recherché est d’apprendre à l’animal à assimiler zone de prélèvement/prélèvement et récompense. Le prélèvement est réalisé en moins d’une minute. Les prises de sang seront chronométrées et toute prise de sang non terminée au bout de 1 minute sera abandonnée. En cas d'apparition de fièvre, l'animal sera traité.

Choix des espèces

L'efficacité de cette molécule a déjà été démontré chez la vache et la cochette pubère. Cette expérimentation vise à démontrer son éfficacité chez la cochette pré-pubère qui représente un état physiologique particulier, pour induire la première ovulation. Une autre espèce ne peut donc pas être utilisée. Cette expérimentation vise à démontrer l'efficacité de notre molécule RPV dans l'induction de l'ovulation chez la cochette pré-pubère, d'où l'utilisation de cochette entre 135 et 150 jours d'âge.

Pour mettre sur le marché des agents qui font entrer de l'ADN et de l'ARN dans les cellules, des souris de 6 semaines reçoivent jusqu'à trois injections de ces produits, par voie sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intranasale. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques de leurs organes, après une à quatre prises de sang. Les produits peuvent provoquer des thromboses, des réactions inflammatoires ou des troubles de la démarche, alors que le porteur dit vouloir "valider l'activité et l'absence de toxicité des produits". Il justifie le choix de la souris par l'usage majoritaire de cette espèce dans les phases de recherche, et parce qu'elle "permet d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.

Bénéfices attendus

Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.

Procédures

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un ou plusieurs prélèvements sanguins (maximum 4) (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections (sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou intranasale). De plus ils subiront un ou plusieurs prélèvements sanguins. Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.