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Etude de l’efficacité anticancéreuse de la synergie entre un traitement aux ultrasons et un traitement de référence en immunothérapie, dans un modèle murin de cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées pour prélever leur tumeur, 78 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses au flanc gauche fait pousser une tumeur pancréatique, suivie de trois séances d'ultrasons sous anesthésie et de trois injections intrapéritonéales d'immunothérapie, à raison d'une par semaine. Le porteur prévoit des mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine pendant trois mois au plus, et signale que des métastases pulmonaires provoqueraient un affaiblissement et des difficultés respiratoires. Il justifie le choix de la souris en écrivant qu'elle est la plus petite espèce dont les tumeurs deviennent assez grosses pour être traitées par ultrasons.
Objectifs
Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie cavitation + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible.
Procédures
- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 3 injections intrapéritonéales à raison d’une par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 3 injections sous cutanée d’antidouleur (30 secondes) à raison d’une par semaine– Autant de pesées que nécessaires seront réalisées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de trois par semaines aussi longtemps que nécessaire (3 mois maximum si traitement efficace).
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Si le modèle métastase, il entraînera une perte de poids et un affaiblissement chez les souris avec notamment difficultés respiratoires (si métastases aux poumons). Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine. Les ultrasons peuvent induire des pétéchies (présence de petites taches rouges sur la peau) dues à la cavitation, résorbées entre 2 traitements. Le traitement par immunothérapie n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris.
Devenir
Tous les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs.
Remplacement
Plusieurs informations ont été données via des études sur des sphéroïdes : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons, ce qui a permis de designer cette étude sur animal et de l’affiner. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Dans cette étude 78 animaux seront utilisés. L’utilisation de l’outil de calcul d’effectif de l’EDA (Experimental Design Assistant, NC3R) nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaire afin de conclure quant à l’efficacité de notre traitement. De plus, nous collecterons un nombre maximal de données par animal afin de répondre aux différentes questions de notre étude en utilisant le nombre d’animaux minimal mais suffisant.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles douleurs les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute ulcération, irritation ou nécrose des tumeurs, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera une crème localement sur 7 jours. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de score et via la palpation on administrera un antidouleur sur 48h. Si la douleur est toujours présente alors on mettra à mort les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux seront mis à mort. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements.
Choix des espèces
La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Dans notre étude, elle est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.
Analyse de l’interaction des Yersinia pathogènes avec leur hôte souris de laboratoire.
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- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Les points limites fixés pour ces infections "surviennent souvent trop tard", et aucun marqueur ne permet de prédire si une souris infectée mourra ou survivra. 12 670 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la peste ou par des Yersinia intestinales, par voie sous-cutanée, intradermique, orale, par ingestion de pain contaminé ou par instillation nasale, puis passent jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que l'infection sera fatale au groupe témoin comme à la moitié des cas testés, et conclut que le modèle animal reste "irremplaçable" pour évaluer la virulence de façon réaliste.
Objectifs
Alors que la peste, causée par la bactérie Yersinia pestis, est une des maladies infectieuses les plus sévères pour l’homme, d’autres Yersinia pathogènes causent seulement une infection intestinale (entéropathogènes : Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica). L’origine de cette différence de virulence n’est pas encore complètement élucidée. Afin de pouvoir lutter le plus efficacement contre ces infections, il est capital de mieux comprendre pourquoi et comment ces bactéries inhibent les processus de contrôle de l’une ou l’autre espèce au sein du genre Yersinia et induisent des dommages systémiques et ou locaux. Il est aussi nécessaire de comprendre l’évolution des espèces au sein des Yersinia ainsi que des lignées au sein des espèces. La virulence est multifactorielle chez les Yersinia. Certains facteurs de virulence ont déjà été identifiés, mais beaucoup restent encore mal connus, voire inconnus. L'objectif principal de ce projet est d'utiliser différentes approches in vitro et in vivo pour identifier ces facteurs, étudier leur mode d'action et mieux comprendre la réponse de l’hôte lors de l’infection. L’étude de l’infection permettra également d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’infection à visée diagnostique. Pour cela, des souches mutantes de bactéries générées au laboratoire seront étudiées in vivo. Nous analyserons les effets que ces bactéries exercent chez des rongeurs modèles, les souris de laboratoire, et identifierons et caractériserons les processus précoces (efficaces ou non), mis en place par l'hôte lors de l'infection. Le projet a donc pour objectifs : - Identifier les facteurs de la bactérie impliqués dans les processus pathologiques dans le cas d'une infection causée par une des espèces pathogènes de Yersinia. - Analyser les interactions entre bactéries invasives et souris de laboratoire. - Caractériser les processus et les routes de progression des bactéries post inoculation /délivrance. - Caractériser les lésions tissulaires et cellulaires induites par l’une ou l’autre espèce et de comparer ces lésions en fonction du niveau de leur pathogénicité. - Mettre en évidence les mécanismes de la réponse immunitaire de l'hôte induits ou inhibés. - Identifier les cellules de l’hôte expérimental avec lesquelles l’une ou l’autre espèce bactérienne interagit à différentes périodes post inoculation / délivrance et dans différents tissus. - Identifier des biomarqueurs précoces d’infection à visée diagnostic.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude nous aideront à acquérir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques induits par les espèces invasives au sein du genre Yersinia chez leur hôte, ainsi que de l’évolution entre les différentes espèces et au sein des lignées d’une même espèce. En effet ils devraient permettre de mieux comprendre pourquoi et comment l’hôte peut (ou non) contrôler l’infection, notamment en inhibant les processus de virulence des Yersinia, ainsi que d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’infection. A terme, les résultats obtenus permettront de lutter le plus efficacement contre la peste et les autres Yersinioses.
Procédures
Gestes techniques communs à toutes les procédures: Infection par voie sc : une injection unique, durant 1 minute, sans anesthésie Infection par voie id : une injection unique, durant 4 minutes ; sous anesthésie gazeuse Infection par voie orale : une inoculation unique, durant 1 minute, sans anesthésie Infection par ingestion de pain : une fois, durant environ 10 minutes (selon leur appétit), sans anesthésie Infection par instillation intranasale : une séance d’instillation unique, durant 5 minutes ; avec anesthésie par injection intrapéritonéale Geste technique spécifique à la procédure n°3 : Prélèvements de sang dans la semaine de l’infection : prélèvement unique, durant 3 minutes, sans anesthésie. Geste technique spécifique à la procédure n°4 : Imagerie in vivo de Yersinia bioluminescentes : anesthésie gazeuse quotidienne (sauf peste : injection sc), un maximum de 10 fois. Imagerie in vivo de Yersinia fluorescentes : anesthésie gazeuse, unique, sans réveil.
Impact sur les animaux
Toutes nos expériences incluent des infections de souris par des bactéries. Les nuisances sont donc presque toujours les mêmes, dans l’ordre chronologique : - Infection / inoculation de bactéries : pour toutes les voies d’infection l’animal recevra une injection unique, que ce soit pour de l’anesthésique (intranasale, intradermique) ou directement de la préparation infectieuse (voies sous cutanée ou intraveineuse). L’infection par la méthode de nourissage au pain infecté ou par canulage intragastrique (infection orale) ne nécessite pas d’injection ni d’anesthésie. - - L’infection bactérienne sera fatale pour le groupe témoin recevant la souche sauvage virulente, et aussi quand les mutations testées ne modifient pas la virulence (nous espérons au maximum 50% des cas). Les procédures sont donc classées « sévères ». Les signes cliniques sont ceux des infections bactériennes : fièvre, poil hérissé, prostration, perte de poids. Des points limites sont définis et seront appliqués. Toutefois, ces point limites surviennent souvent trop tard. De notre expérience, même si certains animaux présentent des signes cliniques, il n'est pas rare qu’ils se rétablissent. Nous avons déjà recherché des marqueurs pronostics de l’infection dans les souris infectées par les Yersinia pathogènes, comme la bactériémie, l’hyperthermie, la perte de poids… sans succès (trop de variations inter-individuelles). Nous ne sommes donc actuellement pas en mesure de prédire la mort ou survie d’un animal infecté par l’observation de tels marqueurs. - Prélèvements : en procédure 3 un prélèvement sanguin unique est effectué avant infection (voir procédures).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet les animaux ayant été infectés développent une immunité anti-bactérienne qui interviendra dans le déroulement d’une autre infection et en altèrera les résultats de manière incontrôlée. Les animaux ne peuvent donc être pas être réutilisés.
Remplacement
Une mise au point in vitro ou ex vivo sera réalisée pour les techniques avancées de criblage. Les résultats de criblage dans des conditions ex vivo (sangs de donneurs, cellules, organes sur puce) permettront également d’identifier des facteurs importants pour l’infection. Une étude approfondie de la littérature sera réalisée afin d’identifier les facteurs déjà décrits, les expériences déjà réalisées ainsi que les résultats négatifs ne montrant pas d’effet lors de la mutation d’un facteur particulier. Les données à grande échelle produites par d’autres laboratoire et rassemblées sur des bases de données spécialisées tels que Yersiniomics seront utilisés afin d’évaluer la pertinence des facteurs choisies. Des tests préliminaires in vitro permettront de réduire le nombre de mutants étudiés in vivo : par exemple ceux qui seraient sévèrement affectés dans leur croissance seraient exclus de ce projet. Aussi, l’absence accidentelle de facteurs de virulence (plasmides, éléments chromosomiques mobiles…) peut être évaluée en amont du présent projet et permettra d’écarter les mutants peu intéressants de l’étude. La possibilité de séquencer les génomes des bactéries à moindre coût est un pas important dans ce sens. Toutefois, les infections bactériennes induisent des processus pathologiques complexes impliquant de multiples organes et le système immunitaire dans son ensemble (organes divers, relations entre organes, circulation sanguine et lymphatique, multiples populations cellulaires et mécanismes effecteurs), ce qui fait que le modèle animal est irremplaçable pour une évaluation réaliste de la virulence.
Réduction
Des expériences pilotes seront réalisées sur un petit nombre d’animaux afin d’évaluer la robustesse des techniques utilisées et des résultats obtenues. Les effets confondants tels que les effets cage, date ou expérimentateur seront pris en compte pour les études avancées et sensibles à l’échelle du génome. Les procédures seront optimisées en étudiant simultanément le plus grand nombre possible de paramètres sur chaque animal, et en regroupant les expérimentations de façon à limiter les groupes d'animaux témoins nécessaires. Les groupes (sauvage vs mutant) seront comparés par des tests statistiques adaptés. Un test sera utilisé pour comparer la survie des groupes (sauvage vs mutant) exposés à la peste. Des modèles linéaires à effets mixtes pourront être utilisés afin de prendre en compte d'éventuels effets techniques liés à la cage et aux répétitions. Le détail des statistiques est décrit dans les procédures. Le nombre d’animaux indiqué a été obtenu par un calcul de puissance statistique en collaboration avec un biostatisticien, et est basée sur le nombre minimum d'animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement robustes et reproductibles.
Raffinement
Durant les infections, un suivi quotidien des animaux sera opéré tout au long de l’expérience pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précèdent généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (score de 2 sur la “grille évaluation douleur stress inconfort utilisée) ou stress ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de gel hydrique, réhydratation sous-cutanée. Si des animaux atteignent les points limites définis, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats, souris, gerbilles etc.) sont des hôtes idéaux pour l'étude de la peste puisqu'ils y sont très sensibles, et sont les principales cibles et réservoirs de la peste dans la nature. La peste se développe chez la souris sous les formes bubonique et pulmonaire avec des cinétiques, signes cliniques et léthalités comparables à celles de la peste humaine. La souris est le modèle le plus utilisé par les laboratoires étudiant la pathogénèse des Yersinia. De même, les souris sont sensibles aux infections par les Yersinia entériques (Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica) et sont des modèles usuels de ces infections. La disponibilité d'un grand panel de souris génétiquement modifiées (principalement des fonds génétiques classiques : BALB/c et C57BL/6) permet de tester un certain nombre de voies ou de mécanismes potentiellement impliqués soit dans la résistance de l'hôte à l'infection, soit au contraire servant de cible au pathogène pour induire des lésions et inhiber les défenses immunitaires de l'hôte. Le système immunitaire murin étant extrêmement proche de celui des humains, il permet des analyses immunologiques et cliniques adéquates. Les souris auront au moins 7 - 14 semaines (âge adulte) afin d’être représentatifs de l’espèce à l’âge adulte, et par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. À l’âge adulte leur système immunitaire est complètement fonctionnel. Cela assure l’homogénéité des sujets, nécessaire à la reproductibilité intra- et inter-expérimentale des résultats. Les infections par Yersinia pathogènes ne sont pas sensibles à l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.
Evaluation d’un dispositif endoscopique chez le porc pour l’amélioration des traitements des tumeurs pancréatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Six cochons de 40 kg subissent une anesthésie de quatre heures et une ouverture de l'abdomen pour poser une sonde à ultrasons focalisés directement sur le pancréas, puis pour trois d'entre eux une incision de l'estomac, sans jamais se réveiller. L'équipe qualifie les traitements ultrasonores d'indolores et signale qu'un produit injecté par voie intraveineuse peut déclencher une réaction allergique. Tous sont tués pour vérifier que les ultrasons ont bien atteint le pancréas et le foie. Le porteur annonce un objectif de dix traitements réussis pour chacune des deux étapes, puis écrit que l'expérience s'arrêtera dès quatre succès.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un enjeu majeur de santé publique. Il est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. Cependant peu de patients sont éligibles (30%). Le pancréas est situé derrière la partie inférieure de l’estomac. Utiliser un endoscope jusqu’à l’estomac paraît intéressant pour l’approcher. L’échographie par voie endoscopique est déjà un des meilleurs outils à ce jour pour diagnostiquer ce cancer. Un endoscope sur lequel a été adaptée une sonde qui génère des ultrasons focalisés qui peuvent entraîner à distance la modification de l’organisation de l’environnement de la tumeur cancéreuse et le rendre moins dense a été développé. Ainsi, l’entrée des traitements (chimiothérapie, radiothérapie ou immunothérapie) à l’intérieur de la tumeur est facilitée. L’efficacité est alors augmentée et les doses peuvent être ajustées, diminuant les effets secondaires. Des essais in vitro montrent que cette hypothèse est vérifiée. Ce projet a pour objectif principal d’évaluer si le dispositif (endoscope + sonde de traitement) permet d’appliquer les ultrasons au niveau du pancréas du porc à travers la paroi de l’estomac. Ceci sera réalisé en 2 temps : dans un premier temps, il sera vérifié la possibilité de réaliser le traitement via une chirurgie abdominale en positionnant la sonde directement sur le pancréas, puis, si cela fonctionne, la voie endoscopique sera testée pour s’assurer de la possibilité de réaliser le même traitement à travers l’estomac. Le modèle porc utilisé ne permet pas le passage de la sonde par voie œsophagienne (comme cela sera le cas chez l’Homme), il sera donc nécessaire d’introduire la sonde directement dans l’estomac via une petite incision pratiquée au niveau de l’abdomen.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible.
Procédures
Une anesthésie de quatre heures avec une injection dans le muscle de la cuisse aura lieu. Lors de cette anesthésie une chirurgie sera pratiquée : une ouverture de l’abdomen dans un premier temps pour mettre la sonde en contact avec le pancréas (sur 3 porcs maximum), puis une petite incision au niveau de l’estomac pour introduire la sonde (sur 3 autres porcs au maximum si la première phase a réussi). Un produit facilitant le traitement pourra être injecté par voie intra-veineuse, ce produit peut potentiellement déclencher une réaction allergique chez le porc. Ces interventions sont réalisées dans le cadre de procédures sans réveil.
Impact sur les animaux
Au moment de l’anesthésie, certains porcs sont stressés. Les traitements ultrasonores réalisés au niveau du pancréas et du foie sont indolores. Un produit facilitant le traitement pourra être injecté par voie intra-veineuse, ce produit peut potentiellement déclencher une réaction allergique chez le porc.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d’examiner le pancréas pour vérifier que les ultrasons ont bien atteint le pancréas et le foie.
Remplacement
Plusieurs questions de l’étude globale sont répondues grâce à l’étude in vitro sur cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons sont évalués en amont par simulations informatiques. Il est important après toutes ces étapes de pouvoir s’assurer que le dispositif fonctionne en condition réelle, que le pancréas est bien repérable et visible et que les ultrasons seront bien appliqués dans le pancréas.
Réduction
Ce projet ne nécessite pas d’étude statistique. Nous avons pour objectif de réussir le traitement à 10 reprises pour chacune des 2 étapes (directement sur le pancréas puis à travers la paroi gastrique). Dès que nous aurons atteint 4 succès l’expérience s’arrêtera. L’essai de traitement sur le foie ici permet de répondre à une question scientifique supplémentaire sans augmenter l’impact sur les animaux ni leur nombre. Les organes non prélevés dans le cadre du projet seront proposés à la communauté scientifique.
Raffinement
Bien que le traitement soit apparemment non douloureux, une analgésie est appliquée en combiné avec l’anesthésie. L’anesthésie est réalisée via un prolongateur ce qui évite d’avoir à effectuer une contention de l’animal. Outre la mise à disposition d’objets à mâchouiller et d’un ballon, les techniciens animaliers disposent d’un temps de jeu, d’échange avec les porcs, leur mettent à disposition des friandises dans la litière pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel de fouissage. Ils sont régulièrement sortis de leur box pour pouvoir courir dans un plus grand espace de l’animalerie. Lors de l’ouverture de l’abdomen, en plus de la combinaison d’anesthésique et analgésique administrée en intraveineux, un anesthésique local sera injecté.
Choix des espèces
L’endoscope humain peut être utilisé chez le porc et l’anatomie interne est suffisamment proche de celle de l’homme pour répondre à l’objectif du projet. Les porcs pèseront 40 kg, ce qui correspond à une taille presque adulte (nécessaire pour le passage de l’endoscope dans les voies digestives) mais avant une prise de graisse trop importante.
Evaluation de la résistance de populations de bars communs d’élevage à des pathogènes
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Des entreprises de sélection aquacole veulent classer leurs reproducteurs sur la résistance aux maladies. Pour cela, 6 330 bars communs juvéniles vont être utilisés, tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère. Ils sont infectés par le nodavirus ou par des bactéries du genre Vibrio, par injection intrapéritonéale sous anesthésie ou par bain, le porteur indiquant qu'il calibre la mortalité pour qu'elle atteigne 40 à 50 % du lot. Le gain annoncé, 2 à 10 % de survie supplémentaire par génération de sélection, se paie de la moitié d'un lot emportée par l'infection et du reste mis à mort faute de pouvoir le ramener en ferme.
Objectifs
Le premier objectif est de poursuivre l’évaluation de la résistance de populations commerciales de bars communs à un pathogène récurrent en pisciculture : le virus de l’encéphalopathie et de la rétinopathie (VER) ou nodavirus. L’évaluation de la résistance aux pathogènes doit en effet être menée sur plusieurs générations successives afin que la sélection sur ce caractère précis soit efficace et porte ses fruits. Les bars mâles et femelles étant sexuellement matures à partir de 2 à 3 ans et de 3 à 4 ans, respectivement, il faut au minimum une période de 3 à 4 ans pour tester 2 générations successives sachant qu’en complément, les entreprises de sélection génèrent de nouvelles cohortes chaque année pour leurs besoins de production. Le deuxième objectif est d’améliorer un protocole existant d’épreuve infectieuse par un agent bactérien. Le protocole actuellement utilisé prévoit une contamination par injection intrapéritonéale du pathogène, ce qui nécessite une anesthésie et une manipulation des animaux mais a également pour inconvénient de passer les muqueuses, qui représentent une barrière de protection contre les pathogènes. Ce projet vise à mettre en place un mode de contamination par bain (pathogène mis directement dans l’eau dans laquelle évoluent les animaux), ce qui permettrait de réduire le niveau de stress et de se rapprocher d’un mode de contamination naturel.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des bars communs en élevages, une diminution de l’utilisation de médicaments et une optimisation de la représentativité du protocole d’infection bactérien. L’amélioration attendue de la survie est estimée entre 2 à 10% par génération de sélection en fonction de la composition des index de sélection et des pressions de sélection appliquées. L’index correspond au poids mis sur un caractère donné au moment de la sélection (qui porte sur plusieurs caractères différents) et la pression correspond au nombre d’individus sélectionnés. Les candidats à la sélection sont classés entre eux selon les performances de survie de leurs collatéraux challengés. Plus les individus sélectionnés sont bien classés, plus vite l’amélioration du caractère évolue.
Procédures
Il n'y a pas d'intervention prévue sur les animaux vigiles. Les animaux qui seront contaminés au moyen d’une injection intra-péritonéale seront anesthésiés au préalable. Chaque individu recevra une unique injection, d'une durée de moins de 10 secondes. La durée d'anesthésie ne devrait pas excéder 5 à 10 minutes par poisson, ceux-ci étant mis en bac de réveil dès l'injection réalisée.
Impact sur les animaux
Le projet consiste à infecter expérimentalement des poissons avec des pathogènes. Afin d'estimer de manière précise le degré de résistance des individus qui seront testés et de leurs familles, il est prévu de calibrer la mortalité induite pour obtenir une proportion de l’ordre de 40 à 50% du lot. Par ailleurs, dans l’objectif de comparer l’apparition des signes cliniques entre différents modes de contamination, une grille de points limites sera utilisée et adaptée. Les animaux qui atteindront un point limite supérieur ou égal à 4 seront mis à mort de manière compassionnelle.
Devenir
Il n'est pas prévu de réutiliser les animaux survivants dans de nouvelles procédures. Par ailleurs, du fait de la nature des essais réalisés et pour des raisons sanitaires, il n'est pas envisageable de transporter les animaux dans leur ferme d'origine. En conséquence, à la fin de chaque procédure, les animaux survivants seront mis à mort.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative in vitro pour ce projet. L'évaluation de la résistance d'individus à un pathogène à des fins d’amélioration génétique progressive de la population doit se faire sur des animaux vigiles capables de mettre en œuvre des systèmes de défense complexes (immunité).
Réduction
Pour répondre au 1er objectif, le nombre de poissons utilisé est réduit au minimum requis par les méthodes d'évaluation génétique. Le principe est que les individus testés dans le projet servent à évaluer et classer leurs collatéraux (frères/sœurs) restés en pisciculture et qui seront sélectionnés. De ce fait, le meilleur compromis doit être trouvé entre un nombre faible de poissons testés et une classification précise de leurs collatéraux en ferme. Pour l’objectif 2, Le nombre de poissons a été déterminé par une approche statistique pour observer une différence de proportion significative.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment deux fois par jour adaptée à leur stade de développement et l'intégration de couvercles sur une partie des bassins pour générer des zones d'ombres. Du fait de la nature des tests entrepris, la mort des poissons est une donnée attendue. Cependant, dans le but d'atteindre le 2nd objectif, les opérateurs mettront à mort de manière compassionnelle les animaux lorsque les points limites définis seront atteints.
Choix des espèces
Le bar commun (Dicentrarchus labrax) fait l’objet d’une forte production en France, notamment au sein d’écloseries pour des fins d’exportation. Ce poisson est par ailleurs particulièrement sensible aux pathogènes bactériens de genre Vibrio et au VER et des épisodes de maladies sont régulièrement constatées au sein de fermes aquacoles en mer, renforcés par les effets du changement climatique. Il s'agit d’une des espèces produites par les partenaires du projet pour lesquels les poissons sont testés. Les animaux testés sont des juvéniles de poids moyen entre 3 et 30g selon les essais. Les individus juvéniles sont sensibles aux pathogènes et en terme d'espace, leur petite taille permet de les étudier et de les infecter dans de bonnes conditions expérimentales.
Etude de la sécurité d’utilisation et de la performance analytique d’un biocapteur épidermique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Anesthésiés vingt minutes, équipés de quatre capteurs plantés dans la peau de l'oreille, puis cathétérisés pour six heures et demie de prélèvements sanguins pouvant atteindre soixante ponctions, 30 cochons subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. La séquence peut se répéter jusqu'à quatre fois par animal, à dix jours d'intervalle au minimum. Le porteur prévoit des injections de potassium et de glucose destinées à faire varier les concentrations sanguines, en reconnaissant qu'une hyperkaliémie importante crée un risque de complication cardiaque pouvant aller jusqu'à l'arrêt du cœur. Aucun prélèvement de tissu n'étant nécessaire, ces cochons seront ensuite transférés vers d'autres projets, y compris des protocoles sans réveil.
Objectifs
Les affections rénales chroniques sont des maladies évolutives touchant les reins dont les stades s’échelonnent de 1 à 5 en fonction de leur gravité. Les reins sont les organes filtrant le sang pour en éliminer les déchets toxiques qui s’y accumuleraient sinon. Une dégradation de l’état de santé du patient des stades intermédiaires 3 à 4 vers le stade 5 se traduit par une importante dégradation de sa qualité de vie. En effet, en phase terminale le patient a besoin de fréquentes dialyses voire d'une transplantation d’organe. Le suivi des patients comprend des prises de sang régulières pour surveiller l’évolution de la maladie et des prises sanguines rapprochées durant des phases aiguës de la maladie. Les délais dans la réception des résultats de ces analyses peuvent conduire à des retards dans les modifications du traitement voire même conduire à des hospitalisations en urgence et au décès. L’analyse en temps réel des données du patient, sans prise de sang, permettrait un suivi moins contraignant et une réponse plus rapide aux évolutions des symptômes. Ainsi, l’état de santé du patient serait stabilisé grâce à une prise en charge plus adaptée permise par cette approche préventive. Le dispositif testé dans ce projet est un capteur portable à placer sur la peau comme un patch et mesurant en continu les concentrations de deux biomarqueurs couramment utilisés par les néphrologues : le potassium et le glucose. L’étude proposée a pour but d’étudier et d’optimiser plusieurs paramètres de notre dispositif que nous ne pouvons pas adresser en laboratoire : 1 - La capacité du capteur à mesurer de manière exacte et reproductible les biomarqueurs cibles dans la peau 2 - Les potentiels risques de sécurité pouvant être provoqués par son utilisation de longue durée (8 jours) sur un être vivant (notamment des démangeaisons ou des rougeurs) 3 - L’optimisation des algorithmes d’analyse des résultats grâce à la création d’une base de données inédite. L’environnement complexe de la peau avec plusieurs couches (épiderme, derme, hypoderme) aux paramètres mécaniques variés et non-homogènes, et la présence d'une réaction inflammatoire sont difficiles à simuler en laboratoire et nécessitent donc une étude préliminaire sur l’animal pour identifier des points d’amélioration de notre dispositif L’ensemble de ces tests permettra de s’assurer de la bonne performance du dispositif en vue d’une future étude clinique sur des patients humains.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet pourraient présenter plusieurs bénéfices sur le long terme, sur le plan médical et sur le plan scientifique. Le projet pourrait être bénéfique aux êtres humains car il s’inscrit dans le cadre du développement d’un instrument destiné à l’amélioration du suivi des affections rénales chroniques. Un meilleur suivi de ces maladies permettra d’améliorer les conditions de vie des patients en repoussant des complications liées à la dégradation de leur état de santé grâce à des traitements plus adaptés. Additionnellement, le dispositif permet de remplacer les prises de sang comme moyen de suivi de l’évolution de l’état des reins par un capteur indolore. Ceci présente 3 avantages : une diminution des contraintes de déplacement pour le patient, et donc un suivi quotidien simplifié ; une augmentation du nombre de points de donnée car le capteur réalise une mesure en temps réel ; une transmission des données automatique entre le médecin et le patient impliquant moins de travail administratif pour le système de santé. Il devient donc possible de réagir plus rapidement pour adapter le traitement médical et/ou le comportement du patient (alimentation notamment) en cas de mesures biologiques s’approchant d'une situation pathologique grave. Au-delà des bénéfices induits directement par l’utilisation de ce capteur à l’avenir, les résultats de cette étude ouvriront la voie au développement d’autres capteurs du même type adaptés au diagnostic, au suivi et/ou au traitement d’autres pathologies. D’un point de vue scientifique, un des objectifs de cette étude est de démontrer l’existence d’un lien utilisable pour la mesure en continu entre le potassium sanguin et sa concentration dans la peau, où est effectuée la mesure. En effet, si des liens sur des mesures ponctuelles ont déjà été observés, aucun lien de ce type n’a été démontré à ce jour pour des mesures dynamiques et une preuve dans ce sens ouvrirait de nouvelles perspectives dans le domaine de la mesure en continu de la kaliémie dans le fluide interstitiel de façon micro invasive.
Procédures
Placement des capteurs : pose de maximum 4 capteurs sous anesthésie générale de courte durée (20 min) au maximum 4 fois. Administration de 2 biomarqueurs modifiant transitoirement les concentrations sanguines naturelles de ces molécules et prélèvements sanguins sous anesthésie générale (60 prélèvements maximum via un cathéter sur une période de 6h30), au maximum 4 fois.
Impact sur les animaux
Le port du capteur peut provoquer des effets secondaires chez l’animal, que ce soit dû à une réaction aux aiguilles insérées dans la peau ou bien l’adhésif utilisé : 1- Irritation locale de la peau, caractérisée par des rougeurs et des démangeaisons 2- Réaction immunitaire due à l’insertion des aiguilles ou en réaction à un des produits présents en surface 3- Stress ou anxiété dans le comportement de l’animal due à la présence du dispositif (peut être lié à un des points ci-dessus) 4- Stress dû à la capture et aux manipulations avant contention chimique 5- Effets secondaires dûs à l’anesthésie (hypotension, hypoxie, réaction anaphylactique) 6- Effets secondaires liés à l’injection de solution de biomarqueurs (notamment pour le potassium) : Une augmentation importante du potassium sanguin crée un risque de complication cardiaque pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardiaque
Devenir
Aucun prélèvement tissulaire n'est nécessaire en fin de protocole. Les procédures réalisées sont peu invasives, de classe de gravité modérée prospective en raison du possible processus d'itération. Les animaux peuvent donc être réutilisés dans des projets, ici de classe de gravité modérée ou sans réveil, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques.
Remplacement
Des études bibliographiques et des tests de biocompatibilité (notamment de la toxicité cellulaire en culture cellulaire et d’extraction) seront menés en parallèle de cette étude. Toutefois ces résultats sont limités et ne remplacent pas une observation in-vivo. De même, des résultats préliminaires concernant la performance analytique du capteur ont été obtenus en conduisant des tests in-vitro. Toutefois, ce résultat ne peut pas être directement extrapolé pour l’utilisation du capteur in-vivo car l'environnement de mesure de la peau est radicalement différent de celui des tests in-vitro. Ces tests incluent l’utilisation de solutions prélevées, de peau d’animal mort ou de peaux artificielles mais ne sont pas suffisants. Il est aussi difficile de simuler informatiquement un environnement aussi complexe. En effet les propriétés des tissus vivants, les concentrations des molécules, la répartition des molécules cibles dans l'environnement et la dynamique de ces paramètres ont une influence importante et ne peuvent être testés qu’in vivo. Additionnellement, cela permet de tester l’effet de la réaction immunitaire sur l’évolution de la qualité de la mesure dans le temps et notamment une diminution du signal dû à une colonisation de la surface des électrodes de mesure par des cellules immunitaires ou à d'autres effets de bio-encrassement.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi en fonction des besoins des 2 procédures qui composent ce projet. Procédure 1 - Test de tolérance du biocapteur : 3 animaux maximum seront nécessaires. Normalement, 1 animal devrait suffire pour cette étape, toutefois en cas de réaction inflammatoire importante, d’autres animaux pourraient être utilisés pour poursuivre le test et vérifier si celle-ci se déclenche chez eux également. L’animal peut être utilisé pour des étapes subséquentes si aucune réaction n’est décelée. Les effets négatifs attendus sont minimes, ce qui permettrait de diminuer le nombre d’animaux nécessaires dans l’ensemble de l’étude. Procédure 2 - Optimisation et validation du biocapteur : 27 animaux maximum seront nécessaires. Cette étape est itérative, chaque itération permet d'optimiser le capteur et l'algorithme de mesure en fonction des résultats de la précédente jusqu'à atteindre un résultat satisfaisant. Le nombre d’itérations, et donc d’animaux nécessaires, dépendra des résultats obtenus durant l’étude. Le nombre d’animaux indiqué correspond donc à une estimation haute du nombre d’itérations qui seront nécessaires pour que le capteur fonctionne correctement et pour valider le résultat. Dans un cas idéal, 1 animal serait suffisant pour optimiser le capteur et 3 pour valider le design et l'algorithme. Chaque animal pourra être réutilisé pour un maximum de 4 itérations, chacune espacée d’au moins 10 jours. Aucune étude statistique n'est prévue sur cette étude, que ce soit sur la procédure 1 ou la procédure 2, celle-ci sera faite à un stade ultérieur du développement du dispositif. A ce stade, la performance analytique est établie de manière individuelle pour chaque capteur.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en box individuel afin d’éviter qu’ils n’enlèvent les capteurs présents sur les autres, ces boxes permettent cependant le contact visuel, auditif et olfactif. Ils sont hébergés dans des locaux avec des paramètres d’ambiance contrôlés adaptés à l’espèce. Ils bénéficient d’une période d’acclimatation de minimum 7 jours pendant lesquels les opérations de nettoyage des boxes et de distribution de nourriture et d’eau sont mises à profit pour habituer l’animal à la présence et au contact de l’Homme, notamment par la distribution de caresses et de morceaux de fruits. Des enrichissements tels que des ballons de plastique et une chaîne au mur sont mis à disposition. Les granulés sont distribués dans la litière de copeaux afin de favoriser le comportement de fouissage. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de vérifier leur état général, la prise alimentaire, la prise de boisson et l’émission de fèces. L’absence de réaction au dispositif sera également contrôlée. Des points-limites adaptés ont été définis afin de limiter et de prendre en charge précocement toute souffrance. Les prélèvements sanguins de la procédure 2 sont réalisés sous anesthésie afin de limiter le stress pour ces procédures invasives comprenant notamment la pose d’un cathéter pour une durée de 6 heures, des prélèvements sanguins réguliers ainsi que des injections pouvant provoquer des états d’hyperglycémie et d’hyperkaliémie. Durant les procédures, le niveau des biomarqueurs sanguins ainsi que l’électrocardiogramme seront suivis en temps réel afin de réagir dès l’apparition des premiers signes alarmants. Ces tests seront espacés d’au moins 10 jours afin de permettre le repos et le rétablissement de l’animal entre les deux phases. Des points limites adaptés ont également été définis. Les animaux sont surveillés quotidiennement pendant la phase d'acclimatation et deux fois par jour après les réveils d'anesthésie générale.
Choix des espèces
Pour cette étude, le choix de l’espèce animale s’est porté sur le porc pour plusieurs raisons : - La structure de la peau des porcs est similaire à celle de la peau humaine, elle fournit un environnement adapté pour tester les capacités de notre capteur - L’épaisseur de la peau des porcs est similaire à celle de la peau humaine à certains emplacements du corps (oreilles, cou...) - La concentration des analytes cibles dans le sang des porcs est similaire à celle que l’on trouve dans le sang des Humains Les porcs utilisés seront des porcs juvéniles d’environ 30 kg. A ce stade de développement, les oreilles des animaux seront suffisamment développées pour supporter les capteurs et les animaux sont plus facilement manipulables.
Evaluation de l’immunogénicité de la protéine VP2 du virus de la peste équine chez les équidés
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Treize prises de sang par cheval et deux injections d'un vaccin à cinq semaines d'intervalle : 15 chevaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet teste trois doses d'un candidat vaccin contre la peste équine, une maladie des équidés transmise par des moucherons, sur trois groupes de cinq chevaux. Les injections peuvent provoquer une légère douleur, un gonflement local et une hausse passagère de la température, les ponctions un hématome. Le porteur retient le cheval comme "l'espèce cible la plus sensible au virus", après des essais où la protection des souris vaccinées a été totale, et prévoit de garder les prélèvements comme "matériaux de référence" pour son laboratoire. Tous les chevaux sont gardés en vie, puis réutilisés pour d'autres activités de recherche.
Objectifs
La peste équine est une maladie des équidés causée par un virus figurant sur la liste des maladies à déclaration obligatoire de l'Organisation mondiale de la santé animale en raison de son taux de mortalité élevé (~95 %) chez les chevaux. Ce virus est endémique dans les zones tropicales et subtropicales d'Afrique, mais s'est propagé à plusieurs reprises hors de son habitat africain au 20eme siècle, provoquant de graves épidémies dans le bassin méditerranéen et en Europe et, plus récemment, jusqu'en Thaïlande. Le virus est transmis d’un animal à un autre par des moucherons piqueurs hématophages. Les facteurs liés au changement climatique (températures, vent) peuvent permettre l'introduction de ces vecteurs dans des régions jusqu’alors indemnes, et accroître le risque d’introduction du virus, comme cela a été montré pour les virus de la fièvre catarrhale du mouton (FCO) et de la maladie hémorragique épizootique (MHE), qui sont aussi vectorisés par les moucherons. La FCO et la MHE ont émergé en Europe et ré-émergent chaque année pendant la période d’activité de ces moucherons. Les mesures pour prévenir et traiter la peste équine restent limitées. Bien qu'un vaccin utilisant le virus de la peste équine atténué, c’est-à-dire non infectieux, soit disponible et utilisé en Afrique du Sud, il existe un potentiel de retour à la virulence, et son utilisation en Europe n’est pas approuvée. Le but de cette étude est de développer des vaccins innovants pour la peste équine. Ces vaccins sont constitués de protéines formant une nanostructure, sur laquelle sont greffés des antigènes. Les antigènes sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation). L’antigènes d’intérêt pour cette étude est la protéine virale VP2, connue pour induire une réponse immunitaire chez l’animal infecté et ainsi de protéger complétement l’animal vacciné d’une infection. Ces candidats vaccins ont été testés sur des souris sensibles à l’infection et la protection des souris vaccinées a été totale. L’objectif de ce projet est maintenant de tester ces candidats vaccins dans l’espèce cible la plus sensible au virus, qui est le cheval. Dans le but de déterminer la meilleure composition du vaccin permettant d’induire la meilleure production d’anticorps, 3 doses d’antigènes seront testées. Au total, 3 groupes de 5 chevaux feront l’objet de cette étude.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer si le candidat vaccin permet la production d’anticorps contre le virus de la peste équine jusqu’à 1 an après la vaccination et ainsi protéger les équidés lors d’une infection qui peut leurs être fatale. De plus, les prélèvements issus de cette expérimentation serviront de matériaux de référence pour les activités du laboratoire.
Procédures
Les chevaux recevront 2 injections du vaccin (1 minute) à 5 semaines d’intervalle. Au total, 13 prises de sang (2 minutes par prise de sang) seront réalisées par cheval lors de cette procédure.
Impact sur les animaux
Les chevaux peuvent ressentir une légère douleur lors des injections du vaccin et lors des prises de sang de contrôle. Il existe un risque très faible de formation d’hématome à la suite de la ponction veineuse. Un gonflement local au niveau du point d’injection du vaccin peut être observé ainsi qu’une augmentation transitoire de la température.
Devenir
Les chevaux seront tous gardés en vie et réutilisés pour d’autres activités de recherche.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif pour tester l’efficacité du vaccin pour la production des anticorps spécifiques sur l’espèce cible la plus sensible au virus : le cheval. Ce vaccin a été précédemment testé sur le modèle murin avec succès.
Réduction
Au total 15 chevaux seront utilisés pour cette procédure et répartis dans 3 groupes distincts (3 doses différentes de vaccins). Par lot, le nombre de chevaux a été fixé à 5. Le nombre de 5 chevaux par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure par des tests statistiques non paramètriques.
Raffinement
La vaccination sera réalisée par un vétérinaire et les prélèvements sanguins seront réalisés par du personnel expérimenté avec une contention légère (tenue au licol) par un animalier familier au sein de leur groupe pour limiter le stress. Un vétérinaire, praticien hospitalier spécialisé en médecine équine, sera présent lors de la primo vaccination et du rappel et restera sur site pendant les 24 heures suivantes, pouvant ainsi intervenir en cas de nécessité. Il sera également contacté en première intention en cas d’effets indésirables pendant toute l’expérimentation. Puis les animaux seront suivis les 5 jours suivant chaque injection du vaccin avec notamment une prise la température rectale des animaux matin et soir, un suivi visuel au niveau du point d’injection et un relevé de toutes postures / comportement anormal (perte d’appétit, abattement, difficulté à baisser l’encolure). Les animaux seront hébergés en groupe en stabulation avec une alimentation 100 % fourrage durant les 5 jours suivant les injections de vaccin et au pâturage en groupe le reste du temps. Si un effet indésirable devait survenir, la prise en charge sera assurée par le vétérinaire et serait la suivante : - injection en urgence de cortico-stéroides et d’adrénaline en cas d’anaphylaxie (réaction quasi-immédiate avec difficulté cardio-respiratoire, sudation, douleur abdominale, tremblements…), - injection de corticoïdes, s’il s’agit d’une réaction de type allergique (démangeaison, chaleur au point d’inoculation, gonflement voire abcès), - des soins locaux seront réalisés en cas d’inflammation marquée, - et des anti-inflammatoires oraux seront administrés en cas de douleur. Les posologies appliquées seront celles recommandées par le vétérinaire. L’expérimentation serait alors arrêtée.
Choix des espèces
La peste équine est un virus d’importance sanitaire dans les populations équines. L’espèce cible pour ce candidat vaccin est donc le cheval. Pour cette étude, des animaux adultes seront inclus afin qu’ils aient un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1, les souris de ce projet développent une ataxie cérébelleuse et une croissance ralentie par rapport aux témoins. 300 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 24 étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une biopsie d'oreille pour génotypage, puis une anesthésie terminale permettant de prélever le cervelet, à cinq semaines avant l'apparition des symptômes ou à vingt semaines quand ils débutent. Le porteur annonce par ailleurs 400 souris sur cinq ans, cent de plus que l'effectif déclaré, sans expliquer l'écart.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptomes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris controles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparitition des symptomes. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : - Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. - Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. - Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de l’oreille pour genotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - injection des analgésiques et anesthésie avant l’intervention chirurgicale nécessaire à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris porteuses de la mutation du gène SCA1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de l’oreille ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 400 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les animaux seront surveillés au moins deux fois par semaine et l'état de santé sera évalué par un personnel compétent. Des points limites précis et adaptés au modèle ont été définis. Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d’utiliser les souris car elles présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptomes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptomes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Evaluation du profil pharmacocinétique d’une substance pharmaceutique au stade de développement préclinique chez le chien et le chat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Chiens : 300
Pour établir le profil pharmacocinétique de médicaments vétérinaires en développement, 300 chiens et 300 chats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit la substance sous contention de moins de dix minutes, une ou plusieurs fois, subit des prélèvements sanguins répétés et peut être hébergé seul jusqu'à 72 heures pour la collecte des urines et des selles. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de déterminer ce profil chez l'espèce de destination, et rappelle que la réglementation impose de tester le produit sur l'espèce à laquelle il est destiné. Aucun de ces 600 individus n'est tué dans le cadre du projet, tous devant être réutilisés, replacés en élevage ou adoptés, devenir rare dans ce corpus.
Objectifs
L’objectif du projet (ou protocole cadre) est de définir les conditions de réalisation des études de pharmacocinétique chez le chien et le chat dans le respect du bien-être animal et de la règle des 3Rs (Remplacement, Réduction et Raffinement). Ce projet permet ainsi d'établir le profil pharmacocinétique du produit en développement et évaluer sa biodisponibilité. Plusieurs études de pharmacocinétique pourront être requises pour répondre à l’ensemble de ces questions selon l’état d’avancement du développement du produit. Le profil pharmacocinétique (PK) et/ou la biodisponibilité de substances médicamenteuses dans divers tissus, organes et/ou fluides de l’organisme seront étudiés.
Bénéfices attendus
Les études pharmacocinétiques, en particulier en conjonction avec les données pharmacodynamiques, sont importantes pour soutenir des schémas posologiques des voies d'administration et des formulations galéniques efficaces et sûrs. De plus, des études pharmacocinétiques peuvent être utilisées pour établir des schémas posologiques en fonction de diverses variables de population (par exemple, l'âge, la race, l'état pathologique...). Enfin, les études pharmacocinétiques peuvent également mettre en évidence d'éventuelles interactions médicamenteuses, soit entre le ou les principes actifs et ceux des produits administrés de manière concomitante, soit entre les principes actifs destinés à une association fixe.
Procédures
Les gestes décrits ci-dessous sont réalisés selon les procédures en vigueur sur le site de l’établissement utilisateur, selon la voie et la durée définies et justifiées dans le plan d‘étude, selon les recommandations des lignes directrices, de la littérature. Lors de chaque geste, toute altération de comportement/état est immédiatement reportée au vétérinaire qui examine l’animal et décide de le maintenir ou non dans l’étude et de le traiter. L'administration des substances actives pourra être réalisée sur animal vigile de façon unique ou répétée selon les bonnes pratiques vétérinaires. Ce geste nécessite une contention de l’animal pendant une période inférieure à 10 minutes. Un à 32 animaux sont inclus par étude. Le nombre de groupes et le nombre d‘animaux par groupe dépend de l’objectif de l’étude et du nombre de composés à tester. Il est précisé dans le plan de l’étude conduite dans le cadre de ce projet. Les prélèvements sanguins nécessitent une contention légère ne visant qu’à restreindre les mouvements de l’animal pour sa sécurité et celle des manipulateurs. La durée de cette contention n'excède pas 5 minutes. Les volumes totaux de sang prélevés par procédure suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal et un temps de repos suffisant entre deux prélèvements est déterminé. L’animal peut être hébergé en box ou en cage individuel(le) en fonction des besoins de l'étude pour la réalisation de prélèvement de selles ou d'urine. La durée de cet hébergement individuel sera défini dans le plan d’étude et ne pourra excéder 72 heures. La réglementation européenne sera respectée pour la contention et l’hébergement des animaux.
Impact sur les animaux
Généralement, la tolérance des produits est déterminée avant d’initier les études de pharmacocinétique. Aucun effet secondaire sévère n’est donc attendu dans les études de pharmacocinétique. Dans le cas où les données de tolérance sont limitées chez l’espèce cible, le dessin expérimental va être adapté avec une administration progressive et un suivi vétérinaire renforcé. Les phases de traitement et de prélèvement pourraient occasionner du stress ou une baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/prélèvement. Si la période de prélèvement oblige les animaux d’être hébergés individuellement pour éviter des contaminations et permettre la récolte de selles ou d’urine sur une durée déterminée sans intervention, la durée n'excèdera jamais 3 jours et les animaux auront un contact visuel, auditif et olfactif avec les congénères ainsi que des interactions avec le personnel formé et compétent.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisé dans le cadre de ce projet pourra être soit réutilisé, replacé ou adopté car la sévérité des procédures envisagées est au maximum de modérée et n'implique pas la mort de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives pour déterminer le profil pharmacocinétique d’un produit dans différents fluides et tissus chez l’animal de l’espèce cible en fonction des voies d'administration. Selon le type de molécules en développement, et couplées aux résultats d’études pilotes, des études de PK/PD (pharmacocinétique / pharmacodynamie) et des modélisations seront conduites pour permettre de définir les conditions expérimentales optimales pour les études de pharmacocinétique ultérieures.
Réduction
Le nombre d’animaux varie selon qu’il s’agit d’une étude pilote (pour une preuve de concept et selon le stade du développement du projet dépendant du niveau de connaissance disponible au moment de l’étude ainsi que le type de molécule testée) ou d’une étude règlementaire devant répondre aux guidelines en vigueur. Un dessin expérimental en cross-over sera suivi autant que possible pour limiter le nombre d’animaux à inclure dans chaque étude. Il est également possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas selon la finalité de l’étude (pilote, règlementaire, évaluation du nombre d’animaux pour une étude de bioéquivalence…), et s’il est considéré que le nombre d’animaux inclus permet d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le développement futur du produit dans le cas d’une étude pilote, ou de décrire précisément les caractéristiques pharmacocinétiques du produit dans le dossier de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) dans le cas d’une étude règlementaire. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique au produit testé dans le cadre de ce projet. Grâce à une approche de modélisation PK/PD (pharmacocinétique / pharmacodynamie), les données PK pourront permettre la sélection du niveau de dose et de l'intervalle de dosage et ainsi remplacer les études de détermination de dose standard habituellement effectuées in vivo (et ainsi donc, limiter l’utilisation d’animaux dans des études ultérieures).
Raffinement
Le projet ne comportant pas de phase pouvant induire une douleur/souffrance/angoisse excessive, aucune médication n’est envisagée. Les conditions d’hébergement permettent aux animaux d’avoir a minima des contacts visuels, auditifs et olfactifs, il n'y a donc pas d'isolement mais un hébergement individuel. Lorsque ce dernier est nécessaire pour atteindre l’objectif de l’étude, les périodes sont les plus courtes possibles et des périodes de regroupement des animaux, de sociabilisation et de jeux avec l’humain sont également prévues. Les animaux disposent d’une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques et ont accès ad libitum à l’eau. Ils sont observés au moins 2 fois par jour pendant toute leur durée d’hébergement sur le site. En cas d’altération de comportement ou de toute observation laissant suspecter une atteinte du bien-être ou de la santé de l’animal, un vétérinaire examinera l’animal afin de poser un diagnostic qui permettra de prendre la décision adéquate pour protéger l’animal avec si nécessaire l'administration d'un traitement et, si besoin, en le sortant de l’étude. En cas de traitement, la voie d’administration, la dose et la durée du traitement seront définies par le vétérinaire. Il assure le suivi de l’animal jusqu’à son rétablissement complet. L’animal malade et/ou nécessitant un suivi spécifique pourra être mis à l'écart des autres animaux pour une meilleure surveillance. Il sera hébergé conformément aux procédures standards en vigueur au sein de l’Etablissement Utilisateur (EU) afin de lui permettre d'exprimer ses besoins physiologiques. Dans le respect de l’atteinte de l’objectif de l’étude, la fréquence des traitements et des prélèvements ainsi que les volumes administrés et les volumes de sang prélevés sont toujours minimisés pour éviter tout stress aux animaux. Des temps spécifiques de récupération sont prévus entre deux prélèvements sanguins en fonction du volume prélevé.
Choix des espèces
Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les objectifs de l’étude détermineront l'âge des animaux utilisés, allant du jeune animal à l’animal adulte. En effet, le devenir du médicament dans l’organisme (absorption, distribution, métabolisme et excrétion) est lié à l’état physiologique et physiopathologique de l’animal, à des facteurs exogènes, aux interactions médicamenteuses… et l’âge reste l’une des principales causes de variabilité pharmacocinétique. Avec l’âge, la maturité des organes cibles se modifie ; chez le nouveau-né, le métabolisme et l’excrétion se font lentement avant normalisation dans les mois suivants, traduisant une sensibilité des organes cibles possiblement très différente de celle de l’adulte. Chez l’animal âgé, le métabolisme est ralenti et la fonction rénale diminuée. Le poids corporel de l’animal est très différent selon l’âge de l’animal et est donc également à prendre en compte lors de la détermination de la dose. Cela impose de tester le futur médicament dans la tranche d’âges de l’espèce cible visée pour l’utilisation du futur médicament pour ajuster la posologie afin d’éviter des problèmes de toxicité ou d’inefficacité. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique au produit testé dans le cadre de ce projet.
Comparaison in vitro de molécules sur des macrophages canins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une entreprise privée cherche des molécules anti-inflammatoires à commercialiser pour la santé canine et fait prélever du sang sur des chiens pour en isoler des macrophages. 12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun subissant deux prélèvements de 30 mL à la jugulaire espacés de quinze jours, sur animal vigile. Le porteur revendique un "besoin" de molécules anti-inflammatoires pour l'espèce canine et présente le passage par des macrophages cultivés comme un moyen d'éviter des tests sur animaux vivants. Ces chiens ne sont pas tués mais réutilisés, et il juge probable qu'ils participent encore à une séance de travaux pratiques en fin d'année avant d'être proposés à l'adoption.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est d'étudier les activités et la réponse biologique de 4 molécules potentiellement anti-inflammatoires sur les macrophages (cellules immunitaires qui ont pour rôle de contribuer à l'entretien et au bon fonction des tissus) isolés à partir de sang canin. En effet, il existe peu ou pas de molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires en santé animale et il existe notamment un besoin pour l’espèce canine. Ce type de projet a déjà été mené sur du sang bovin mais nous manquons d'informations sur les cellules de l'immunité dans le sang canin. Cette étude est donc une étape préliminaire qui se concentrera principalement sur (1) une meilleure connaissance des caractéristiques des macrophages chez le chien, (2) l'étude des interactions entre de potentielles molécules anti-inflammatoires et ces macrophages canins.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la sélection de molécules anti-inflammatoires pour améliorer la santé des chiens.
Procédures
Pour chaque chien, deux prélèvements sanguins de 30 mL espacés de 15 jours. Chaque prélèvement sanguin dure au maximum 1 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont très faibles. Nous ne préleverons en effet pas plus de maximum 7% de la volémie totale sur 15 jours avec seulement une ponction par veine jugulaire sur des animaux vigiles. Les prises de sang engendreront donc une douleur très modérée et de très courte durée.
Devenir
Les animaux pourront être réutilisés à l'issue de la procédure. Il est probable qu'ils participent à nouveau à une session de TP en fin d'année et qu'ils soient proposés à l'adoption par la suite.
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux car les macrophages canins doivent être obtenus à partir de sang canin. En effet, il n'existe pour le moment aucune lignée de macrophages canins de disponible sans passer par des prélèvements sur animaux. Cependant, les molécules seront testées pour leur action anti-inflammatoire. Or, les macrophages dérivés in vitro sont un modèle relevant pour tester ces molécules tout en évitant les tests in vivo.
Réduction
La réalisation des tests des molécules anti-inflammatoires directement sur les macrophages permet de réduire le nombre de chiens utilisés au total pour le projet (seulement 12 chiens pour cette étude contre au moins 8 chiens*4 molécules =32 chiens si le projet final était mené directement sur animaux vivants). De plus, cela permet également de diminuer les actes menés sur les animaux (seulement 2 prises de sang à 15 jours d'intervalle).
Raffinement
Les chiens sont hébergés en groupe (2 à 4 chiens) avec un accès en extérieur 5 jours/7. Les animaux sont observés en continu le jour des prises de sang pour vérifier qu'il n'y a pas d'irritation due à la tonte des poils ou de formation d'hématome suite à la ponction. Pour limiter le stress des chiens lors des prises de sang, ils ont été habitués en amont à se tenir sur une table, être contenus par un animalier, au bruit de la tondeuse, aux pressions sur la jugulaire, ... et récompensés lors de chaque entrainement.
Choix des espèces
L’espèce canine a été choisie par l’entreprise privée car son objectif est de trouver des nouvelles molécules pour améliorer la santé des chiens. Les animaux seront des animaux adultes car c'est la population ciblée pour les essais des molécules inflamatoires par la suite.
Etude du rôle de l’endothéline dans la calcification valvulaire aortique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les rats subissent trois chirurgies, une ligature de l'artère du rein gauche à J1, l'ablation du rein droit à J8 et la pose d'une mini-pompe à J38, encadrées d'un prélèvement sanguin à J37 puis d'une IRM et d'une échocardiographie en semaine 12. 108 rats Sprague-Dawley mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. L'insuffisance rénale ainsi provoquée s'accompagne, si le modèle fonctionne, d'une anémie, d'une hypertrophie et d'une fibrose du cœur et d'une baisse de la fonction ventriculaire, avec 25 % de mortalité annoncée. Le porteur espère à long terme un traitement du rétrécissement aortique et vérifie d'abord une hypothèse sur un récepteur de l'endothéline.
Objectifs
Le rétrécissement aortique est une pathologie fréquente qui touche environ 2% de la population de plus de 65 ans. Cette maladie se caractérise par une calcification des tissus et une diminution de la surface valvulaire empêchant l’éjection du sang. Au stade final de la maladie, il en résulte des symptômes à type de dyspnée, insuffisance cardiaque à l’origine d’une importante morbi-mortalité cardiovasculaire. Hors, il n’existe actuellement aucun traitement médical permettant de stopper le développement des calcifications valvulaires. La seule issue thérapeutique consiste en une intervention. Quelques études suggèrent l’implication de la voie de l’endothéline dans le rétrécissement aortique et ex vivo qu’un blocage du récepteur de l'endothéline B augmentait les calcifications et qu’à l’inverse, une stimulation diminuait les calcifications . La stimulation du récepteur de l'endothéline B pourrait donc être une potentielle cible thérapeutique à l’avenir. L’objectif de cette expérimentation est donc de vérifier sur un modèle animal de calcification valvulaire ces premiers résultats et de s’assurer de l’absence d’effets secondaires de cette modulation de la voie de l’endothéline.
Bénéfices attendus
Le rétrécissement aortique est une pathologie qui représente un véritable enjeu de santé publique. Il s’agit en effet de la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux avec une prévalence de 2% des sujets de 65 ans et plus et 10% des sujets de 80 ans et plus . Les symptômes apparaissent au stade du rétrécissement aortique serré et sont le plus souvent invalidant à type de dyspnée amenant à des hospitalisations. Actuellement le seul traitement consiste est une intervention, soit par voie chirurgicale, soit par voie percutanée. Dans les deux cas, le remplacement de la valve par une prothèse valvulaire n’est pas dénué de risque (accident vasculaire cérébral, implantation de pacemaker, troubles du rythme). Même si certaines publications anciennes ont suggéré un rôle de l’endothéline dans les calcifications valvulaires aortiques, cela n’a toujours pas été confirmé et les mécanismes impliqués n’ont toujours pas été expliqués. Notre projet pourrait donc permettre : 1)A court terme, de répondre à une question scientifique en cours et confirmer le potentiel rôle de l’endothéline dans le développement du rétrécissement aortique. La compréhension des mécanismes impliqués pourrait également ouvrir la voie à d’autres idées de recherche dans des domaines variés. En effet, la voie de l’endothéline est notamment étudiée en oncologie et en neurologie . 2) A long terme, cette étude pourrait également permettre la conception d’un traitement médical du rétrécissement aortique. Cela pourrait éviter à de nombreux patients d’arriver au stade symptomatique de la maladie et donc éviter des hospitalisations et des interventions.
Procédures
Les animaux de la procédure subiront trois chirurgies dans un premier temps une ligature de l'artére rénale du rein gauche à J1 de l'étude puis une ablation totale du rein droit au J8 de l'étude et enfin une pose de mini pompe à J38. Des prélèvements sanguins seront effectués à J37 sur tous les animaux sous-anesthésie gazeuse pour randomiser nos groupes en fonction du dossage de la créatine. L'analyse des effets fonctionnels (IRM : semaine 12 et échocardiographie cardiaque : semaine 12 et J38 ) sera effectué sous anesthésie avec une durée de 10 minutes/rat.
Impact sur les animaux
La procédure est classée sévère. La chirurgie visant à induire une un modèle animal de calcification valvulaire afin d’étudier l’impact de la modulation du récepteur de l’endothéline B dans le développement du rétrécissement valvulaire aortique. Pour cela les animaux subiront une néphrectomie qui sera réalisée en deux temps avec une ligature de l’artère rénale gauche à J1 et une ablation du rein droite à J8 (avec une durée de chaque intervention de 20 minutes). De manière certaine, les animaux, après néphrectomie (Sténose) du rein gauche des 5/6ème (procédure classée sévère) et néphrectomie totale rein droit développeront une insuffisance rénale Chronique (IRC). Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, insuffisance rénale chronique associé avec une anémie, une hypertrophie cardiaque, une fibrose cardiaque et une diminution de la fonction systolique et diastolique du ventricule gauche. Le taux de mortalité lors de la réalisation de ce modele est de 25%. Tous les animaux subiront plusieurs anesthésies gazeuse et une anesthésie par injection lors de IRM (durée 40 minutes) et de la mise à mort.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort puisqu'il est nécessaire de récupérrer la valve aortique et le coeur pour analyse des calcifications présentes.
Remplacement
Dans ce projet d’étude, des expérimentations in vitro et ex vivo sur des cellules valvulaires ont déjà été faites antérieurement. Cependant, le modèle in vivo ne peut pas être remplacé car il permettra d’étudier l’effet systémique des modulateurs de la voie de l’endothéline au-delà des cellules valvulaires ainsi que la tolérance des agents pharmacologiques sur un organisme vivant. Il s’agit d’une étape indispensable si l’on souhaite développer par la suite un médicament chez l’homme.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis une analyse histologique. Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaire.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la structure chargée du bien être animale. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique à l’aide de xylazine (10 mg/kg) en préopératoire et de buprénorphine (0.5 mg/kg) en pré et post-opératoire est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Le choix du rats sprague dawley males se justifie par l’expérience du laboratoire à la fois pour la chirurgie de la néphrectomie mais également pour l’étude des fonctions cardiaque par échocardiographie et IRM. Par ailleurs, le rapprochement des espèces humaines et des rongeurs sur le plan phylogénétique rend pertinent le choix de cette espèce en garantissant une bonne extrapolation des résultats chez l’homme. Nous utiliserons que des mâles pour notre études pour diminuer les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Nous utiliserons des rats adultes car cette pathologie survient chez des humains adultes (pathologies non existante chez les enfants).
Implication des cellules lymphoïdes innées de type 2 dans la réponse allergique.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.
Objectifs
Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.
Procédures
Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.
Impact sur les animaux
La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.
Remplacement
La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.
Raffinement
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.
Choix des espèces
La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.
Validation preclinique d’une administration trans papillaire rénale par ureteroscopie d’un vecteur viral de thérapie génique.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Tous tués sous anesthésie à la fin du projet pour une autopsie des reins, 20 cochons d'environ 3 mois vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent, une ou deux fois selon les groupes et sous anesthésie générale de 1 h 30 à 2 heures, un vecteur viral de thérapie génique injecté dans un ou deux reins par un urétéroscope souple passé par les voies urinaires. S'y ajoutent quatre à cinq prises de sang sous sédation, une injection intramusculaire par semaine et des comprimés quotidiens d'un traitement immunorégulateur, pendant trois à quatre semaines. Le porteur juge cette validation "indispensable" à un futur dossier d'essai clinique, présente le porc comme "la seule espèce" adaptée et décrit l'étude comme "qualitative", sans analyse statistique. Il choisit l'urétéroscopie parce que "cette voie n'est pas invasive", pour un acte mené sous anesthésie générale jusqu'à deux heures.
Objectifs
--- La cystinurie est une maladie rénale qui aboutit à l’insuffisance rénale suivies de dialyse/transplantation. Bien que l'incidence de la cystinurie soit faible (≈1/7000), les calculs de cystine sont très récurrents et entraînent une morbidité importante : interventions chirurgicales fréquentes et lésions rénales dans près de 80% des cas. La précipitation de cystine est la seule manifestation de cette maladie rare, qui se traite par des mesures diététiques visant à obtenir des urines non sursaturées en cystine. Une information du patient et un suivi diététique pour réduire les aliments riches en méthionine, à boire >3L/j. Malheureusement, malgré un régime diététique efficace, plus de 85% des patients récidivent. Il existe des traitements médicamenteux qui visent à modifier la cystine urinaire pour la rendre incapable de former des cristaux mais, ces médicaments sont associés à des effets secondaires. --- Dans le contexte du développement thérapeutique de maladies rares, et notamment rénales, nous avons identifié un vecteur viral de thérapie génique qui permet le transfert de gène dans les parties malades du rein grâce à une injection dans les voies urinaires, en direction des reins. Dans le cadre d’une preuve de concept, le mode opératoire pour une telle administration a été réalisé chirurgicalement. Nous souhaitons dès lors, nous pencher sur des indications thérapeutiques et commencer par explorer l’usage atraumatique de la voie endourologique, c’est-à-dire en passant par les voies naturelles. Ceci est rendu possible par l’utilisation d’un urétéroscope flexible (endoscope souple, fin, équipé d’une microcaméra et d’instruments à son extrêmité) ammené jusqu’au centre des reins pour délivrer le vecteur de thérapie génique. Cette méthode est cliniquement pertinente et peut-être réalisée en ambulatoire – couramment utilisée en clinique pour détruire des calculs ou retirer des tumeurs rénales. Cette validation préclinique est indispensable pour la constitution à terme d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique et nécessitera donc l’utilisation du modèle porc étant donné la similitude anatomique des voies urinaires avec l’Homme. En conclusion, notre projet repose sur l’usage du porc pour la validation du protocole d’administration en vue de la constitution d’un dossier d’essai clinique de thérapie génique dans une indication en néphrologie.
Bénéfices attendus
****Opportunités thérapeutiques : La confirmation que l’emploi d’un urétéroscope flexible permet d’atteindre ces résultats ouvrirait de multiples opportunités pour traiter un ensemble important de maladies rénales originaires du néphron, tels que la cystinurie ou encore la polykystose rénale. ****Sécurité thérapeutique : éviter les effets secondaires : La validation de la méthode d’administration par urétéroscope permet de concentrer le vecteur de thérapie génique dans l’organe cible (ici les reins) limitant ainsi la circulation sanguine et les effets secondaires comme ont pu en être observés dans le cas de thérapies géniques contre la myoptahie de Duchenne par exemple. ****Mode d’administration raffiné : une fois validée l’administration par les voies naturelles offrira aux patients un traitement rapide, non invasif, précis et ne nécessitant pas d’hospitalisation.
Procédures
Sur la durée du projet, les animaux subiront les interventions suivantes : -4 à 5 prises de sang (selon les groupes d’animaux) sous sédation ce qui représente une injection intramusculaire du sédatif d’une durée de moins d’une minute. La prise de sang dure environ 2 minutes. La sédation complète dure environ une demi-heure. -Un traitement immunorégulateur (pour éviter le rejet de la thérapie génique) qui se présentera sous la forme d’une injection intramusculaire par semaine (durée moins d’une minute) et de la prise de comprimés quotidienne qui seront mélangés à un aliment ou une boisson appétente. -1 à 2 procédures d’administration de vecteur de thérapie génique (selon les groupes d’animaux) qui se déroulent sous anesthésie générale. L’anesthésie inclut une injection intramusculaire pour la sédation (durée de moins d’une minute). L’animal est ensuite inconscient pour le reste de la procédure. La procédure totale sous anesthésie dure entre 1h30 et 2h, selon qu’un seul rein ou deux sont traités. -A la fin du projet (au bout de 3 à semaines selon les groupes) : les animaux feront l’objet d’une dernière anesthésie générale (injection intramusculaire de moins d’une minute), la suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale. Au cours de celle-ci une chirurgie sera réalisée afin de réaliser des prélèvements d’organes. L’animal sera ensuite mis à mort, toujours lors de cette anesthésie générale.
Impact sur les animaux
La plupart des actes se dérouleront sous sédation ou sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire. Nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. Lorsqu’une anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de la procédure se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur fiable permettant de nous assurer de l’absence de toute souffrance. Pour les injections intramusculaires du traitement immunomodulateur, là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible. La prise de comprimés ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin d’étudier l’effet de la thérapie génique sur les reins post mortem.
Remplacement
Compte tenu que le but du projet est de démontrer l’emploi d’un urétéroscope flexible pour délivrer un vecteur viral de thérapie génique par les voies naturelles, il ne peut y avoir d’alternative à l’usage d’un modèle animal. Après administration intra-rénale du vecteur de thérapie génique, il sera nécessaire de maintenir l’animal en vie afin de pouvoir évaluer le niveau et la distribution de l’expression du gène transféré. Ainsi, nous ne pourrions substituer l’utilisation d’un animal vivant.
Réduction
****Stratégie de réduction: Ce projet se découpe en une Phase pilote incluant 6 porcs suivie d’une Phase de Consolidation incluant 14 porcs. La Phase Pilote aura la particularité d’injecter les 2 reins d’un même animal permettant ainsi de diviser le nombre d’animaux par 2. En fonction des résulats obtenus à l’issue de la Phase Pilote, la Phase de Consolidation n’injectera qu’un seul rein sur les deux afin de disposer d’un rein contrôle non exposé au vecteur de thérapie génique. Cependant, compte tenu qu’au cours de la Phase Pilote, les injections seront restreintes soit à la partie supérieure soit inférieure du rein, il est possible que le pôle rénal non directement exposé puisse servir de tissu contrôl interne. Auquel cas, là également, nous pourrons exploiter les 2 reins chez un même animal et ainsi diviser le nombre total d’animaux par 2. Il faudra donc attendre l’issue de la Phase Pilote avant de pouvoir décider la meilleure option pour promouvoir la Réduction du nombre d’animaux. ****Statistiques: cette étude ne prévoit pas d'analyse statistique des résultats. Il s'agit d'une étude qualitative qui est destinée à tester quelques paramètres d’injection car nous sommes en mode exploratoire. Une fois nous aurons identifiés les paramètres et conditions clés, une seconde session incluera des ‘n’ plus conséquent pour confirmer et valider les conditions optimales d’injection.
Raffinement
Conditions d’hébergement : Les porcs sont réceptionnés au sein de l’animalerie où ils sont acclimatés et hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, avec des conditions d’ambiances contrôlées. Ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses facilite les interactions avec les soigneurs et réduit leur stress lors des manipulations. Un programme musical apaisant est diffusé pour couvrir les bruits d’ambiance aversifs. Conditions expérimentales : L’urétéroscopie par les voies naturelles est justement choisie comme méthode d’administration des vecteurs de thérapie génique car cette voie n’est pas invasive. En effet, en clinique humaine, l’urétéroscopie ne nécessite pas de prise en charge particulière après l’examen. De plus, cet examen mobilisera l’intervention d’un urologue spécialisé dans cette pratique chez des patients humains mais également lors d’enseignements sur des porcs pour former des chirurgiens à cette abord chirugical non-invasive. Les animaux sont anesthésiés et recevront des analgésiques pour toutes les procédures et ils font l’objet d’un suivi au réveil afin de s’assurer qu’ils ont bien récupéré de leur anesthésie. Nous travaillerons de manière aseptique (matériel stérile, à usage unique ou stérilisable, champs stériles, tenue stérile de l'opérateur et du chirurgien, désinfection cutanée et des muqueuses) afin de pouvoir éviter les risques infectieux et garder en vie pendant 3 à 4 semaines l’animal injecté sans que sa fonction rénale et son état général n’en soit affectés. L'usage d'une antibiothérapie de couverture en peropératoire et posopératoire immédiat permettra également d'éviter les risques infectieux. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Afin que l’étude que nous proposons ait une pertinence forte pour ensuite déposer un dossier de demande d’essai clinique aux agences réglementaires ad hoc, l’espèce animale doit permettre d’évaluer précisément la procédure d’administration du traitement avec un équipement identique et un protocol adapté à celui déjà utilisé chez les patients humains. Il faut également que l’anatomie de l’espèce animale et de l’organe ciblé soient similaires à l’homme. Le porc est donc la seule espèce qui nous permettra une validation préclinique de la procédure d’injection. Des porcs de 3 mois environ (soit 40-50 kg) seront utilisés. A ce stade de développement, le système urinaire du porc est très proche de celui de l’humain tant du point de vue anatomique que du point de vue de sa taille, permettant ainsi de se positionner dans les mêmes conditions que celles de la thérapie chez l’Homme.