Recherche appliquée

864 souris subissent une chirurgie d'environ vingt minutes pour se voir implanter une tumeur dans le cerveau, puis deux séances d'IRM sous anesthésie. Avec les 960 autres, injectées sous la peau, 1 824 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Un groupe de 32 porte pendant six semaines un dispositif appliqué en continu sur l'abdomen, et l'ulcération ou la nécrose de la tumeur figure parmi les effets attendus. Le porteur qualifie la majorité des procédures de peu traumatisantes et annonce un vaccin thérapeutique contre le glioblastome, tumeur cérébrale pour laquelle il indique lui-même qu'aucun traitement connu ne fonctionne.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. Le succès récent de l’immunothérapie dans divers cancers a renouvelé l'intérêt pour les vaccins anti-tumoraux. Actuellement aucun vaccin a montré une efficacité dans les cancers, probablement à cause de la faible activation de lymphocytes cytotoxiques capables d’attaquer les cellules du cancer par les formulations vaccinales classiques utilisant aluminium ou émulsions comme adjuvants. Nous avons développé une formulation vaccinale innovante qui permet de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène tumoral. Notre but est de poursuivre le développement de notre formulation afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Devant la résistance du glioblastome à tout traitement connu à l’heure actuelle, la stratégie la plus prometteuse semble être l’association de plusieurs thérapies. Dans ce projet différentes combinaisons thérapeutiques de notre vaccin avec des traitements anti-cancéreux seront évaluées : chimiothérapie, traitements immunomodulants, thérapies qui permettent d’augmenter le passage de molécules thérapeutiques et lymphocytes dans le cerveau.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la validation de l’efficacité de notre vaccin innovant dans un modèle intracrânien de glioblastome et de sélectionner les meilleures stratégies thérapeutiques de combinaison du vaccin avec des traitements couramment utilisés pour le glioblastome (chimiothérapie) et d’autres traitements immunomodulateurs ou potentiellement synergiques avec l’immunothérapie.

Procédures

960 Souris subiront des injections sous anesthésie générale (durée totale de la procédure de 5 minutes) et 864 Souris une intervention chirurgicale (durée de la procédure d’environ 20 minutes). Pour l’administration des traitements, toutes les Souris auront des injections à fréquence variable selon la molécule entre une fois par jour et une seule injection dans toute la durée de l'experience (durée d’environ une minute). Un groupe de 32 Souris sera traité avec un dispositif appliqué au niveau abdominal 24/24h pendant maximum 6 semaines. Afin d’évaluer l’effet des différents traitements sur la croissance tumorale, nous réaliserons 2 IRM aux Souris avec le modèle intracérébral (864 souris). Durée totale de la procédure : environ 30 minutes. 216 Souris seront mises à mort par chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie générale profonde et analgésie. Aucun prélèvement sera réalisé chez l’animal vivant mais toujours après mise à mort.

Impact sur les animaux

Aucune de ces lignées de Souris ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Concernant les injections réalisées sous anesthésie générale (injection de cellules tumorales), les animaux subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie. Un effet indésirable attendu, susceptible d'entrainer une douleur modérée, est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. En ce qui concerne les injections des médicaments, les animaux subiront un léger stress pour la contention et les effets indésirables sont une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection. Les effets indésirables attendus pour le dispositif appliquant un courant sont une rougeur au niveau de la zone d’application du dispositif. Les examens d'imagerie réalisés sont non invasifs et atraumatiques et impliquent l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Néanmoins, le souris subiront un léger stress pour l’induction de l’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de limiter la souffrance (selon points limite) et aussi afin de prélever les différents organes et les analyser pour pouvoir comprendre les mécanismes d’efficacité ou échappement du cancer aux traitements.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués. Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Afin de limiter le nombre de souris avec un modèle de tumeur intracrânien, uniquement les stratégies de combinaison thérapeutique les plus prometteuses selon les résultats des modèles sous-cutanées seront évaluées dans ce modèle. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs traitements ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 1824 souris seront utilisées dans ce projet.

Raffinement

La majorité des expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes (injections sous-cutanées ou intra-péritonéales, traitements par voie orale). La bonne tolérance des formulations vaccinales a été préalablement démontrée dans notre laboratoire. Chez les animaux porteurs de tumeurs sous-cutanées, la croissance tumorale est mesurée 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. En ce qui concerne les animaux porteurs de tumeur intracrânienne, l’implantation sera réalisée sous anesthésie locale et générale et après analgésie locale. Afin de prévenir la douleur post-chirurgicale, un traitement analgésique pendant 3 jours après l’implantation sera également administré. Tous les animaux de toutes les procédures font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire, selon les points limite.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souris est bien caractérisé et de nombreux outils pour l’analyse de la réponse immunitaire aux immunothérapies sont disponibles. Les animaux seront âgés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

Trente minutes de nage forcée dans une piscine réparties sur deux jours, puis treize jours d'un test d'apprentissage : 45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Elles subissent quatre tests de mémoire étalés sur six semaines, mémoire spatiale, reconnaissance d'objets, olfaction et apprentissage d'une tâche, le porteur indiquant que la nage peut provoquer une légère hypothermie. L'objet déclaré est de savoir si la perte d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau modifie la mémoire, dans le cadre d'une forme de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence. Le choix de la souris tient à l'existence de tests comportementaux déjà établis chez elle, et l'effectif de 45 est présenté comme le minimum fixé par des consignes internationales de la discipline.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones (cellule nerveuse spécialisée dans la commande des mouvements) et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA ont une cause non-identifiée, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), on appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été identifiées comme étant impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT et donc à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront transportés de l’établissement d’élevage à l’établissement utilisateur à l’âge de 2 mois. Dans l’EU les souris réaliseront 4 tests de comportement répartis sur 6 semaines, à partir de l’âge de 4 mois. Ces tests permettent de tester la mémoire des souris Le premier test permet d’évaluer la mémoire spatiale des souris et nécessite 30 minutes par souris répartis sur 2 jours. Le second test permet d’évaluer la capacité à reconnaitre et mémoriser des objets et dure 10 minutes par jour pendant 4 jours. Il est suivi par un test d’olfaction qui dure 20 minutes sur une journée. Le dernier test permet d’évaluer l’apprentissage d’une tâche, puis la mémoire spatiale, et dure 30 minutes réparties sur 13 jours (soit 1 habituation d’1min + 4 répétitions de 1 minute par jour pendant 7 jours + 2x 1 minute dernier jour). Les tests seront espacés d’au moins 4 jours pour éviter de stresser les animaux. Ces 4 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer différentes formes de mémoire des souris. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées par une méthode règlementaire, et les tissus d’intérêts sont prélevés après vérification de la mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent induire un stress et angoisse chez l'animal. L’un des tests consistera à faire nager les animaux dans une piscine ce qui pourrait induire une légère hypothermie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées pour prélever des tissus d’intérêts.

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce projet, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules immunitaires du cerveau (microgliales) avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (réaction en réponse à une molécule stimulante). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtile in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible chez l’animal.

Réduction

Pour les tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype avec 3 génotypes étudiés soit 45 souris au total. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Comme les quatre différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous utiliserons les mêmes souris pour ces 4 tests, avec au moins 4 jours de repos entre chaque test, pour en utiliser le moins d'animaux possible

Raffinement

Les souris seront transférées de l’EU d’élevage à l’EU d’expérimentation. Elles seront mises dans une boite de transport adaptée, entre congénères (1boite par cage). Le transfert sera rapide (moins de 1h), car les deux EU sont géographiquement très proches. Les conditions d’hébergement sont agréées. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et un enrichissement correspondant à leurs besoins. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons du coton, permettant de faire des nids dans chaque cage, et des bâtonnets à ronger. Les animaux seront hébergés entre fratrie autant que possible, mais pourraient être séparés en cas de bagarre. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Avant la réalisation des tests comportementaux, une habituation à l’expérimentateur sera réalisée par manipulation des animaux pendant une semaine tous les jours. De plus, avant chaque session de test il y aura une habituation à la pièce pour les animaux en déposant les cages dans la salle d’expérimentation 30min à 1heure avant le début de l’expérimentation. Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant les tests comportementaux. Nous respecterons une période de repos au moins 4 jours entre chaque type de test comportemental et nous réaliserons les tests du moins au plus stressant. Pour le test nécessitant de faire nager les animaux, à la sortie de l’eau ils seront séchés à l’aide d’un torchon avant d’être replacés dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central de mammifère. Par conséquent, nous avons besoin d’un système complexe pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie (cellules immunitaires du cerveau) peut influencer le comportement chez la souris. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois).

Quatorze jours d'injections sous-cutanées quotidiennes pour reproduire des symptômes de schizophrénie, et un libre accès à l'alcool dès l'âge de quatre semaines : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent d'abord une puce sous la peau sous anesthésie, puis passent des tests de locomotion, d'anxiété, de mémoire de travail et d'interaction sociale. Le produit injecté leur provoque une hyperlocomotion, des troubles sociaux et des troubles de mémoire, présentés comme la reproduction des symptômes vécus par les patients. 96 souris sont tuées par chirurgie terminale pour prélèvement d'organes, tandis que 24 autres, utilisées comme "souris attractives" pendant les tests sociaux, partent vers un autre projet.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact de la consommation volontaire d’alcool à l’adolescence sur la symptomatologie (symptômes de type positif et négatif, symptômes cognitifs) dans un modèle pharmacologique de schizophrénie (administration subchronique de PCP) chez des souris mâles et femelles C57Bl/6. En effet, il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'alcool sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool sur les comportements des modèles animaux de la schizophrénie. L’objectif secondaire sera d’étudier une éventuelle consommation exagérée d’alcool à l’âge adulte des modèles animaux de la schizophrénie.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet devrait permettre d’une part, une meilleure compréhension de la comorbidité entre trouble de l’usage d’alcool -schizophrénie, et d’autre part de valider un modèle robuste et reproductif de ce type de comorbidité qui permettra par la suite d’identifier des stratégies thérapeutiques de traitement dans ce domaine.

Procédures

Afin de pouvoir être facilement identifiables, les animaux auront une puce électronique (1,4 mm x 8 mm) implantée en sous-cutanée à l’aide d’un système miniaturisé de micro-injecteur stérile sous anesthésie (durée de la procédure : 5 minutes). Les animaux seront soumis à un traitement chronique par voie sous-cutanée chaque jour pendant 14 jours. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Les animaux vont effectuer plusieurs tests comportementaux afin tout d’abord de mesurer de l’activité locomotrice/exploratrice et du comportement de type anxieux (1 session de 10 minutes), puis de mesurer les performances de mémoire de travail (1 session de 5 minutes) et enfin de mesurer les intéractions sociales (1 session de 5 minutes suivie de 2 sessions de 10 minutes). Pour finir, les animaux subiront une procédure sans réveil sous anesthésie et analgésie en vue de prélèvement d’organes (durée de la procédure : 10 minutes).

Impact sur les animaux

Durant deux périodes, les animaux auront à leur disposition un libre choix entre eau et alcool (nuisance légère). Les autres nuisances attendues sur les animaux sont tout d’abord liées au modèle de schizophrénie choisi. Il s’agit d’un modèle pharmacologique basé sur un traitement chronique par voie sous-cutanée chaque jour durant 14 jours (nuisance modérée). Outre les aspects stressants des injections quotidiennes, ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.). A la fin de l’étude comportementale, les animaux seront mis à mort par une chirurgie terminale (procédure sans réveil).

Devenir

Les 96 animaux réalisants les tests comportementaux seront mis à mort alors que les 24 souris servant de souris attractives lors du test des interactions sociales seront réutilisées pour un autre projet.

Remplacement

Le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau. Ces facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés nécessitent d’utiliser des animaux vivants et entiers. De plus, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.

Réduction

L’étude sera réalisée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Pour ailleurs, nous utiliserons une seule cohorte d’animaux pour toute l’expérience afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront suivis de façon longitudinale et réaliseront toute l’expérience. Un total de 120 souris sera nécessaire pour cette étude (48 femelles et 48 mâles pour les tests et 12 mâles et 12 femelles comme souris attractives lors du test des interactions sociales), nombre permettant d’obtenir une puissance des analyses statistiques suffisante.

Raffinement

Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisés que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, une période d’acclimatation de 5 jours (cycle inversé) est effectuée où les animaux seront stabulés par groupe de 6 souris (mâles et femelles séparés), avec un enrichissement de la cage d’hébergement (maisonnette, papier kraft, tunnel et bâtonnet en bois). Durant cette période, ils seront manipulés (5 min par jour) et pesés quotidiennement. A leur arrivée au laboratoire et en tenant compte de leur jeune âge (3 semaines), des coupelles de croquettes humides seront mises à disposition des animaux. Ceci sera prolongé jusqu’à 2 jours après le puçage (période de récupération de l’anesthésie). Le puçage est fait 5 jours après leur arrivée sous anesthésie gazeuse et sur couverture chauffante. Une semaine après leur arrivée, les souris seront hébergées par 12 dans des cages intelligentes, pendant 16 jours (2 jours d’adaptation puis exposition choix eau/alcool), puis replacées dans les cages classiques pendant 6 semaines puis de nouveau hébergées pendant 3 semaines dans les cages intelligentes (accès intermittent à l’alcool). L’intérêt de l’utilisation des cages intelligentes est en particulier d’éviter l’isolement des animaux durant les périodes d’exposition à l’alcool et donc de minimiser le stress induit par cet isolement, tout en pouvant contrôler leur consommation individuelle (mesure du nombre de « licks » de chaque biberon). Les animaux seront pesés deux fois par semaine (suivi de poids individuel). Si, au cours de ce projet, des animaux ont des difficultés à s’alimenter (aucune difficulté observée dans de précédents protocoles), nous adapterons l’alimentation par l’ajout de gelée alimentaire. L’utilisation d’anesthésique volatil sera effectuée pour chaque mise à mort et un analgésique puissant sera également utilisé afin de réduire la douleur lors de la procédure de perfusion.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris (mus musculus). Il s’agit, comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, activité spontanée). Par ailleurs, les cibles pharmacologiques des traitements sont similaires chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP). Les animaux seront utilisés à l’âge adolescent (ou jeune adulte) (arrivée au laboratoire à l’âge de 3 semaines et début de l’exposition volontaire à l’âge de 4 semaines) car l’étude vise à étudier l’effet de l’exposition à l’alcool au stade de l’adolescence. L’étude longitudinale se poursuivra jusqu’à l’âge de 18 semaines. Les souris stimuli seront âgées de 6 semaines au moment des tests de sociabilité et reconnaisssance sociale sur la base de données bibliographiques.

Pour trier des souris entre résilientes et vulnérables à la dépression, 528 d'entre elles sont soumises huit semaines à des conditions d'hébergement rendues stressantes et imprévisibles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur état est mesuré par un test de désespoir, un test de motivation, un test d'anxiété et une mesure hebdomadaire de deux heures de leur consommation de sucre, censée révéler la perte de plaisir. Celles qui sont classées vulnérables reçoivent ensuite un antidépresseur en injection quotidienne pendant cinq semaines, avant que toutes soient tuées pour analyse métabolique et génomique. Le porteur chiffre le coût mondial de la dépression à 350 milliards de dollars par an et renvoie les retombées à des biomarqueurs qui restent à identifier.

Objectifs

La prévalence au cours de la vie (environ 20 %) et le fardeau économique (350 milliards de dollars par an) associés aux troubles de dépression majeure (TDM) en font l'une des maladies neuropsychiatriques les plus courantes et les plus débilitantes. Le diagnostic du TDM et des comportements suicidaires est subjectif et il manque des biomarqueurs quantitatifs pour une détection précoce et une évaluation à long terme. Sans ces biomarqueurs objectifs, le diagnostic, la surveillance et les ajustements thérapeutiques reposent exclusivement sur un examen clinique sous-optimal. L’accent mis sur l’utilisation du carburant cérébral comme différenciateur de la vulnérabilité et de la résilience au stress est un concept nouveau et original qui n’a pas été exploré de manière approfondie.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus peuvent conduire à une compréhension étendue et plus détaillée du métabolisme du cerveau et du corps normal et dysfonctionnel. L'étude a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles innovantes pour promouvoir la résilience et améliorer le diagnostic, la surveillance et le traitement du TDM. L’étude des liens mécanistiques à travers les niveaux d’analyse (épigénome, métabolome, comportement) aidera à expliquer comment et quand des facteurs de stress spécifiques et divers conduisent à des changements durables dans le cerveau et produisent des déficits fonctionnels durables en matière de santé mentale liés au comportement. Nous allons rechercher ces changements qui contribuent au maintien de la santé ou des états pathologiques.

Procédures

Nous modifions les conditions d'hébergement stressantes sans que celles-ci puissent être anticipées. Les animaux peuvent alors engager 2 styles d'adaptation: la résilience ou la vulnérabilité au développement de troubles du comportement de type dépressif et anxieux que nous mesurerons par des tests de désespoir, de motivation et d'anxiété appliqué une seul fois sur une durée de 10 minutes au cours des 8 semaines de protocole. Le 1er objectif vise à sélectionner les sujets résilients ou vulnérables à la dépression. Le 2e objective vise à évaluer la stabilité du trait phénotypique avec ou sans traitement antidepresseur (injection quotidienne pendant 5 semaines). Le protocole débutera à l'age de 3 mois et durera 8 semaines. Dès la 3e semaines d'exposition les animaux seront triés en groupes de résilients et de vulnérables selon leurs scores de consommation de sucrose lors d'un test de mesure d'anhédonie (diminution de la capacité à ressentir le plaisir), pratiqué 1 fois sur 2 heures par semaine pendant 8 semaines. Des prélèvements sanguins (20 microlitres) sur deux minutes sont prévus à l'issu du 1er objectif (1 fois à la 3e semaine) et du 2e objectif (1 fois à la 8e semaine).

Impact sur les animaux

Stress léger chronique chez la souris Douleurs d’injection Douleurs de prélèvements de sang

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de vérifier la validité des interventions génétiques et phamarcologiques. Des échantillons seront prélevés pour permettre les analyses métaboliques et d'expression du génome qui differencieraient les individus résilients des vulnérables malgré leur exposition identique au stress chronique léger.

Remplacement

Les facteurs de stress sont hétérogènes et ne peuvent être réduits à une seule expérience. Un paradigme peut conduire à des réponses uniques chez différentes espèces. Par conséquent, il sera testé plusieurs modèles complémentaires avec des collaborateurs. Cette application concerne un modèle murin exclusivement. Une manipulation expérimentale rigoureuse est obligatoire étant donné que la réponse au stress peut varier en fonction du moment, de l'intensité, de la durée, de la chronicité, du contexte et des sexes biologiques. Les réponses des sujets sont à la fois dynamiques et multiformes, nécessitant des études longitudinales sur les mêmes sujets. La précision de la conception expérimentale nous a amenés à choisir le stress chronique léger (CMS) comme paradigme expérimental adapté aux rongeurs pour développer de nombreux styles d'adaptation (résistance et vulnérabilité) comme chez les êtres humains. Nous utiliserons la souris comme modèle, qui selon l’état de l’art peut résister ou être susceptibles aux conséquences néfastes liées au stress. Les autres collaborateurs impliqués dans ce projet étudient le rat, ou bien des souches murines sélectionnées pour leurs critères de résistance ou de vulnérabilité innés, ou bien des patients atteints de dépression majeure. Chaque centre utilise un modèle complémentaire pour interroger les mécanismes conservés entre espèces. Il n’est pas raisonnable d’utiliser des modèles alternatifs réducteurs in vitro pour étudier la relation physiologique entre le cerveau et le comportement des résilients et des vulnérables. Il n’existe pas de solution in vitro alternative conservant les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet. Nous étudierons des modèles génétiques murins caractérisés pour leurs similitudes génétiques et physiologiques aux corrélats de pathologies humaines.

Réduction

Une seule souche de souris sera utilisée ce qui limitera le nombre d'animaux à utiliser. Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale rationnelle et qui augmentera la puissance statistique des données collectées. Nous ne pouvons pas étudier un seul sexe puisque les différences entre les sexes sont associées à la physiopathologie de la depression et à la réponse au traitement.

Raffinement

Une grille de score des points limites adaptés est mise en place pour identifier quand raffiner. Un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est établi pour déterminer quels individus sont concernés. L'administration d'analgésique permettra de corriger des douleurs éventuelles. La mise à mort en dernier recours serait effectué si le score des points limites venait à dépasser les critères de raffinement prérequis.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal présentant une grande similitude avec le cerveau humain en terme de structure, d’organisation et de connectivité. Un modèle mammifère semble donc être le plus adapté pour répondre à nos besoins. Les rongeurs ont été choisi à cause de leurs manipulations génétiques bien étudiées. De plus, les rongeurs ont déjà été utilisés comme modèle fiable et solide pour l'étude de conditions de vulnérabilité et de résilience au stress. Les processus que nous étudierons ne sont pas reproductibles à ce jour par des modèles in vitro ni par la modélisation in silico. La souris demeure le modèle de choix. Les souris seront âgées de 3 mois au début du protocole de stress qui durera pendant 8 semaines. Nous ciblons en particulier des jeunes adultes afin de comparer les résultats avec l'étude clinique chez l'homme conduites chez les patients dépressifs par notre collaborateur. Le même protocole de stress léger sera aussi appliqué par nos collaborateurs sur des espèces complémentaires.

Cinq lapins reçoivent dans l'œil, à quatre reprises, un laser dont l'éclairement dépasse d'un facteur dix la limite fixée par la norme ISO, avec une lame de verre posée sur la cornée. Ces séances de quarante-cinq minutes se déroulent sous anesthésie générale et relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des ulcères de l'épithélium cornéen, des lésions de l'endothélium et une cataracte par effet thermique comme atteintes possibles, et précise que l'étude est faite "justement" pour en constater la survenue. Tous les lapins sont tués pour histologie oculaire, leurs os et leur cochlée partant à d'autres équipes, afin qu'une startup française puisse déposer un dossier d'autorisation pour son appareil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) nommée LC-OCT permettant d'effectuer des images proche de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer la safety sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte ou prise de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme des selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'oeil sous sédation et l'animal sous anesthésie général. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT durera 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 820 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35). Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires. D'autres équipes de recherche récupéreront les os et la cochlée des animaux.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Tout d'abord nous utilisons l'oeil gauche de chaque animal comme oeil contrôle réduisant de moitié le nombre d'animaux nécessaire. Ensuite, Compte tenu de la faible variabilité interindividuelle habituellement observée dans les études ophtalmologiques utilisant l'imagerie non invasive, ainsi que de notre objectif de comparer, par suivi clinique et histologie post-mortem, l'état des tissus oculaires des yeux contrôles (OG) et des yeux analysés (OD) pour chaque animal à l'aide d'une échelle de graduation semi-quantitative, et afin d'obtenir un échantillonnage suffisant pour effectuer une analyse statistique avec des tests de rangs non paramétriques (OG vs OD), nous avons déterminé qu'un minimum de 5 animaux est nécessaire pour tirer des conclusions valables. En effet, avec moins de 5 lapins, les tests statistiques perdent de leur pertinence, tandis qu'un nombre supérieur à 5 semble excessif.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

Une souris qui perd 15 % de son poids, titube ou cesse de se toiletter deux jours d'affilée est retirée de l'étude et tuée par dislocation cervicale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes pour l'injection de vecteurs viraux dans deux populations de neurones, puis vit seule en cage pendant dix semaines et demie, avec six injections dans l'abdomen et deux semaines de mesure continue de sa prise alimentaire et de sa course. Le porteur compense cet isolement par sept carrés de cellulose et un morceau de bois, et renvoie les retombées à la compréhension de l'obésité et de l'anorexie chez l'être humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de comprendre comment les réseaux neuronaux participent à la balance énergétique et la motivation pour l'exercice. Pour cela, des souris transgéniques permettant de manipuler de façon concomitantes les deux sous-populations neuronales principales impliquées dans la motivation recevront des injections de vecteurs viraux permettant de manipuler spécifiquement l'activité de ces deux populations. Différents tests comportementaux permettront d'étudier la prise alimentaire exacte, la dépense énergétique et la motivation pour courir de chaque souris afin de mieux disséquer les mécanismes biologiques impliqués dans cette balance énergétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d'identifier les mécanismes sous-jacents aux régulation métaboliques et de l'activité physique, dimensions altérées en particulier dans les troubles du comportement alimentaire tels que l'obésité ou l'anorexie.

Procédures

- Procédure chirurgicale (environ 90 minutes x 1 fois/ animal) - Isolement (environ 10.5 semaines) - Injections intrapéritonéales (1 injection/ jour x 6 fois, environ 3 secondes par injection)-Tests comportementaux: étude de la prise alimentaire et de l'activité locomotrice (2 semaines au total, 24h/24) et étude de la motivation pour l'activité physique (2 semaines au total, 1h/jour)

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d'interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. La chirurgie stéréotaxique pour l'injection bilatérale de virus peut entrainer des risques de douleurs post opératoires ou d'infections. Ces douleurs devraient s'estomper dans les jours suivant la chirurgie grâce au traitement analgésique mis en place. Enfin, les injections intrapéritonéales durant la période dans les cages métaboliques ou durant les tests de ratio progressifs peuvent également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour procéder à des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce n d’animaux/groupe a été fixé (i) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications du domaine (iii) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats et en prenant en compte que certains animaux pourraient ne pas apprendre la tache comportementale opérante (pourcentage de succès de 50-60%). Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.

Raffinement

Comme prévue par la Directive 2010/63/CE, un enrichissement du milieu (7 carrés de cellulose) ainsi qu’un morceau de bois à ronger seront utilisés pour réduire les stress des animaux lié à l'isolement que ce soit dans les cages métaboliques ou dans les cages d'hébergement des souris. Les souris seront manipulées grâce à un tunnel en carton (présent dans leur cage d'hébergement) afin de les déplacer dans les cages métabolique ou dans les chambres opérantes. En ce qui concerne la période pré et post-opératoire, les animaux recevront un traitement analgésique et suite à la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine (médication, poids corporel, aspect général). La récupération des animaux est normalement totale après 1 semaine. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris et permet la reproductibilité et la comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et avec la communauté scientifique plus large. Des modèles animaux moins évolués (par exemple: ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour l'étude d'une récompense naturelle comme l'activité physique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l'immaturité du système nerveux au cours de l'adolescence.