Recherche appliquée

Une partie des souris utilisées a un système immunitaire déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules leucémiques prélevées sur des patients. 4 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à sept injections intraveineuses et dix injections intrapéritonéales, 3 192 d'entre elles jusqu'à quinze gavages, 1 440 jusqu'à trois ponctions de moelle osseuse dans le fémur et 720 une injection directe dans la moelle. La leucémie provoquée peut entraîner une anémie, une grosse rate et des difficultés de locomotion quand la greffe gagne le cerveau, et le porteur prévoit de tuer l'animal dès l'apparition de signes de souffrance.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent les cancers du sang les plus courants de l’adulte, mais elles demeurent très difficiles à traiter avec un taux de rechute élevé et seulement 20% de survie chez les patients agés. Au cours des 40 dernières années, les traitements pour les LAM ayant très peu progresser, il est crucial de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients, notamment après une rechute. Nos recherches ont identifié une nouvelle cible : la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines. Nous avons réalisé des tests en laboratoire sur des cellules leucémiques, y compris celles résistantes aux traitements existants, ainsi que sur des cellules de patients. Nos résultats préliminaires ont montré que notre traitement ciblant la SUMOylation pourrait être prometteur pour traiter les LAM. Nous devons désormais confirmer ces résultats dans des modèles animaux, plus proches de la réalité clinique, avant de pouvoir envisager des essais sur des patients. De plus, nous avons découvert que bloquer la SUMOylation pouvait stimuler le système immunitaire pour combattre les cellules cancéreuses mais nous devons confirmer ces résultats sur des souris. Enfin, nous explorerons également si notre traitement peut être utilisé en combinaison avec d'autres médicaments déjà utilisés en clinique pour augmenter son efficacité.

Bénéfices attendus

Les LAM sont des cancers au pronostic sombre. Ce projet a pour objectif d’étudier une nouvelle approche thérapeutique consistant à cibler la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines, seule ou en combinaison avec d'autres molécules déjà utilisées en clinique. La validation préclinique effectuée dans le cadre de ce projet constituera une étape essentielle au développement clinique de ces nouvelles molécules.

Procédures

En fonction de la procédure dans laquelle ils seront impliqués, les animaux pourront subir : 1- Injection intraveineuse à la veine caudale sur animaux vigiles à l’aide d’un tube à contention (durée de la procédure : 1 minute): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet (soit 4912 souris) seront soumis à des injections en I.V., au maximum 7 fois au cours de leur vie 2- Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet seront soumis à des injections en I.P., au maximum 10 fois au cours de leur vie 3- Gavage sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): cette intervention concernera un maximum de 3192 animaux (en fonction des combinaisons de molécules sélectionnées pour la suite du projet au cours de la procédure 1) et sera réalisée au maximum 15 fois au cours de la vie de l’animal 4- Prélèvement de moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 1440 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé au maximum 3 fois au cours de la vie de l’animal et au minimum à 4 semaines d’intervalle. 5- Injection orthotopique dans la moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 720 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal. 6- Prélèvement de sang à la veine caudale (durée de la procédure : 1 minutes): Cette intervention concernera au maximum 2208 animaux et sera réalisée au maximum 7 fois (50µl de sang) au cours de la vie de l’animal et au minimum à 14 jours d’intervalle. L’ensemble de ces gestes étant parfaitement maîtrisés par le personnel amené à intervenir dans ce projet, les durées d’interventions sont très courtes ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux.

Impact sur les animaux

La greffe de cellules leucémiques chez la souris peut induire l'apparition de symptômes tels que l'anémie, la splénomégalie ainsi que des difficultés de locomotion lorsque la greffe se localise dans le cerveau.

Devenir

Dans la mesure où nous induisons une pathologie chez l’animal qui peut induire des nuisances, les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure ou dès lors qu'un des animaux présentera des signes de souffrance.

Remplacement

Nos recherches ont montré en laboratoire l'importance de la SUMOylation, un mécanisme qui modifie les protéines, dans les Leucémies Aigues Myéloïdes (LAM), notamment en tant que cible potentielle pour des traitements. Maintenant, pour confirmer si ces observations pourraient être applicables en clinique dans le futur, nous devons nécessairement tester ces molécules sur des animaux de laboratoire dont le système immunitaire est déficient et qui portent des cellules cancéreuses de patients pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur un organisme vivant complet plus proche de la réalité clinique. De plus, étant donné que le TAK possède des effets sur le système immunitaire, nous devons également vérifier ces résultats sur des animaux de laboratoire ayant un système immunitaire normal, pour comprendre comment celui-ci pourrait contribuer à l'efficacité du traitement contre le cancer. Si nos résultats se confirment dans ces tests, cela ouvrirait de nouvelles pistes pour traiter les patients atteints de LAM.

Réduction

Nous utilisons des cellules leucémiques luminescentes pour suivre l’évolution du cancer à l’aide d’une caméra adaptée dont nous disposons au laboratoire. Quand cela sera possible, nous utiliserons cette méthode pour suivre la progression des tumeurs. Cela nous permettra d'utiliser beaucoup moins d'animaux pour nos expériences. De plus, nous utiliserons un logiciel de calcul de statistiques qui permet d'optimiser nos groupes expérimentaux, avec un maximum de 8 souris par groupe. Cela nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés tout en étant certains que nos résultats restent fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées au maximum par groupe de 5 animaux par cage afin de limiter stress et angoisse et bénéficieront d'au moins 2 enrichissements/cage (coton et cabane). Lors du change, effectué de façon hebdomadaire par le même zootechnicien, la cabane et une partie du nid seront conservés afin de garder les odeurs des animaux dans la cage propre et ainsi limiter le stress. Dans les pièces de stabulation, nous diffusons des sons de nature (oiseaux, rivière, forêt) afin de limiter les variations sonores entre le jour et la nuit dans le but de réduire le stress des animaux. Pour les animaux en cours d'expérimentation et qui sont manipulés plusieurs fois par semaine, nous ajouterons une roue d'exercice par cage comme enrichissement supplémentaire, ainsi que de l’aliment et de l’eau en gel afin de favoriser l’hydratation des animaux et d’agrémenter leur alimentation. Au cours des procédures nécessitant une anesthésie, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane 2,5%. Concernant les procédures pouvant induire de la douleur (injection intra-fémorale), une analgésie à la Buprénorphine 0.05mg/kg en sous-cutané 30 minutes avant l’injection puis 12h post-injection sera administrée. Afin de réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement, y compris les weekends, et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité, isolement, hérissement des poils, dos voûté, difficulté de locomotion) seront recherchés et seront répertoriés dans la grille de scoring jointe en annexe. En fonction du score obtenu, l’animal sera maintenu sous simple surveillance, surveillance accrue (2 fois/jour) ou immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

En vue d'une utilisation clinique future, seule une étude pré-clinique menée in vivo chez la souris permettra de valider la SUMOylation comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des LAMs. Le modèle murin est particulièrement pertinent pour la réalisation notre projet. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéprimées et immunocompétentes. En effet, les modèles immunodéprimés permettent de greffer aisément des cellules de patients et de récapituler la pathologie humaine chez la souris afin de tester l'efficacité anti-tumorale de nos molécules. Par ailleurs, il existe déjà des modéles syngéniques de LAM chez la souris qui nous permettrons d'évaluer le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale induite par l'inhibition de la SUMOylation. Les animaux utilisés auront entre 6 et 8 semaines. Ce niveau de développement permet une greffe efficace des cellules humaines et permet d'effectuer des expériences à long terme, en particulier dans le cas des patient-derived xenografts (Pdx) qui peuvent nécessiter jusqu'à 6 à 8 mois pour se développer.

Enfermés trois fois cinq jours dans une loge individuelle où ils ne peuvent ni se tourner ni marcher, 234 porcs de 20 à 100 kg sont rationnés à 90 % de leur appétit pendant tout l'essai. Ils subissent jusqu'à trois séries de prises de sang à la jugulaire de 15 mL et des piqûres à l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'enjeu est zootechnique, mesurer la digestibilité de matières premières et d'enzymes ajoutées afin de formuler des aliments au plus près des "besoins" des animaux non-humains et de limiter les rejets. 96 porcs au maximum seront tués pour prélèvements ou parce qu'ils auront reçu des additifs interdits à la consommation humaine, les 138 autres repartant dans le cycle de production.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la digestibilité des nutriments des aliments chez le porc en croissance, c’est-à-dire de 20 à 100 kg. Cela permet d’améliorer les connaissances scientifiques de la digestibilité des matières premières et de l’amélioration de la digestibilité permise par des enzymes exogènes. En effet, ces valeurs de digestibilité des matières premières sont des données importantes puisqu’elles permettent de formuler des aliments au plus près des besoins des animaux afin d’optimiser leur croissance et limiter les rejets dans l’environnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure connaissance de la digestibilité des nutriments des matières premières et de l’amélioration de la digestibilité permise par des enzymes exogènes chez le porc en croissance.

Procédures

Les porcs seront hébergés trois fois 5 jours dans une loge à digestibilité individuelle au cours de la procédure. Ils seront rationnés à environ 90% du niveau ad libitum pendant toute la durée de l’essai. De plus, au maximum, deux séries de 1 à 3 prises de sang maximum par ponction à la jugulaire (15 mL maximum par ponction) pourront être réalisées sur les porcs impliqués dans cette procédure. Les prises de sang seront espacées d'au moins 30 minutes et les séries de 3 prises de sang seront espacées d'au moins 5 jours. Par ailleurs, une ou plusieurs mesures de glycémie, d'hémoglobinémie ou autres paramètres sanguins (maximum 5 en 4 heures environ) à l'aide d'un appareil de biologie déporté sur les porcs impliqués dans cette procédure. Au total, les porcs pourront donc subir trois fois au cours de la procédure ces séries de 1 à 5 prélèvements à l'oreille. Pour réaliser ces mesures, quelques gouttes de sang seront prélevées grâce à une piqûre réalisée à l'oreille à l'aide d'une aiguille. Les porcs de cette procédure pourront être concernés par les séries de prise de sang ou par les prélèvements de quelques gouttes de sang à l'oreille. Une prise de sang par ponction à une veine jugulaire ou via une piqûre à l'oreille nécessite une contention des animaux, sur une durée pouvant varier de 20 secondes à 2 minutes.

Impact sur les animaux

L’hébergement individuel dans la loge à digestibilité empêche l’animal de se tourner et de marcher. Cette réduction de liberté de mouvement peut entrainer de la frustration ou du stress chez l’animal. Les animaux seront rationnés pendant toute la durée de l’essai. Cela pourra engendrer de l’agitation et de légères griffures entre les deux porcs au sein d’une même aire d’adaptation pendant cette phase. Les prélèvements sanguins peuvent induire un stress lors de la manipulation et la contention des animaux, ainsi qu’une douleur transitoire au moment de l’introduction de l’aiguille.

Devenir

Au total, 96 porcs maximum seront euthanasiés dans la globalité du projet dans le cas où des prélèvements biologiques (organe, phalange, contenu intestinal...) post-mortem sont nécessaires ou lorsque les animaux recevront des additifs non enregistrés dans l’Union européenne puisqu’ils ne pourront pas rentrer dans la filière de consommation humaine. Les autres animaux seront maintenus en vie et continueront leur cycle de production dans l’élevage.

Remplacement

La digestion d’un aliment résulte principalement de régulations hormonales et enzymatiques aboutissant in fine à l’absorption des nutriments. Il n’existe pas aujourd’hui de modèle in vitro suffisamment fiable permettant d’évaluer la digestibilité des nutriments chez le porc en croissance. Ainsi, le recours à l’animal est indispensable.

Réduction

Chaque animal testera trois régimes et sera logé individuellement au moment des mesures de digestibilité, ce qui permet de réduire le nombre d'individus nécessaire à la mise en évidence de différences significatives entre plusieurs traitements (variabilité inter-individuelle réduite, précision des mesures...). Ainsi, 36 mesures de digestibilité seront obtenues par applications de la procédure (=essai) avec 12 porcs. En effet, un calcul de « la puissance statistique du test » a permis de définir un nombre de 8 répétitions par régime. Cependant, dans le cas de régimes plus fibreux, le nombre minimum de mesures de digestibilité est de 11 car le coefficient de variation est plus élevé. Toutefois, afin de tenir compte d’éventuelles exclusions ou mortalité pendant l’essai, il faut ajouter un animal supplémentaire par lot. Ainsi, le nombre minimum de mesures de digestibilité par lot est porté à 9 avec quatre lots expérimentaux ou 12 pour les régimes plus fibreux avec trois lots expérimentaux. Les données seront ensuite analysées par des tests statistiques.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives lors des prises de sang sera limité à 2 par veine jugulaire ou par oreille (donc 4 au total) et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux. Les aires d’adaptation seront chacune équipées d’un disque en fibres de bois et les loges individuelles auront chacune un tube en plastique suspendu afin d'atténuer le stress pouvant être induit par le logement individuel des animaux lors des phases de collecte. Les loges individuelles seront disposées afin que les animaux puissent se voir.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. De plus, la spécificité des conditions d'élevage de cette espèce de rente ne permet pas de la remplacer par une autre espèce modèle. Enfin, il n’existe pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer de manière fiable la digestibilité des nutriments chez le porc. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet pèseront entre 20 kg et 100 kg. En effet, le tube digestif des porcs s'allonge tout au long de la vie de l'animal donc la digestibilité varie en fonction du poids de l'animal. Ainsi, nous souhaitons effectuer des mesures de digestibilité avec des animaux de différents poids.

Chaque souriceau est amputé d'une phalange par patte entre le septième et le dixième jour après la naissance, pour l'identifier et le génotyper en une seule opération. 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées chaque jour pendant quatre semaines ou injectées dans l'abdomen, puis soumises à des tests de locomotion en environnement nouveau et de coordination des membres. Le porteur écrit pourtant que les expériences réalisées ici "ne sont pas douloureuses" et qu'elles consistent uniquement en des études comportementales. Toutes sont tuées à la fin pour récolter le matériel biologique qui complétera les résultats de comportement.

Objectifs

Des mutations d’un récepteur de la vitamine A sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptômes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodéveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations. Les souris mutantes présentent des symptômes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle de ce récepteur dans le développement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire ce récepteur contrôle le développement d’une sous-population de neurones, alors qu’à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous-population de neurones. Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptômes moteurs et cognitifs en modulant l’activité de ces neurones afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptômes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 6 traitements différents à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition et/ou réduire des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes, ou en régulant leur activité. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.

Procédures

La technique d'identification utilisée dans notre EU est la phalangectomie. Celle-ci permet d'identifier les animaux et également de les caractériser génétiquement en une seule étape. L’identification sera réalisée entre les 7è et 10è jours postpartum conformément aux recommandations de la CNREEA. Cependant des méthodes alternatives sont en développement afin de remplacer la phalangectomie par une autre méthode moins invasive. 3 traitements pharmacologiques visant à prévenir les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. 2 traitements pharmacologiques visant à atténuer les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 10 à 25 semaines (adulte). Tous les traitements se feront par injection intrapéritonéale (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et le traitement contrôle (solution saline) (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 120 mâles et 120 femelles = 240 animaux au total. Ensuite, des tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évaluation de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des réflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de la mémoire. Un délai minimum de 1 jour sera respecté entre chaque test afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. Les mêmes cohortes recevront une seconde dose de traitement et s'en suivra les mêmes tests à des fins de réduction et pour évaluer la meilleure dose dans l'efficacité du traitement dans l'atténuation des symptômes. La moitié des animaux de chacun des 6 traitements (pharmacologique + contrôle) = 312 animaux (156 mâles et 156 femelles), sera ensuite utilisée pour réaliser des analyses cellulaires. L’autre moitié sera utilisée à des fins d’analyses moléculaires.

Impact sur les animaux

Les phalangectomies réalisées entre le 7e et 10e jour postpartum comme recommandé par le CNREEA provoqueront une douleur de durée légère. Elles seront limitées à une seule phalange par patte pour ne pas compromettre la préhension que les animaux exercent avec leurs pattes. Les autres effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive et un léger stress sont à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables majeurs. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. Amendement : Les injections intrapéritonéales des traitements, et du mélange anesthésie/analgésie lors des perfusions intracardiaques, peuvent provoquer une légère douleur à l'animal ainsi qu'un stress. De plus, nous injecterons une seconde dose des traitements sur les mêmes cohortes expérimentales, espacée d'une semaine

Devenir

L’ensemble des animaux utilisé sera mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses qui permettent simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Ces cinq traitements ont déjà été utilisés aux mêmes doses, sans causer de souffrance chez les animaux. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Les animaux seront surveillés méticuleusement tous les jours à l'occasion des traitements et un suivi de poids sera réalisé 2 fois par semaine (le mardi et le vendredi) pour contrôler leur bien-être. En cas de mal être de l’animal sera exclu de l’étude et un examen vétérinaire sera immédiatement réalisé. Amendement : Différentes injections intrapéritonéales seront réalisées lors des procédures expérimentales 4 et 5 d'une part pour administrer les traitements pharmacologiques, et d'autre part pour administrer le mélange anesthésie/analgésie. En effet, les perfusions intracardiaques seront réalisées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésie/analgésie afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections intrapéritonéales sont peu douloureuses également. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort après une anesthésie sans réveil par exsanguination par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions des signalisations calcique, dopaminergique et glutamatergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans un premier temps des animaux de 4 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptômes. Dans un second temps, nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 25 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements visant à réduire les symptômes moteurs et cognitifs.

2 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de médicament et douze injections de traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées avec des cellules tumorales de myélome, elles subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie et des séances d'imagerie espacées de deux à trois jours. Le porteur indique que la tumeur peut se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner l'animal dans ses mouvements. Les retombées annoncées pour les personnes malades, moins de toxicité et une meilleure pharmacocinétique, restent au conditionnel, quand l'objectif immédiat consiste à comparer cinq nanotransporteurs.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.

Cathéter posé sous anesthésie générale, injections de sang ou d'un agent vasoconstricteur, séances d'imagerie par ultrasons : 198 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure. Le porteur annonce des douleurs et un mal-être liés à l'inflammation provoquée par ces injections, une gêne au point d'incision et une perte de masse corporelle. Il s'agit de mettre au point une échographie super-résolue capable de détecter tôt le vasospasme après une hémorragie sous-arachnoïdienne chez les patients. Sur l'effectif, il écrit qu'il est difficile de l'estimer avec exactitude et l'évalue à 10 animaux pour valider la technique, sans expliquer comment on arrive aux 198 souris déclarées.

Objectifs

L’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) correspond à une issue de sang dans les espaces sous-arachnoïdiens du cerveau et figure parmi les premières causes d’admission en réanimation. L’impact socio-économique de cette pathologie est majeur puisqu’elle touche des sujets jeunes dont un tiers des survivants conservent des séquelles neurologiques. Le principal facteur associé à l’importance du handicap post-HSA est la survenue d’une ischémie cérébrale retardée (ICR). Or, à ce jour, en dépit de plusieurs décennies de recherche, aucun diagnostic précoce testée chez l’homme a pu empêcher l’incidence de l’ICR. Nous souhaitons développer et utiliser l’échographie super-résolue pour diagnostiquer l’ICR chez l’homme après une phase de développement chez l’animal. La technique de Microscopie par Localisation Ultrasonore (ULM en anglais) a été inventée en 2010 et a fait l’objet d’une récente revue de la littérature. Cette technique consiste à tracer à l’échelle du micromètre le parcours d’un agent de contraste ultrasonore approuvé en clinique qui consiste en une solution de bulles injectables et restreintes au domaine vasculaire. L’ULM a ainsi pu cartographier la structure vasculaire à l’échelle des pré-capillaires chez l’animal et a aussi été utilisé depuis chez l’homme. L'objectif du projet est de développer un outil d'imagerie par échographie 3D ultra-résolu, qui permettrait d’identifier de manière précoce le vasospasme (un des facteurs impliqués dans l’IRC) ainsi que les troubles de perfusion intracrânienne post-hémorrhagie afin de pouvoir diagnostiquer l’ICR. Cette nouvelle technique sera évaluée dans quatre modèles précliniques différents de HSA (deux de vasospasme avec l’injection d'un agent vasoconstricteur) et deux modèles d'hémorragie sous-arachnoidienne. Le but serait de pouvoir rendre plus accessible et précoce le diagnostic de l’ICR ainsi que permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales grâce à l'imagerie ultrasonore, couplée à une injection d'un agent de contraste non radioactif et biocompatible.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet étant de proposer un modèle de détection précoce de troubles de perfusion, vasospasme et ICR par une modalité d'imagerie plus accessible, les bénéfices attendus seraient : - De proposer un agent de contraste peu coûteux, biocompatible, non radioactif et donc avec moins de risques sanitaires et accessibles à plus de patients, qui pourraient être exclus des méthodes d'imagerie habituelles. - De proposer une technique d'imagerie novatrice, qui pourrait être mise à chevet du patient et nécessitant moins d'infrastructures spécifiques, qui pourrait être portable, en plus d'être moins coûteuse et accessible à plus de patients que les méthodes d'imagerie habituelles, comme l’imagerie à resonance magnétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des inductions d'anesthésie gazeuse, à des poses de cathéter sous anesthésie générale, à des injections intraveineuses et des injections d’agent vasoconstricteur ou de sang.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - De mal supporter la concentration de microbulles nécessaires. - Une gêne possible au niveau de l'incision (démangeaison ou douleurs les premiers jours). - Une gêne possible au niveau du site d'insertion du cathéter. -Des douleurs et un mal-être des souris liés à l'inflammation provoqués par les injections d'agent vasoconstricteur ou sang. - Une perte de masse corporelle liée à l'anesthésie générale. - Des douleurs post-opératoires possibles au niveau du point d'incision.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant un degré de sévérité a été estimé pour chaque procédure au lieu de les classer toutes en "sans réveil" car les animaux seront amenés à être réveillés au sein des procédures. De plus, il a été choisi de classer les procédures selon un degré de sévérité afin d'adapter le raffinement (analgésie, conditions per-opératoires ...).

Remplacement

Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal, il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires et tissulaires physiopathologiques associés, survenant lors d'une hémorragie sous-arachnoïdienne / vasospasme. L'imagerie de la perfusion vasculaire cérébrale ne peut être réalisée autrement que par un modèle in vivo.

Réduction

Il est difficile d'estimer avec exactitude le nombre d'animaux nécessaires à ce projet. Il n'est pas possible d'avoir une idée de taille d'effet puisque l'on ne comparera pas des réponses à des traitements. Pour la mise au points des modèles de vasospasme, nous avons estimé des concentrations qui semblent être cohérentes avec ce qui est décrit dans la littérature. Pour la partie du projet ou on cherche le diagnostic d’ICR par ULM l'idée sera de valider la robustesse et la reproductibilité de l'agent de contraste et la méthode développé en le comparant à l’imagerie à résonance magnétique et le doppler. Nous estimons le nombre d'animaux nécessaires à 10, afin de valider cette technique malgré les différentes variations possibles liées à la physiologie des animaux.

Raffinement

Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole. Cela permettra de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et à apprendre aux souris à coopérer. Les souris vivront en groupe dans des cages enrichies (coton, kraft et maisonnette en papier) afin de respecter leur mode de vie. Après chaque anesthésie, les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Durant chaque chirurgie, les souris seront analgésiées, et sous anesthésie locale au niveau de l'incision de la peau et de la zone d'insertion du cathéter. Une application d'anesthésiant est également prévue sur les sutures pour éviter les démangeaisons ou les douleurs post-opératoires éventuelles. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux lors de chaque anesthésie afin d'éviter le dessèchement oculaire. Le réveil postopératoire se fera dans une enceinte post opératoire dédiée à cet effet avec une température optimale pour les animaux ne régulant plus leur température corporelle avec de l'eau et de la nourriture, jusqu'à ce que les animaux retrouvent une bonne mobilité. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort immédiatement dans l'une des situations suivantes : - Signes de douleurs indexés sur le Grimace-Scale Souris ; -Absence de réaction ; - Animal inactif dans sa cage ; - Complications chirurgicales inattendues; - Perte de poids; - Ré ouverture de l'incision de la peau.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurovasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour permettre la localisation précise de vasospasmes et les troubles de perfusion vasculaires cérébrales. Nous utiliserons des souris adultes en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études précédentes. Les souris seront de jeunes adultes. Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de rester cohérent avec l'âge des souris couramment employées lors de protocoles d'étude de hémorrhagie sous-arachnoidienne (qui touche des patients jeunes) et d'optimiser la reproductibilité du protocole. Enfin, les souris ne doivent pas être trop âgées afin de pouvoir réaliser les acquisitions en imagerie ultrasonore. En effet, le crâne s'épaississant avec l'âge, il serait difficile d'imager le tissu cérébral chez des souris trop âgées.