Recherche appliquée

La mort d'une souris figure parmi les signes de toxicité qui conduiront à réduire la dose lors de l'expérimentation suivante. 2 440 souris et 60 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les souris sont infectées par Leishmania par voie intraveineuse et les hamsters par injection intracardiaque, puis gavées ou injectées cinq jours consécutifs avant que leur foie soit prélevé pour compter les parasites. Le porteur qualifie le hamster d'animal de laboratoire "idéal" pour servir de réservoir, ces animaux étant tués pour récupérer dans leur rate de quoi infecter les lots de souris suivants.

Objectifs

La leishmaniose viscérale est une maladie parasitaire en pleine expansion du fait du réchauffement climatique et des mouvements de populations depuis les zones d’endémie. Cette maladie affecte des populations socialement vulnérables et souvent immunodéprimées. Différentes espèces de Leishmania peuvent mener à la leishmaniose viscérale, dont la Leishmania donovani, qui affecte uniquement l'homme et la Leishmania infantum, qui affecte l'homme et le chien, ce qui fait du chien un réservoir de ce parasite pour l'homme. Sa transmission aux mammifères, y compris aux humains, se fait par des insectes infectés, appelés phlébotomes. Une fois introduites chez l’homme, les leishmanies infectent les cellules du système immunitaire du patient, principalement les macrophages. Malgré le grand impact de cette maladie sur la santé publique, les thérapies actuellement existantes présentent des limites majeures, en termes de toxicité et de chimiorésistance. Dans ce contexte, la recherche et développement de nouveaux médicaments est urgente. Pour ce faire, dans le cadre de programmes de recherche, nous évaluerons l’activité de substances pures soit d’origine naturelle, soit de synthèse et qui sont des inhibiteurs de voies métaboliques spécifiques au parasite, ou bien encore des formulations. Après un premier criblage de cytotoxicité et d’activité in vitro, c’est-à-dire, sur les macrophages et sur les parasites en culture cellulaire, seules les substances les plus actives et les moins toxiques seront évaluées sur des modèles de leishmaniose expérimentale chez l’animal. L’objectif étant de découvrir de nouveaux candidats-médicaments contre les leishmanioses humaines et canines, avant de pouvoir accéder aux essais cliniques de phase 1 chez l'Homme, il est nécessaire de démontrer que les substances sélectionnées in vitro sont capables de réduire la charge parasitaire in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet: - l'identification de candidats – médicaments capables de surmonter les limites des traitements existants, en termes de toxicité et de chimiorésistance.

Procédures

Lors de l’étude de détermination de la dose maximale tolérée certains lots de souris sont soumises à une administration par gavage (voie orale) ou par voie parentérale (intrapéritonéale ou intraveineuse) avec des substances ou des formulations d'intérêt. Les administrations sont effectuées une fois par jour, sur cinq jours consécutifs. En outre, pour la détermination de l'activité antileishmanienne, une seule injection intraveineuse (pour les souris) ou intracardiaque (pour les hamsters) de moins de dix secondes est pratiquée pour l’infection des animaux. Concernant le traitement des souris infectées, les administrations sont effectuées sur cinq jours consécutifs soit par gavage soit par voie intrapéritonéale ou intraveineuse. Les administrations intraveineuses ou intracardiaques sont réalisées sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La leishmaniose n'est pas douloureuse pour les animaux, mais des effets indésirables, comme la perte de poids, l'apathie ou piloérection peuvent survenir lors de la détermination de la dose maximale tolérée, car certaines molécules peuvent s'avérer toxiques. Pendant le traitement, les animaux peuvent ressentir un inconfort lors de l'administration intraveineuse, qui sera minimisée grâce à l'anesthésie à l'isofurane. Quant à l’administration orale, elle est peu douloureuse par gavage.

Devenir

Les souris infectées sont euthanasiées afin de déterminer la charge parasitaire au niveau de leur foie après un traitement sur cinq jours consécutifs qui démarre une semaine après leur infection. Les hamsters infectés sont euthanasiés afin de récupérer les parasites qui serviront à l’infection des lots de souris et d’autres hamsters.

Remplacement

Les substances d'intérêt sont, dans un premier temps, soumises à un test in vitro de cytotoxicité sur les cellules hôtes des parasites, c'est à dire les macrophages. L'absence de cytotoxicité à la concentration de 100 μM justifie de continuer les expérimentations d'évaluation antileishmanienne sur les modèles de Leishmania donovani ou Leishmania infantum chez la souris. Compte tenu des barrières pharmacologiques rencontrées, ainsi que la métabolisation auxquelles sont soumises les substances à évaluer, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’évaluation sur un modèle animal avant de lancer des essais cliniques de phase 1 chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire l'utilisation des animaux, nous allons réaliser une étude de la dose maximale tolérée (DMT). Elle sera réalisée sur des lots de 7 souris par dose. Nos études antérieures ont par ailleurs montré que 7 souris est un nombre suffisant pour mettre en évidence des troubles liés aux substances testées. En l’absence de données sur la toxicité, une première évaluation de la DMT sera faite à 100 mg/kg par voie orale ou par voie intrapéritonéale ou intraveineuse sur 5 jours consécutifs. Si des signes de toxicité apparaissent, tels que la mort d'une souris ou des symptômes majeurs, nous réduirons la dose lors d'une nouvelle expérimentation. A chaque expérimentation, une seule dose sera utilisée afin de limiter au maximum le nombre de souris utilisé. Des groupes de 3 hamsters seront utilisés comme réservoir de parasites pour infecter les souris pour les études d'efficacité. Pour l'évaluation de l'activité antileishmanienne, nous utiliserons 8 animaux par groupe, la variabilité des taux d'infection nécessitant ce nombre pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point pour lequel nous attachons une attention particulière pour toutes les études prévues. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies de coton, et de rouleaux de carton afin de pouvoir constituer de refuges. Un suivi journalier sera également effectué afin de s'assurer de leur état général. En plus, pour minimiser l'inconfort qui peut survenir lors d’une injection intraveineuse, une anesthésie à l’isoflurane sera faite au préalable. Des points limites seront mis en place et strictement appliqués.

Choix des espèces

Pour déterminer la dose maximale tolérée et pour l’étude d’efficacité antileishmanienne les souris seront utilisées, car le modèle souris s'avère un modèle pertinent et reconnu dans la littérature. En autre, le hamster est largement reconnu comme l'animal de laboratoire idéal pour servir de réservoir de parasites. Son utilisation comme réservoir pour infecter les souris est préférable en raison de la grande quantité de parasites obtenue à partir de la rate des hamsters, permettant ainsi d'infecter un nombre important de souris avec une grande efficacité. Les hamsters ont un poids de 80 à 100 grammes et sont âgés de 8 semaines. Les souris ont un poids de 18-20 grammes et sont âgées de 6 à 8 semaines au moment de l’infection.

Tués en fin de protocole pour que la prothèse valvulaire soit prélevée et examinée, 70 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit un remplacement de valve aortique sous circulation extracorporelle, six heures d'anesthésie puis une dizaine d'heures sous sédation et ventilation, quarante-huit à soixante-douze heures de soins intensifs, et des échographies à un, trois et six mois. Le porteur cite parmi les effets attendus l'infection du site chirurgical et un mauvais fonctionnement cardiaque pouvant aller jusqu'à l'insuffisance cardiaque. Il calcule ses effectifs en intégrant une perte "classiquement attendue" de 50 % faute de redémarrage du cœur, chiffre qui dit ce que ce modèle chirurgical inflige.

Objectifs

Aucun traitement médical n’est à l’heure actuelle disponible pour traiter les pathologies valvulaires cardiaques. La seule option offerte aux patients est le remplacement valvulaire par une nouvelle prothèse lors d’une chirurgie à cœur ouvert. Ces dernières années, l’utilisation de prothèses biologiques a pris le pas sur les prothèses mécaniques, principalement à cause de leur meilleure performence hémodynamique et du développment de techniques moins invasives (remplacement par transcatherter des valves). Par contre, ces prothèses ont une durabilité réduite : en effet, la dégénerescence de ces bioprothèses est observée 10 à 15 ans post implantation. Cette dégénrescence a une implication importante d’un point de vue clinique, pouvant entraîner des symptomes chez les patients, un besoin d’une ré-intervention valvulaire et peut aussi entrainer le décès. Cependant, à ce jour, les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ce processus dégénératif sont inconnus. L’objectif de notre projet de recherche est d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la survenue de cette dégénérescence des bioprothèses. Ce projet s’appuie sur un modèle de chirurgie de remplacement valvulaire cardique chez le cochon. L’étude portera sur le rôle de l’hypercholestérolémie et de la thrombose dans le processus de dégénérescence des bioprothèses. Des cochons contrôles (Yucatan WT) et modifiés génétiquement (Yucatan avec gain de fonction de PCSK9), recevant ou non un traitement anticoagulant seront étudiés dans cette étude, qui permettra donc d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la dégénrescence des bioprothèse et l’effet synergique de l’hypercholestérolémie et/ou de la thrombose prosthétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le processus de dégénérescence des bioprothèses, et ainsi aboutir à des modifications de prise en charge des patients subissant un remplacement valvulaire avec une bioprothèse, mais aussi modifier la préparation des bioprothèses (préparation et confection des matrices utilisées par exemple). L’un des avantages majeurs de l’étude est que nous pourrons identifier les processus précoces impliqués dans le dévelopement de la pathologie, dès l’implantation de la prothèse et donc proposer des interventions chez l’homme tôt, en per ou post chirurgie.

Procédures

Chirurgie de prothèse valvulaire avec circulation extracorporelle sous anesthésie générale (anesthésie durant 6 heures puis maintien sous sédation et ventilation pendant une dizaine d'heures), Soins intensifs post-opératoires sur 48 à 72 heures, Prélèvements sanguins intra et post-opératoires pendant la semaine de soins intensifs par aspiration de sang au niveau du cathéter veineux central (aucune contention de l'animal et aucune douleur), Prélèvement sanguin et échographie transthoracique à un mois, 3 mois et 6 mois jusu'à la fin du protocole sur animal vigile ou sous sédation selon la tolérance de l'animal (utilisation d'une contention physique minimale et si échec, utilisation d'une contention chimique anxiolytique à base de benzodiazépines), Anesthésie générale finale avant euthanasie

Impact sur les animaux

Douleur modérée pendant l'acte chirurgical sous anesthésie générale et suite au trauma chirurgical en phase postopératoire : traitement analgésique multimodal pendant l'anesthésie et le post-opératoire immédiat et plan d'analgésie de secours si traitement multimodal de première intention insuffisant. Infection du site chirurgical (douleur légère à modérée, hyperthermie, manque d'appétit) : technique chirurgicale aspetique et antibiothérapie adaptée selon les analyses hématologiques, Protection des plaies avec des bandages souples. Malfonctionnement cardiaque suite à l'intervention pouvant entrainer une insuffisance cardiaque (douleur légère à modérée, fatigue, anorexie). Manipulation de l'animal pour l'administration des traitements et des prises de sang (stress, douleur légère) : instrumentation avec un cathéter long-terme jugulaire permettant le prélèvement sanguin sans contention et l'administration de médicaments par voie intraveineuse sans inconfort. Stabulation isolée le temps de la phase post-opératoire immédiate (enrichissement avec jouet et nourriture) et remise en contact d'un congénère dès que la convalescence est suffisante (alimentation normale, arrêt des soins et traitements post-opératoires)

Devenir

Euthanasie en fin de protocole pour prélèvement et étude histologique de la prothèse valvulaire

Remplacement

II n’existe pas de méthode in vitro ou in silico permettant de reproduire les phénomènes physiologiques et pathophysiologiques liés au fonctionnement et à la dégénérescence de la prothèse valvulaire. Les prothèses sont testées pour leur tolérance tissulaire sur des animaux de laboratoire plus petits (rats) avec une mise en place du tissue en sous-cutané. Cette méthode n’est pas adaptée à l’étude de la dégénérecence du tissu valvulaire, qui est implanté chez l’homme dans la circulation et fait face a des contrainte liées au flux sanguin et au pressions/tensions observées au niveau du système circulatoire central.

Réduction

Compte-tenu des connaissances sur les modèles de chirurgie intracardiaque avec circulation extracorporelle chez le porc et de la nécessité d’avoir un nombre d’animaux minimum pour avoir une significativité statistique, le nombre d’animaux comprend des animaux pour la mise au point et la standardisation du modèle chirugical de remplacement valvulaire aortique ainsi que 8 à 15 animaux par groupe pour chaque condition d’évaluation de la dégénérescence prosthétique (perte maximale classiquement attendue pour des protocoles de chirurgie cardiaque chez le porc de 50% par défaut de redémarrage du coeur). Au vu des résultats préliminaires obtenus, le nombre d’animaux pourra être réduit pour chaque groupe d’expérimentation et conditions.

Raffinement

En plus du raffinement des conditions d’hébergement et de manipulation des animaux, les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des anesthésistes/réanimateurs spécialistes. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant les interventions chirurgicales et le suivi postopératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage du plateau technique. Les données de monitorage sont enregistrées fréquemment afin de relever à posteriori d’éventuelles réponses physiologiques chez les différents animaux. Des échantillons sanguins sont prélevés avant la chirurgie (après anesthésie), pendant la chirurgie et après la chirurgie (pendant le suivi post-opératoire) afin de collecter le maximum de données. Les besoins en données sont anticipés et ouverts aux analyses exploratoires afin de pouvoir effectuer des analyses sur des paramètres qui n’auraient pas été anticipés. Les chirurgies cardiaques avec CEC sont réalisées par des chirurgiens cardiaques humains, avec le support d’un perfusionniste, permettant de rafiner le protocole chirurgical selon les standards cliniques.

Choix des espèces

Le choix du mini-porc est fondé sur plusieurs critères : - Modèle animal bien décrit et largement utilisé pour la chirurgie intracardiaque avec CEC avec des aspects anatomiques et un fonctionnement physiologique proche de l’homme ; des paramètres hémato-biochimiques comparables et dont les variations sont accessibles par des techniques de dosages similaires à celle utilisées en médecine humaine, afin d’assurer la prédictivité des résultats. - Existence d’une lignée modifiée génétique (gain de fonction de PCSK9) présentant une hypercholestérolémie. - Réponse du mini-pig à l'induction d'une diète HC en 4 semaines (doublement du taux de cholestérol) permettant de générer un modèle hypercholestérolémique, représentatif de l'Homme. - Taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie, ainsi que l’utilisation d’instruments et de matériels identiques à ceux utilisés chez l’Homme. - Le mini-porc à l’âge adulte atteint un poids minimum de 40 kg et reste maitrisé par le rationnement (environ 50-60 kg) ce qui représente un avantage comparativement au porc charcutier. Animaux adultes afin d’avoir une taille de thorax et d’aorte compatible avec l’intervention chirurgicale

Immunisés cinq à plus de seize fois par an, puis saignés jusqu'à vingt et une fois par an pour produire du sérum, 1 500 lapins, 1 000 cobayes, 30 chèvres et 30 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués une fois le titre d'anticorps et le volume de sérum jugés suffisants, après un dernier prélèvement plus important. Les anticorps polyclonaux obtenus alimentent des tests de diagnostic vendus dans le monde entier, le porteur mentionnant jusqu'à un test utilisé par seconde et un nombre d'animaux fixé par le "Donneur d'ordre". Il indique que la réaction inflammatoire au point d'injection disparaît en quelques jours et qu'aucune conséquence néfaste n'est observée ensuite, description difficile à tenir pour des animaux immunisés et ponctionnés pendant deux ans avant d'être tués.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l'immunisation des animaux afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Après immunisation et prélèvement du sang, le sérum obtenu contient les anticorps polyclonaux spécifiques de l’antigène utilisé. Après purification, les anticorps servent à produire différents tests par exemple : hémostase, thrombose, infections inflammatoires, détermination des groupes sanguins (utilisés pour les transfusions et les transplantations…). Ces tests de laboratoire permettent de doser les facteurs concernés dont le déficit est responsable des troubles cliniques dans le suivi des patients en thérapie ou en postopératoire. Les tests peuvent aussi permettre de confirmer des résultats sérologiques faibles ou peu clairs avant une transfusion ou une transplantation… Les tests immunologiques produits à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés à partir des sérums des animaux hyperimmunisés sont marqués CE, ou enregistrés IVDR pour l’Europe, ou FDA (510(k)) pour les USA, ainsi que dans les systèmes règlementaires de la majorité des pays, afin de pouvoir les utiliser dans les hôpitaux pour le diagnostic et le suivi des pathologies. Le projet est principalement à visée humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la production d’anticorps polyclonaux, sont la mise à disposition des laboratoires hospitaliers et cliniques de tests diagnostiques performants et précis, utilisant directement ou indirectement la technologie immunologique. L’utilisation du processus d’immunisation sur animaux permet d’obtenir des anticorps polyclonaux, d’isotype IgG, reconnaissant l’ensemble de la structure de la protéine (utilisée comme antigène), avec une grande affinité, c’est-à-dire une réaction spécifique et très forte avec cette protéine. Cela permet de l’identifier, de la quantifier ou de l’extraire dans un milieu très complexe, comme le sang, tout liquide biologique (ascites, liquide céphalo-rachidien, urines, etc…), ou un lysat cellulaire. Deux applications importantes sont mises en œuvre dans le projet : a) test l’utilisation des anticorps pour la production de tests de diagnostic médical, permettant de quantifier précisément une protéine ou un anticorps dans un liquide provenant du corps humain, à des fins de diagnostic, de pronostic, ou de suivi de traitement thérapeutique. b) Extraction spécifique d’une protéine d’un milieu complexe, comme le plasma humain, afin de produire un plasma déficient en cette protéine. Ce plasma est ensuite utilisé dans des trousses de diagnostic, pour doser l’activité de la protéine concernée, apportée par le plasma à tester. Le bénéfice est très important car une faible quantité de sérum permet de fournir une très grande quantité de tests, ils sont utilisés au niveau mondial à très grande échelle (jusqu’à un test utilisé par seconde dans le monde).

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur une durée de 2 ans maximum : Prélèvements sur animaux vigiles : 1 prélèvement de sang sain. Immunisations sur animaux vigiles : 5 à plus 16 par an. Prélèvements sur animaux vigiles : 1 à plus 21 prélèvements sanguins par an pour la production sérum. Lorsque le titre des anticorps et le volume de sérum seront jugés suffisants, le protocole d’immunisation sera arrêté et les animaux euthanasiés après prélèvement d’un volume sanguin plus important.

Impact sur les animaux

L’expérience acquise avec ces protocoles permet de dire que la principale nuisance sur les animaux concerne la réponse au processus d’immunisation, qui peut induire une réaction inflammatoire au point d’injection. Cette réaction inflammatoire disparait généralement en quelques jours, et aucune conséquence néfaste n’est observée ensuite. Les autres nuisances possibles concernent la contention et l’introduction de l’aiguille sous la peau des animaux pendant le prélèvement, pouvant provoquer de l’inconfort, une sensibilité légère limitée à la durée du prélèvement. L'anesthesie a répétition chez le cobaye. Cette étape n’a pas d’autre conséquence particulière sur les animaux.

Devenir

Tout animal ayant étaient immunisés sera mis à mort car l'immunisation ne permet pas de les utiliser dans d'autre procédures.

Remplacement

A chaque fois que cela est possible, des anticorps monoclonaux produits par culture cellulaire, ou des anticorps recombinants, sont utilisés, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Toutefois, les anticorps polyclonaux présentent des caractéristiques uniques par leur grande affinité vis-à-vis de la protéine utilisée pour leur immunisation, et par la reconnaissance globale des structures de cette protéine. A l’inverse, les anticorps monoclonaux ou recombinants, ne reconnaissent qu’une seule structure de la protéine, et si cette structure est affectée par une mutation génétique, la reconnaissance et perdue, et le variant n’est pas détecté. Les anticorps obtenus par immunisation des animaux permettent ainsi d’obtenir des caractéristiques uniques pour les besoins du laboratoire et la mise à disposition d’outils de diagnostic performants. Le client s'engage à faire la production in vitro lorsque cela est possible et respecte les normes réglementaires de diagnostic.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu résulte de 2 contraintes : a) Utiliser un nombre suffisant d’animaux pour réduire la variabilité inter-animaux de la réponse immunitaire. b) Utiliser le nombre requis pour obtenir la quantité de sérum suffisante pour la quantité d’immunoglobulines IgG purifiées nécessaires pour répondre aux besoins. Le nombre d'animaux utilisés correspond au minimum en fonction des volumes souhaités, définis par le Donneur d'ordre. La ré-immunisation des animaux au long terme permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. En moyenne, nous pouvons produire 26 litres de sérum par an avec 6 moutons ou 6 caprins, 130 litres de sérum par an avec 300 lapins et 13 litres de sérum par an avec 200 cobayes.

Raffinement

Les animaux sont tous contrôlés de façon journalière, ils ont à disposition des enrichissements adaptés et variés avec des roulements périodiques si possible (Lapin: bloc de cellulose à ronger, bout de bois.../Ovins, caprins:balai, un gros ballon, sapin perchoir(tronc d'arbre).../Cobayes: petite balle, bloc de cellulose...).- Pour les lapins, les cages disposent de mezzanines et de petits trous sur les parois leurs permettant de voir et de sentir les lapins dans les cages voisines . Les prélèvements se font dans une pièce séparée des hébergements. Après chaque prélèvement les lapins sont placés dans une piscine remplie de copeaux et de balles en plastique le temps du prélèvement d’un autre lapin.- Les ovins et caprins,sont dans une bergerie qui leurs est dédiée avec accès sur 2 hectares de prairie. Ils sont hébergés dans un box recouvert de paille. L'alimentation est composée de foin, pierre à sel, graines d'orge et d'avoine. Les prélèvements se font dans une partie dédiée, séparée de l'enclos. -Les cobayes sont hébergés dans une unité indépendante dans des cages par groupes sociaux harmonieux (2ou 3) avec mise à disposition d'une maison . Après chaque prélèvement ou immunisation ils reçoivent une récompense .Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être provoqué lors des procédures avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Des isolements de quelques minutes seront appliqués le temps des immunisations. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor. Un tableau d’évaluation des points limites est mis à disposition pour suivre l’évolution d’un animal qui présente des signes cliniques. (voir arbre décisionnel et critères d'arrêt des souffrances en pièces jointes). Les administrations ou les prélèvements s’arrêteront si un animal atteint un score de 3 sur la grille d’évaluation. Le dernier prélèvement est réalisé sous anesthésie générale , (excepté s' il y a contre-indication scientifique). Dans ce cas, l’animal ne se réveille pas, il est mis à mort dans la foulée du prélèvement .

Choix des espèces

Les lapins, les ovins, caprins et cobayes font partis des espèces les mieux documentées et les plus appropriées pour la production d’anticorps polyclonaux selon les recherches des donneurs d’ordres L'un des facteurs qui influence la production d'anticorps est la nature de l'immunogène utilisé (spécifique à chaque espèce). Le lapin est facile à manipuler et à prélever, il produit des volumes suffisants d'antisérum à titre élevé et à forte affinité. Les ovins et caprins ont une longue durée de vie, sont facile à manipuler et le prélèvement sanguin est facile à réaliser (veine jugulaire). La grande taille des animaux apporte un volume important d'immunsérum et réduit par la même occasion le nombre d'animaux. Les lapins ont au minimum deux mois et demi à la première immunisation et 5 mois aux premiers prélèvements. Les ovins et caprins ont au minimum trois mois à la première immunisation et 5 mois et demi aux premiers prélèvements. Les cobayes ont au minimum trois mois à la première immunisation et de 4 mois et demi aux premiers prélèvements. Cet âge à l’avantage de permettre une bonne acceptation des administrations par les animaux avec le développement d’une réaction immunitaire correcte et de permettre prélever une quantité intéressante de sang.

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une injection de cellules cancéreuses de la tête et du cou, puis pour certaines un anticorps trois fois par semaine pendant six semaines sur animal vigile, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau. Le porteur écrit que le traitement administré a le potentiel d'améliorer le bien-être des animaux non-humains en réduisant la charge tumorale, tumeurs qu'il a lui-même greffées. Sur le remplacement, il indique que des études sur lignées cellulaires précèdent les expériences, mais qu'une validation sur "animal entier" reste requise pour reproduire la complexité du système immunitaire.

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou sont la 8ème causes de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitements faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour les cancers de la tête et du cou. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches aux cancers de la tête et du cou afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.

Bénéfices attendus

Les cancers de la tête et du cou sont un grave problème de santé public. Dans les cas les plus avancés, ils répondent très mal au traitements traditionnels et l’immunothérapie n’est efficace que chez un groupe restreint de patients. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et potentiellement la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres maladies.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine pendant 6 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Les animaux anesthésiés subiront un prélèvement de sang unique, d'une durée de 1 minutes.

Impact sur les animaux

Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection, ou de l’inflammation. La contention des animaux peut engendrer un stress. Par ailleurs, le traitement administré a le potentiel d’améliorer le bien-être des animaux en réduisant la charge tumorale.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation sur animal entier permettant de reproduire la complexité du système immunitaire avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

Le nerf vague est sectionné au niveau du cou, d'un seul côté, sur des souris ensuite nourries d'un régime riche en lipides pendant quatre à vingt-quatre semaines. 4 608 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Chacune subit un gavage de glucose ou une injection d'insuline ou de toxine diphtérique, cinq prélèvements de sang successifs sur deux heures, une contention en tube et un séjour seule en cage de calorimétrie, une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort. Le porteur écrit que les souris récupèrent rapidement et complètement après la section du nerf, sans signe significatif de douleur ni de détresse, et que le régime gras ne devrait causer aucune douleur perceptible.

Objectifs

La stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) est une maladie du foie caractérisée par une accumulation excessive de graisse dans les cellules hépatiques, accompagnée d'une inflammation et d'une lésion hépatique. Actuellement, il n'existe pas de traitement pharmacologique efficace et validé pour cette maladie. Cependant, des recherches antérieures ont mis en évidence le rôle clé de l'inflammation dans le développement de la NASH. Précédemment, nous avons montré que l’inflammation pathogène était un acteur important dans le développement de la NASH. Une découverte intéressante a montré une relation entre l'innervation vagale et le métabolisme hépatique. Le nerf vague, qui est une composante du système nerveux autonome, semble jouer un rôle dans la régulation du métabolisme du foie. Des études ont montré que la stimulation du nerf vague pouvait avoir des effets positifs sur la fonction hépatique. De plus, des recherches ont indiqué que la vagotomie cervicale unilatérale (section du nerf vague du côté gauche du cou) était associée à une augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Cela suggère que la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, à partir de la moelle osseuse et de la rate. Cependant, les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux saisir ces interactions complexes, nous proposons une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront soumises à un régime riche en lipides pour induire une NASH. L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la NASH. Cette recherche pourrait fournir des informations cruciales pour mieux comprendre les liens entre le système nerveux autonome, l'inflammation et la pathogenèse de la NASH, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour le développement de traitements futurs.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). La NASH représente la forme la plus prévalente de maladie hépatique et est étroitement liée à la progression de l’obésité. A ce jour, les patients souffrant de NASH ne disposent pas de traitements approuvés, et le nombre de patients nécessitant une transplantation hépatique est en constante augmentation. Par conséquent, une compréhension plus approfondie des mécanismes sous-jacents ouvre la voie à de nouvelles approches et stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires dont les patients atteints de NASH pourront bénéficier.

Procédures

Les souris seront soumises à des interventions chirurgicales consistant en une section du nerf vague au niveau cervical côté gauche (vagotomie) ou des chirurgies contrôles sans section du nerf vague (Sham). Chaque souris subira une seule opération, qui durera environ 10 minutes et sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Une période de récupération de 3 semaines suivra l’intervention. Ces procédures chirurgicales sont décrites en détail dans la littérature scientifique. Les observations indiquent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes significatifs de douleur ou de détresse. Par la suite, les souris seront soumises à des régimes alimentaires, soit une diète standard, soit une diète riche en lipides induisant la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH). Ces régimes alimentaires ne sont pas associés à une détresse particulière. Nous examinerons l’impact de ce régime à 4 moments différents : une période courte de 4 semaines, une période intermédiaire de 8 semaines, une période de 16 semaines marquée par une inflammation avancée, et enfin, une période de 24 semaines caractérisée par une fibrose avancée. Des explorations dites métaboliques seront réalisées en fin de procédure impliquant un gavage des animaux avec du sucre (glucose) ou une injection d’insuline puis des prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures). La durée des actes techniques de prélèvements de sang est de 5 à 7 minutes par souris, et de gavage est de 2 à 5 minute par souris. En toute fin de procédure, les souris seront placées dans un tube pendant 2 minutes avec une certaine restriction de mouvement pour mesurer leur quantité de graisse. Elles seront ensuite placées seules dans des cages de dimension réglementaire permettant des mesures de leur métabolisme, leur activité et de leur consommation d’eau et de nourriture. Avant l’euthanasie, un prélèvement sous-mandibulaire de sang sera réalisé d’une durée d’environ 30 secondes puis l’animal sera euthanasié conformément aux directives éthiques. Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les éventuels effets indésirables chez les animaux sont principalement liés à la chirurgie (douleur physique passagère, hypothermie éventuelle durant l’anesthésie). Les observations montrent que les souris récupèrent rapidement et complètement après la chirurgie, sans présenter de signes de douleur ou de détresse significative. Dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime gras (Western-type). Ce régime alimentaire ne devrait pas causer de douleur ou de détresse perceptible chez les souris, mais plutôt entraîner une prise de poids, qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie, l’animal sera sorti de l’étude. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant 4 heures, le gavage de glucose, l’injection intra-péritonéale d’insuline ou de toxine diphtérique (une seule piqure abdominale) avec contention douce de l’animal et la microcoupure de la queue pour les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires et de courtes durées pour les animaux. De plus, l’isolement nécessaire de la souris de ses congénères en cage de mesure calorimétrie peut également provoquer un stress de l’animal.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la maladie dans un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

Nous aurons besoin de 12 souris par groupe. Nous visons à minimiser le nombre d’animaux nécessaires tout en maintenant la robustesse des résultats. Pour assurer la solidité statistique de nos résultats, il sera nécessaire de reproduire les expériences sur deux lots de souris. Le nombre total d’animaux prévu est de 4608 souris. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins (réduction jusqu’à 25 pourcents).

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft, maisons en carton, tunnels en carton ou carrés de coton compacté). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. L’identification des animaux génétiquement modifié sera réalisée par le personnel qualifié et formé de l’animalerie. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal, conformément aux directives éthiques. En ce qui concerne les chirurgies, les animaux seront soumis à une anesthésie générale par injection intrapéritonéale. Une dose préventive d’antalgique sera administrée avant la chirurgie, puis renouvelée toutes les 8-12 heures pendant 48 heures. Un gel ophtalmologique sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie. Lors de la chirurgie, réalisée sur un tapis chauffant pour maintenir la température de l’animal, une attention particulière sera portée sur sa fréquence respiratoire. Un rétablissement complet sans douleur ni détresse notable devra être observé après la chirurgie. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. Une perte de poids de 20 pourcents dans les jours suivant la chirurgie sera considérée comme point limite et entrainera l'euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle du nerf vague dans la mobilisation et le recrutement des cellules immunitaires dans le foie, et comment cela influence le développement de la stéatose hépatique non-alcoolique (NASH) chez la souris. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la NASH. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude de la NASH et des effets de la vagotomie. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines à leur entrée dans la procédure expérimentale. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris entreront en procédure à 8 semaines et en ressortiront à 15, 19, 27 et 35 semaines. L’âge des animaux est suivi par rapport à leur date de naissance qui sera sur les étiquettes des cages ainsi que dans le logiciel de gestion des animaux.