Recherche appliquée

Le protocole revient à faire passer à des rongeurs l'équivalent préclinique des essais de phase 1 menés sur des volontaires humains sains, pour établir la dose à laquelle une molécule en développement devient toxique. 1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les uns pour des prélèvements, les autres parce qu'ils ont reçu des substances dont le porteur ignore les effets à long terme. En douze semaines, un même animal peut recevoir jusqu'à 336 administrations, subir 64 prélèvements sanguins et passer 60 tests comportementaux, censés mesurer la motricité, la cognition, la douleur, l'anxiété et la dépression, sans qu'aucun de ces tests soit nommé. Le porteur affirme que ces modèles ont une "prédictivité reconnue", au motif qu'ils "répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché".

Objectifs

La nécessité d’évaluer la sécurité des médicaments et des molécules en cours de développement est apparue suite aux accidents thérapeutiques du début du XXème siècle voire aux tragédies comme ce fut le cas pour la thalidomide. Dans ce cadre, l’étude de l’index thérapeutique et de l’innocuité d’une molécule est primordiale. Il s’agit de déterminer les doses à administrer afin d’obtenir la concentration sanguine permettant l’effet recherché mais également d’évaluer la dose à laquelle les premiers effets secondaires apparaissent. Ces études sont fréquemment réalisées sur des rongeurs et pourraient être également considérées comme l’équivalent préclinique des études de phase 1 en développement clinique impliquant des volontaires sains. Dans ce projet, nous proposons d’administrer des composés en cours de développement à des rongeurs puis d’adresser jusqu’à 3 questions interdépendantes : - La première interrogation est de savoir comment le composé se comporte vis-à-vis de l’organisme - Ce projet permet également d’évaluer les éventuels effets secondaires d’une molécule lors de son administration aux doses que l’on souhaite utiliser pour traiter la maladie. Pour cela, des animaux sains sont traités par le composé à tester et leur comportement est observé pour détecter des effets non souhaités. - Finalement, ce projet permet de déterminer la dose d’apparition des effets indésirables. Ceci est réalisé en administrant un composé à une dose supérieure à la dose thérapeutique et à étudier leur comportement pour détecter des effets non souhaités.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la connaissance des effet secondaires des nouveaux médicaments et à la sélection de nouveaux traitements ayant une balance bénéfice/risque la meilleure possible.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront sur une période de 12 semaines un maximum de 336 administrations, de 64 prélèvements sanguins ( en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) et de 60 tests de comportements, ces tests de comportements permettront de mesurer l’impact de la molécule sur le système moteur, cognitif, nociceptif mais aussi sur le niveau d’anxiété ou de dépression des animaux. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les tests de comportement sont généralement courts (entre 30 sec et 5 min) et ne dépasse pas 30 min pour le plus long.

Impact sur les animaux

LLes administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les tests de comportement peuvent induire un inconfort thermique, un stress, une légère désorientation ou des douleurs de courte durée.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu’il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses globales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les analyses du présent projet nécessitent des observations uniquement possibles chez l’animal vivant. De plus, les effets secondaires sont par nature imprévisibles. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 50 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 25 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Une grille de score permet de surveiller les points limites préalablement défini et le devenir de l’animal est évaluer à l’aide d’un arbre décisionnel permettant d’éviter les souffrances inutiles.Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de leur mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des raffinements spécifiques pour chaque procédure seront mis en place.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat. De plus, tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (souris de 4 à 5 semaines et des rats de 6-7 semaines au début du projet). Il s’agit de s’adresser à des animaux dont l’activité spontanée est suffisante pour réaliser les tests proposés.

Une partie des souris utilisées est irradiée du corps entier pour éliminer ses défenses immunitaires, d'autres sont immunodéficientes de naissance et développeraient des maladies hors d'un hébergement protégé. 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit des cellules tumorales sous la peau, des injections sous-cutanées, intraveineuses ou dans l'abdomen sous anesthésie, et jusqu'à six séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie, certaines étant transportées vers un autre établissement pour l'irradiation. Toutes sont tuées en fin d'étude pour que la radioactivité soit mesurée dans les organes prélevés.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer l’état d’avancement de la pathologie et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale. Nous travaillons également sur une nouvelle modalité de traitement appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV) qui utilise la même chimie que les sondes d’imagerie. Nos développent donc des solutions pour mieux détecter et traiter le cancer en « attachant» une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. La différence réside dans le type de radioactivité utilisé : * pour la détection, on utilise de très faibles doses de radioactivité qui traverse le corps et est détectée par des caméras dédiées. * pour le traitement, on utilise de la radioactivité à très faible rayon d’action qui va détruire les cellules à proximité. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique. Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc triples : * Développer des outils diagnostiques qui serviront de socle pour déterminer si un traitement par RIV peut être développé sur une cible donnée (identifiée préalablement in vitro). * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * En dernier lieu évaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser précisément à la fois des traceurs diagnostiques d’imagerie nucléaire mais également des composés de thérapie. Il sera à terme ainsi possible de valider en amont du traitement si il se lie bien aux cellules tumorales du patient grâce à une imagerie non invasive afin de lui proposer un traitement parfaitement personnalisé par radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.

Procédures

* Pour certains animaux, une irradiation corps entier dans une autre EU avec transport agréé sans sortie de leur cage – une heure avec le transport. * Une injection sous-cutanée sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Une injection intraveineuse sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Au maximum 6 imageries sous anesthésie : au maximum 1 heure sous anesthésie pour une imagerie limitée à 55 minutes * Une injection intrapéritonéale sous anesthésie– environ 5 minutes

Impact sur les animaux

- L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires strictes. - le transport pour irradiation pourrait provoquer un certain stress. - l’implantation sous cutanée de cellules tumorales va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales si elle n’est pas maitrisée. - Les produits administrés pour le diagnostic ne devraient pas impacter l’état de santé des animaux car les doses sont très faibles. Pour la thérapie, les produits peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées.

Devenir

Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible pour les études de biodistribution et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée pour les études d’efficacité.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=5 souris sont suffisamment robustes pour permettre d’identifier le métabolisme et la pharmacocinétique dans les études de biodistribution. L’imagerie sera répétée et permettra d’éviter d’euthanasier des animaux pour chaque point de temps examiné et ainsi de réduire l’effectif d’autant. Les effectifs devront être étoffés à n=10 pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

L’imagerie utilisée dans nos études est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie eux-mêmes très proches des appareillages humains, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

Ouverture de la cavité abdominale, implantation de cellules tumorales dans le pancréas ou le cæcum, ablation de la rate pour le modèle de métastases hépatiques, fermeture : trente minutes par souris. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite transférées dans un second établissement, reçoivent une injection tous les sept jours sous anesthésie, passent une imagerie hebdomadaire, puis subissent une seconde ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de la tumeur guidée par fluorescence, soit deux laparotomies par animal. Toutes sont tuées et autopsiées pour vérifier l'absence de reprise tumorale, au terme d'une démonstration que le porteur juge impossible autrement que sur des animaux porteurs de ces tumeurs.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. Ces travaux sont en cours de réalisation dans des souris qui sont déficientes en système immunitaire et permettent de greffer des cellules cancéreuses d’origine humaine. Pour mimer encore plus ce que nous pouvons retrouver chez l’homme, nous utiliserons dans ce projet des souris présentant un système immunitaire pour vérifier que les résultats retrouvés seront similaires à ceux obtenus dans les souris immunodéficientes. Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques, chez la souris immunocompétentes, mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou le caecum, ou d’enlever la rate. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant chez des animaux pourvus d’un système immunitaire fonctionnel. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée, mais également dans des modèles de souris dépourvues de système immunitaire (en cours).

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines. Ces souris sont largement utilisées pour l’implantation de cellules cancéreuses murines en sous-cutanée mais également dans les organes d’origine. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Un trou percé au dremel dentaire dans le tibia, un implant de titane posé au contact, une solution bactérienne inoculée dans la plaie : 29 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'opération dure dix minutes sous anesthésie fixe, et l'infection osseuse qui suit, une ostéomyélite localisée, fait partie des effets recherchés. Le porteur veut savoir si des bactériophages, seuls ou associés à la vancomycine, viennent à bout d'un staphylocoque résistant à la méticilline, et il précise que cinq des 29 rats sont utilisés uniquement pour que l'opérateur s'entraîne au geste. Le rat a été retenu parce que son tibia est plus gros que celui de la souris, "trop petite" pour que l'implant tienne.

Objectifs

Les infections ostéoarticulaires (ou ostéite) sont des infections qui touchent les os et/ou les articulations. Ce sont des pathologies graves susceptibles d’entraîner un handicap très lourd et parfois de mettre en jeu le pronostic vital. Elles peuvent survenir chez les patients porteurs de prothèse articulaire ou de matériel (clou, plaque, vis…) mais aussi à la suite de traumatismes (fractures ouvertes sans matériel), engendrant des ostéites chroniques. Actuellement, les infections ostéoarticulaires sont le plus souvent dues à des staphylocoques, avec une prédominance des Staphylocoques à coagulase négative et sont traitées par antibiothérapie. Cependant, l’antibiothérapie classique a montré ses limites pour diverses raisons : résistance des souches bactériennes, mauvaise diffusion des antibiotiques dans le tissu osseux, présence de matériel étranger (ex : prothèse) favorisant la formation de biofilm bactérien (lequel protège la bactérie de l’action des antibiotiques). Dans ce contexte, il est donc aujourd’hui nécessaire de trouver des solutions alternatives et/ou complémentaires aux antibiotiques, efficaces pour traiter ces infections. La phagothérapie (usage de bactériophages) apparait aujourd’hui comme une solution pertinente. Les bactériophages sont des virus qui possèdent la particularité de n’infecter que les bactéries, d’être inoffensifs pour tous les organismes eucaryotes tels que les mammifères (humains, animaux) et d’être très spécifiques de l’espèce bactérienne qu’ils attaquent. Ils sont déjà largement utilisés chez l’homme en Europe de l’Est mais, s’agissant d’organismes vivants, leur développement en France se heurte à un cadre réglementaire peu clair et inadapté à la phagothérapie dans la conduite d’essais cliniques. De ce fait, les agences règlementaires demandent la réalisation d’études pré-cliniques préalables. Ce projet se déroulera de façon séquentielle et la première étape se divisera elle-même en deux parties : 1. Entrainement de la pose d’implant dans le tibia du rat non infecté. 2. Mise au point du modèle d’ostéite à Staphylococcus epidermidis résistant à la méticilline chez le rat avec matériel étranger ;

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement thérapeutique dans le traitement des infections ostéoarticulaires. L’efficacité de ce traitement permettra d’étendre le champ des possibilités dans la guérison de ces infections pouvant conduire à l’amputation de certains patients suite à l’échec de l’antibiothérapie seule.

Procédures

- Les rats recevront une injection intrapéritonéale (5 secondes) d’un mélange anesthésique. - Un acte chirugical de 10 min subit par l’animal sous anesthésie fixe : Une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué de façon à pouvoir placé l’implant dans un premier temps puis inoculé la solution bactérienne. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur. La phase pilote consistera à calibrer les différentes conditions expérimentales permettant d’induire une infection ostéoarticulaire avec un matériel étranger dans le tibia du rat. La première nuisance sera liée à l’administration du mélange d’anesthésiques. La deuxième nuisance principale est due à la chirurgie en elle-même. Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. Sous anesthésie fixe, une incision de 1 cm sera réalisée stérilement au niveau du genou et un trou sera effectué à l’aide d’un dremel dentaire de façon à pouvoir placé l’implant en titane. Dans un même temps, l’infection bactérienne sera effectuée au contact de l’implant. Deux à trois points de sutures seront réalisés sur le plan cutané afin de refermer la plaie. Une troisième nuisance également attendue est le développement de l’infection, une ostéomyélite localisée.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (29))afin de récupérer les tibias et implants pour dénombrement bactériens.

Remplacement

Une étude a été réalisée in vitro sur l’efficacité de ce bactériophage sur un grand nombre de souches de S. epidermidis ainsi que dans des modèles de biofilm. Toutefois, l’efficacité de tels composés in vivo peut s’avérer très différente de celle obtenue in vitro tant sur le plan de l’efficacité elle-même que sur la cinétique des phages dans un organisme vivant au niveau du site de l’infection. Également, l’infection ostéoarticulaire est particulière dans le sens où toutes les conditions qui la caractérisent ne peuvent être rassemblées dans un modèle vitro. Enfin, les modèles pré-cliniques sont règlementaires pour le développement de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, au vu du peu d’informations existantes sur ce sujet.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Nos expériences passées nous permettent de tester qu’un seul inoculum pour la mise en place de l’infection ostéoarticulaire. 6 animaux par jour d’autopsie (J7, J12, J21, J28) seront nécessaires pour évaluer la charge bactérienne au cours du temps. De plus, pour la phase d’entrainement, seuls 5 animaux seront utilisés pour l’appréhension du geste technique de la pose d’implant dans le tibia du rat.

Raffinement

Nos expériences précédentes nous ont permis de raffiner l’acte chirurgical afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de l’implant au niveau articulaire sera réalisée sous anesthésie fixe. De plus, une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée. Le suivi post-chirurgical d’une récupération de la mobilité de l’animal sera mis en place. Durant toute l’étude, La nourriture sera placée directement à l’intérieur des cages et des biberons au bec plus long seront également installés afin de faciliter l’accès aux animaux. La litière sera également changée tous les deux jours Le suivi du poids sera effectué tous les deux jours. Enfin, un programme d’enrichissement de l’environnement (igloo, jouet …) sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal préférentiellement utilisé dans la littérature dans ce type d’expérimentation est le rat. En effet, la taille du tibia chez le rat permet un meilleur accès et une meilleure prise d’infection et d’implantation que chez la souris trop petite. Le tibia du rat permet une implantation plus stable et reproductible. Des rats mâles de 250 g seront nécessaires pour la phase pilote.

Vingt rats subissent l'ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes sous anesthésie, dix un simulacre d'opération, puis tous sont transportés trois heures par la route jusqu'au site d'expérimentation. 30 rats vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent l'implantation d'une minipompe sous la peau, cinq séjours de deux jours en cage à métabolisme, quinze injections dans l'abdomen et cinq ponctions de la veine de la queue, pour savoir si des excès de calcium répétés abîment le rein. Le porteur énumère lui-même les atteintes attendues, douleur opératoire, hémorragie, infection de plaie, hypocalcémie, insuffisance thyroïdienne, angoisse en cage à métabolisme et douleur à chaque piqûre.

Objectifs

L’hypoparathyroïdie est une maladie endocrine rare et complexe, caractérisée par une concentration basse ou indétectable d’hormone parathyroïdienne (PTH) entrainant une hypocalcémie et une hyperphosphatémie lorsqu’elle n’est pas traitée. Le traitement conventionnel est une association de métabolite de la vitamine D et de sels de calcium. Un effet secondaire habituel de ce traitement est une hypercalciurie ainsi que des épisodes d’hypercalcémie. Les 2 sont dus à une augmentation de l’absorption intestinale de calcium et à une diminution de la réabsorption tubulaire rénale de calcium, due à l’absence de PTH. L’hypoparathyroïdie et/ou le traitement conventionnel sont associés à une augmentation de la morbidité rénale, sous forme d’une lithiase rénale et/ou d’un néphrocalcinose et/ou d’une insuffisance rénale. Selon les séries, la prévalence de l’insuffisance rénale s’étend de 14 à 41 pour cent, dans tous les cas beaucoup plus élevée que dans la population générale. Epidémiologiquement, le risque d’insuffisance rénale est associé au nombre d’évènements hypercalcémiques et à la durée de la maladie. L'objectif du projet est de déterminer expérimentalement s'il existe un lien de causalité entre la survenue d'épisodes répétés d'hypercalcémie et la survenue d'une insuffisance rénale, et, si oui, d'en déterminer le mécanisme.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif principal de déterminer l'éventuel lien de causalité entre épisodes répétés d'hypercalcémie, induite par un surdosage thérapeutique (fréquent en médecine humaine) et la survenue d'une dégradation de la fonction renale, une des principales morbidités observées au cours du suivi des patient.es avec hypoparathyroïdie. La démonstration du lien de causalité aurait 2 conséquences -

Procédures

Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (ou un simulacre) est réalisée, sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes, 1 fois). Les animaux sont transporté du site d'élevage (où a lieu la chirurgie) au site d'expérimentation, par transport routier agréé (3 heures, 1 fois). Un traitement par hormone thyroïdienne dans l'eau de boisson est apporté aux animaux ayant subi une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes pendant 71 jours. Une minipompe sous cutanée est implantée sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes, 1 fois). Les animaux subissent une acclimatation à l'hébergement en cage à métabolisme pour habituation (animal vigile, 3 jours, 1 fois). Dix animaux reçoivent un régime riche en calcium (animal vigile, 3 jours, 5 fois). Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne (animal vigile (1 minute par injection), 3 jours de suite, 5 fois). Les animaux sont hébergés en cage à métabolisme pour recueil d’urine (animal vigile, 2 jours, 5 fois). Un prélèvement sanguin par ponction de la veine de la queue est réalisé chez les animaux (animal vigile, 1 minute, 5 fois); le volume prélevé est conforme aux recommandations. Une euthanasie est pratiquée chez les animaux sous anesthésie générale et analgésie par une méthode réglementaire (10 minutes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Tous les animaux subissent une chirurgie cervicale : il s’agit d’une ablation des glandes thyroïde et parathyroïdes (thyroparathyroïdectomie) chez 20 d’entre eux et d’un simulacre chez 10 d’entre eux. La plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort, la thyroparathyroïdectomie cause une hypocalcémie et une insuffisance thyroïdienne. La chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont transportés du site de l’éleveur au site d’expérimentation par transport routier, ce qui peut induire un stress. Les animaux de tous les groupes subissent une chirurgie sous anesthésie pour implantation de la pompe sous-cutanée : la plaie opératoire peut être à l’origine de douleurs ou d’inconfort. Par ailleurs, la chirurgie peut être cause d’hémorragie et d’infection de plaie. Tous les animaux sont hébergés périodiquement en cage à métabolisme : cet hébergement peut être à l’origine d’une perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, d’angoisse et d’intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme. Des injections intrapéritonéales de calcitriol ou de placebo, et d’anesthésiques sont réalisées chez les animaux, causant une douleur au point d'injection. Des ponctions veineuses sont réalisées de manière itérative chez tous les animaux : ces ponctions causent une douleur et peuvent causer une hémorragie.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus pour analyse moléculaires (ARNm et protéines)

Remplacement

La complexité des mécanismes contrôlant la valeur de calcium dans le sang et la fonction rénale est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences des épisodes d'hypercalcémie sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.

Réduction

Trente (30) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.

Raffinement

Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. L’anesthésie est encadrée par une analgésie lors de l’implantation des pompes ; après la chirurgie, l’analgésie est maintenue systématiquement pendant 48 heures. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Lorsqu'un hébergement en cage à métabolisme est nécessaire, les animaux sont préalablement acclimatés à cet environnement, et la durée d'hébergement est réduite au strict nécessaire. Des soins peuvent être mis en place en fonction des signes de souffrance observées (soins médicamenteux, raffinement des conditions d’hébergements, et des techniques de chirurgie etc…). Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande

Choix des espèces

L'espèce étudiée est le rat chez qui l’homéostasie du calcium est proche de celle de l’humain et chez qui la thyroparathyroïdectomie est techniquement réalisable. La stade de développement est celui du jeune adulte, ce qui correspond à l’âge auquel sont souvent réalisées les thyroparathyroïdectomies chez l’humain.

246 souris reçoivent une injection de cellules tumorales de mélanome puis un gavage quotidien pendant quinze à vingt semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur tumeur est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, et une partie d'entre elles reçoit en plus une injection tous les deux à quatre jours. Le porteur indique que le gavage quotidien peut irriter le larynx et gêner la déglutition, et que la tumeur peut finir par empêcher l'animal de se déplacer, de s'alimenter et de s'hydrater. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, au terme d'une étude qui vise à confirmer chez la souris un résultat déjà obtenu en culture cellulaire.

Objectifs

Les mélanomes avec mutations activatrices d’un gène particulier peuvent être traités par des thérapies ciblées entrainant une rémission rapide chez 65-70% des patients. Cependant, la majorité des cas développent des résistances au traitement, parfois au bout d’un an seulement. Certaines cellules de la tumeur,, appelées « cellules persistantes », auraient un rôle essentiel dans le développement de ces résistances. Les « cellules persistantes » sont en effet capables de survivre aux thérapies ciblées en engageant des changements qui leur permettent de s'adapter au traitement. Or, ces cellules constituent un réel problème clinique car elles peuvent évoluer en cellules qui résistent de façon permanente à la thérapie. Cette évolution vers des cellules résistantes implique l'introduction d'erreurs dans l'ADN, appelées mutations, qui leur permettent de proliférer et de survivre malgré le traitement. Une étude a mis en évidence que, pour survivre à la thérapie ciblée, les cellules persistantes de mélanome modifient le processus qui permet aux cellules de fabriquer des protéines à partir d'une copie de l'ADN, appelée ARN messager. En effet, lors de thérapie ciblée, il y a une augmentation de la production de certaines protéines, dont l’une d’elles peut potentiellement favoriser l’introduction des erreurs dans la séquence de l'ADN. Afin d'offrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour surmonter cette résistance chez les patients atteints de mélanome, ce projet a pour objectif de démontrer que l'inhibition de la production de cette protéine peut supprimer, ou au moins retarder, la résistance aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Environ 50 % des mélanomes présentent une mutation activatrice d’un oncogène (gène dont l’expression favorise la survenue de cancers) particulier. L'inhibition, par thérapie ciblée, de la protéine issue de cet oncogène, permet d'obtenir des réponses thérapeutiques efficaces. Cependant, ces réponses sont souvent limitées dans le temps et la moitié des patients rechutent après 12 à 15 mois. La compréhension des mécanismes à la base de cette résistance est nécessaire, et l'identification du déterminant moléculaire de cette résistance peut offrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer le pronostic des patients. Les expériences in vitro dans les cellules de mélanome traitées par thérapie ciblée montrent un rôle de notre protéine clé dans l'augmentation de l'instabilité génétique, qui est la cause principale de la résistance aux thérapies. Ce projet a donc pour objectif de confirmer l’implication de notre protéine clé dans cette résistance dans un contexte in vivo. De plus, nos expériences in vitro ont permis d’identifier une molécule_actuellement utilisée dans des essais cliniques pour le traitement d'autres types de cancer_ qui peut empêcher les mutations lors de la réparation des dommages à l’ADN et donc limiter la résistance thérapeutique aux thérapies ciblées. Nous devons confirmer ces résultats dans un contexte in vivo. L'objectif à long terme est d'apporter des bénéfices aux patients atteints de mélanome en améliorant le taux de survie des patients .

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience- durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines-durée du geste inf à 10sec)). Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour par gavage. Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois tous les 2 jours pendant 22 jours avec un second traitement (administration des traitements par injection aux animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Enfin, dans une troisième procédure, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront ensuite traités à raison d’1 fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (administration des traitements par gavage sur animaux vigiles pendant environ 15-20 semaines durée du geste inf à 10sec). Les animaux seront aussi traités à raison d’une fois tous les quatre jours pendant 3 semaines (administration des traitements par injection i sur animaux vigiles durée du geste inf à 10sec). Pour tous ces animaux, la croissance tumorale sera mesurée trois fois par semaine sur animal vigile à l’aide d’un pied à coulisse (durée du geste inf à 15 sec).

Impact sur les animaux

La greffe sous-cutanée de cellules tumorales peut amener une gêne qui peut s’amplifier avec le développement de la tumeur, pouvant aller jusqu’à une modification de l’état physiologique de l’animal (manque de toilettage, prostration, difficulté à se déplacer, s’alimenter et à s’hydrater). Ces effets ne sont attendus qu’en fin d’expérience. Le gavage quotidien peut amener une irritation du larynx pouvant amener des difficultés à s’alimenter, à déglutir. L’injection des médicaments peut entrainer une gêne liée à la piqûre elle-même juste après l’injection.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortem d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Notre étude in vitro utilisant différentes lignées cellulaires de mélanome a permis de déterminer l'implication du processus de production de notre protéine d’intérêt dans la résistance acquise du mélanome à la thérapie ciblée. De plus, nos résultats obtenus in vitro ont montré que l'inhibition de ce processus peut limiter la résistance acquise. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. De plus, Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro suffisamment robuste pour tester des synergies thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'outils statistiques.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. De plus, un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place de la procédure expérimentale pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés tous les jours lors de la procédure , qui est raffinée par l’établissement de points limites précoces, entrainant et la mise en place de soins (supplément alimentaire, administration de solutés) voire la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de points limites. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. La souris est le modèle de choix pour les études de cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la production de souris immunodéficientes nous permet de travailler sur des modèles cellulaires d’origine humaine. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et ciblée par les éventuels traitements.

Sous anesthésie, des souris sont brûlées ou privées d'un fragment de peau pour créer une plaie, puis anesthésiées à nouveau tous les trois jours et demi pour recevoir crème ou pansement, mesurer la plaie et en prélever l'exsudat, avec trois prises de sang en deux semaines. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exposées selon le porteur à la douleur de l'inflammation, et possiblement à la déshydratation, à l'anémie et aux hématomes. Il parle de "génération des plaies" et d'"application de plaies", la brûlure n'apparaissant qu'une fois, entre parenthèses. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes, dans l'espoir de montrer que les actifs de l'équipe cicatrisent mieux que le Bepanthen.

Objectifs

Le but de la cicatrisation des plaies à la suite d’une blessure est de former un tissu régénéré dont la fonctionnalité et l’aspect visuel sont aussi proches que possible de la peau d’origine. La cicatrisation des plaies, en tant que processus biologique normal dans le corps humain, est obtenue par le biais de quatre phases précisément et hautement programmées. Pour qu’une plaie guérisse avec succès, les quatre phases doivent se dérouler dans le bon ordre et dans le bon délai. De nombreux facteurs peuvent interférer avec une ou plusieurs phases de ce processus, provoquant ainsi une altération de la cicatrisation des plaies. Pour remédier à l’altération du processus de cicatrisation, des dispositifs médicaux tels que l’application de crèmes cicatrisantes ou de pansements ont été développés. Ces dispositifs accélèrent la cicatrisation, soulagent la douleur induite par l’inflammation, aident à prévenir les infections et améliorent la régénération tissulaire. L’objectif de notre projet est de montrer l’efficacité accrue de nouveau composés, utilisable sous forme de crème ou en association avec un pansement, sur la cicatrisation cutanée suite à des blessures.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité de nos actifs cicatrisants par rapport au contrôle positif (Bepanthen) largement utilisé pour améliorer la cicatrisation.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Génération des plaies : Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. Une chirurgie de 10 minutes pour chaque souris. 2) Administration des dispositifs médicaux : Sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. 4 fois car l’expérimentation dure 14 jours (Tous les 3,5 jours). Durée de l’administration des dispositifs médicaux, 10 minutes pour chaque souris. 3) Mesures des dimensions et de la température des plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie, en même temps que l’application des dispositifs médicaux. Durée 2 minutes pour chaque souris. 4) Prélèvements des exsudats de plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie. Durée 3 minutes pour chaque souris. 5) Prélèvements sanguins (Tous les 7 jours) : 3 fois, durée 2 min, pour chaque souris sous anesthésie générale. Toutes les souris (120) du projet sont concernés par cette procédure.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de l’application de plaies est la douleur induite par l’inflammation. Ces plaies pourraient aussi induire une déshydratation des animaux. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances telles que l'anémie, l’apparition d’hématomes et une déshydratation des souris.

Devenir

À la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leurs organes à des fins d'analyses d'immunohistochimie, de biochimie et de biologie moléculaire. Ces analyses approfondies sont essentielles pour élucider les mécanismes thérapeutiques de nos agents cicatrisants.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’actifs cicatrisants au niveau systémique. Actuellement, aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Après l’intervention chirurgicale, des mesures seront prises pour éviter un isolement complet, telles que l'utilisation d'adhésifs pour protéger les plaies et maintenir les animaux en groupe. L'anesthésie et l'analgésie seront systématiquement administrées lors de la génération des plaies et tout au long de l'expérimentation. Nous accordons une attention particulière à la gestion de l'inflammation induite par les plaies. En cas de dépassement des critères définis, comme par exemple une perte de poids dépassant 10-15% de leur poids initial, des mesures seront prises pour restaurer leur santé et pour éviter toute souffrance inutile. Pour atténuer l'angoisse des animaux qui seraient isolés en post-opératoire, nous enrichirons leur environnement en leur fournissant davantage de coton, d'igloos et de roues d'exercice, et nous les nourrirons avec une gelée alimentaire enrichie en nutriments. Cette alimentation spécifique sera également distribuée après chaque prise de sang. Un suivi attentif des animaux sera effectué en conformité avec les recommandations du comité de suivi du bien-être animal de notre établissement.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de l’efficacité thérapeutique des produits que nous avons développés. Ce projet a pour but de démontrer que des actifs cicatrisants sont efficaces dans deux modèles de cicatrisation (Excision/Brûlure). Les rongeurs, et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines, ainsi des modèles de cicatrisation utilisant des souris ont été développés. Ces modèles induisent une plaie sur la peau de l’animal. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques des processus de cicatrisation observable chez l’humain (Inflammation, synthèse d’exsudats, ré-épithélialisation des lésions cutanées, etc…). Les animaux seront utilisés à l'âge adulte car nos actifs cicatrisants seront prescrits chez l'adulte et que ce stade de développement est plus stable d'un point de vue physiologique.