Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
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- Troubles nerveux
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- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Comparaison de l’efficacité de l’administration d’Angiotensine 2 versus Noradrénaline dans un modèle porcin d’arrêt cardiaque réfractaire réanimé 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Sous sédatif dans un premier établissement puis transférés dans un second, 16 cochons de 50 à 60 kg sont placés sous anesthésie générale et reliés par une veine et une artère à une circulation extracorporelle. Le thorax est ensuite ouvert et une artère du cœur obstruée pour provoquer un arrêt cardiaque, afin de comparer l'angiotensine 2 et la noradrénaline, avec des prises de sang à l'arrêt puis trois et six heures plus tard. Ces procédures, huit heures en tout, sont menées sous anesthésie, sans réveil, et le porteur signale un risque de choc hémorragique à la pose des canules. Aucun ne peut être réveillé "dans des conditions compatibles avec la vie", écrit-il, et tous sont tués par surdose d'anesthésique, avec prélèvement de tissu cardiaque.
Objectifs
L'initiation d'une oxygénation par une circulation extra corporelle est devenue une intervention de plus en plus fréquente chez les patients en état de choc cardiogénique et y compris en cas d'arrêt cardiaque réfractaire aux thérapies standards. La survie globale jusqu'à la sortie de l'hôpital en utilisant cette technique se situe entre 29 % (réanimation cardio-pulmonaire extracorporelle) et 41 % (choc cardiogénique réfractaire). La médication la plus couramment utilisée et recommandée pour palier aux effets secondaires de la circulation extracorporelle est un médicament appelé la noradrénaline mais ce médicament à des effets délétères sur le coeur et les vaisseaux. Il est possible que l'utilisation de l'angiotensine 2 sans effet cardiaque spécifiques soit meilleure. Nous allons comparer dans ce projet les effets de ces 2 médicaments sur un modèle porcin reproduisant l'état clinique de tels patients. Ce protocole est réalisé dans 2 établissements utilisateurs (appelés EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
L'un des résultats clés attendus concerne l'efficacité sur la circulation sanguine, mesurée à travers des paramètres tels que la pression artérielle moyenne ou le débit cardiaque. L'Angiotensine 2 est attendue pour démontrer sa capacité à maintenir ou à augmenter la pression artérielle moyenne de manière significative par rapport à l'administration de Noradrénaline, actuellement un traitement standard dans ces situations. Des différences entre les deux groupes de traitement pourraient influencer la décision clinique et le choix d'un médicament optimal.
Procédures
A l'EU1, les animaux subiront l'injection d'un sédatif pour atténuer le stress lié à la manipulation. Ensuite, ils sont transférés dans l'EU2 où se déroul la suite du protocole : une perfusion intraveineuse sera établie pour induire une anesthésie générale. Une fois complètement endormis et sous traitement analgésique, nous procéderons à l'installation d'un dispositif de circulation extracorporelle. Ce dispositif permettra de maintenir un débit cardiaque et d'assurer l'oxygénation du sang. Cette procédure implique la mise en place d'une canule dans une veine et une artère du cochon. Par la suite, une ouverture thoracique sera réalisée pour exposer le cœur, et nous simulerons un arrêt cardiaque en obstruant l'une des artères cardiaques. Des prélèvements sanguins seront effectués au moment de l'arrêt cardiaque, puis après 3 et 6 heures. Toutes ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec maintien d'une normothermie et une administration continue d'antalgiques pendant les 8h de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
Stress lors de la prémédication. Douleur induisant une possible tachycardie ou une hypertension. Effets secondaires à la chirurgie : perte de sang avec choc hémorragique lors de la pose de l'assistance circulatoire.
Devenir
Le cochon ne pourra pas être réveillé dans des conditions compatibles avec la vie. De plus, des prélèvements de tissus cardiaques sont nécessaires pour une étude microscopique, l’animal ne reprendra pas conscience et sera euthanasié par overdose d'anesthésique.
Remplacement
Le modèle d’arrêt cardiaque suivi de procédures de réanimation ne peut être effectué que sur un organisme dans son entier avec un impact sur les différentes fonctions. L'adaptation à l'environnement physiologique direct du coeur nous conduit à réaliser cette étude sur un modèle animal où toutes les contraintes seront présentes. Ce modèle animal expérimental imite étroitement le scénario clinique des cas réfractaires d'arrêt cardiaque, permettant une évaluation plus précise des résultats microcirculatoires.
Réduction
Ce modèle est déjà en place dans notre structure ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car le personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquement exploitables. La mise en place des appareillage (canules...) sera réalisée par des chirurgiens cardiaques expérimentés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à l'animalerie par groupes (au moins 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. L’animal est mis à jeun la veille de l’expérimentation. Le jour de l’expérimentation, les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés sédatives et myorelaxantes avec un produit psychotrope dissociatif aux propriétés analgésiantes. Les animaux peuvent être ainsi manipulés sans recours à des méthodes susceptibles de les effrayer inutilement ou de leur infliger des souffrances évitables. Les animaux seront ensuite sous anesthésie profonde pendant toute la durée de l'opération. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, respiratoire, la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal de cochon, animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une circulation extra-corporelle est utilisé pour sa similitude avérée, en terme d’anatomie cardiaque et de circulation sanguine, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la circulation extra-corporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.
Evaluation in vivo d’une sonde de pression tissulaire en oxygène et en dioxyde de carbone chez le cochon anesthésié.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Trépanés sur quelques centimètres pour introduire des sondes dans le cerveau, après pose d'un cathéter dans la carotide et modulation forcée de la ventilation artificielle, 20 porcelets d'environ deux mois sont opérés sous anesthésie générale profonde et tués avant tout réveil. Les mesures portent d'abord sur le muscle, avec cinq animaux par procédure, puis sur le cerveau, avec dix animaux. Le projet vise à vérifier la justesse et la réactivité de capteurs de pression tissulaire en oxygène et en dioxyde de carbone, destinés à terme au monitorage de patients cérébrolésés. Sur l'effectif, le porteur reconnaît qu'il est difficile de donner prise à une justification précise du nombre de sujets.
Objectifs
La prise en charge spécialisée des patients souffrant de certaines pathologies neurologiques, comme le traumatisme crânien sévère, est notamment guidée par de nombreux paramètres reflétant l’état du cerveau, dont la pression tissulaire en oxygène (O2) et en dioxyde de carbone (CO2). Un certain nombre de dispositifs sont actuellement disponibles, en pratique clinique, pour la surveillance, souvent indirecte, de ces paramètres, et ces dispositifs sont en constante évolution afin de proposer des solutions de plus en plus directes, efficaces et/ou sécuritaires. Evidemment, avant de pouvoir être considérés dans le cadre d’une utilisation clinique, ces dispositifs doivent satisfaire à un certain nombre de tests techniques, in-vitro et souvent in vivo qui permettent de vérifier notamment la justesse et la réactivité des mesures dans des conditions physiologiques réalistes et tenant compte de la variabilité et de la variation d’un certain nombre de facteurs connus et décrits dans la littérature, comme les variations des niveaux de pressions partielles dans le sang en O2 ou en CO2 et la perfusion sanguine. Le projet que nous proposons a pour objectif d’évaluer, chez le cochon sous anesthésie générale profonde, les dispositifs de mesure de la pression tissulaire en O2 et en CO2. Dans un premier temps, les sondes seront testées dans le muscle avant d’être testées au niveau cérébral. En particulier, nous testerons la fiabilité et la réactivité des mesures fournies lors de variations contrôlées des niveaux sanguins d’O2 ou de CO2 (par modifications des paramètres de ventilation artificielle) et du débit sanguin tissulaire.
Bénéfices attendus
- Vérifier le fonctionnement in vivo des capteurs tissulaires d’oxygène et de dioxyde de carbone - Comparer la précision de meure des capteurs tissulaires d’oxygène et de dioxyde de carbone - Evaluer la réactivité des capteurs tissulaires d’oxygène et de dioxyde de carbone - Améliorer le design et l'interface du moniteur pour une utilisation plus ergonomique - A terme, application clinique dans le champ du monitorage des patients cérébrolésés en neuro-réanimation
Procédures
Mise à part la phase d'induction de l'anesthésie pas de geste en dehors de la sédation. Types d'interventions : - La sédation par voie intramusculaire à l’arrivée dans la structure d’expérimentation - La pose d’une voie veineuse périphérique de petit calibre sur une veine auriculaire, afin d’injecter les produits d’induction de l’anesthésie générale - L’intubation orotrachéale dont la douleur est limitée par les agents analgésiques préalablement administrés - La pose d’un cathéter artériel en carotidien (sous anesthésie générale) - L’incision cutanée, introduction du capteur et suivi des valeurs (pour les expérimentations sur le cerveau : trépanation de quelques centimètres pour pouvoir introduire les sondes dans le parenchyme cérébral) - Le maintien d’une sédation et d’une analgésie visant l’entretien d’une anesthésie générale profonde tout au long de l’expérimentation
Impact sur les animaux
Les nuisances seront limitées à : - La sédation par voie intramusculaire à l’arrivée dans la structure d’expérimentation - La pose d’une voie veineuse périphérique de petit calibre sur une veine auriculaire, afin d’injecter les produits d’induction de l’anesthésie générale - L’intubation orotrachéale dont la douleur est limitée par les agents analgésiques préalablement administrés - La pose d’un cathéter artériel en carotidien (sous anesthésie générale) - L’incision cutanée, introduction du capteur et suivi des valeurs (pour les expérimentations sur le cerveau : trépanation de quelques centimètres pour pouvoir introduire les sondes dans le parenchyme cérébral) - Le maintien d’une sédation et d’une analgésie visant l’entretien d’une anesthésie générale profonde tout au long de l’expérimentation
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les évaluation préalables in-vitro ne permettent pas de simuler de manière adéquate l’environnement réel d’utilisation des sondes (tissus spécifiques, vascularisation,…). Donc, un modèle animal, proche de l'Homme, comme le porc, est nécessaire pour évaluer la fiabilité des dispositifs médicaux in vivo avant de pouvoir évaluer leur applicabilité future potentielle chez les patients cérébrolésés pour monitorer certains paramètres cérébraux.
Réduction
Le nombre d’animaux étudiés sera réduit au minimum, en accord avec les principes des 3R, notamment le raffinement des méthodes expérimentales et la réduction du nombre d’animaux utilisés pour l’expérimentation, basée sur un plan statistique. Au vu des données disponibles dans la littérature, il semble toutefois difficile de donner prise à une justification précise du nombre de sujets. Aussi, cette justification repose sur les délais d’expérimentation, sur la stratégie considérée en termes de plan expérimental et sur une simulation en termes de puissance statistique permettant d’assurer la fiabilité des mesures recueillies, avant son utilisation éventuelle en pratique clinique. Un effectif total de 5 animaux par procédure expérimentale sur le muscle et 10 animaux pour les mesures sur le cerveau (soit un total de 20 animaux pour l’ensemble du projet) doit toutefois permettre d’assurer l’analyse de la réactivité et de la réaction des sondes aux épreuves prévues. Le choix de n’utiliser que 10 animaux pour l’ensemble des mesures cérébrales repose sur deux éléments. Le premier est que ces manipulations sont plus complexes et qu’il est possible que certaines manipulations n’arrivent pas à leur terme par suite de problèmes techniques. Deuxièmement, la destination finale de ces moniteurs étant le monitorage cérébral, nous souhaitons recueillir plus de données dans cette configuration intracérébrale.
Raffinement
En pratique, les animaux seront acheminés depuis l’établissement fournisseur, vers l’établissement utilisateur, le matin-même de l’expérimentation. Au sein de l’établissement utilisateur, l’angoisse des animaux sera limitée par l’utilisation d’un local adapté de stabulation, avec libre accès à l’alimentation et à une source d’eau jusqu’à 6 heures avant leur sédation intramusculaire en vue de leur inclusion dans le protocole de recherche. En particulier, les animaux ne seront maintenus en cages de dimensions adaptées à la réglementation (surface minimale par animal : 0,4 m2 ; hauteur minimale : 50 cm) et comportant des éléments d’enrichissement (environnemental : litière épaisse de paille ; occupationnel : jeux distractifs adaptés ; nutritionnel avec distribution auto-déclenchée des aliments), que le temps minimal strictement nécessaire, e.g. pour le transport des animaux jusque dans des enclos spécifiques au sein de l’établissement utilisateur (dimensions réglementaires des enclos : surface au sol minimale de 0,2 m2 par animal ; longueur minimale de mangeoire par tête de 0,2 m) et l’administration de la sédation intramusculaire par Azapérone avant réalisation d’une anesthésie générale par voie intraveineuse (soit au total environ 3 heures).
Choix des espèces
Le modèle porcin est le modèle le plus proche de l’Homme, hors primates non humains, motivant son utilisation pour évaluer in vivo ce dispositif destiné à une application clinique future. La réalisation des mesures physiologiques (hémodynamiques, respiratoires) et issues des sondes de de pression tissulaire en oxygène et en dioxyde de carbone nécessite une taille minimale des porcelets. Des animaux immatures seront suffisants. Les animaux seront âgés d’environ 2 mois et seront de sexe indifférent (selon l’établissement fournisseur).
entrainement medical chez le porc
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Conduits chaque jour vers une case de prélèvement, puis piqués pendant trente secondes au maximum sans être maintenus par le groin, 60 porcs en croissance subissent jusqu'à trois prises de sang espacées d'une semaine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet déclaré est de tester un entraînement médical avec récompense sucrée donnée après la piqûre et non pendant, les séances étant filmées pour servir d'outil de démonstration en expérimentation et en élevage. Le porteur indique qu'un inconfort et une douleur légère et transitoire sont possibles à l'introduction de l'aiguille, et que l'animal pourra s'y soustraire. Les 60 porcs, 30 mâles et 30 femelles répartis en six bandes, seront replacés en élevage à l'issue de la procédure.
Objectifs
L’entrainement médical est un procédé très efficace de raffinement des procédures expérimentales. Nous réalisons notamment chez le porc des prélèvements de sang sans aucune contention. L’entrainement médical est l’alternative à la prise par le groin pour immobiliser l’animal qui est particulièrement douloureuse. Nous souhaitons développer une méthode d’entrainement médical avec récompense sucrée après le prélèvement et non pendant celui-ci ; les récompenses sucrées pouvant modifier certains paramètres physiologiques si elles sont données avant et pendant le prélèvement sanguin. Nous testerons notre protocole, déplacement, immobilisation puis prélèvements sur 6 lots de 10 porcs, ces séances seront filmées pour pouvoir servir d’outil de démonstration en expérimentation et en élevages.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de réaliser des prélèvements sanguins respectueux du bien être animal, il s'agit d'un véritable raffinement des prises de sang. il permettra de démontrer aux scientifiques que les prélèvements de sang sans contention et avec récompense, après le prélèvement sont possibles. Une large communication sur la faisabilité sera réalisée, webinaire, formation
Procédures
Les porcs seront soumis après entrainement à 3 prélevements de sang maximum sur animal vigile, espacés au minimum de 1 semaine . La durée maximal de chaque prélèvement est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Un inconfort et une douleur légère et transitoire lors de l’introduction de l’aiguille est possible, l’animal pourra s’en soustraire
Devenir
les animaux seront replacés en élevage à la fin de la procédure
Remplacement
Nous ne pouvons remplacer l’objet étant de réaliser des prises de sang sur l’animal vigile.
Réduction
Nous avons réduit l’effectif à 10 porcs pour 120 porcs par bande. L'expérimentation sera conduite sur 6 bandes successives, soit 60 porcs, 30 mâles et 30 femelles Les taux de succès à ce projet permettront d’établir les effectifs animaux pour des projets ultérieurs nécéssitant des prises de sang sans modifier la glycémie. Si lors des 2 premiers lots le taux de succés au prélèvement sanguin est inférieur ou égal à 20 pour cent le projet sera stoppé.
Raffinement
Le protocole en lui-même est un raffinement ; la sortie quotidienne vers la case de prélèvements est une forme de jeu qui est obtenu en 2 jours. Les porcs sont libres de leurs mouvements à tout moment et peuvent se retirer en cas d’inconfort (lors de la piqûre par exemple), le protocole est alors stoppé. Enfin ce protocole sera mené dans un dispositif biologique où les surfaces d’hébergement sont doublées par rapport à la réglementation élevage. Les animaux sont hébergés sur de larges litières de paille. Les surfaces d’élevage de 2,3 m² minimum par porc sont supérieures à celles exigées en expérimentation animale.Les porcs sont surveillés quotidiennement (enregistrement quotidien sur application dédiée selon les principes d'un bon environnement, d'une bonne alimentation, d'uen bonne santé et d'un bon comportement) et des mesures prises en amont sont prises en cas d'atteintes des points limites liés à la prise de sang.
Choix des espèces
Le projet vise à évaluer l’impact de l'entrainement medical chez le porc, cette espèce est donc requise pour le projet. Nous testerons sur les porcs en croissance, de 50 à 100 kg, il s’agit du stade où nous avons le plus de demandes de prélèvements.
Investigation de l’activité antibactérienne d’anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par Pseudomonas jusqu'au sepsis, les souris traversent quarante-huit heures que le porteur décrit comme les plus critiques en douleur et en mortalité, le modèle conduisant à la mort de l'animal en l'absence de traitement. 560 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de tester l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux contre une bactérie responsable de près de 10 % des infections nosocomiales et souvent résistante aux antibiotiques. Le porteur annonce une analgésie et une surveillance trois fois par jour pendant les deux premiers jours, sans préciser la dose bactérienne administrée, le nombre de groupes, ni le calcul qui aboutit à 560 souris, dont il écrit seulement que l'effectif "doit permettre de faire des analyses statistiques robustes".
Objectifs
Pseudomonas est une bactérie responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Les infections à pseudomonas sont en augmentation et sont généralement associées à des résistances aux antibiotiques. Elles représentent ainsi une réélle menace pour la santé publique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis (réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider l'activité antibactérienne des anticorps polyclonaux et de proposer une alternative thérapeutique dans un domaine ou le besoin médical est important. Ce projet pourrait aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre les infections bactériennes.
Procédures
Les traitements se feront par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une contention légère sera faite par du personnel qualifié sur les souris pour l'administration des traitements, afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Ces manipulations ainsi que les piqures ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé ici conduit à la mort de l’animal en l'absence de traitement. Il s'accompagne d'une l’inflammation locale et systémique, source de douleur et d’inconfort. Il est donc classé comme procédure sévère. Les premières 48 heures qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. A partir de 48h, l’état des souris s’améliore avec une chute des nuisances et de la mortalité.
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Si des tests in vitro permettent d'évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur potentiel thérapeutique dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.
Réduction
Le nombre d'animaux prend en compte le besoin de réduction (règle des 3R) et les contraintes statistiques liées au modèle et aux analyses qui seront réalisées. Le nombre d’individus par cohorte doit permettre de faire des analyses statistiques robustes.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 12 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la souffrance des animaux au cours du modèle. La douleur sera évitée par injection d'analgésiques en fonction des signes cliniques observés ou en euthanasiant les animaux. Les premières 48h qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. Une attention particulière sera donc apportée durant cette période avec une surveillance des souris 3 fois par jour. Cette surveillance pourra être renforcée avec augmentation de la fréquence des passages si besoin. Une analgésie sera aussi appliquée 3 fois par jour durant les 48 premières heures du modèle (la première injection sera réalisée 15 minutes avant le challenge bactérien). A partir de 48h environ, l’état des souris traitées doit s’améliorer. L'analgésie sera alors décidée en fonction de l'état des animaux en prenant en compte les éléments suivants: morphologie générale, poids, paupières, aspect des larmes, aspect de la zone urogénitale, apathie, comportement en groupe, activité de la respiration.
Choix des espèces
Le modèle de sepsis décrit dans ce projet a été validé et caractérisé dans des publications. Nous travaillerons avec des souris femelles (les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps).
Evaluation par imagerie IRM de la fonction cérébrale d’un modèle murin du syndrome Cornelia de Lange
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rendues haplo-insuffisantes pour le gène Nipbl, les souris de ce modèle reproduisent selon le porteur les symptômes du syndrome de Cornelia de Lange, dont des comportements auto-agressifs. 18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant trois semaines, à partir du sevrage, d'une molécule déjà en essai clinique en cancérologie, puis passent deux heures sous anesthésie gazeuse pour une imagerie cérébrale, à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme réduire le nombre d'animaux "au minimum permettant de répondre à la question scientifique" tout en reconnaissant l'absence de données préliminaires sur la taille d'effet attendue, et présente un éventuel effet du traitement comme la première piste thérapeutique pour des enfants qui n'en ont aucune.
Objectifs
Le syndrome de Cornelia de Lange est une maladie rare du développement qui affecte plus de 9000 enfants en Europe, 30 000 aux Etats Unis. Il s’agit d’un retard de développement de la croissance accompagné de défaut de formation du cerveau, du système auditif, du cœur et d’une partie du système digestif. la cause génétique de ce syndrome est une insuffisance du gène nommé Nipbl. Il en résulte des problèmes d'expression de nombreux gènes. Les enfants souffrant de ce syndrome sont de plus petite taille que la normale, marchent très tardivement , doivent subir des interventions chirurgicales réparatrices, ne parlent pas ou parfois très tardivement, et ont des comportements auto-agressifs. Il n’y a aucune piste thérapeutique à ce jour. Avec un modèle de souris haplo-insuffisant pour le gène Nipbl, qui récapitule les symptomes des patients, nous avons trouvé que le syndrome induisait un arrêt de la prolifération cellulaire embryonnaire prématurée. Des cellules sénescentes ( en arrêt de prolifération) ont été identifiées dans tous les organes au cours du développement y compris dans le cerveau des nouveaux nés. Le traitement des souris gestantes par une molécule en essai clinique en oncologie permet la naissance de souriceaux de taille normale sans malformation cardiaque sans cellule sénéscente y compris dans le cerveau. Notre projet va étudier si le traitement des souris au sevrage et au cours de la maturation du cerveau peut prevenir ou limiter la sénéscence dans le cerveau et les effets fonctionnels tels que l 'agressivité .
Bénéfices attendus
Un effet positif du traitement sur le fonctionnement neuronal serait un atout majeur et permettrait d’apporter pour la première fois une piste thérapeutique pour les patients qui n’en ont aucune jusqu ‘aujourdh’ui. ce projet ouvrirait les discussions avec les cliniciens qui s 'ocupent des enfants affectés par le syndrome afin d'évaluer l 'utilisation du médicament.
Procédures
Les souris seront traitées avec le médicament pendant 3 semaines par un gavage quotidien durant 15 secondes . Elles seront ensuite anesthésiées pour un examen d'imagerie cérébrale de 2 heures . elles seront mises à mort à la fin de l 'examen
Impact sur les animaux
La prise du médicament par gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiquée par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Examen clinique par IRM sous anesthésie gazeuse : la seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Les souris seront mise à mort à la fin du protocole d'imagerie pour collecter les cerveaux à des fins d'histologie
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de l’impact de la délétion de Nipbl sur le développement cérébral et l’éventuelle correction de ces anomalies par le traitement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par les organoides qui ne peuvent rendre compte du développement, de la maturation et du fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau. Il n’existe pas non plus de modèle informatique de la maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives d’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) et de Spectroscopie à Résonnance Magnétique (SRM). Ces méthodes avancées permettent de réaliser des explorations couvrant la totalité du cerveau et d’obtenir un grand nombre d’informations quantitatives dans le cadre d’un examen clinique sous anesthésie générale. Le caractère non invasif de l’exploration rend possible la réalisation d’examens répétées sans dommage pour l’animal. En l’absence de données préliminaires permettant de connaitre la "taille d'effet" attendue et compte-tenu de notre expérience en IRM préclinique, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Les animaux étant hébergé dans le même bâtiment que celui où sera réalisé l’imagerie, le délai d’acclimatation ne sera que de 2 à 3 jours, une habituation à l'expérimentateur sera assurée lors de l’arrivée des animaux. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitorage physiologique continu (t° rectale, respiration) avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure . Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.
Choix des espèces
la souris peut être facilement modifiée génétiquement. Notre modèle murin récapitule parfaitement le phenotype des patients. elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour une pathologie du développement . Les souris seront traitées post-sevrage (3 semaines) lors de la maturation du cerveau qui persiste jusque 3 mois chez les rongeurs.
Rôle potentiel de l’ajout d’une nouvelle source butyrate dans l’alimentation des truies pour améliorer les performances et la santé du porcelet
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Pour évaluer un additif alimentaire au butyrate destiné à la filière porcine, 672 cochons, 48 truies et leurs portées, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les truies subissent cinq prises de sang, quinze jours avant la mise bas, le jour de la mise bas, puis après sept, quatorze et vingt et un jours de lactation, et sont mises à jeun la veille des prélèvements couplés aux pesées. Les porcelets, sevrés à vingt et un jours, soit une semaine plus tôt que d'ordinaire, sont prélevés à la naissance, au sevrage et un mois après, le porteur reconnaissant que ce sevrage anticipé représente pour eux "un stress plus important". Aucun n'est tué dans le cadre de l'essai, tous restent vivants et poursuivent leur cycle dans un élevage de production, l'objectif annoncé étant d'améliorer les performances zootechniques et de réduire les traitements antibiotiques.
Objectifs
Il s'agit d'évaluer l’efficacité du butyrate sous forme lactique, produit apporté chez la truie en période de fin de gestation et lactation, sur les performances et la santé de sa descendance, de démontrer et de clarifier le mode d’action de ce produit sur le métabolisme et les paramètres endocrinologiques chez la truie, améliorant ainsi le niveau de production, la composition et/ou les apports énergétiques du colostrum et du lait. Des études précédentes sur des molécules de la même famille et effectuées sur différentes espèces (porcines, bovines et murines) ont montré des améliorations dans l’homéostasie glucidique (maintien du taux de glucose sanguin) ainsi que des changements endocrinologiques très intéressants chez les femelles en fin de gestation et pendant la lactation avec des retombées positives sur la descendance. Le butyrate permettrait un accroissement de la quantité de lait et de colostrum produits et une augmentation de leurs teneurs en nutriments et en immunoglobulines. Le butyrate est un acide gras à chaîne courte naturellement présent dans les huiles végétales et les graisses animales. Chez les mammifères, il est produit par le microbiote intestinal, sert de source d'énergie pour les cellules intestinales et agit probablement sur le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons démontrer des effets bénéfiques sur les portées de porcelets pendant les périodes de lactation et de post-sevrage (réduction des diarrhées liées au syndrome post-sevrage), sur la santé intestinale chez les truies et les porcelets (augmentation de la survie et de la performance des portées), sur l'usage de médicaments (réduction de traitement à base d’antibiotiques notamment en post-sevrage), sur la transition gestation/lactation et sur la reprise d’état des femelles après la mise bas.
Procédures
Les truies et les porcelets seront soumis à des prises de sang. Des prélèvements de sang seront effectués sur 48 truies, 15 jours avant mise-bas, le jour de la mise-bas, puis après 7, 14 et 21 jours de lactation. Des prélèvements de sang seront effectués sur 48 porcelets à la naissance, au sevrage et après un mois de post-sevrage. Pour les prises de sang et les pesées effectuées le même jour, les truies devront être mises à jeun la veille et pour les porcelets en fin d'étude à 49 jours uniquement. Les porcelets seront sevrés à 21 jours d'âge. La durée de post-sevrage est de 8 semaines.
Impact sur les animaux
En se basant sur les précédentes études in vivo et in vitro, aucun effet indésirable de l'additif n’est attendu. Ce sont les prises de sang qui présentent une source de douleur pour les animaux. Mais les prélèvements de sang seront réalisés par des personnes spécialisées de façon à ce que la durée de contention soit la plus réduite possible. Le sevrage anticipé d'une semaine dans le cadre de cet essai représente un stress plus important pour les porcelets. En revanche les opérations de prélèvements de colostrum et de lait, ainsi que la procédure de mise à jeun ne représentent pas de risque.
Devenir
Tous les animaux sont conservés vivants à l'issue de l'essai et poursuivront leur cycle classique d'un élevage de production.
Remplacement
Les alternatives alimentaires à l'usage des antibiotiques en élevage de porcs doivent être évaluées sur l'animal concerné et dans des conditions d'élevages conventionnelles. Pour que le potentiel du butyrate sur l'incidence des infections bactériennes chez le porcelet soit appréhendé, l'étude ne peut être menée que sur des truies et leurs portées.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude est réduit au minimum : 48 truies et leurs portées au total soient 16 truies et environ 208 porcelets par traitement alimentaire. Ces effectifs permettront de vérifier, grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés, l'intérêt d'incorporer le butyrate dans l'alimentation des truies sur le plan de leur production laitière et colostrale et par conséquent sur l'état de santé des porcelets. Le cas échéant, les mécanismes en jeu (endocrinologiques, immunitaires et/ou métaboliques) pourront alors être identifiés.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d'élevage adaptées à leur stade physiologique: surface par animal, température ambiante contrôlée, abreuvement à volonté, alimentation spécifique. Les porcs malades sont soignés, voire retirés de l'étude et isolés en infirmerie si nécessaire. Des précautions sont prises lors des prises de sang : utilisation de matériel adapté au gabarit des animaux, personnel spécialisé, rapidité de la prise de sang, suivi des animaux après prélèvement. Ils ont constamment accès à un abreuvement pendant toute la durée de l'étude. Les porcelets sevrés seront accueillis dans des salles préchauffées à 28°C. Un aliment spécifique au sevrage sera distribué pendant 3 semaines, puis sera remplacé par un aliment adapté à des animaux un peu plus lourds.
Choix des espèces
Il s'agit de mesurer des performances zootechniques (gain de croissance, efficacité alimentaire) sur des porcs en conditions d'élevages conventionnelles. Les truies recevront les régimes expérimentaux 2 semaines avant mise-bas puis pendant la phase de lactation. Elles seront donc suivies pendant 5 semaines, qui correspondent à la période de distrbution des aliments expérimentaux. Les porcelets recevront le même aliment quel que soit le régime de leur mère. Il sera adapté à leur stade physiologique et ne contiendra pas de butyrate. Leurs performances seront suivies en cours d'allaitement (3 semaines), puis en phase de post-sevrage (4 semaines). Tous les porcelets issus des 48 truies seront suivis en période d'allaitement et de post-sevrage.
Évaluation des effets thérapeutiques cardiaques d’un nouveau virus adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trente-deux souris sont cathétérisées jusque dans le cœur par la veine jugulaire, sous anesthésie générale, et ne sont pas réveillées. 126 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 94 d'entre elles et modéré pour 32. Baguées et biopsiées à trois semaines pour vérifier leur statut génétique, elles reçoivent une injection de virus adéno-associé à sept semaines, puis de trois à cinq électrocardiogrammes et un examen échographique, certaines jusqu'à l'âge de soixante semaines. Le porteur justifie la mise à mort systématique après cathétérisme par l'impossibilité de suturer la veine jugulaire, qu'il faut donc ligaturer, et par le risque que le cathéter lèse les valves cardiaques et provoque une insuffisance cardiaque droite.
Objectifs
L'objectif général du projet est d'évaluer les effets thérapeutiques d'un virus adéno-associé sur un modèle de souris présentant des troubles de la conduction de l'influx électrique cardiaque liés à une perte de fonction d'un gène impliqué dans cette conduction. Chez les humains, les mutations conduisant à une perte de fonction de ce gène sont à l'origine de pathologies génétiques responsables de morts subites (syndrome de Brugada et troubles de la conduction cardiaque) pour lesquelles il n'existe pas de thérapie préventive. Le virus adéno-associé a été montré, dans un modèle cellulaire, comme étant susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique. Les objectifs spécifiques du projet sont d'évaluer les effets du virus adéno-associé sur : 1. la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, à l'aide d'enregistrements de l'électrocardiogramme ; 2. la survenue d'arythmies ventriculaires ; 3. l'apparition de fibrose cardiaque secondaire à la perte de fonction du gène de la conduction au cours du vieillissement. Ces deux derniers objectifs ne seront réalisés que si le virus adéno-associé permet une amélioration de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du virus adéno-associé sont une amélioration significative, voire une restauration complète de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, et une disparition des arythmies ventriculaires et du remodelage fibrotique cardiaque.
Procédures
Trois semaines après la naissance, les souris seront baguées et biopsiées (afin de vérifier leur statut génétique) sous anesthésie générale. Dans une première étape du projet, 32 souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme à l'âge de 7 (durée de 3 min), 9 (3 min) puis 12 semaines (15 min), et un examen échocardiographique (15-20 min) à 12 semaines, réalisés sous anesthésie générale. En fonction des résultats obtenus dans la première étape, 32 autres souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines et 2 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7 puis 9 semaines, réalisés sous anesthésie générale, puis une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 20-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus dans l'étape 1, 20 souris supplémentaires seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 5 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7, 9, 30, 45 et 60 semaines et 1 examen échocardiographique (15-20 min) à 60 semaines, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme les patients, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction comme observé chez certains patients ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme observé chez d'autres patients. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. L'injection des virus adéno-associés sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale au point d'injection afin d'éviter stress et douleur. Les examens réalisés pour étudier les effets cardiaques des virus adéno-associés (enregistrement de l'électrocardiogramme et échographie) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ils seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire, qui sera prévenue par une anesthésie locale, comme cela est fait chez les patients. En ce qui concerne le virus adéno-associé, une étude antérieure a montré qu'il n'entraine pas d'effet indésirable chez des souris sauvages aux doses conduisant à un effet bénéfique dans le modèle cellulaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (effets du virus adéno-associé sur la fonction cardiaque), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens immunohistochimiques. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves cardiaques, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études biochimiques. A l'issue de la procédure 4 (effets à long terme du virus adéno-associé), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens histologiques.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée avec un modèle cellulaire, puis une étude in vivo chez la souris sauvage qui montrent que la surexpression du virus adéno-associé entraine une augmentation de l'expression du gène cible. Ces études sont à la base de ce projet réalisé sur un modèle pertinent pour la pathologie humaine. Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la fonction cardiaque : l'observation d'un effet bénéfique sur un modèle cellulaire est un pré-requis mais ne préjuge en rien de l'efficacité in vivo. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal vivant.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris traitées avec le virus adéno-associé présentent une amélioration significative de leur conduction cardiaque. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée avec le même logiciel.
Raffinement
Lors du sevrage, le prélèvement d'une biopsie pour déterminer le statut génétique des souris est réalisé sous anesthésie générale. Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié sous anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront injectées avec les virus adéno-associés à l'âge de 7 semaines, puis étudiées jusqu'à l'âge de 12 semaines dans la première étape, et de 60 semaines dans la seconde, parce que ces pathologies ne touchent que très rarement les enfants et les adolescents. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles dans des proportions comparables parce que les pathologies d'intérêt chez l'humain touchent tous les genres. L'injection du virus à l'âge de 7 semaines permet, d'une part, de réduire la quantité d'AAV9 injectée et, d'autre part, d'obtenir une expression optimale de l'AAV9 avant d'en étudier les effets cardiaques chez les jeunes souris adultes (9, puis 12 semaines). Si le traitement s'avère efficace sur la conduction de l'influx électrique cardiaque, l'étude réalisée à l'âge de 60 semaines permettra de déterminer ses effets à long terme sur l'apparition de fibrose cardiaque observé normalement chez ces souris.
Rôle du ganglioside A2B5 dans la réponse immunitaire dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
La mise à mort est déclenchée dès qu'une souris perd 20 % de son poids, convulse, se paralyse, se prostre ou n'arrive plus à se déplacer. 68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome au cours d'une intervention chirurgicale d'environ trente minutes, et la tumeur provoque ensuite une perte d'appétit, une malnutrition puis une perte de poids, le porteur ne qualifiant de "douleur légère de courte durée" que les injections. Il vise à comprendre le rôle d'une molécule, A2B5, dans la réponse immunitaire, ce qui "permettrait" selon lui de nouvelles thérapies contre une tumeur cérébrale aujourd'hui sans traitement curatif.
Objectifs
A2B5 est une molécule exprimée par les cellules tumorales de glioblastome (tumeur cérébrale). L'objectif est d’analyser le rôle de la molécule A2B5 dans la réponse immunitaire. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de A2B5 dans l'activation du système immunitaire et dans le développement de la tumeur.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale est une pathologie fatale (médiane de survie de 1 an) et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension du rôle joué par la molécule A2B5 (exprimé par la tumeur) dans les mécanismes immunitaires permettrait la mise en place de nouvelles thérapies pour les patients atteints de glioblastome.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales de glioblastome (68 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques pour la réalisation de la craniotomie sont générateurs de stress pour les animaux. Par ailleurs les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
L'ensemble des souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une analyse du système immunitaire et de l'évolution tumorale, ce qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques immunitaires et tumoraux nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, convulsions, paralysie, prostration, difficulté à se déplacer). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales et à l'immunité tumorale. Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal précis sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Inflammation pulmonaire et altérations cardiovasculaires dans un modèle de Bronchopneumpathie Obstructive Chronique (BPCO)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 198 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun subit la totalité des gestes du protocole. Sur animal éveillé, ils passent quinze minutes en pléthysmographie, quinze minutes d'épreuve d'effort sur tapis, quinze minutes de mesure de pression artérielle à la queue, et une prise de sang deux jours après une infection pulmonaire simulée. Sous anesthésie, un emphysème leur est induit, leur fonction cardiaque est mesurée par échographie et une sonde relève la pression transœsophagienne. Comme effets attendus, le porteur ne décrit pourtant qu'une "difficulté respiratoire modérée à l'exercice", une réduction de l'activité physique et un stress lié aux manipulations sur animal éveillé.
Objectifs
Les changements rapides dans notre environnement peuvent perturber l'équilibre délicat de nos poumons, entraînant des problèmes de santé tels que l'asthme et la Bronchopneumopathie Obstructive chronique (BPCO), une maladie pulmonaire chronique. Les substances que nous respirons peuvent également affecter d'autres parties de notre corps, comme le cœur, les vaisseaux sanguins, le cerveau, les muscles et les reins. Les infections virales ou bactériennes peuvent aggraver la BPCO, et des problèmes cardiaques sont fréquents chez les personnes atteintes de BPCO ou d'emphysème qui est une maladie qui entraine la destruction des alvéoles des poumons. Cela rend la respiration difficile, car les poumons ont du mal à se remplir d'air et à expulser le dioxyde de carbone. Comprendre comment cette maladie se développe ou s'aggrave est complexe, et nous ne comprenons pas encore complètement comment ils progressent dans le temps. Pour mieux comprendre comment les problèmes cardiaques se développent chez les personnes atteintes de BPCO, nous avons créé un modèle chez le rat qui imite cette maladie. Notre objectif est d'étudier comment la taille de l'emphysème affecte le cœur et les vaisseaux sanguins chez les rats, et comment l'inflammation et le vieillissement contribuent aux problèmes respiratoires et cardiaques après une infection pulmonaire. Nous allons également tester différentes approches pour réduire les impacts sur le système cardiaque chez les personnes atteintes de BPCO.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette recherche seront principalement de comprendre et d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents des répercussions cardiaques de l'emphysème. En analysant les composantes de l'inflammation et du vieillissement, nous visons à élucider les intrications complexes entre ces processus, offrant ainsi des perspectives plus approfondies sur les facteurs qui contribuent aux dysfonctionnements cardiaques observés dans le contexte de la BPCO. De plus, en éclaircissant les liens entre l'inflammation, le vieillissement et la pathologie cardiaque, cette recherche pourrait contribuer à la découverte de biomarqueurs potentiels et à la mise en évidence de voies thérapeutiques ciblées.
Procédures
La totalité des animaux seront soumis aux mêmes gestes techniques suivants: sur animal éveillé la pléthysmographie/fonction respiratoire (15 minutes par animal), tapis métabolique/épreuve d'effort (15 minutes par animal), mesure non invasive de la pression artérielle à la queue (15 minutes par animal), prélèvement sanguin de 0,1 mL sera effectué à la queue deux jours après avoir mimé une infection pulmonaire (environ 1 minute par animal). L'animal sera anesthésié pour induire l'emphysème (10 minutes au total), analyser la fonction cardiaque par échographie (environ 15 minutes par animal) et enfin mesurer la pression transœsophagienne (environ 15 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle. Les animaux peuvent présenter les symptômes classiques de l'emphysème pulmonaire chez l'homme, tels qu'une difficulté respiratoire modérée à l'exercice et une réduction de l'activité physique. De plus, un stress lié aux manipulations non invasives sur animal éveillé peut exister chez l'ensemble des animaux (prise de la pression artérielle, prise de sang et épreuve d'effort).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre des prélèvements d'organes. L'objectif principal de cette euthanasie est de réaliser une exploration histologique approfondie, mettant particulièrement l'accent sur des organes tels que le cœur et les poumons. Ce processus est essentiel pour une compréhension détaillée des éventuelles altérations histopathologiques et pour valider les atteintes pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode en laboratoire capable de reproduire les conditions exactes rencontrées chez les personnes atteintes d'emphysème ou de BPCO. Pour mieux comprendre ces maladies et leurs mécanismes, des expériences sur des rats sont nécessaires. Cela nous permet d'étudier les processus inflammatoires qui se produisent dans les poumons lors de la BPCO. Ces expériences sont difficiles à réaliser chez les humains, et il n'existe pas de modèle cellulaire qui puisse reproduire parfaitement la maladie.
Réduction
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle, ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats, en utilisant les données publiées de notre équipe de laboratoire pour une procédure similaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés grâce à une approche rationnelle et organisée des protocoles : des études échographiques, hémodynamiques et biologiques sont réalisées sur le même rat, ce qui permet de diminuer le nombre de rats et d'optimiser les interprétations. De plus, à la fin du protocole, les animaux sont utilisés par plusieurs groupes de recherche de l'équipe pour étudier les fonctions pulmonaires, cardiaques, vasculaires et musculaires. Afin de réduire le nombre d'animaux et d'augmenter la puissance statistique, un maximum de déterminations seront réalisées sur tous les animaux. Le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole (22 animaux par groupe, soit un total de 352 animaux) a été calculé afin d'obtenir des résultats significatifs grâce à des outils statistiques.
Raffinement
Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés de manière appropriée, avec un enrichissement du milieu permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés de près et les points limites établis seront appliqués. Nous évaluerons les critères de souffrance animale (rythme cardio-respiratoire, reprise de mouvement, état de prostration, hydratation) ; en cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par injection létale d'anesthésique. Chaque jour, les animaux seront contrôlés par un zootechnicien formé lors de sa visite de zone.
Choix des espèces
Le modèle de rat est largement caractérisé sur le plan cardiovasculaire, avec un nombre important de travaux décrits dans la littérature quant à sa faisabilité. La physiologie cardiaque des rongeurs et notamment du rat présente de grandes similitudes avec celle de l’homme, tant au niveau des régulations que de la structure morpho-fonctionnelle. Le modèle rongeur présente l’avantage de permettre des investigations depuis l'échelle cellulaire et moléculaire jusqu'aux mesures sur l'animal en laboratoire, en utilisant les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les études sont réalisées sur des animaux adultes mâles âgés de 8 semaines, ainsi que sur des mâles âgés de 18 mois, afin d'étudier l'effet du vieillissement.
Evaluation in vivo de l’action antitumorale d’une surexpression de GPER sur la croissance et la réponse au traitement standard des glioblastomes dans un modèle de greffe orthotopique de glioblastome humain chez la souris immunodéprimée. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
Une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, au moins dix séances d'imagerie sous anesthésie, dix séances de radiothérapie, douze administrations du composé testé et un test d'éviction d'obstacle trois fois par semaine : 164 souris immunodéprimées vont subir ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale implantée provoque des effets délétères que le porteur qualifie lui-même de non réversibles, et la répétition des anesthésies peut entraîner une accoutumance obligeant à augmenter les doses administrées. L'objet du projet est de vérifier si l'augmentation d'une protéine, combinée à son activation par une molécule, ralentit la croissance tumorale et améliore la réponse aux traitements standards, les retombées annoncées pour les patientes et les patients restant renvoyées au conditionnel. 116 souris sont tuées dès l'atteinte d'un point limite, et 48 autres, dites "satellites", plus tôt encore, à la fin du schéma de traitement, pour analyser leurs tissus.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).
Procédures
- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).
Choix des espèces
Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
Effet de la modulation du microbiote intestinal par antibiothérapie sur les cellules entéroendocrines de souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.
Objectifs
Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.
Bénéfices attendus
Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.
Procédures
Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.
Impact sur les animaux
Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques
Remplacement
L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.
Contrôle de la régression tumorale à long terme par les cellules humaines CAR-VST anti-CD19
- Recherche appliquée
- Cancers
Aucune souris n'est gardée plus de vingt-huit jours après l'injection des cellules leucémiques, ni au-delà du point limite si elle l'atteint avant. 32 souris NSG, dépourvues de système immunitaire, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent la leucémie dans la veine de la queue, puis un traitement cellulaire une semaine plus tard, trois prises de sang caudales et des séances d'imagerie sous anesthésie après injection d'un produit dans le ventre. Le porteur décrit la maladie qu'il leur donne, poils hérissés, baisse d'activité, perte de poids et parfois début de paralysie des pattes arrière, pour comparer deux thérapies cellulaires dont l'une pourrait, à terme, persister plus longtemps chez les patients.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse appelée CAR-T cells, est produite à partir des cellules du patient. Ces cellules sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses, ce qui permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells et montrer premièrement qu’elles sont aussi efficaces que le traitement actuel.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique et s’il est comparable au traitement de référence par CAR-T cells. Nous souhaitons voir un effet comparable dans cette expérimentation et valider l’acquisition de cette fonctionnalité anti-tumorale. Puis, dans une prochaine saisine, nous souhaiterions montrer que nos cellules persistent plus longuement dans un modèle de leucémie.
Procédures
-Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J0 (1min) -Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) -Un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J14, J21 et J28 (1min) Imagerie des souris par signal lumineux des cellules tumorales : -contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, -pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (30min max)
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, avec contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
Nous utilisons un nombre de souris permettant de générer des résultats fiables et de sécuriser la mise en œuvre si des souris sont à exclure de l’étude du fait de la complexité des gestes techniques. Un effectif de 3 souris par groupe est suffisant selon la simulation d’un outil statistique (G-Power), mais nous souhaitons ajouter 2 souris supplémentaires dans les groupes traités, afin d’avoir une meilleure représentativité des échantillons et pouvoir mieux les caractériser. Nous aurons besoin de 16 souris pour cette saisine. Si les résultats ne sont pas probants, nous souhaitons répéter cette expérience une seconde fois. Cette saisine comprendra 32 souris au maximum.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.