Recherche appliquée

Une vingtaine de minutes pour aspirer le gel qui remplit l'œil et le remplacer par un substitut, puis des examens oculaires deux fois par semaine pendant une durée qui peut atteindre six mois : 1 155 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le composé à tester leur est administré dans le vitré ou sous la rétine au cours de l'opération, et le suivi comprend lampe à fente, mesure de la pression intraoculaire, électrorétinographie sous anesthésie générale et angiographie après injection de fluorescéine. Le porteur range parmi les effets possibles des inflammations oculaires et des décollements de rétine qu'il décrit comme indolores mais susceptibles d'atteindre la vision, et prévoit un hébergement individuel jusqu'à six mois quand la mesure des consommations l'exige. Tous les lapins sont tués à l'issue pour analyse des tissus, dans un projet qui sert aussi de support de formation professionnelle et alimente des dossiers d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Le but du projet est d'adopter une technique de vitrectomie chez le lapin afin de tester des dispositifs médicaux à injecter sous la rétine ou de tester des substituts de vitré. Le vitré est le gel aqueux normalement transparent qui remplit l'œil et qui se situe entre le cristallin et la rétine. La vitrectomie est l'ablation du vitré par un appareil adapté, le vitréotome qui aspire le vitré. La vitrectomie permet d'avoir un accès direct à la rétine, elle est nécessaire dans le traitement de certaines maladies de la rétine, comme des hémorragies vitréennes, des décollements de rétine, ou des traumatismes oculaires. Le vitré est remplacé par un gaz, un liquide physiologique ou de l'huile de silicone selon le cas à traiter. L'intérêt d'avoir un accès direct à la rétine est de pouvoir administrer près de la cible, des traitements potentiels dans les pathologies de la rétine.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer la toxicité locale et la pharmacocinétique de molécules qui deviendront potentiellement des médicaments ciblant les affections de la rétine.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet auront une vitrectomie : chirurgie qui consiste à remplacer le vitré par un substitut physiologie, cette opération dure une vingtaine de minutes sous anesthésie générale. Au cours de cette opération sera administré le composé à tester soit directement dans le vitré soit sous la rétine. Puis une série d'examen sera pratiquée : observation en lampe à fente, mesure de la pression intra oculaire pour suivre les éventuelles complications ou effets indésirables. Ces examens se font sur animal vigiles, 2 fois par semaine, ils ne durent que quelques secondes ou minutes. Selon le type d'appareil utilisé la mesure de la pression intra oculaire peut nécessiter une anesthésie locale de la cornée. D'autres types d'examens nécessitent un immobilisme complet de l'animal comme l'électrorétinographie et se feront sous anesthésie générale. Selon le produit testé il est possible de devoir suivre son effet sur les vaisseaux de rétine, pour cela une angiographie, après injection de fluorescéine sera réalisée. Cet examen peut s'effectuer sur lapins vigiles ou anesthésiés car il n'est pas invasif, sans contact avec l'animal qui est placé devant une caméra. Ces types d'examens se font une fois par semaine. La durée de l'étude peut varier de 1 semaine à 6 mois. Pour une étude longue la fréquence des examens nécessitant une anesthésie ou l'injection de fluorescéine sera réduite à une fois toutes le 2 semaines. En première intention les lapins seront hébergés en binôme mais s'il existe un risque de contanination lors d'un test de traitement entre deux animaux invalidant l'interpretation des résultats ou si la consommation en nourriture et en eau doit être mesurée individuellement, les lapins seront hébergés individuellement sans restriction de la taille des cages et en maintenant un contact olfactif, visuel et auditif entre les congénères sur toute la durée de l'étude soit maximum 6 mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles, à la suite de la vitrectomie avec ou sans administration de produit sont des irritations ou des inflammations des tissus oculaires des rougeurs conjonctivales et potentiellement des décollements de rétine qui sont indolores mais qui peuvent impacter la vision. Malgré le soin et la vigilance apportés à la manipulation des animaux, un stress est toujours possible au moment de leur manipulation lors des observations, de l’administration de l’anesthésie ou des traitements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif. Les études qui font l'objet de ce projet, toxicité locale et pharmacocinétique du produit, font partie des étapes de développement d'un médicament, elles sont requises dans les dossiers de demande d'autorisation de mise sur le marché de médicament qui réclame des études réalisées in vivo chez des mammifères avant de pouvoir tester la molécule chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Ce nombre est adapté des informations recueillies dans la bibliographie. Les résultats des mesures seront analysés par des tests de comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à un groupe témoin non traité. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives des structures internes de l'œil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. Dans la mesure du possible nous proposons de coupler les études de toxicité locale et de pharmacocinétique pour un même produit de manière à diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les lapins seront placés préférentiellement par deux si les conditions expérimentales le permettent dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture rationnée et enrichissement. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de méthode alternative. De nombreuses études sur la pression intraoculaire sont réalisées chez le lapin en raison des similitudes avec l'œil humain (taille de l'œil, structures) permettant de recueillir des résultats extrapolables à l'humain et de tester des traitements ou des dispositifs médicaux directement transposables chez l'homme. Nous avons donc choisi cette espèce pour mener à bien le projet. Les lapins sont de jeunes adultes et ont minimum 8 -12 semaines, âge minimum pour la maturation de l'œil.

Mis au régime gras avec leur mère, ou injectés d'un vecteur viral dans la veine jugulaire au premier jour de vie sans anesthésie, des ratons passent ensuite des échographies du cœur sous anesthésie, des ECG éveillés et, pour une partie, des gavages de glucose et sept prises de sang au bout de la queue en deux heures à chaque test. 1 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude cherche comment le déséquilibre métabolique de la mère altère le développement du cœur des petits. Le porteur décrit des actes "très rapides et peu douloureux", et signale par ailleurs que le vecteur viral peut provoquer une insuffisance cardiaque, que des mères rejettent ou mutilent les ratons manipulés et que certains rats meurent sous anesthésie sans pouvoir être réanimés malgré l'intubation.

Objectifs

L'obésité est un problème majeur de santé publique et sa prévalence croissante contribue à augmenter l’incidence de maladies cardiovasculaires. L'épidémie de surpoids touche les femmes enceintes et des études épidémiologiques rapportent que les enfants nés de mères obèses présentent un risque accru de cardiopathies congénitales et, à l’âge adulte, des taux plus élevés d'événements cardiovasculaires et de mortalité. Cependant, il existe une véritable lacune dans nos connaissances sur l’origine des mécanismes moléculaires conduisant au développement de ces pathologies cardiaques.Notre objectif est d’établir l’impact du dysmétabolisme périnatal sur le développement de l’insuffisance cardiaque d’origine congénitale. Nous proposons une étude longitudinale sur la descendance pour caractériser la chronologie des altérations cardiaques et les défauts d’organisation postnataux des cardiomyocytes. Nous étudierons les voies (moléculaires, métaboliques) impactées (précocement ou plus tardivement) par le dysmétabolisme maternel pouvant expliquer les altérations développementales du cœur et, pour in fine, identifier des signature spécifiques et biomarqueurs potentiels

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhension du développement des cardiomyocytes et l'impact des pathologies métaboliques sur l'organisation des domaines membranaires en eux-mêmes permettrons de cibler le rôle de protéines d'intérêt identifiées au laboratoire dans la survenue de pathologie structurales et électriques. Ces avancées seront amenées à permettre de développer des cibles thérapeutiques dans le traitement de différentes arythmies et cardiomyopthies.

Procédures

Une partie des animaux seront mis sous régime riche en graisse, 4 mois pour les génitrices (2 mois avant la reproduction et pendant la durée de reproduction et lactation). Les géniteurs seront sous régime riche en gras uniquement pour la reproduction. Les petits seront sous le régime maternel correspondant (riche en gras ou contrôle) jusqu’au sevrage (20 jours de vie). Afin de valider le modèle de rat obésogénique, des mesures métaboliques seront réalisées sur animaux vigiles. Le gavage de glucose, procédure très rapide (quelques secondes) sera réalisé à deux stades : 20 et 60 jours de vie pour tester la tolérance au glucose. Le test de tolérance à l'insuline sera réalisé par injection intrapéritonéale aux 2 stades (20 et 60 jours de vie). Le prélèvement d'une goutte de sang à la queue (quelques secondes) est effectué sur les animaux vigiles et permet de mesurer l'évolution de la glycémie. Cet acte sera répété 7 fois en 2 heures pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le phénotypage cardiaque sera réalisé par échocardiographie (15 minutes), sous anesthésie gazeuse légère, pour d'obtenir de nombreux paramètres morphométriques et hémodynamiques. Les mesures seront effectuées aux 2 temps, 20 et 60 jours de vie (soit 2 fois pour chaque animal). L’électrocardiogramme (ECG) de surface sera réalisé aux mêmes temps à 20 et 60 jours de vie : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie (animaux vigiles) et sera réalisée dans la foule de l'échographie pour réduire le nombre d'interventions. Les animaux sont placés dans un tunnel en plexiglas aéré, les quatre pattes positionnées sur des plaques métalliques permettant de suivre le rythme cardiaque. Une seconde partie des animaux vigiles seront soumis à une injection de virus (AAV) par voie systémique à 1jour de vie (veine jugulaire facilement visible à ce stade). L'intervention est très rapide (quelques secondes). Ils seront phénotypes par ECG de surface et échographie, aux 2 stades (20 et 60 jours de vie). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage. L'injection du vecteur viral peut engendrer dans les semaines qui suivent une insuffisance cardiaque, en particulier lors du stress des manipulations. Les injections au stade nouveau-né et donc la manipulation des ratons par un tiers peut engendrer le refus de la mère de reprendre le petit dans la portée, tout comme des cas de mutilations. Il arrive également que des animaux ne supportent pas l'anésthésie lors des échocardiographies et ne peuvent être réanimés, et ce malgré l'intubation. Les tests métaboliques peuvent induire : une sensation de faim lors de la mise à jeun des animaux, une irritation de l'oesophage lors des administrations per os, une légère douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales et des prélèvements de sang. Les prélèvements peuvent induire également une irritation de la queue de l'animal.

Devenir

A l'issue de cette étude, tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l'importance de l'organisation fonctionnelle du cardiomyocyte sur la fonction cardiaque, et en quoi un régime riche en graisse peu directement l'impacter. Comme nous travaillons à l'échelle de l'organisme, il est nécessaire d'utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, certaines études seront réalisées in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude (n=1350) est déterminé à la suite des études antérieures, relativement similaires dans la forme. Les paramètres échocardiographiques et métaboliques seront étudiés sur les mêmes lots d'animaux afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à cette stratégie expérimentale. La taille de nos groupes expérimentaux est également déterminante au regard de la puissance statistique nécessaire à la réalisation de comparaisons entre groupes. Ceux-ci requièrent un minimum de 20 animaux par groupes pour être relativements fiables et robustes.

Raffinement

Les rates arrivent à l'animalerie et sont soumises à un temps d'acclimatation de 7 jours avant le début du régime. Les rats servants à la reproduction sont soumis au même temps d'acclimatation avant le début de la reproduction. Afin de prévenir le risque de rejet et mutilation par la mère après manipulation par l'expérimentateur, la contention des ratons est réalisée avec des gants préalablement frottés contre la litière de la cage au moment de l'injection. Les portées sont à une par cage, et ce jusqu'au moment du sevrage, c'est à dire 3 semaines après la naissance. Les rats sont ensuite séparés par sexe et laissés 2 par cage lorsqu'ils ont atteint l'âge adulte. Les cages sont agrémentées avec du matériel d'enrichissement (jouets cartonnés, bâton de bois, sciure de bois, ouate). Les animaux sont surveillés tous les jours par le personnel compétent de l'animalerie. Lors des enregistrements par échographie, les animaux reçoivent une anesthésie gazeuse légère pour les maintenir immobiles. Les animaux se réveillent dès l'arrêt de l'anesthésie. La surveillance par les techniciens de l'animalerie est accrue pendant une semaine après anesthésie. Toutes les évaluations de fonction et prélèvements réalisés (prélèvement de sang) sont très rapides et peu douloureux. Un analgésique est administré en cas de douleur. Les points limites sont différents en fonction de l'âge du rat: - Avant sevrage: mise à l'écart du reste de la portée, refus de la rate d'alimenter le petit donc perte de poids, déshydratation, prostré dans un coin de la cage, mutilation. - Après sevrage: poil hirsute, pelade, comportement inhabituel.

Choix des espèces

Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études. Il permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. Comme nous n'utilisons pas la technologie des transgènes, nous pouvons nous permettre un modèle rat, chez qui les études écho-cardiographiques sont plus simples. Par ailleurs, l'isolement de cardiomyocytes nécessaire aux études d'électrophysiologie est le plus fiable et mis au point chez le rat. Les stades de développement utilisés pour notre étude sont nécessaires : - Afin d'étudier la mise en place des domaines membranaires du cardiomyocyte, qui se fait en postnatal (d'où les stades 5, 20 et 60 jours de vie). - Afin d'étudier le rôle de la protéine d’intérêt sur le développement myocardique (d'où l'injection à 1 jour postnatal). Les rats sont utilisés dès le premier jour après la naissance, et euthanasiés à 2 mois post injection. Ce stade correspond au stade suffisant du développement du remodelage cardiaque. C'est également le stade de maturité totale du myocarde.

74 464 rongeurs, 59 624 rats et 14 840 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par voie orale chaque jour, les femelles subissent des lavages vaginaux avant accouplement, et les petits nés dans les études sont soumis à des tests de développement physique, sexuel et neurologique, à des examens ophtalmologiques, à des mesures du tibia et de la distance ano-génitale ainsi qu'à des prélèvements de sang et d'urine. Les effets attendus portent sur toutes les étapes de la reproduction : accouplement, nidation, gestation, mise bas, lactation, comportement maternel et développement des descendants. Le porteur présente ces essais comme "indispensables" dans un dossier de mise sur le marché et "nécessaires règlementairement", et note qu'aucun modèle in vitro ne couvre l'ensemble de la fonction de reproduction.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché d’un médicament ou d'enregistrement d'un produit chimique et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).

Bénéfices attendus

A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.

Procédures

Les animaux sont traités, le plus souvent par voie orale de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits issus des portées pourront être soumis à des tests non invasifs de suivi de développement physique, sexuel ou de maturité sexuelle et neurologiques/comportementaux, ainsi qu’à des observations ophtalmologiques. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur et pourront faire l’objet d’une mise à jeun préalable .

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets pharmacologiques du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. De l’inconfort et du stress liés aux procédures elles-mêmes (contention, administration, sédation/anesthésie, l’hébergement individuel (quand nécessaire), observations et mesures (lavages vaginaux, examens ophtalmologiques, mesure de la taille du tibia ou de la distance ano-génitale, tests de suivi de développement ou de maturité sexuel(le), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques) et/ou prélèvements) et des effets systémiques liés au produit administré (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont actuellement pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e) : poids corporel, évaluation de la consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée, revue par un vétérinaire (le cas échéant) et si un ou plusieurs points limites sont atteints, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Les rongeurs sont hébergés en groupe la plupart du temps à l’exception de certaines situations expérimentales ou sanitaires exigeant l’hébergement individuel.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces de choix, le rat étant celle qui est la plus fréquemment utilisée. En effet: - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits issus des portées, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance). Dans d’autres études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement et selon les lignes directrices/recommandations règlementaires) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).

Chaque souris subit, sous anesthésie, une incision de la peau et des tissus au-dessus de la trachée, puis une injection d'une molécule qui déclenche une fibrose pulmonaire, la plaie étant refermée par un ou deux points de suture. 480 souris, dont des porteuses d'une inactivation d'une copie du gène Parn, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique un risque de mortalité lié à la fibrose du septième au quatorzième jour après l'injection, une gêne respiratoire et une perte de poids possibles, atteintes qu'il déclare pourtant en souffrance modérée. Toutes sont tuées pour prélever les poumons, après un lavage bronchoalvéolaire par cathéter introduit dans la trachée.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie pulmonaire fréquente et grave. Environ 10% des cas de FPI sont associés à des cas familiaux. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucun traitement permettant de guérir cette maladie n’est disponible pour les patients. La FPI résulte d'un dysfonctionnement de cellules pulmonaires : les pneumocytes de type 2 (P2), qui résulte notamment d’expositions environnementales, et d’anomalies génétiques favorisantes, le vieillissement constituant un facteur favorisant majeur. On détecte dans près de 30% des formes familiales une lésion génétique pathogène (délétère) sur un gène contrôlant la stabilité de l'extrémité des chromosomes. Parmi celles-ci, les anomalies dans le gène « poly(A)-specific ribonuclease » (PARN) sont parmi les anomalies les plus fréquemment rencontrées. Les phénomènes biologiques reliant ces anomalies génétiques de PARN et le développement de la fibrose demeurent inconnus. Les modèles de souris de fibrose pulmonaire sont la référence actuelle pour l’étude de la physiopathologie (mécanismes à l'origine d'une maladie) de la fibrogenèse (formation de la fibrose) pulmonaire. Le développement d’un modèle sur la souris de fibrose pulmonaire associée au défaut génétique de Parn est justifié par i) l’accès très limité aux prélèvements pulmonaires de patients atteints de ce défaut génétique ; ii) les limites de l’utilisation de modèle in vitro (culture cellulaire) pour l’étude de la fibrogenèse pulmonaire. L’objectif de ce travail est de caractériser l’impact du défaut génétique de Parn sur la fibrogenèse pulmonaire.

Bénéfices attendus

La fibrose pulmonaire idiopathique est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques. Cette étude a pour objectif d’étudier le rôle du défaut autosomique dominant (la transmission d'une copie du gène muté est suffisante pour transmettre la maladie) de Parn dans des modèles sur la souris de fibrose pulmonaire. Atteindre cet objectif exige l’étude du rôle de Parn dans un organisme animal vivant respectant la complexité de la biologie pulmonaire qui implique de nombreux types cellulaires et médiateurs. Cette étude, réalisée d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins, assurera une meilleure connaissance de la physiopathologie de la fibrogenèse pulmonaire chez l’Homme. Ceci est un préalable indispensable au développement de nouvelles thérapies ciblées et curatives pour nos patients.

Procédures

Nous utilisons dans ce projet des souris contrôles, des souris transgéniques avec un défaut génétique inactivant l'une des deux copies du gène Parn. En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à des temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi qu'un lavage bronchoalvéolaire (une petite incision au niveau de la trachée est réalisée pour permettre de placer un cathéter souple, une injection unique de sérum Physiologique est effectuée délicatement, et ré-aspirée) et le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Dans les modèles de fibrose induite par deux molécules différentes, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après injection. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose . Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice, suite à l’intervention chirurgicale au niveau de la trachée, est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes cellulaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules issues d’autres tissus/organes via la circulation sanguine notamment. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères, des conférences en pneumologie/immunologie et une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2000-2023. Il faut noter que des méthodes alternatives comme les organoïdes (culture cellulaire en laboratoire) sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ce modèle n’intègre qu’un nombre restreint de sous-types cellulaires pulmonaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement des cellules extrapulmonaires (c'est à dire l'arrivée de cellules non pulmonaires dans le poumon).

Réduction

Le nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures expérimentales. Des antalgiques seront donnés en pré et post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton et d’un tunnel de change dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiée par dislocation cervicale. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins trois fois par semaine par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie, posture de repli, détresse respiratoire, hypothermie...), la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose pulmonaire humaine. Les souris offrent également la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et d’étudier spécifiquement le rôle d’un gène donné dans le poumon. Enfin, le modèle murin permet la mise en place de modèles pré-cliniques incontournable pour le développement précoce de thérapies innovantes. Actuellement, pour la fibrose pulmonaire, il n’existe pas de stratégie alternative pour modéliser la réponse d’un organe dans le contexte d’un organisme entier. La souris est donc un animal incontournable pour apporter des réponses à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 7 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

Porteurs d'une mutation qui les prive de dystrophine, 330 rats voient leurs muscles dégénérer et, passé dix mois, développent pour environ un sur cinq une tumeur musculaire, le plus souvent au muscle de la mâchoire. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le protocole se limite à les laisser vieillir et à les palper chaque semaine sur tout le corps pour détecter la masse, l'animal étant tué au plus tard quinze jours après la découverte, pour prélever la tumeur. Le porteur signale que ces rats perdent la mobilité au point de ne plus pouvoir se toiletter, et qu'il les loge avec des rats sains qui s'en chargent, avant de conclure qu'ils sont "irremplaçables" pour ce travail.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l’absence d’une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d’insuffisance cardio-respiratoire. Dans des modèles animaux de DMD, notamment chez les rats, des complications sont observées de façon précoce lors de leur vieillissement. En effet, à partir de 10 mois, les rats DMD peuvent développer de manière spontanée une tumeur musculaire, pouvant se retrouver au niveau de tous les muscles squelettiques mais majoritairement au niveau du muscle masséter permettant de fermer la mâchoire. Suivant la localisation, les conséquences à l’échelle de l’organisme varient et peuvent impacter différentes fonctions comme la prise de nourriture, la locomotion et le toilettage. Le but de ce projet est donc de déterminer globalement les différents signes cliniques tardifs chez les animaux DMD, incluant le développement de tumeurs musculaires et de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l'apparition de ces tumeurs.

Bénéfices attendus

Le but du projet est de caractériser au mieux la DMD et son histoire naturelle en vue de proposer des traitements innovants permettant de contrer les mécanismes pathogéniques. Comprendre les possibles comorbidités en vue de les traiter dans un contexte de réparation musculaire est donc un étape essentielle. À court terme, il est attendu une amélioration du suivi et de la prise en charge des comorbidités associées à l’évolution tardive de la maladie. À moyen terme, il s’agira de mieux investiguer le rôle de suppresseur de tumeurs de la dystrophine – et de ses variants de forme (longeur variable de la protéine) - pour, à long terme, aboutir à des tests de stratégies thérapeutiques ciblant de façon spécifique ou en parallèle les tumeurs musculaires dans les modèles animaux dystrophiques. Il est en effet crucial d’identifier la signalisation moléculaire conduisant au développement de ces tumeurs musculaires chez le rat et d’inclure ces connaissances dans le design des solutions thérapeutiques pour qu’elles visent d’emblée à traiter le syndrome dystrophique dans son ensemble, au-delà de la seule récupération fonctionnelle cardio-respiratoire et locomotrice.

Procédures

Pour la procédure décrite dans la présente saisine, les animaux ne subiront aucune intervention particulière à part une manipulation régulière par les zootechniciens pour leur suivi clinique. S’ils présentent une masse tumorale, elle sera prélevée au moment de leur mise à mort en accord avec la grille de score et au plus tard 15 jours après la détection de la tumeur.

Impact sur les animaux

Jusqu’à l’âge de 10 mois, il n'a été constaté aucune entrave à une qualité de vie globalement compatible avec une vie en cage autonome pour les animaux DMD. Au-delà de 10 mois en revanche, un suivi individuel s’impose. Dans cette étude, les animaux seront plus âgés que 10 mois et auront atteint un stade sévère de la pathologie qui s’accompagne d’un développement spontané de tumeurs pouvant toucher les muscles squelettiques. Un personnel compétent pratiquera alors de façon hebdomadaire un suivi individualisé et complet des animaux en plus du suivi classique dispensé par une zootechnicienne. Les animaux seront donc palpés manuellement sur l’ensemble de leur corps afin de détecter une éventuelle masse tumorale. La locomotion des animaux sera également observée afin de détecter un possible déficit engendré par une tumeur sur les muscles mobilisant les articulations des membres postérieurs. L’impact de la masse tumorale dépend de sa localisation (locomotion, prise alimentaire, toilettage, …). Une perte de mobilité générale est observée lors de la phase sévère de la maladie, pouvant empêcher les rats DMD d’effectuer certaines tâches essentielles à leur bonne santé comme le toilettage. Pour cette raison, les rats DMD sont systématiquement allotés avec un ou deux rats de génotype sauvage qui, nous l’avons constaté, prennent soin des rats handicapés, par exemple en les toilettant. Ainsi, le pelage des rats DMD demeure entretenu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires ainsi que la mise en culture.

Remplacement

Le rôle de la dystrophine en tant que suppresseur de tumeur est connu et décrit. L'objectif de cette saisine n’est pas de tester des molécules antitumorales, ce qui pourrait être réalisé en partie sur des cellules, mais 1) de calculer l’incidence de la tumeur du muscle dans des modèles dystrophiques, 2) de quantifier la variabilité de l'âge de démarrage du processus cancéreux dans un contexte biologique, et 3) d’initier la caractérisation des tumeurs au niveau ultrastructural du tissu et moléculaire. Le modèle du rat étant celui qui mime le plus fidèlement et en une seule année l’évolution chez l’humain, ces animaux sont irremplaçables pour remplir en un temps court les objectifs de ce projet.

Réduction

De nombreuses études sont menées sur les lignées DMDdel52 et DMDdup10-17. Dans ces deux modèles, la survenue de tumeurs musculairesa été observée de façon assez fréquente (20%). Jusqu'à présent, les animaux qui présentaient ces tumeurs étaient écartés des procédures dans lesquelles ils étaient inclus pour être mis à mort sans autre utilité, la présence de la tumeur pouvant potentiellement altérer les résultats de ces études. Comme ce type de tumeur a également été décrite chez les patients DMD, le présent projet vise à élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent à l'apparition de ces tumeurs dans les modèles de rats dystrophiques, et nous proposons d'inclure dans nos analyses les tumeurs détéctées chez les animaux enrôlés dans d'autres saisines afin qu'ils ne soient plus mis à mort sans que leur tissus ne soient prélevés et analysés. Ainsi ces animaux fourniront également des données biologiques grâce à l'analyse de leurs tumeurs. Ces animaux étant par ailleurs décomptés dans d'autres saisines, leur utilisation dans ce projet permettra de réduire le nombre de rats sur la cohorte dédiée. En effet, dès lors que le nombre de sujets nécessaires aux analyses sera atteint, il n'y aura pas de nouveaux animaux inclus. De plus, la diversité des animaux utilisés permettra par ailleurs un résultat biologique de meilleure qualité puisqu’il intègrera des rats au parcours de vie différent : parfois peu manipulés notamment ceux de la présente saisine, parfois manipulés régulièrement, parfois soumis à un exercice musculaire, autant de situations proches de la variabilité des modes de vie de l’enfant atteint.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventiléesde grande taille, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont les capacités locomotrices sont évaluéesen permanence. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. En cas de score clinique élevé, les animaux affaiblis seront suivis de façon rapprochée via une procédure de gestion spécifique à ces animaux. Tout dépassement des points limites sera suivi d’une action correctrice et en cas d’absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Par ailleurs, les animaux provenant d'autres saisines ne subiront aucune procédure supplémentaire puiqu'ils seront mis à mort dès lors qu'une tumeur sera détéctée.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l’humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rats DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris mdx, mondialement utilisé, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 10 mois et plus, sans excéder 17 mois. L'étude de caractérisation montre que c’est à partir de 10 mois que les animaux entrent dans une phase de la maladie qui les rend prédisposés au développement de rhabdomyosarcome et éventuelles autres comorbidités.