Recherche appliquée

Une hypoglycémie confirmée sur deux prélèvements successifs entraîne la mise à mort immédiate de la souris. 6 048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une modification génétique qui augmente le risque de tumeurs neuroendocrines, reçoivent une injection de tamoxifène, jusqu'à deux prélèvements sanguins et jusqu'à trois injections d'anti-inflammatoires en cas de douleur, avant une anesthésie terminale. Les mises à mort s'échelonnent à 3, 6, 12, 18 et 24 mois de vie pour prélever les organes, et l'effectif de 6 048 animaux repose sur une probabilité de phénotype tumoral estimée d'après la littérature, le porteur indiquant qu'il le réduira si l'effet observé dépasse son estimation.

Objectifs

La néoplasie endocrinienne multiple de type 1 (NEM1) est une maladie rare prédisposant à la survenue de plusieurs tumeurs du système endocrinien. Elle est due à des mutations du gène MEN1, codant pour la ménine. Notre hypothèse est que l’inactivation de Men1 dans des cellules dérivées de la crête neurale (CCN) favorise la tumorigénèse dans les sites endocriniens avoisinants. Notre objectif est de développer, de caractériser et de comparer les phénotypes tumoraux et hypophysaires de modèles murins présentant une inactivation du gène Men1 dans ces CCN à différents moments de leur différenciation pré- et post-natale, afin de déterminer le rôle de la crête neurale dans le développement des tumeurs hypophysaires. L’étude des autres lésions de la NEM1 dans nos modèles murins permettra de mieux connaître le rôle des CCN dans la tumorigénèse des patients.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet qu’il augmente nos connaissances sur le rôle des cellules dérivées de la crête neurale dans le développement tumoral hypophysaire, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans ces tumeurs. Nous pensons que ce travail nous permettra de mettre en évidence des facteurs juxtacrines ou paracrines impliqués dans la prolifération et l’hypersécrétion hypophysaire. L’étude des autres lésions de la NEM1 dans nos modèles murins permettra de mieux connaître le rôle des CCN dans la tumorigénèse des patients. Ce travail original permettra de mieux comprendre l’expression et les conséquences des déficiences de la ménine et plus généralement la tumorigénèse hypophysaire, afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques translationnelles et actionnables.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - Une modification génétique augmentant le risque d'apparition de tumeur neuro endocrinienne - Une injection unique intrapéritonéale de tamoxifène - Des potentiels prélèvements sanguins pour suivi de la glycémie (maximum 2/souris) - Des potentiels injections sous cutanées d'anti inflammatoires en cas de douleur (maximum 3 injections/souris)- Une anesthésie générale profonde terminale pour laquelle deux injections seront réalisées (une en sous cutanée et une intrapéritonéale)

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les individus seront susceptibles de développer des anomalies du système endocrine et neuroendocrine :( (adénome hypophysaire, hyperparathyroïdie primaire, tumeur neuroendocrine digestive (dont insulinome), tumeur surrénalienne, tumeurs testiculaires). Le risque de développer ces tumeurs chez les lignées que nous étudierons ne peut pas être prédit car seule une faible proportion des cellules de chaque souris portera la mutation. Les tumeurs liées à une déficience du gène Men1 sont le plus souvent bénignes et de croissance lente et donc peu susceptibles d’entraîner une souffrance, d’altération de l’état général ou de symptômes liés à la compression ou la mort des individus par des phénomènes de compression. Les animaux issus des certains croisements recevront une injection unique de tamoxifène, qui en dehors de l'inconfort lié à la contention et à l'injection, ne devrait pas induire d'effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Notre projet consiste en l’étude du rôle du microenvironnement dans la tumorigénèse hypophysaire et en particulier, du rôle des cellules dérivées de la crête neurale dans cette tumorigénèse, par leur rôle de soutien et leurs effets paracrines. Ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire. Le modèle murin est le modèle de choix pour étudier ces mécanismes puisque : 1) Ce modèle a été validé dans la littérature 2) L’étude du phénotype endocrinien des individus n’est pas possible chez la drosophile et le zébrafish

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette procédure, nous avons choisi une approche statistique pour réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Notre critère de jugement principal est un critère qualitatif : l’objectivation d’un phénotype tumoral hypophysaire. Nous avons estimé la probabilité d’observer ce phénotype en nous basant sur la littérature concernant les souris Men1 mutées hétérozygotes dans toutes les cellules. Néanmoins, si l’effet observé était plus fort que celui estimé nous réduirons le nombre de souris engagées dans chaque groupe.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage, afin de réduire la douleur et le stress des animaux (prélèvement par poinçonnage à l'oreille). L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux ne sera faite que par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des rongeurs. Certains des modèles que nous allons utiliser n’ont pas été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations poussées des animaux et identifier, de la manière la plus précoce, l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les tumeurs liées à une déficience du gène MEN1 sont le plus souvent bénignes et donc peu susceptibles d’entraîner la mort des individus par des phénomènes de compression ou d’envahissement métastatique. Pour certaines tumeurs extra hypophysaires, en particulier les insulinomes, l’hypersécrétion hormonale pourrait induire une hypoglycémie, que nous surveillerons par glycémie capillaire si des signes cliniques (tremblements, faiblesses musculaires) venaient à apparaître. En cas d’hypoglycémie, une supplémentation par une eau enrichie type DietGel ou un régime hyperénergétique seront mis en place. En cas d’hypoglycémie objectivée sur deux prélèvements successifs, la souris sera euthanasiée immédiatement. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure chargée du Bien Etre Animal (SBEA)

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction de l’hypophyse et du système endocrinienne des souris et des hommes sont proches, les orthologues impliqués dans la tumorigénèse également. Les souris génétiquement modifiées sont des modèles reconnus d’étude de la tumorigénèse du système endocrine et de ses causes génétiques. Les animaux seront mis à mort à 3 mois de vie puis à 6 mois, 12 mois, 18 mois et 24 mois. Trois et six mois correspondent à des stades matures (post pubertaire) et donc pleinement fonctionnels de l’hypophyse auxquels nous pensons pouvoir mettre en évidence des différences biologiques reflets des interactions paracrines prétumorales entre CCN et cellules hypophysaires sécrétantes. Douze mois, 18 mois et 24 mois correspondent aux stades auxquels un phénotype tumoral peut être observé d’après la littérature concernant le phénotype des souris Men1+/-.

Comparer deux modes d'administration du pimobendane, en bolus ou en perfusion continue : 5 chiens sains sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur deux périodes de 24 heures séparées d'une semaine, chacun reçoit un cathéter artériel posé sous anesthésie générale, puis subit 13 examens échographiques et 10 prélèvements sanguins, en cage individuelle tant qu'il porte le cathéter. Le porteur juge l'hypotension et les arythmies très peu probables chez le chien et prévoit malgré tout de les surveiller. Les 5 chiens sont gardés en vie pour être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont des affections fréquentes du chien âgé, particulièrement chez certaines races prédisposées. L’insuffisance cardiaque, lorsqu’elle survient, a un fort impact sur le confort des chiens et sur leur espérance de vie. Dans ses formes aigües, le traitement actuel repose sur l’administration de médicaments comme le pimobendane lors de la prise en charge du chien en clinique vétérinaire. En effet, le pimobendane est recommandé dans la prise en charge des insuffisances cardiaques congestives (ICC) du chien secondaire à une valvulopathie. Plusieurs études, réalisées chez des chiens sains, rapportent les effets hémodynamiques bénéfiques du pimobendane injectable : augmentation de la contractilité cardiaque, augmentation du débit cardiaque, réduction des résistances vasculaires systémiques et maintien voir légère augmentation de la pression artérielle. Chez l’homme, un médicament similaire au pimobendane, le levosimendan, est utilisé dans le traitement des ICC. En aigu, lors d’ICC, son utilisation est associée amélioration plus rapide des patients (notamment une disparition plus rapide des signes de congestion pulmonaire et une réduction de la fatigue de ces patients). Étrangement, malgré des propriétés similaires, les protocoles d’administration de ces médicaments sont très différents : - Chez l’homme, le levosimendan est administré en perfusion continue. - Chez le chien, le pimobendane est administré toutes les 12h. Il semble néanmoins que l’utilisation de doses plus importantes puissent être bénéfiques : d'après la littérature, les chiens recevant de plus grosses doses présentent moins de récidives d’épisodes congestifs. Nous souhaitons étudier l’efficacité de l’administration du pimobendane avec un protocole similaire à celui utilisé pour le levosimendan chez l’homme et comparer ce protocole à celui recommandé actuellement. L’administration d’une perfusion après un bolus pourrait permettre de maintenir une concentration plasmatique stable et donc des effets hémodynamiques constants, permettant probablement un meilleur traitement des signes de congestion. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser une étude préclinique sur chien sains. Cette étude permettra de comparer les effets hémodynamiques des deux protocoles d’administration du pimobendane.

Bénéfices attendus

Les bénéfices concernent les chiens présentant une insuffisance cardiaque congestive. Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre d’améliorer la prise en charge de ces animaux et pourrait conduire à une modification des protocoles thérapeutiques d’administration du pimobendane lors de cette affection.

Procédures

L’essai se déroule sur deux périodes de 24 h déparées d’une semaine Pendant l’essai, le chien sera dans des conditions équivalentes à celle d’une hospitalisation en clinique vétérinaire, mais en plus, un cathéter artériel sera mis en place sous anesthésie générale. Le chien recevra le pimobendane par administration intra-veineuse lente (bolus) ou par perfusion. Il subira aussi 13 examens échographiques (10 à 15 minutes maximum) et 10 prélèvements sanguins (moins de 1-2 minutes). Le port du catheter artériel nous oblige à conserver les chiens en cage individuelle pendant chaque période de 24h.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : légère douleur à l'injection, inconfort et stress. Néanmoins, des effets secondaires décrits dans la littérature pour des molécules de la même famille que le pimobendane (comme le lévosimendan) chez l'homme, tels que l'hypotension artérielle ou des arythmies, sont possibles. Ces deux complications semblent très peu probables puisqu'elles n'ont pas été décrites chez le chien dans les études précédemment réalisées. Cependant, notre protocole prévoit de surveiller et d'anticiper ces complications.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.

Remplacement

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : légère douleur à l'injection, inconfort et stress. Néanmoins, des effets secondaires décrits dans la littérature pour des molécules de la même famille que le pimobendane (comme le lévosimendan) chez l'homme, tels que l'hypotension artérielle ou des arythmies, sont possibles. Ces deux complications semblent très peu probables puisqu'elles n'ont pas été décrites chez le chien dans les études précédemment réalisées. Cependant, notre protocole prévoit de surveiller et d'anticiper ces complications.

Réduction

Pour calculer le nombre d’animaux nécessaires, nous avons estimé que nous souhaitions mettre en évidence une augmentation significative du débit cardiaque de 25% dans le groupe perfusion, 12h après le début d’administration du pimobendane. Pour nos calculs, nous avons utilisé les valeurs de débit cardiaque publiées dans la littérature, ainsi que notre estimation de débit cardiaque moyen 12h après la première administration de pimobendane. Le calcul des effectifs a été réalisé grâce à un logiciel statistique et indiquait que 4 chiens étaient nécessaires. Nous avons fixé l’effectif à 5 chiens au cas où une complication conduirait à exclure l’un des chiens de l’étude.

Raffinement

Les chiens seront manipulés en prenant toutes les précautions pour limiter le stress et compenser les désagréments engendrés par le protocole. Ces chiens sont bien socialisés, régulièrement utilisés pour ce type de petites procédures, et très habitués à notre équipe. L'hébergement individuel est de courte durée, et les chiens sont en contact visuel, olfactif, auditif et même tactile au travers des barreaux des cages. Ils sont hébergés dans des cages équipées de litière et ils sont sortis en récréation toutes les 4 h pendant la journée, pendant 10 minutes. Toutes les pharses d'examen qui peuvent provoquer du stress sont accompagnées de la distribution d'une friandise, par du personnel entrainé à l'éducation canine.

Choix des espèces

L’étude est réalisée chez le chien car il s’agit d’une étude préclinique visant à optimiser la prise en charge thérapeutique d’une affection chez le chien. Ce seront des animaux adultes, nous avons choisi ce stade de développement parce que l’insuffisance cardiaque congestive apparaît chez l’adulte.

Humanisées par injection de cellules souches ou de globules blancs humains, les souris de ce projet développent une maladie du greffon contre l'hôte, les cellules humaines finissant par attaquer leur organisme. 1 240 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous anesthésie générale, jusqu'à deux administrations par jour pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine caudale, et une ponction intracardiaque terminale. Le porteur classe la maladie du greffon contre l'hôte en gravité modérée au motif que la perte de poids importante déclenche la mise à mort de l'animal avant la suite.

Objectifs

L'immunothérapie a révolutionné le traitement des cancers depuis 10 ans, avec des taux de survie à long terme sans précédent, mais ses bénéfices restent limités. La particularité de cette approche est qu'elle ne cible pas directement la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques (chimiothérapies, radiothérapie,…), mais vise à utiliser les cellules du système immunitaire pour défendre l’organisme en reconnaissant et détruisant les cellules cancéreuses grâce notamment à des anticorps qui vont réveiller le système immunitaire (anticorps inhibiteurs de points de contrôle immunitaire) ou obliger des cellules dites « tueuses » à attaquer directement les cellules cancéreuses (anticorps bispécifiques). Mais comme tous les types de tumeurs et tous les patients ne répondent pas ou deviennent résistants aux médicaments existants, il faut identifier de nouveaux traitements qui pourraient prolonger les réponses ou améliorer le taux de patients répondeurs. Il y a donc une demande importante de modèles expérimentaux plus prédictifs et pertinents, pour améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse ou la résistance aux immunothérapies actuelles, et permettant d’évaluer de nouveaux traitements immunothérapeutiques. La particularité de ces traitement nécessite l'utilisation de modèles expérimentaux spécifiques possédant des cellules immunitaires capables de détruire la tumeur. Pour cela nous projetons de travailler avec deux types de modèles souris humanisées qui sont des modèles de choix pour étudier les interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales humaines greffées conjointement: - des souris humanisées par injection de cellules souches capable de recréer un système immunitaire humain chez la souris; - des souris humanisées à l'aide de cellules immunitaires présentes dans le sang (appelées Leucocytes ou globules blancs)

Bénéfices attendus

Ce projet a donc pour objectif le développement de modèles de souris humanisées portant à la fois un système immunitaire humain et des tumeurs humaines nécessaires pour déterminer l'efficacité d'immunothérapies (anticorps thérapeutiques) développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique. Ces modèles devraient permettre d'identifier et d'évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de valider de nouveaux anticorps dirigés contre ces cibles afin d'améliorer la prise en charge des patients pour lesquels il n'existe pas de solutions thérapeutiques à l'heure actuelle, et/ou d'apporter de nouvelles solutions thérapeutiques à des patients pour lesquels les traitements actuels sont insuffisants.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (greffe de tumeurs) qui dure 1 à 2 minutes. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale suivie jusqu’à 12 semaines. Les cellules immunitaires humaines servant à humaniser les souris seront injectées une seule fois. Selon les traitements expérimentaux, les animaux recevront au maximum 2 administrations quotidiennes pendant 8 semaines maximum. Des prélèvements de sangs seront effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques seront pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. Ces nuisances sont transitoires et peuvent donc être classées en modérées. Si ces nuisances devaient persister, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite. Dans le cas de l’injection de cellules immunitaires humaines, les cellules humaines finissent par attaquer la souris, il s'agit de la 'maladie du greffon contre l'hôte' ou GvHD. Elle se manifeste quelques semaines après l’injection et se traduit d’abord par une perte de poids importante, puis une voussure dorsale et/ou une mobilité réduite. Cette nuisance peut être classée comme modérée dans la mesure où la perte de poids importante déclenche l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur de tumeurs, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de tumeurs, injection de cellules immunitaires humaines).

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur effet antitumoral. De nombreuses lignées cellulaires originaires de tumeurs de patient ont été dérivées pour la réalisation de tests in vitro, et depuis quelques années l’utilisation de modèles cellulaires en '3D' (organoïdes) est en plein essor. Ces modèles sont très utiles mais sont plutôt utilisés en amont des tests sur les animaux dans le processus de développement de médicaments contre le cancer. Ces tests in vitro contribuent à une évaluation plus complète des candidats médicament et à une réduction de l'utilisation d'animaux dans la recherche. Cependant, il est difficile de remplacer entièrement les tests sur les animaux par des tests in vitro, d'une part car les tumeurs sont des environnements complexes et les tests in vitro ne capturent pas pleinement cette complexité. Dans le cas spécifique de ce projet utilisant des souris humanisées, il est nécessaire de pouvoir caractériser les cellules du système immunitaire capables d'infiltrer la tumeur et celles présentent dans la circulation pour comprendre l’impact d’un traitement sur les cellules immunitaires présentes et les cellules tumorales. Et ces interactions système immunitaire/tumeurs ne peuvent être évaluées de manière optimale qu'in vivo

Réduction

La connaissance parfaites des modèles de tumeurs utilisés dans ce projet permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études de caractérisation poussées in vitro pour ne tester que des traitements potentiellement efficaces chez l'animal.

Raffinement

Lors de l’acte chirurgical, pour éviter le risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Afin d’éviter les risques d’infection en suite de chirurgie, un antiseptique (Biseptine®) sera appliquée sur la peau de l’animal préalablement à l’incision réalisée lors de la greffe. Les agrafes permettant de refermer l’incision après la greffe seront également aseptisées avec de la Biseptine®. Le matériel utilisé lors de la greffe (ciseaux, pinces, puces) sera préalablement stérilisé par autoclave. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire (Ocry-Gel®) sera administré à l’animal.

Choix des espèces

On considère que passé l'âge de 6 mois (soit 26 semaines) les souris sortent de la catégorie "adulte mature" et commencent à montrer des signes de sénescence. Pour rester au plus près de cette catégorie d’adulte mature et du fait des contraintes de temps liées à l’utilisation d’animaux humanisés par injection de cellules souches, les animaux utilisés ne devront pas dépasser l’âge de 31 semaines. En effet, la période nécessaire au développement du système immunitaire étant de 12 à 13 semaines après injection des cellules sur des animaux de 4-5 semaines, les tumeur seront greffées sur des animaux de 17 à 19 semaines en fin de période d’acclimatation et la croissance tumorale suivie jusqu'à 12 semaines après la greffe, ce qui nous amène à un âge des animaux maximum de 31 semaines. Dans le cas des souris humanisées par injection de Leucocytes (ou globules blancs), les animaux utilisés seront tous des animaux adultes âgés de 6 semaines en fin de période d'acclimatation et âgés de moins de 13 semaines au moment de la greffe et la croissance tumorale sera suivie jusqu’à 12 semaines après la greffe. La durée de chaque procédure correspond donc au suivi de la croissance tumorale, elle est donc de 12 semaine maximum.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par un trou dans l'oreille ou une puce sous-cutanée, gavées une fois par jour pendant dix-sept jours avec des souches probiotiques, infectées par Clostridioides difficile lors d'un gavage unique et rendues plus réceptives à la bactérie par une injection d'antibiotique. Le porteur annonce des diarrhées et une perte de poids, avec recueil quotidien des selles, la mise à mort finale servant à prélever les organes. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider l'effet thérapeutique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du microbiote, tout en indiquant que la vérification in vivo est de toute façon exigible réglementairement.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas de colites associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente » dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Trois molécules antibiotiques sont utilisées actuellement pour le traitement des ICD. Bien que généralement efficaces elles présentent des inconvénients tels que le risque de sélection de bactéries résistantes, coût important voir échec thérapeutique. En effet, les ICD sont caractérisée par un taux de récidive important de l’ordre de 20% avec parfois des récidives multiples particulièrement invalidantes pour les patients. Les antibiotiques font partie des molécules les plus prescrites dans le monde et il a été démontré qu’elles peuvent induire des modifications du microbiote. La perturbation du microbiote intestinal appelé dysbiose est un facteur de risque pour les ICD. En effet, l’implantation de ce pathogène est favorisée dans ce contexte. Il est donc capital de rechercher des thérapeutiques complémentaires/alternatives aux antibiotiques telles que les probiotiques permettant d’épargner/restaurer le microbiote dans le cadre de la prise en charge des ICD. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Il a ainsi été montré que les probiotiques pouvaient participer au rétablissement du microbiote intestinale et de ce fait restaurant son effet de barrière contre les pathogènes. A ce jour diverses souches bactériennes et différentes combinaisons de ces souches ont été testées avec des effets variables pour traiter et prévenir le risque d’ICD. Ce projet de recherche a pour objet de développer des stratégies de lutte contre la colonisation intestinale de C. difficile grâce à l’utilisation de probiotiques ayant diverses propriétés. En effet, les mécanismes d’action des probiotiques peuvent être divers et nous allons tester plusieurs stratégies.

Bénéfices attendus

Le développement de nouvelles stratégies de lutte contre ce pathogène permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque de récidives.

Procédures

Les souris seront identifiées par un trou dans l’oreille ou une puce insérée en sous-cutané avec un dispositif dédié aux rongeurs. Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches probiotiques (1 gavage/jour pendant 17 jours) ou la souche de C. difficile (un gavage unique durant la procédure) et une injection d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection d’une durée de 10 secondes durant la procédure). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum), sur la durée de l'essai.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux sont de classe modérée. Elles incluent les actes expérimentaux d’identification, de gavage et l’unique injection d’antibiotique ainsi que les nuisances liées à l’infection par la bactérie C. difficile pour les groupes d’animaux qui y seront exposés comprenant des diarrhées et une perte de poids des animaux. Les méthodes d’identification (trou dans l’oreille, puce) essentielles pour suivre les animaux au cours du temps occasionnent également des nuisances.

Devenir

Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro ont permis de sélectionner les souches probiotiques présentant une activité anti C. difficile intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse basée sur les expériences passées du laboratoire et les publications scientifiques du domaine a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. En utilisant des logiciels statistiques spécifiques nous avons ainsi déterminé que pour pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 10 animaux par groupe seront ainsi nécessaires. Ainsi le nombre total d’animaux est de 300 pour minimiser le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l'étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques locaux permettant de limiter la souffrance des animaux lors des injection intrapéritonéales. Une procédure d’euthanasie anticipée est mise en place et des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Enfin, à terme, les souris seront identifiées par une puce insérée en sous cutanée permettant à la fois l’identification et le relevé de la température ». Le puçage avec relevé de température est une méthode nouvelle dans l’équipe permettant d’avoir un critère supplémentaire permettant d’objectiver l’état de santé de l’animal et pouvant constituer un point limite supplémentaire (fièvre ou hypothermie).

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.

Greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome de l'œil, puis injectées dans l'abdomen trois fois par semaine sur animal vigile et sans anesthésie, pendant jusqu'à seize semaines, 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour récupérer les tumeurs et les organes porteurs de métastases. Le porteur décrit une croissance tumorale pouvant entraîner poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration et nécrose de la peau, auxquelles s'ajoutent rougeurs, infections et nécroses au point d'injection. Il annonce par ailleurs que la lignée cellulaire créée à cette occasion servira à des expériences in vitro permettant de "s'aligner sur le bien être animal".

Objectifs

Le mélanome oculaire est une tumeur cancéreuse de l’œil se développant à partir des cellules « les mélanocytes », responsables de la production de mélanine (le pigment de notre peau et de nos yeux). Ce cancer est le plus fréquent dans la population adulte. La majorité de ces mélanomes a pour origine l’uvée, un tissu de l’oeil. Si la tumeur primaire peut être traitée par énucléation ou irradiation, il a été mis en évidence que des micrométastases se propageaient via la circulation sanguine plusieurs années avant le diagnostic. Ces métastases sont fortement résistantes aux traitements par chimiothérapie ainsi qu’à la radiothérapie. L’absence de traitement efficace pour ces tumeurs entraine une mortalité à 90% dans les 6 mois qui suivent la découverte des métastases. Actuellement, il n’existe pas de traitement approuvé pour le mélanome uvéal métastatique. Il faut donc continuer à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de cette tumeur pour identifier des cibles thérapeutiques et des traitements efficaces. Pour ce faire, nous avons réalisées des études du profil d’expression des gènes qui nous ont permis d’identifier de nouveaux candidats cibles intéressants. De plus, l’absence de modèles expérimentaux (cellulaires, animaux) de mélanome uvéal ne permet pas de tester l’efficacité préclinique de drogues dans un contexte de système immunitaire complet. Pour améliorer cela et pouvoir proposer des traitements personnalisés pertinents, nous désirons mettre en place un modèle de souris qui repose sur la greffe de cellules issues de biopsies de mélanome uvéal de souris dans des souris immuno-déficientes.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de développer une lignée de cellules de mélanome uvéal murin qui sera utile à la communauté internationale. Ce modèle sera utile à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant dans ce domaine pour des études in vivo mais aussi in vitro permettant de s’aligner sur le bien être animal. Une fois ce modèle établi, il sera aussi possible d’étudier l’efficacité de certaines molécules dans des animaux ayant un système immunitaire complet dans le but de lutter contre la progression du mélanome uvéal.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome uvéal murin. Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (ou un maximun de 16 semaines après injection des cellules). Cette intervention ne nécessite pas d’anesthésie et est effectuée sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection de traitement. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection sera également surveillé.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir complètement de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent la survie de cellules de mélanome oculaire murin fraichement isolées à partir d’une biopsie et de travailler de façon intégrée où l’écosystème tumoral est reproduit. Cependant, la nouvelle lignée cellulaire de mélanome oculaire murin pourra être utilisée pour des expériences in vitro.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) afin de réaliser des analyses in vitro. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris immunodéprimés mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et observées quotidiennement par les animaliers et de façon exhaustive deux ou trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, stress ou inconfort. Les manipulateurs, habitués à l’expérimentation sur les souris, éviteront tout dommage à l’animal lors des injections.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

Toutes tuées à la fin de l'étude pour des analyses histologiques et moléculaires, 24 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze portent l'invalidation d'un gène candidat des myopathies congénitales, les douze autres forment le groupe témoin. Après une biopsie de phalanges vers le sixième jour de vie, chaque souris passe un test de coordination motrice tous les mois de 2 à 8 mois, puis, à 8 mois, avant et après une heure de course forcée sur tapis roulant, un test de douleur où sa queue est exposée à une source de chaleur et 24 heures d'isolement dans une cage de mesure d'activité. Elle est ensuite anesthésiée, son muscle tibial antérieur disséqué pour en mesurer la contraction, puis elle est tuée. Le porteur juge l'emploi de souris "indispensable" et y voit un "modèle d'étude idéal de myopathies", en invoquant 96 % d'homologie de la protéine étudiée et des techniques de mesure perfectionnées depuis des années dans son équipe.

Objectifs

Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons.

Bénéfices attendus

Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.

Procédures

Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.

Remplacement

Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.

Réduction

Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.

Raffinement

Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.

Choix des espèces

La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.