Recherche appliquée

Des souris femelles gestantes respirent un insecticide pyréthrinoïde huit heures par jour, du douzième jour de gestation jusqu'à la naissance de leur portée, et jusqu'à sept jours au-delà. 258 souris, mères et petits, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau. Le porteur attend chez les mères des troubles digestifs, une hyperventilation, des déficits moteurs et des symptômes de type parkinsonien ou épileptique, et chez la descendance une mortalité accrue à la naissance ou un syndrome de type autistique, qui constitue précisément l'hypothèse testée. Les petits passent ensuite l'open field, la croix surélevée et le test d'interaction sociale à trois chambres, et le porteur affirme que reproduire une exposition par inhalation impose l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence de l'autisme ne cesse d'augmenter à l'échelle mondiale, devenant un problème de santé publique non négligeable. Les composantes environnementales ont un plus fort impact que les facteurs génétiques dans l'apparition de troubles du spectre autistique (TSA). Parmi elles, on retrouve les pesticides, néfastes pour les nuisibles mais également pour l'Homme dans le stades précoces du développement. En effet, diverses études épidémiologiques (Etats-Unis, France, Royaume-Uni...)) montrent une utilisation durant la dernière décennie de pesticides mais plus précisément d'insecticides à usage domestique dans 70 à 95% des cas. Ces produits sont retrouvés majoritairement sous forme de pulvérisateurs avec pour la plupart, comme substance active : les Pyréthrinoïdes (insecticides). Ainsi, une exposition aux pyréthrinoïdes pendant la période périnatale augmente le risque d'apparition de TSA, au travers d'un contact entre le pesticide et le foetus par l'intermédiaire de la mère qui l'inhale. Les agences environnementales alertent également sur leur utilisation intensive en air intérieur, notamment par les femmes enceintes car dans la société actuelle, la majorité de la population passe plus de 80% de son temps dans un environnement clos, taux augmentant à 95% pour les femmes enceintes. Nous avons précédemment montré que les concentrations de pyréthrinoïdes domestiques dans l'atmosphère intérieure sont 1000 fois plus élevées qu'à l'extérieur et que l'application aiguë de pyréthrinoïdes modifie l'activité électrophysiologique (activité électrique) des neurones des mammifères. Nous supposons qu’une exposition prénatale aux pyréthrinoïdes perturbe la séquence de développement des réseaux neuronaux et la synaptogenèse (connexions nerveuses), entraînant une altération durable des comportements sociaux et cognitifs. Nous sommes un consortium de neurobiologistes et de chimistes de l'atmosphère qui modéliseront l'exposition environnementale aux pyréthroïdes humains chez la souris. Nous focaliserons notre étude sur la deltaméthrine, un pyréthrinoïde de type II car il est le plus fortement détecté dans l'air ambiant ; l'Agence Française ANSES le classe parmi les 32 substances prioritaires ; enfin, il cible les récepteurs GABA et l'altération de la neurotransmission GABAergique est un mécanisme physiopathologique des TSA.

Bénéfices attendus

Face à l'orientation pandémique actuelle des TSA, la recherche doit aller au-delà des facteurs génétiques, sachant que les produits chimiques industriels largement disséminés dans l'environnement sont des contributeurs importants à cette pandémie. La nature innovante du projet est de démontrer le lien neurobiologique avec les preuves émergentes d'une association entre l'exposition prénatale à la pollution par les pyréthrinoïdes et l'apparition des TSA. Dans ce contexte, l'utilisation croissante d'insecticides ménagers commerciaux dans les atmosphères intérieures soulève des questions en raison des propriétés potentiellement dangereuses des substances actives pour la progéniture, étant donné que le niveau et la durée d'exposition à ces produits chimiques sont susceptibles d'être significatifs. La modélisation de cette exposition subaigue sur un modèle animal apportera donc des avancées importantes quant à la neurotoxicité des pyréthrinoïdes sur le cerveau en développement.

Procédures

Aucune intervention invasive ou chirugicale ne sera conduite sur les animaux. Les femelles gestantes seront exposées 8h/ jour à minima 7 jours (du stade embryonnaire jour 12 (E12) de gestation à la naissance de la portée) et jusqu'à 14 jours (du stade E12 de gestation à la naissance de la portée + 7 jours de vie). Cette procédure sera conduite à deux doses; l'une représente une dose mesurée en air intérieur (1µg/m^3) et l'autre une dose mesurée en air extérieure (10 ng/m^3). Des tests comportementaux seront effectués, à savoir : Les milestones entre les âge 3 et 15 jours afin de percevoir la présence de déficits sensori-moteurs caractéristiques des troubles autistiques pour une durée de 30 minutes par jour et par portée. Les enregistrements de vocalisations seront réalisées pendant 5 minutes sur des animaux âgés de 8-10 jours. Les tests comportementaux suivants seront réalisés sur des animaux âgés de 21 à 48 jours : le test de l'Open Field (10 minutes); la croix surélevée (5 minutes) et enfin le test d'interaction sociale à trois chambres (40 minutes).

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sur les mères gestantes pourront être observés suite à l'inhalation de pyréthrinoides de type 2 : troubles digestif, hyperventilation, déficits cognitifs et moteurs avec symptomes de type parkinson ou de C-S syndrome (épilepsies). Les effets indésirables liés à l'exposition subaigue de l'insecticide sur la descendance sont une augmentation de la mortalité à la naissance ou un syndrome de type autistique ce qui est l'hypothèse de notre étude. Les tests comportementaux seront une source de stress engendrée par la séparation maternelle et les manipulations que nous prendrons en compte.

Devenir

L'ensemble des animaux seront sacrifiés dans la dernière étape de la procédure pour récuperer leur cerveau et permettre les analyses electrophysiologiques ou biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de mimer l'exposition humaine par inhalation des insecticides sur un modèle animal afin de mesurer la neurotoxicité sur le comportement ainsi que sur l'activité nerveuse, ce projet ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances de l'impact de l'environnement sur le développement cérébral ne peuvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement n’est donc pas possible.

Réduction

Un plan d’expérience sera systématiquement rédigé avant les expérimentations dans un souci permanent d’optimisation du nombre d’animaux. Aucune étude antérieure n’a été menée sur ce projet auparavant. Nous envisageons l'utilisation de tests statistiques non paramétriques (Wilcoxon-Mann-Whitney, ANOVA 1 facteur - Kruskal Wallis, ANOVA 2 facteurs ) afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les expériences seront conduites sur un seul modèle animal et une seule souche : souris de type sauvage. Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture exposée à l'insecticide, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Les mères et leur nouveau-nés seront hébergés sous environnement contrôlé, dans une cage d'exposition aux insecticides avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids, et avec la possibilité de boire et manger ad libitum. Afin de réduire la souffrance des expositions, celles-ci seront appliquées par inhalation et à des doses contrôlées par des mesures permanentes du taux d'insecticide (1µg/m^3 et 10ng/m^3). Les expériences de comportement sur la progéniture seront conduites uniquement en situations aigües et non chroniques. Afin de limiter leur stress, la salle de comportement est équipée d'un tapis chauffant, d'une lumière tamisée, d'un contrôle de la température. La pièce est silencieuse et ventilée. Le manipulateur frottera ses gants dans la sciure pour ne pas perturber les animaux par ses odeurs. Nous mettrons en place les points limites suivants: pour les femelles gestantes nous observerons la détérioration de l'apparence de l'animal, des difficultés respiratoires sévères et prolongées, la léthargie de l'animal (immobile, ne répondant pas aux stimuli), la perte de poids excessive (supérieure à 20% de son poids initial), diarrhée et température (suivi par caméra thermique). En fonction du score de l'animal (Annexe 3), les interventions seront : à surveiller (score de 3 à 5), demander un second avis et considérer l'euthanasie (score de 5 à 7) et souffrance sévère, prévoir l'euthanasie (score de 7 à 9). En ce qui concerne les descendants, les points limites seront l'apparition de troubles respiratoires (la cyanose), l'hypotonie néonatale, la perte de poids, et la prise de lait (visualisée au niveau de l'estomac).

Choix des espèces

Nous avons sélectionné la Souris pour plusieurs raisons: - L'objectif étant de reproduire l'exposition perinatale et par inhalation des femmes à un insecticide répandu, nous devons rester sur un modèle mammifère - Afin de pouvoir contrôler au mieux les concentrations d'expositions tout en considérant le bien être animal nous avons réalisé une chambre d'exposition dont le volume (30l) est approprié pour les rongeurs. - L'équipement que nous possédons sur notre plateforme comportementale afin de rechercher un phénotype autistique est adapté à la souris jeune et adulte et pas complètement au rat. - La période d'exposition (stade embryonnaire 12 à 7 jours post-natal) a été choisie car c'est une période critique pour le développement du système nerveux. Les expériences d'électrophysiologie sont réalisées au 7ème et 20ème jour post-natal afin d'observer la séquence développementale de l'activité excitatrice versus inhibitrice du GABA.

Pour tester si une molécule empêche la douleur du visage déclenchée par une inflammation, 130 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour le prélèvement de tissus nerveux. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq à huit jours sous anesthésie gazeuse, plus une injection sous-cutanée, puis passe chaque jour un test d'allodynie où un filament est appliqué sur sa face. Le porteur qualifie ces mesures de peu douloureuses au motif que l'animal peut se soustraire au filament, et attend de l'expérience qu'elle produise l'hypersensibilité douloureuse recherchée. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont mis à mort.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau de la face sont peu connus.Nos résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution d'un type de canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Le projet étudiera s’il est possible de prévenir les inflammations sur les canaux astrocytaires et par conséquent la douleur, à l’aide d'une molécule capable de moduler l’expression du gène correspondant à la protéine du canal astrocytaire. Il combinera des approches moléculaires et comportementales, et sera réalisé sur des rats adultes mâles, âgés entre 4 et 8 semaines.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : • Injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une prériode d’adaptation suite à la livraision suivie d'une période d’habituation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tout ces éléments. C’est pourquoi il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections systémiques,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à parti de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 5 à 8 semaines (125 à 250 g), pour comparer avec les données du laboratoire.

Capturés au piège dans leur milieu, 150 mulots sylvestres et mulots à collier sauvages sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés. Chacun subit sous anesthésie gazeuse une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire, geste que le porteur chiffre à trois minutes entre la sortie du piège et la fin du prélèvement. Le projet poursuit deux objectifs déclarés, former des étudiants de master aux métiers de la conservation et suivre les pathogènes des rongeurs sauvages. Le porteur admet un taux de mortalité de l'ordre de 3 % lié au piégeage, par arrêt cardiaque, rupture des cervicales ou refroidissement, et justifie le choix de ces deux espèces par leur abondance et leur "facilité de capture".

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans des objectifs de formation pédagogique et scientifique des étudiants de niveau Master ayant pour projet professionnel de travailler dans les métiers de l’environnement appliqués à la conservation d’animaux sauvages. Les objectifs sont i) de fournir un niveau de connaissance adapté à l’utilisation d’animaux de la faune sauvage à travers une approche éthique (présentation des comités d’étiques en expérimentation animale, règle des 3R,…) ; ii) initier les étudiants à la capture de Micromammifères (essentiellement le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le Mulot à collier (Apodemus flavicollis) et le Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), potentiellement d’autres espèces sauvages moins abondantes ; le présent projet portera cependant uniquement sur les 2 espèces de Mulots, les autres espèces seront relâchées immédiatement, cf ci-dessous) ; iii) présenter les risques liés à la contention et les bonnes pratiques de terrain ; et iv) intégrer le bien-être animal en condition de captivité. Les échantillons récoltés avec les étudiants permettront ensuite de réaliser un suivi à long terme de l’état de santé des populations de rongeurs à l’échelle régionale et de maintenir une surveillance des pathogènes présents chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’apport de connaissances nouvelles à des étudiants pouvant être amenés à manipuler des animaux sauvages dans leur cursus professionnel, et l’obtention de données nouvelles, remplissent un objectif à la fois pédagogique et scientifique à travers une approche non-létale. La formation à l’éthique et au bien-être animal répond ainsi aux enjeux sociétaux et de perfectionnement personnel d’une pratique encadrée par un context légal et qui s’inscrit directement dans les plans de carrière de certains étudiants. De plus, la formation à une démarche non létale sur des mesures hématologiques, immunologiques et hormonales est innovante et offrira un panel de compétences attractives auprès de leurs futurs employeurs. Sur le plan scientifique, le suivi de l’état de santé de rongeurs sauvages sur les sites d’études permettrait une meilleure compréhension des enjeux sociétaux actuels, mais aussi de définir des risques épidémioloques pour la présence de zoonoses dans l’environnement.

Procédures

Les animaux subiront une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Cette procédure sera réalisée par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé d’une prise de sang (avec identification spécifique, sexage et mesures morphométriques) est de l’ordre de 3 minutes de la sortie du piège à la fin du prélèvement.

Impact sur les animaux

Au cours de la manipulation, les animaux peuvent ressentir un stress lié à la capture, la contention, et la manipulation. Les parties potentiellement douloureuses ou particulièrement stressantes (prise de sang notamment) se font cependant sous anesthéise gazeuse. L’anesthésie gazeuse évite une injection (intrapéritonéale), l’induction de l’anesthésie est rapide (de l’ordre de 30 secondes) et l’anesthésie elle-même est brève (de l’ordre de 3 min, permettant l’identification spécifique, le sexage, les mesures morphométriques et la prise de sang), évitant une hypothermie. A l’issue de la prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un lubrifiant oculaire et un anesthéisant local seront appliqués sur l’œil des individus. Par la suite, les animaux seront placés dans des boîtes dortoirs pour être remis en liberté après un temps de repos (minimum 1 heure) et la vérification préalable de leur bon état de santé (œil en bon état, comportement normal, cf § relatif aux points-limites ci-dessous). Cette méthode de prise de sang n’est pas substituable à un prélèvement dans la queue qui donne un volume trop faible ou dans le sillon mandibulaire . De précédents tests de prise de sang dans le sinus mandibulaire ont été effectués par des personnes qualifiées à ce type de prélèvement sur souris de laboratoire mais n’ont pas permis de réaliser des prises de sang. L’absence de ce sinus chez les Mulots est suspectée.

Devenir

Les animaux seront relâchés à l’issue de chaque procèdure en considérant qu’aucun traitement pouvant moduler leur réponse immunitaire ou affecter leur comportement ou fonction écologique ne pourrait affecter le devenir de ces animaux en condition naturelle. Cette remise à l’état sauvage prend en compte l’expérience des responsables du projet et le travail de la SBEA ayant statué à l’unhanimité sur la possibilité de réaliser un prélèvement sanguin comme indiqué dans chaque procédure suivi du relâcher des animaux.

Remplacement

Le double objectif du projet est (i) de former des étudiants aux méthodes éthiques et réglementaires d’utilisation d’animaux de la faune sauvage à des fins scientifiques et (ii) d’acquérir des données de long terme sur l’état de santé et les pathogènes de micromammifères sauvages. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différait significativement (Abolins et al., 2017; Viney and Riley, 2017),l’utilisation d’animaux sauvages est également requise. L’étude pathogènes potentiellement zoonotiques ne peut par ailleurs se faire que sur animaux capturés dans l’environnement et non sur animaux-modèles de laboratoire.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles et la reproduction de ces mêmes conditions n’est pas possible en laboratoire. De nombreuses études scientifiques commencent à intégrer les conditions environnementales comme effets modulateurs de la réponse immunitaire face aux infections (Flies and wild comparative immunology consortium, 2020). Parmi les agents infectieux susceptibles d’étre identifié, Borrelia burgdorferi, l’agent responsable de la maladie de Lyme présente des prévalences parfois très faibles au sein de populations de Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et de Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1 and 2 ne peuvent être inférieurs à 30 rongeurs (Procédure 1) et 30 rongeurs (Procédure 2) par site d’étude et par an pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

En ce qui concerne les captures, les pièges sont relevés au moins une fois par jour. Cependant, la littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à un arrêt cardiaque, une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges). En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Les conditions de captivité des animaux seront conformes aux conditions des Rongeurs de laboratoires (Cages normalisées, nourriture et eau fournis ad libitum), sauf en ce qui concerne la captivité individuelle, mais avec un enrichissement aussi élaboré que possible (Dortoir et coton permettant la confection d’un nid, structures de carton, roue et balle pour le jeu). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en des lieux séparés. Les mesures et prélèvements seront effectués sous anesthésie par du personnel qualifié.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et le Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Le Mulot sylvestre et le Mulot à collier sont des Micromammifères abondants, ubiquistes, opportunistes avec un régime alimentaire varié. Leur positionnement trophique intermédiaire les place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leur utilisation dans des travaux scientifiques en écologie, écotoxicologie, ou écoépidemiologie est fréquente, permettant une relation des résultats obtenus ici avec la littérature internationale, tant par les étudiants concernés que par l’équipe de recherche (Chrono-environnement). Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Seuls les Rongeurs d’âge adulte et les femelles non gestantes seront utilisés pour cette étude.

Incision de deux à trois centimètres dans l'abdomen sous anesthésie, insertion d'un fragment de tumeur dans le foie, suture : 16 lapins subissent d'abord une chirurgie d'une trentaine de minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sept et quatorze jours plus tard, chacun est anesthésié quarante minutes pour recevoir le traitement dans la veine de l'oreille et passer une échographie abdominale, puis vingt minutes de plus le lendemain pour une prise de sang. Au bout de trois semaines, tous sont tués et leurs tumeurs prélevées pour analyse histologique. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable de la molécule testée, et annonce que la confirmation de la réduction tumorale permettra de consolider le dossier pour le passage en clinique.

Objectifs

Les immunothérapies ont permis de grandes avancées dans le traitement des cancers. Malheureusement, les taux de réponse aux immunothérapies restent encore limités. Un défi urgent est donc de développer de nouvelles molécules permettant d’améliorer l'efficacité des immunothérapies actuelles. Grâce à leur capacité à activer le système immunitaire, les immunostimulants ont le potentiel d'améliorer l'efficacité de ces immunothérapies, tout en minimisant leur toxicité. Un candidat médicament a ainsi été développé. Des études préliminaires ont démontré qu’il s’agit d’un puissant stimulateur des cellules immunitaires avec un meilleur profil de sécurité que les autres molécules existantes. Afin de poursuivre le développement de ce produit, il est à présent nécessaire d’évaluer son efficacité dans un modèle tumoral chez le lapin. L’objectif de ce projet est donc de valider l’activité et l’efficacité du candidat médicament dans un modèle animal non rongeur pertinent, le lapin. Ceci permettra d’ apporter la preuve de concept de l’efficacité de cette nouvelle thérapie innovante dans le cadre du traitement du cancer avant son passage chez l’Homme.

Bénéfices attendus

La confirmation de la réduction tumorale grâce au traitement par le LipoLPS permettra de consolider le dossier pour le passage en clinique. .

Procédures

La chirurgie sous anesthésie générale et antidouleur va s’étendre sur environ 30 minutes pendant lesquelles l’animal, après préparation (tonte, désinfection, mise en place du monitoring) va subir une incision d’environ 2-3 cm. Un fragment tumoral sera inséré dans le foie puis la plaie sera suturée. 7 jours et 14 jours après la chirurgie, l’animal sera anesthésié pendant 40 min pour la réalisation de l’injection du traitement à la veine de l’oreille, de l’administration du traitement par voie intraveineuse et une échographie abdominale pour observer la croissance de la tumeur. 8 jours et 15 jours après la chirurgie l’animal sera anesthésié pendant 20 min pour la réalisation d’un prélèvement de sang à la veine de l’oreille. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine. Au bout de 3 semaines, l’animal sera sédaté pour une prise de sang (5 min) et sera mis à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement : * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale * nuisances liées au traitement : - stress et inconfort lié aux anesthésies/traitement - Aucun effet indésirable de la molécule testée n’est atendu - pesée deux fois par semaine (stress).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les tumeurs et d’effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont permis de valider l’effet antitumoral de la molécule à tester. Cependant, le lapin est le seul modèle animal non rongeur pour lequel un modèle tumoral est disponible et parfaitement maitrisé. Le projet nécessite le système immunitaire fonctionnel et ne peut donc pas être réalisé avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

L’effectif de chaque groupe a été calculé grâce à des outils statistiques. L’utilisation d’un suivi longitudinal des animaux grace à l’échographie permet également une réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des études chez le rongeur ont permis de valider l’innocuité du traitement et une étude de pharmacocinétique a été menée chez le lapin au préalable pour déterminer la dose à utiliser. La procédure d’implantation du modèle tumoral est parfaitement maitrisée par l’équipe. La connaissance du modèle permet de mettre en place des points limites précoces minimisant ainsi la souffrance potentielle. L’état des animaux est évalué par l’observation de leur état physique (ouverture des yeux, orientation des oreilles) et la quantité d’aliment consommée.

Choix des espèces

Le lapin est le seul modèle animal non rongeur disposant d’un modèle tumoral fiable et reproductible. De plus, ce modèle tumoral est un modèle proche de l’Homme en terme de sensibilité à ce type d’immunostimulant et donc pertinent au niveau immunitaire. Des animaux au stade adulte (environ 12 semaines) seront utilisés. Ce stade permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire mature (3-3,3kg)

Pour mesurer ce qui arrive réellement dans le sang quand un antibiotique est dilué dans l'eau de boisson, 612 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en trois groupes de 204, ils reçoivent de l'amoxicilline, de la tilmicosine ou de la tylosine pendant 72 heures, puis subissent jusqu'à quatre prises de sang sous contention, une par jour pendant quatre jours. Le porteur ramène les nuisances à la contention et à la ponction. Aucun animal n'est tué au titre du projet, les 612 porcelets étant rendus à la filière d'élevage pour y poursuivre ce que le porteur appelle leur cycle.

Objectifs

La diminution d'efficacité des antibiotiques, du fait des résistances bacteriennes qui se développent, oblige à mieux utiliser les antibiotiques, notamment en administrant des doses optimales, c'est à dire suffisantes pour permettre la guérison sans contribuer à une surconsommation abusive des antibiotiques en médecine vétérinaire. Pour ajuster les doses, il faut connaitre les concentrations qui arrivent sur le site infectieux après administration par voie orale (voie utilisée en élevage, notamment via l'eau de boisson) et donc réaliser des pharmacocinétiques. Au cours d'un précédent projet une étude réalisée en station expérimentale avait montré qu'une administration en continu d'amoxicilline dans l'eau de boisson conduisait à une sous exposition des animaux. Un des leviers d'action pour augmenter l'exposition des animaux à l'antibiotique pourrait être de distribuer la même dose journalière mais sur un temps restreint au moment des pics de consommation d'eau. Deux autres antibiotiques utilisés en post sevrage seront également évalués. Il s'agit de la tilmicosine et de la tylosine. Selon une étude sur les consommations en antibiotiques en élevage de porcs, ces trois antibiotiques (amoxicilline, tilmicosine et tylosine) sont les plus utilisés en post sevrage, ce qui explique notre choix de se porter sur ces trois molécules. Les données préliminaires sur les consommations d'eau obtenues lors d'un précédent projet et les données de la littérature suggèrent qu'il y aurait des pics de consommation d'eau en fin de matinée, début d'après midi et/ou en fin de journée/fin de nuit. Nous comparerons donc les concentrations plasmatiques en amoxicilline, tilmicosine et tylosine retrouvées chez les porcelets après une administration de ces antibiotiques en continu, sur plusieurs temps restreints 10h-16h ou 8h-17h ou 17h-8h. L'objectif de cette étude est de déterminer, en conditions d'élevage, les concentrations plasmatiques en amoxicilline, tilmicosine et tylosine, observables chez le porcelet en post sevrage lorsque l'antibiotique est administré via le circuit d'eau de boisson en continu ou sur un temps restreint.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre d'optimiser l'utilisation de traitements antibiotiques via l'eau de boisson et de mieux soigner les animaux malades pour lesquels une des trois molécules étudiées ici serait la solution thérapeutique de première intention.

Procédures

Le projet sera mené sur trois groupes de porcelets à des temps différents, chaque groupe comportant 204 porcelets, soient 612 sur la totalité du projet. Les trois groupes seront traités avec un antibiotique différent administré via l'eau de boisson toutes les 12h ou 24 h, pendant 72h, en fonction des recommandations données dans le RCP (Résumé des Caractéristiques du Produit) de chaque antibiotique. Pour les trois groupes, les 204 porcelets seront hébergés dans 12 cases comportant chacune 17 animaux. Dans toutes les cases, les consommations d'eau individuelles et par case de tous les animaux seront relevées quotidiennement par des compteurs d’eau connectés équipés de lecteur de boucles individuelles de chaque porc. La concentration en antibiotique dans l'eau de boisson sera mesurée au laboratoire suite à un prélèvement d’eau à l’abreuvoir. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur tous les porcelets pour déterminer les concentrations plasmatiques en antibiotiques (au maximum 4 prises de sang par animal, 1 prise de sang par jour pendant 4 jours) car une grande variabilité interindividuelle est attendue compte-tenu du fait que les animaux n'ont pas tous le même poids, ne consomment pas tous les mêmes quantités d'eau au même moment, n'ont pas tous le même statut sanitaire, etc.

Impact sur les animaux

LLa contention et la prise de sang constituent une nuisance pour les animaux. La contention et les prises de sang seront réalisées par des personnes agueries au geste pour que leurs durée soit la plus courte possible.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie à la fin des procédures et continueront leur cycle dans l'élevage.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer totalement l’utilisation des animaux dans ce projet. En effet, il n’est tout d’abord pas possible de déterminer par d’autres moyens les consommations d’eau des animaux dans des conditions d’élevage. De plus, le devenir d’un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale,...).

Réduction

Pour chaque traitement antibiotique (3 au total) et périodicité de traitement, 51 porcs seront utilisés. A chaque temps de prélèvement nous prélèverons 24 ou 27 porcs car une grande variabilité interindividuelle est attendue compte-tenu du fait que les animaux n'ont pas tous le même poids, ne consomment pas tous les mêmes quantités d'eau au même moment, n'ont pas tous le même statut sanitaire, etc. Des expérimentations menées précedemment en atelier porcin et en engraissement ovin ont montré que ce nombre d'animaux était suffisant mais nécessaire pour bien caractériser la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques liée à la variabilité de comportement d'abreuvement des animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions délevage de production classique, afin de rester proche des conditions d’élevage. Cependant, pour éviter tout stress ou douleur à l'animal, la contention des animaux ainsi que les prélèvements seront réalisés par du personnel formé plus particulièrement à la manipulation des porcelets et habitués à la manipulation d'animaux d'élevage (moins d'habituation possible aux manipulations répétées que pour les animaux d'expérimentation). Les animaux ne seront jamais isolés pour éviter tout stress de séparation du groupe.

Choix des espèces

L'objectif du projet est de déterminer les concentrations plasmatiques en antibiotiques atteintes chez le porc après un traitement via l'eau de boisson ainsi que la variabilité interindividuelle existante en terme de consommation d'eau et donc en terme de concentrations plasmatiques en antibiotiques. Pour cela, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux dans des conditions d'élevage classiques. Les animaux utilisés seront en post sevrage, période à laquelle les traitements antibiotiques étudiés sont habituellement utilisés en élevage. L'étude sera réalisée 2 à 3 semaines après le sevrage sur des porcs de 15-22 kg.

Pour déterminer quel anesthésique tue le plus vite les poissons zèbres selon leur stade de développement, 945 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure dans un bain d'anesthésique, puis vingt-quatre heures de suivi pendant lesquelles les expérimentateurs observent ses battements de cœur et ses réflexes à trois, six et vingt-quatre heures. Ceux qui survivent peuvent présenter des signes d'intoxication, des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage, avant d'être tués au terme des vingt-quatre heures pour cause de détérioration jugée irréversible. Le porteur range ce travail sous le principe de raffinement : neuf méthodes de mise à mort testées sur trois stades de développement, à trente-cinq individus par méthode.

Objectifs

La Directive européenne 2010/63/CE autorise l'euthanasie des poissons par surdose d'anesthésiques ou l'étourdissement électrique. Chez le poisson zèbre, la directive prend effet à partir de 5 jours post-fécondation. Dès lors, la méthode d'euthanasie la plus utilisée dans les laboratoires est la surdose de tricaine (MS-222). Bien que l'efficacité de cet anesthésique soit démontrée chez les poissons zèbres adultes, peu d'informations sont disponibles sur son efficacité pour les stades larvaires, juvéniles. Toutefois, il a été montré que le MS222 est inefficace pour l'euthanasie des poissons zèbres aux stades embryonnaires. La différence d'efficacité du MS222 par rapport aux adultes peut être expliquée par les transitions importantes lors du développement du poisson, liées aux changements métaboliques et au développement des organes, qui peuvent affecter la sensibilité des poissons aux anesthésiants en fonction de leur stade de développement. L'objectif de l'étude est d'identifier des protocoles d'euthanasie respectueux du bien-être animal pour parvenir à l'euthanasie des poissons zèbres, pendant leurs premiers stades de vie, notamment pour les stades larvaires, juvéniles. L'accent est mis sur la réduction de la durée de la procédure et l'amélioration du confort des animaux lors de l'euthanasie. Cette étude s'inscrit dans le cadre du principe de « Raffinement » en expérimentation animale, visant à minimiser la douleur et la détresse des animaux de laboratoire lors de l'euthanasie. Dans cette optique, l'étude vise à déterminer le meilleur choix d'anesthésiant pour garantir une euthanasie rapide et sans souffrance à différentes étapes du développement du poisson zèbre, couvrant les stades larvaires, juvéniles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer la méthode d'euthanasie la plus efficace et rapide à différents stades de vie des poissons zèbres, tout en minimisant la douleur et la détresse de l'animal. Les résultats de ce projet serviront de base à des recommandations qui seront bénéfiques à la communauté des chercheurs qui travaillent sur le modèle du poisson zèbre en France et en Europe.

Procédures

Les animaux seront soumis à une exposition aux anesthésiques pendant 1 heure par balnéation (dans l’eau de nage), suivie d'une période de suivi de 24 heures. Les battements du cœur et les réflexes des animaux sont observés pendant 1 heure en présence d'anesthésiants, puis pendant 1 heure de récupération. Ensuite, les poissons sont surveillés, pour les mêmes paramètres, trois fois post-récupération : à 3 heures, à 6 heures et à 24 heures. A l’issue de cette période, les animaux seront euthanasiés (24h post-exposition).

Impact sur les animaux

Lors de la phase de récupération, les animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou des effets indésirables, notamment des signes d'intoxication, tels que des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage.

Devenir

Étant donné que l'exposition aux surdoses d'anesthésiants pendant une heure pourrait entraîner une détérioration irréversible et un inconfort prolongés des animaux, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L'étude dont il est question vise à trouver des méthodes d'euthanasie qui soient rapides, efficaces et qui minimisent la souffrance des animaux. Le remplacement des animaux par des modèles in vitro ou in silico n'est pas possible dans ce cas. En effet, ces modèles ne permettent pas de reproduire l'expérience de l'euthanasie chez les animaux. Ils ne peuvent donc pas être utilisés pour évaluer l'efficacité et la sécurité des protocoles d'euthanasie.

Réduction

La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Nous aurons ainsi besoin de 35 individus pour chaque méthode d'euthanasie, totalisant ainsi 315 individus pour les neuf méthodes. En testant ces méthodes sur les trois stades de développement, nous utiliserons un total de 945 animaux sur une période de 5 ans. Cette approche nous permettra d’obtenir des données statistiquement valides et une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergements des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont enlevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères (nourriture vivante), ce qui leur permet de chasser. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Un suivi des animaux rigoureux sera effectué avec attribution de note qui dicteront des actions (point limites). Les poissons zèbres sont maintenus à une température de 26 degrés Celsius. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est largement utilisé dans la recherche scientifique, notamment en raison de la transparence de ses larves et de sa génétique similaire à celle des humains. L'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants est une pratique courante pour ces poissons. Bien qu'elle soit efficace chez les adultes, aucune étude n'a encore évalué son efficacité aux premiers stades du développement du poisson zèbre. Notre objectif est de déterminer l'efficacité de différents agents anesthésiques pour l'euthanasie des poissons zèbres à trois moments clés de leur développement : la formation des organes (embryons), l'acquisition des comportements sociaux (larves) et la transition de la larve au stade juvénile. En étudiant l'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants à ces moments critiques du développement du poisson zèbre, nous pourrons mieux comprendre leur efficacité et garantir une euthanasie sans douleur pour ces animaux. Cette étude contribuera à améliorer les pratiques d'euthanasie des poissons zèbres dans les laboratoires de recherche.

Fabriquer un réactif de diagnostic sérologique : 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récolter les parasites de leur cavité abdominale. Elles reçoivent une inoculation intrapéritonéale de toxoplasmes et une inoculation de cellules tumorales qui déclenche une ascite. L'infection se manifeste par des poils hérissés et un dos courbé, signes que le porteur décrit comme la preuve que l'inoculation a fonctionné. La culture cellulaire est écartée au motif du rendement : il faut environ 80 milliards de parasites par production, quantité que le porteur affirme ne pas pouvoir obtenir in vitro.

Objectifs

En France, la surveillance sérologique mensuelle (recherche d’anticorps dans le sang) de la toxoplasmose durant toute la durée de la grossesse chez les femmes enceintes séronégatives pour la toxoplasmose, est nécessaire en vue du dépistage de séroconversion en cours de grossesse pour la mise en place précoce d’un traitement adapté et limiter les complications pour le foetus. Le diagnostic sérologique est également utile pour les immunodéprimés, les patients susceptibles d'être greffés, les donneurs d'organes. L’utilisation d’antigènes est nécessaire pour la recherche d’anticorps. En l'absence d'antigène de toxoplasme seul commercialisé, la fabrication de l'antigènes de toxoplasma est donc une activité nécessaire pour les contrôles sérologiques faits en dehors de tests commerciaux.

Bénéfices attendus

Le projet est d’avoir des tests fiables permettant le diagnostic de la toxoplasmose, pathologie potentiellement grave puisque, elle peut entraîner des malformations congénitales mais aussi le décès de patients immunodéprimés chez l'Homme.

Procédures

Inoculation intrapéritonéale de parasites et de cellules effectuées pour créer une infection parasitaire qui se traduit par l'apparition de signes cliniques, preuve de l’infection.: 1 inoculation/souris, 1 minute. Inoculation intrapéritonéale de cellules TG180 induisant une ascite: 1 injection, 1 minute. Anesthésie flash à l'isoflurane: 1 seule, 1 min

Impact sur les animaux

L’inoculation intrapéritonéale de parasites chez la souris provoque une infection parasitaire. Les souris présentent des symptômes cliniques d'infection (poils hérissées, dos coubés), rentrant dans la grille de score et nous permettant de déterminer les points limites.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des parasites de la cavité abdominale.

Remplacement

L’alternative à l’utilisation d’animaux serait de produire l’antigène par culture cellulaire. Cependant plusieurs problèmes se posent et nous empêchent de basculer sur une technique de culture : - la reproductibilité de la méthode qui n'est pas fiable. En effet, nous savons par expérience que la multiplication des parasites in vitro est incertaine, avec un nombre de parasites variables d’une boîte de culture à l'autre ne permettant pas d'assurer un antigène reproductible entre les différents lots contrairement à la multiplication in vivo. - la qualité de l'antigène est différente entre une production d'antigène in vivo et une production in vitro. Les deux préparations de parasites sont différentes jouant sur la sensibilité de chaque méthode. - la quantité de parasites. Il faut pour la fabrication de cet antigène, la production d'un nombre très élevé de toxoplasmes. Cette énorme quantité de parasites (environ 80 milliards de parasites) ne peut pas être obtenue en culture cellulaire. La production en cultures cellulaires nécessiterait une grande quantité de boîte de culture pour obtenir la même quantité de parasites. A notre connaissance, aucune autre alternative n’a été développée pour obtenir une si grande quantité de parasites. Il y a quelques années, nous avons travaillé (pour la multiplication parasitaire) avec des cellules en suspension qui ne permettaient pas d’avoir un nombre suffisant de parasites. Nous avons donc changé de type cellulaire pour travailler avec des cellules adhérentes. Nous avons ainsi amélioré notre rendement de parasites en le multipliant par 5. Cependant, ce type cellulaire bien que facilitant l’invasion et la multiplication cellulaire n’est pas suffisant pour obtenir la grande quantité de parasites exigée pour la production d’antigène. Les approches in silico ne peuvent pas être envisagées car le diagnostic de la toxoplasmose se fait biologiquement avec les sérums des patients mis au contact de l’antigène.

Réduction

La standardisation de cette technique (concentration de parasites, cellules, réactifs, …) réalisée par notre laboratoire depuis plus de 30 ans permet de prévoir un nombre minimum de souris nécessaire à la fabrication d'antigène. Pour la fabrication de cet antigène, un nombre d'animaux a été estimé : en dessous de ce nombre de souris, le rendement pour l’obtention du nombre de parasites est trop faible pour assurer la fabrication d’un volume d’antigène suffisant. De plus, le protocole de fabrication a été optimisé pour minimiser le nombre de souris au maximum. Ainsi, historiquement la souche de parasite et la lignée cellulaire (nécessaire pour la multiplication des parasites) étaient entretenues sur souris (passages successifs) toute l’année de façon continue consommant un nombre important de souris. Actuellement, les parasites et la lignée cellulaire sont stockés congelés et décongelés en prévision de la production de l’antigène. C’est donc une approche expérimentale validée au cours du temps qui nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire avec une variabilité du volume obtenu. Nous ne pouvons prévoir la quantité d’antigène que par les volumes antérieurs utilisés annuellement.

Raffinement

Une surveillance accrue des souris (2 fois/ jour) est effectuée dans les 72 heures après leur inoculation par des personnels formés et expérimentés afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Après l’inoculation parasitaire, une attention particulière est portée sur 5 critères : l’apparence physique de l’animal (aspect du poil), son comportement (réponse aux stimuli externes, mobilité) et la présence de signes cliniques (respiration). L’utilisation d’un analgésique permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Il sera administré aux souris (5mg/kg) per os (dans un biberon) après inoculation de la souche parasitaire. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne).

Choix des espèces

Le modèle souris décrit dans les publications sont des souris (femelles) âgées de 8 semaines (20g) qui présentent un système immunitaire fonctionnel.

3 892 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à treize tests de force, treize mesures de motricité et treize échocardiographies sous anesthésie gazeuse. Un quart d'entre elles, celles dont le gène est aboli, développent une cardiomyopathie vers huit semaines et meurent vers douze, en perdant du poids et en adoptant une posture anormale à partir de la onzième. Les nouveau-nés reçoivent une injection intraveineuse après immobilisation par hypothermie sur de la glace humide, et les animaux circulent entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélèvements terminaux, le porteur écrivant espérer restaurer la protéine défectueuse avant d'envisager un essai chez l'humain.

Objectifs

Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le cœur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Ce projet est multi-site et sera réalisé sur 3 établissements.

Bénéfices attendus

À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.

Procédures

L'élevage des animaux transgéniques se fera dans l'établissement 1 avec biospsie de la queue sur animaux vigiles (1 fois par souris). Dans l'établissement 2 seront réalisées les -Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ), -les tests destinés à évaluer le force (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - injection en IV sur souriceaux immobilisés par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris). Les études par imagerie non invasive et test comportementauxseront réalisées dans l'établissement 3 : -mesure de la motricité dans un milieu ouvert (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris), échographie non invasive sous anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris).

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie autour 8 semaines, et mourront à 12 semaines. À partir de 11 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort, pour prélèvements terminaux.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes