Recherche appliquée
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- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
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- Troubles cardiaques
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- Troubles urogénitaux
Etude de l’intérêt des implants en graphène dans l’amélioration du diagnostic des pathologies rétiniennes et en thérapeutique (restauration visuelle) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Neuf examens de la rétine, sept séances d'enregistrement d'une heure et jusqu'à quatre heures de stimulation électrique sous anesthésie : 500 rats vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, une partie opérée sans réveil, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit une injection qui détruit leur rétine, d'autres portent une mutation qui les rend progressivement aveugles. La pose d'électrodes sous la rétine dure jusqu'à une heure trente, et le porteur décrit comme risques une inflammation persistante dans 5 % des cas, le décollement de la fenêtre crânienne, une hémorragie sous celle-ci ou l'arrachement du connecteur par l'animal. Le rat a été retenu parce que son œil est assez grand pour recevoir les implants, la souris ayant été écartée pour cette seule raison.
Objectifs
Les pathologies rétiniennes touchent chaque année 10 millions de personnes dans le monde. Les plus connues sont la rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) qui se caractérisent par la dégradation progressive des photorécepteurs et mènent irrémédiablement à la cécité. Afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints, il est essentiel de disposer d’outils performants pour les diagnostiquer le plus tôt possible et de développer des stratégies de restauration visuelle qui pallient les traitements médicamenteux actuels inefficaces. Divers types d’interfaces cerveau-machine ont été développés ces dernières années pour le diagnostic (enregistrement des signaux électrophysiologiques via des électrorétinogrammes) et pour la restauration visuelle (stimulation électrique des neurones résiduels). Le matériau des électrodes joue un rôle majeur dans les performances et la longévité de ces interfaces. Par exemple, les prothèses actuelles en tests cliniques ne permettent pas une résolution spatiale suffisante pour l’autonomie complète du patient aveugle. De même, les électrodes actuelles en or utilisées en diagnostic clinique ne fournissent pas une précision optimale pour la caractérisation des fonctions rétiniennes. Les matériaux carbonés possèdent de prometteuses propriétés électrochimiques qui permettraient une stimulation électrique plus efficace et/ou une restitution plus fidèle des signaux neuronaux rétiniens. L’objectif de ce projet est de démontrer la performance de ces nouveaux types d’implants, aussi bien dans la détection de signaux rétiniens anormaux (diagnostic) ou bien dans la stimulation électrique sous-rétinienne à la manière de photorécepteurs artificiels (thérapeutique). Cette étude sera menée sur deux modèles murins. Pour les implants en mode diagnostic, la validation fonctionnelle sera effectuée par enregistrements de l’activité de l’œil in vivo (électrorétinogrammes). En mode thérapie (restauration visuelle) la validation fonctionnelle sera réalisée par stimulation électrique de la prothèse et enregistrement simultanée des signaux corticaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de démontrer la supériorité des matériaux carbonés incorporé dans des interfaces cerveau-machine en permettant un enregistrement d’électrorétinogrammes (ERG) de qualité plus fine ainsi qu’en apportant une stimulation électrique plus stable et plus performante dans le temps. Ces implants, biocompatibles et plus performants que les prothèses classiques métalliques, permettront la mise en place d’une nouvelle génération d’interfaces dans l’espoir d’une translation clinique chez l’humain pour le diagnostic précoce de pathologies liées à la dégénérescence de l’épithélium rétinien pigmentaire (RPE) et pour la restauration visuelle.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : Injection d’un composé chimique induisant une dégénération de la rétine (5 min) : 1 fois par rat sous anesthésie générale et analgésie. Enregistrements des signaux rétiniens sur rats (1h) : 7 séances par animal sous anesthésie générale pour les rats normaux, et 5 fois par rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine sous anesthésie générale (fixe) Examens de la rétine : - les rats normaux seront imagés un jour avant chaque session d’enregistrements rétiniens 7 fois sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - les rats rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine seront imagés 5 fois afin d’observer la dégénérescence sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - Tous les rats avec des implants sous la rétine feront 9 examens de la rétine, le tout sous anesthésie générale fixe pendant 10 min. Chirurgie pour implantation sous la rétine d’électrodes : - rats normaux et aveugles, 1 fois par animal avec ou sans réveil pendant au maximum 1h30 sous anesthésie générale et sous analgésie Imagerie du cerveau et stimulation électrique de l’implant sous-rétinien sous anesthésie fixe - les rats avec un implant rétinien seront imagés et stimulés pendant 4h avec euthanasie à la fin de l’expérience. - autres rats avec un implants rétinien seront imagés sur 8 séances pendant 1h30. Mesures des propriétés électrochimiques l’implant : - les rats implantés avec un implant sous la rétine feront l’objet de mesures électrochimiques sur 9 séances, pendant 1h30/séance, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Durant les chirurgies une mauvaise réaction à l’anesthésie peut survenir tel que : stress thermique, détresse cardio-respiratoire, arrêt cardiorespiratoire (rare). Les anesthésies par injection intrapéritonéales répétés peuvent engendrer à terme une résistance à l’anesthésie. Pour les animaux implantés en sous-rétinien, une éventuelle inflammation au niveau du site d’implantation peut apparaître, se résorbant naturellement généralement sous 7 jours (95 pour cent des cas). Dans les cas où l’inflammation ne se résorbe pas (5 pour cent), le rat sera surveillé, re-imagé à 14 jours et gardé s’il ne montre pas de signes de douleur, détresse ou de problèmes oculaires (paupière gonflée, paupière fermée, cataracte). La pose d’implants chronique avec fenêtre/aminci cranial peut engendrer dans les 3 premiers jours post-chirurgie un stress physique et une perte de poids, en plus du stress social lié à son isolement en cage. Il existe également un risque que la fenêtre chronique se décolle, que les fils de suture sautent (auxquels cas ils doivent être immédiatement recousus), qu’il y ait une hémorragie sous la fenêtre, ou encore que l’animal arrache le connecteur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. En effet, des prélèvements et analyses complémentaires sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Dans ce projet, l’enregistrement des électrorétinogrammes ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau suite à un stimulus électrique ne peuvent pas être réalisés par des expérimentations ex vivo. Le suivi des caractéristiques électrochimiques dans des conditions proches de l’humain n’a de sens qu’évalué in vivo chez le rongeur en pré-clinique. De même, les activations neuronales et variations de flux sanguin mesurées par les techniques d’imagerie par ultrasons au niveau du cortex visuel ne peuvent être observées que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation du modèle animal est donc indispensable.
Réduction
Basé sur l’expertise du laboratoire, sur des projets proches, le nombre d’animaux a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise implantation, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Ceci implique l’utilisation de 500 animaux au total.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum, et sont hébergés en binôme avant le début des expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce utilisée. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Lors des différentes procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie gazeuse ou fixe intrapéritonéale prodiguée par une seringue et une aiguille. Un analgésique, un anesthésiant local et un anti-inflammatoire seront administrés afin que l’animal sous anesthésie ne ressente aucune douleur pendant l’expérimentation. La douleur post-opératoire est gérée par l'administration d'analgésique jusqu’à 3 jours post-opération. Une signalétique spécifique mise en place permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux en expérimentation tout particulièrement pour les chirurgies. Tout signe d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale, dos courbé, position couchée sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, réduction de la mobilité. Des points limites adaptés au projet ont été définis.
Choix des espèces
Les rats présentent une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. Nous utilisons généralement dans le cadre de nos études des rats normaux, dont la taille de l’œil est adaptée à celle des implants fabriqués. Un modèle plus petit tel que les souris n’aurait pas convenu, du fait du trop petit diamètre de l’œil comparé aux implants de diagnostic et de stimulation électrique. Leur rétine devient mature à partir de 8 semaines d’âge, aussi nous les utiliserons à partir de 9 semaines. Des rats de lignée transgénique modélisant la rétinite pigmentaire montre une dégénérescence des photorécepteurs au bout d’environ 9 mois. Nous les utiliserons à partir de cet âge là. Ce modèle génétiquement modifié n’est pas à phénotype dommageable. En effet, La mutation induite entraîne la dégradation progressive des photorécepteurs et donc une cécité progressive, mais pas de douleur, détresse ou souffrance supérieure à celle causée par l’introduction d’une aiguille. Nous utilisons également un autre un modèle de dégénérescence héréditaire de la rétine qui débute à partir de 3 semaines post-naissance. Les enregistrements classiques des signaux rétiniens à partir de 3 mois d’âge montrent un signal plat du fait de la dégénérescence totale. Nous les utiliserons à partir de 2 semaines d’âge jusqu’à 2 mois d’âge, afin de visualiser l’évolution des signaux rétiniens avec l’avancée de la pathologie.
Évaluation d’approches thérapeutiques dans un modèle murin humanisé de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, leur diaphragme et leur cœur, 1 880 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses de la mutation humaine de la dystrophie myotonique de type 1, activée par un antibiotique ajouté à la nourriture, elles reçoivent une à quatre injections intraveineuses sous anesthésie, deux prélèvements sanguins, des mesures de force d'agrippement, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. Une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie profonde sert à mesurer la force musculaire, la mise à mort suivant immédiatement, avant tout réveil. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe de douleur même après plusieurs mois d'induction du phénotype, et renvoie le bénéfice attendu, un médicament, à un éventuel passage ultérieur en essai clinique.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse et fonte musculaire, problème de relaxation), cardiaques (trouble du rythme) et neurologiques, particulièrement invalidantes. Actuellement il n’existe pas de traitement pour cette maladie mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et en essais cliniques chez l’homme. L’utilisation de modèles animaux qui reproduisent des symptômes moléculaires et fonctionnels de la maladie est cruciale pour ces études. Un nouveau modèle murin de la DM1 qui exprime la mutation humaine et reproduit les symptômes musculaires a été caractérisé. Ce modèle qui combine les qualités des deux modèles précédemment les plus utilisés va devenir une nouvelle référence pour les études préclinique de composés thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’utiliser ce modèle pour évaluer plusieurs nouvelles approches thérapeutiques innovantes développées par le laboratoire. L'objectif à long terme reste d'identifier un composé thérapeutique capable d'aller en essai clinique chez l’homme et à terme devenir un médicament.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie musculaire la plus fréquente chez l’adulte (1 personne sur 8000 en moyenne au niveau mondial) et est très invalidante. Il n’y a encore aucun médicament pour cette maladie. L’attente des patients pour un traitement ciblé est donc très forte. L’objectif principal de ce projet est la validation de composés thérapeutiques innovants, développés dans notre laboratoire, qui permettraient une amélioration des symptômes spécifiques à la maladie dans le modèle murin, pour ensuite passer à des essais chez l’homme et avoir un médicament spécifique. Les composés évalués dans ce projet pourraient à terme bénéficier, en théorie, à tous les patients atteints de DM1. Par ailleurs, ce projet va également permettre de valider ce nouveau modèle murin comme modèle de référence pour l’évaluation d’approches thérapeutiques qui profitera ainsi à toute la communauté scientifique DM1 et donc accélérer le développement et à la validation d’autres médicaments pour la maladie.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'injections en intraveineuse, sous anesthésie. Il y aura, selon les procédures, entre 1 et 4 injections espacées de 2 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Les souris feront également l'objet de prélèvements sanguins. Cette intervention de moins de 5 min se fera deux fois, un début et en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Une partie des animaux fera l'objet d'évaluations fonctionnelles non-invasives (mesure de force d’agrippement, échographie cardiaque, électrocardiogramme, mesure de respiration). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force nécessitant une intervention chirurgicale d’environs 15 min sous analgésie et anesthésie profonde. Cette mesure sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil.
Impact sur les animaux
En présence d’inducteur dans la nourriture, les souris vont développer un phénotype, très similaire à celui des patients atteints de Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d’activité. Cependant nos études montrent que les souris ne montrent pas de problème à se déplacer ou à se nourrir. De plus les souris ne montrent pas de signe de douleur même après plusieurs mois d’induction. Donc les nuisances ou effets indésirables qu’elles pourraient expérimenter seront surtout liés à ce phénotype DM1, que nous cherchons à obtenir, similaire à celui des patients et aux procédures dont elles feront l’objet (pour l’identification à l’animalerie d’élevage ou les procédures du projet). A cause des actes dont elles feront l’objet, les souris pourraient ressentir une gêne au point d’injection/prélèvement, et une détresse légère lors des manipulations (comme la mesure du poids chaque semaine à partir du début du protocole ou la contention pour les injections). Les animaux pourraient également subir un stress thermique dû à l’anesthésie ainsi qu’éventuellement une petite hémorragie temporaire suite au prélèvement sanguin. Concernant les effets indésirables dus au traitement, des versions similaires aux composés qui seront évalués dans cette étude ont déjà tété injectées dans des modèles murins d’autres pathologies musculaires et n’ont pas montré de signes évidents d’effets secondaires délétères.
Devenir
Tous les animaux qui entreront dans ce projet (soit un maximum de 1880 souris) seront euthanasiés à la fin de la procédure à laquelle ils seront associés. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des organes atteints. Dans le cas du modèle murin de la maladie que nous étudions (Dystrophie myotonique de type 1), nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles, du diaphragme et du cœur, ce qui rend strictement nécessaire l’euthanasie en fin de procédure afin de prélever ces organes. Ces marqueurs moléculaires sont très spécifiques à la maladie et corrèlent très bien avec l'état de sévérité et donc également avec l'efficacité du traitement. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyses de marqueurs sanguins pour déceler une éventuelle toxicité.
Remplacement
Dans un objectif de REMPLACEMENT, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie (Dystrophie Myotonique de Type 1 ou DM1) sera effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Cependant les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutique nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation humaine DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et surtout physiologique. Ainsi, seuls les composés montrant une forte efficacité sans effet délétère seront injectés dans un premier temps en intramusculaire puis par voie intraveineuse dans les souris DM1.
Réduction
Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les souris n’ayant pas les symptômes d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles (études fonctionnelles et analyses moléculaires sur plusieurs organes comme les muscles et le cœur). Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation des animaux prévus dans la seconde étape, et ainsi de suite. Nos études précédentes, ainsi que l’utilisation d’un logiciel de statistiques, nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Ensuite les groupes seront comparés grâce à des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, un maximum de 1880 animaux sera utilisé.
Raffinement
Finalement, dans le but RAFFINER le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour /nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès illimité à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements suivants : carré de lanière kraft, rouleau en carton, bâtonnet en bois ou abri en carton. Si un animal se retrouve isolé (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage...), il bénéficiera de deux enrichissements et il sera vérifié par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) pour valider ses conditions d’hébergement. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites (spécifiques à chaque protocole mis en place) ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids importante seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Par ailleurs au cours des différentes procédures, tout acte le nécessitant sera accompagné d’une anesthésie et d’un traitement préventif de la douleur. De plus, une surveillance accrue des animaux sera effectuée pendant une à deux heures après chaque acte.
Choix des espèces
L’efficacité d’une approche thérapeutique pour la Dystrophie Myotonique de Type 1 (DM1) doit être validée sur un modèle animal de cette pathologie. A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrits pour la maladie. Cependant seuls les modèles murins montrent des symptômes robustes (physiologiques et moléculaires) similaires à ce qui est observé chez les patients. L’étude des différents modèles murins a permis la compréhension de plusieurs symptômes observés chez les patients. Dans ce contexte, le modèle murin DM1, utilisé pour ce projet, présente un énorme avantage : il a la mutation humaine qui ne s’active qu’après l’ajout d’un inducteur (ici un antibiotique : la doxycycline) dans la nourriture. Les souris ne présentent donc pas de symptômes pendant les périodes d’élevage. Quand on active la mutation, à l'âge adulte, les souris développent un phénotype similaire à ce qui est observé chez les patients DM1 : caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction et qui donne son nom à la maladie), de la faiblesse musculaire et de forts défauts moléculaires dans plusieurs organes. Aucune mortalité n’est observée. Pour le projet, les souris seront utilisées à l’âge adulte, quand tous les organes, et surtout les muscles, sont bien développés et que la croissance est terminée.
Intérêt d’associer activité physique et antipsychotique (aripiprazole) dans un modèle murin de schizophrénie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour mesurer si l'exercice physique améliore la tolérance d'un antipsychotique, 214 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un groupe reçoit une injection quotidienne de phencyclidine pendant quatorze jours, censée reproduire des symptômes de schizophrénie, puis de l'aripiprazole dans l'eau de boisson, deux séances d'imagerie sous anesthésie générale et un mois de tests comportementaux. Parmi eux, l'inhibition du réflexe de sursaut place chaque souris une trentaine de minutes dans un dispositif qui lui inflige trente sursauts mesurés. 118 souris pourront être réutilisées dans d'autres protocoles, les 96 autres étant tuées par perfusion-fixation pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique fréquente (1% de la population), qui regroupe des troubles multiples, liés à la pathologie elle-même, au style de vie des patients mais aussi aux traitements et au caractère chronique de leur prise. Hormis les troubles directement liés à la pathologie, le style de vie des patients fait souvent empirer la situation (sédentarité, hygiène négligée, troubles du sommeil, mauvaise alimentation…). S’ajoutent à cela les effets indésirables et inévitables des traitements, qui sont généralement des traitements à vie. De façon très intéressante, la plupart de ces problèmes peuvent être en partie contrebalancés par l’activité physique, reconnue pour être un moyen non-pharmacologique très puissant pour améliorer la santé, non seulement physique mais aussi mentale. De plus en plus d’études révèlent que l’activité physique stimule les fonctions cérébrales en augmentant notamment le nombre de cellules gliales, de neurones, de synapses, et de dendrites, et de vaisseaux sanguins. De tels effets sont associés à une amélioration de la cognition et à une augmentation de la résistance au stress, aussi bien chez l’homme que chez l’animal. L’objectif de ce projet est d’une part, d’approfondir dans des modèles murins de schizophrénie l’impact d’un protocole d’entraînement physique sur l’efficacité et la tolérance d’un traitement chronique par l’aripiprazole (antipsychotique le plus prescrit en France) et d’autre part d’appréhender les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces modulations physiologiques. Il s’organise en 2 parties. La première vise à développer un système innovant de suivi de l’activité physique volontaire chez des souris ne nécessitant pas d’isoler les animaux. Il sera d’abord testé chez des souris saines puis chez un modèle animal de schizophrénie (délétion du gène de la sérine racémase), connu pour son hyperactivité. La seconde partie est dédiée au traitement chronique, soit par l’aripiprazole, soit par l’entraînement physique ou les deux, d’un modèle animal de schizophrénie induit par l’administration subchronique de phencyclidine.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique s’inscrit en parallèle d’un essai clinique visant à démontrer les effets bénéfiques de l’activité physique adaptée chez les patients souffrant de schizophrénie. Les données recueillies chez l’animal permettront d’apporter des arguments scientifiques supplémentaires sur les bienfaits de l’activité physique sur le cerveau et sur la prévention des effets secondaires des antipsychotiques. La réalisation de ce programme permettra d’affiner la connaissance des mécanismes d’une part, sous tendant les effets bénéfiques de l’activité physique sur les altérations comportementales, anatomiques, électrophysiologiques et neurobiologiques en lien avec la schizophrénie et d’autre part, d’approfondir les mécanismes d’action synergique entre une telle activité physique et un traitement pharmacologique dans ce contexte. Il permettra enfin de développer de nouveaux outils pour le suivi d’activité physique (roues), avec des applications potentielles dans d’autres pathologies.
Procédures
Dans la première partie du projet, les animaux seront soumis à un suivi d’activité dans les roues durant 3 semaines. Dans la seconde partie du projet, les animaux seront soumis à environ 3 mois de suivi, avec 3 semaines d’induction du modèle, 7 semaines de traitements et 1 mois de tests comportementaux. Le modèle consiste en l’injection sous cutanée (durée : 1 minute) quotidienne d’un psychotrope durant 14 jours consécutifs. Le traitement consiste en l’administration d’un antipsychotique dans l’eau de boisson avec ou sans activité physique (roue). Pendant cette période, 2 sessions d’imagerie d’une heure maximum seront réalisées (anesthésie générale). Des séries de tests comportementaux seront ensuite réalisés, dont une majorité directement dans la cage d’hébergement (Intelllicage). L’inhibition du réflexe de sursaut sera évaluée en une seule session d’une durée d’environ 25 min pour chaque souris. La sociabilité de l’animal sera évaluée lors d’une session de 10 minutes. Enfin, une partie des souris seront mises à mort par la méthode de perfusion/fixation qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Pour les 2 parties du projet, l’utilisation d’isoflurane par voie inhalée pour l’anesthésie est à prendre en considération par son effet relativement désagréable durant quelques instants au niveau des muqueuses, et par la perte de connaissance qu’il induit. Pour la seconde partie du projet, s’ajoutent les nuisances liées au modèle animal et aux évaluations. Pour le modèle "PCP", outre les aspects stressants des injections quotidiennes de phencyclidine (PCP) (durée d’injection : environ 1 minute), ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie. Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Le traitement antipsychotique n’a pas d’effet aigu notable et l’imagerie est réalisée sous anesthésie générale (1 heure maximum par session). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement lié aux tests comportementaux qui seront réalisés. Les évaluations comportementales en Intellicage sont en majorité des tests d’activité spontanée qui ne sont pas décrits pour induire un stress marqué. Seuls les tests d’impulsivité et la limitation temporelle de l’accès à l’eau peuvent induire un certain stress mais pas de douleur. Pour les autres tests, celui de l’inhibition du réflexe de sursaut peut aussi générer un stress. En effet, les animaux sont placés pour une durée d’environ 30 minutes dans le dispositif et les sons diffusés entraînent des sursauts qui sont mesurés (30 essais).
Devenir
Les animaux de la première partie du projet pourront tous être réutilisés, de même que les 10 « souris stimulus » utilisées dans le test de sociabilité de la seconde partie du projet. Les autres animaux de la seconde partie du projet seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’échantillons biologiques.
Remplacement
Dans la mesure où le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau, facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés, il y a absolue nécessité de réaliser des études comportementales (in vivo). Par ailleurs, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu en imagerie (réduction du volume de certaines structures cérébrales de 10% par exemple) et pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les données seront comparées par des tests non-paramétriques et/ou paramétriques en fonction de leur distribution. La première partie du projet contiendra des mâles et des femelles, afin d’évaluer les différences d’activité entre les sexes mais pour la seconde partie du projet, un seul sexe sera testé (mâles) afin de limiter le nombre de groupes d’animaux. Il est indéniable qu’une comparaison mâle / femelle serait idéale, cependant, cette étude est une preuve de concept et la pathologie cible, la schizophrénie, connue pour présenter des symptômes plus graves chez les patients masculins. Le suivi longitudinal par imagerie IRM permettra aussi de réduire le recours aux méthodes ex vivo.
Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés régulièrement durant la durée totale du projet afin de les habituer au contact humain. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en permettant de faire de l’activité physique. Le traitement à l’aripiprazole sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage. L’utilisation du système Intellicage permettra de réaliser des tests directement dans la cage d’hébergement en groupe, ce qui réduit le stress des animaux par rapport aux méthodes standards (isolation des animaux pour un suivi individuelle des performances). Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces, l’imagerie et la mise à mort.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, la sérine racémase ainsi que les cibles pharmacologiques des traitements sont présentes chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP et récepteurs dopaminergiques et sérotoninergiques pour l’aripiprazole) et sont caractérisées par une activité fonctionnelle similaires dans les 2 espèces. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), à un âge auquel les grands systèmes physiologiques sont matures. Cela correspond à l’âge d’apparition de la pathologie chez les patients.
Etude de pharmacocinétique et de pharmacodynamie de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées d'une tumeur sous la peau ou par voie intraveineuse, puis injectées jusqu'à une fois par jour pendant dix-huit semaines et saignées jusqu'à deux fois par jour à la veine caudale, 20 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à quatre prélèvements rétro-orbitaires sous anesthésie et un prélèvement terminal. L'objet du projet reste en amont de tout traitement : mesurer la concentration plasmatique de composés et calibrer les doses des études d'efficacité à venir, à raison de cent études sur cinq ans. Le porteur qualifie de "légères" les douleurs liées aux injections et aux prélèvements, tout en listant comme possibles la nécrose, l'ulcération de la tumeur et la paralysie.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer la concentration plasmatique de composés thérapeutiques, caractériser les niveaux et la durée de saturation de la cible à différentes doses et permettre l’identification de cellules immunitaires ou de facteurs solubles impliqués dans la réponse induite par ces composés. Les études menées sur des modèles de souris porteuses de tumeur permettront, également, d’analyser la corrélation entre ces paramètres et la croissance tumorale. L’ensemble des données recueillies dans ce projet serviront à affiner les doses et fréquences utilisées dans les études ultérieures d’efficacité.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intra-tumoral (maximum 1 fois /jour pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante en intra-péritonéal, sous-cutané ou per os (maximum 1 jour sur 2 pendant 18 semaines, 15 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (maximum 2 fois /jour, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Administration de composé thérapeutique en intraveineuse (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante en intraveineuse (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire ou en intracardiaque.
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du composé thérapeutique. Stress et douleur légère lors de l’administration de la molécule déplétante/neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables sévères liés au composé thérapeutique : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, un minimum de 4 prélèvements par point temporel est nécessaire pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques et/ou pharmacodynamiques statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. 20 animaux maximum par groupe sont donc requis pour l’étude d’un composé dans une procédure. Dans le cas où l’étude permet le développement de méthodes de dosage adaptées à des micro-volumes de sang, le nombre d’animaux utilisés est considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées car l’ensemble des valeurs peuvent être obtenues sur un même animal. Dans ce cas, le nombre d’animaux par groupe peut être diminué à 4 minimum pour les études sans greffe tumorale et 10-15 pour celles avec greffe pour tenir compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Un maximum de 100 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou les tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé administré et/ou les cellules tumorales greffées pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Investigation par IRM de la neurotoxicité des ganglions de la racine dorsale induite par des AAV chez le primate non humain 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Déjà utilisés dans d'autres projets et pour cette raison présentés comme habitués aux manipulations, trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du protocole. Ils subissent quatre anesthésies, dont une chirurgie de quatre heures avec ouverture des vertèbres pour poser un cathéter dans l'espace sous-arachnoïdien, des ponctions de liquide céphalorachidien et des prises de sang. L'injection d'un virus adéno-associé vise à provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à détecter par IRM, et du bleu de méthylène est injecté en fin de procédure pour vérifier le trajet du cathéter. Le porteur affirme que cette étude est "nécessairement réalisée chez l'animal", au motif qu'elle a "pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale".
Objectifs
Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.
Procédures
Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.
Devenir
Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.
Remplacement
Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.
Réduction
Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.
Raffinement
Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.
Choix des espèces
Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.
Etude de l’effet de la longueur de la chaine carbonée des acides gras sur la lipémie postprandiale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Améliorer l'image nutritionnelle des matières grasses laitières, et par là encourager leur consommation : 18 hamsters dorés vont être utilisés dans ce but, dans des procédures déclarées de souffrance légère, puis proposés à l'adoption ou inclus dans un autre protocole. Chacun jeûne douze heures avant d'être gavé à l'huile par sonde, une fois par semaine pendant trois semaines. Sous anesthésie gazeuse, jusqu'à 10 % de leur volume sanguin leur est prélevé chaque semaine, en six ponctions étalées sur six heures lors du premier cycle, trois lors du second. Le porteur revendique une réduction de plus de moitié des effectifs grâce à cette réutilisation des mêmes individus, et annonce comme bénéfice une meilleure qualité nutritionnelle des produits laitiers, qui "encouragerait davantage leur consommation".
Objectifs
L’ingestion d’un repas riche en graisse provoque une augmentation excessive des lipides dans le sang. Cette augmentation du taux de lipides dans le sang est connue comme étant un facteur de risque de développer des maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous allons vérifier si le remplacement d’une partie des lipides alimentaires par des acides gras qui ont une structure particulière (dits acides gras à chaînes courte et moyenne) entraînerait une moindre augmentation du taux de lipides après un repas et serait donc favorable à une meilleure santé cardiovasculaire. Nous prévoyons donc d’administrer ces lipides laitiers par voie orale à des hamsters, d’analyser les différents taux de lipides dans le sang pendant les 6h qui suivent l’administration et de comparer les résultats avec ceux obtenus après l’administration chez ce même groupe de hamsters de lipides laitiers standard ou de l’huile de palme (acides gras connus pour leur effet délétère). Ces expériences seront réalisées sur deux lots d'animaux et les expérimentations sur chaque lot sont appelées par la suite cycle 1 d'expérimentation et cycle 2 d'expérimentation.
Bénéfices attendus
Il est attendu une diminution des taux de lipides dans le sang après l’ingestion des lipides laitiers riches en acides gras à chaînes moyennes et courtes comparé aux lipides laitiers standard ou encore à l’huile de palme. Trois paramètres seront étudiés : l’évolution du taux de lipides pendant 6 heures après l’administration, taux cholestérol estérifié dans les HDL (bon cholestérol) et les LDL (mauvais cholestérol) et la mesure d’activité d’un transporteur de lipide (CETP). Les produits laitiers sont une source importante de protéines et de calcium, et leur consommation fait partie intégrante des habitudes alimentaires en France. La modification de leurs lipides pour les rendre moins susceptibles d’induire des maladies cardiovasculaires constituerait une amélioration significative de leur qualité nutritionnelle, et encouragerait davantage leur consommation.
Procédures
- Mise à jeun (12h) avant chaque gavage à l'huile à l'aide d'une sonde souple. - Gavages une fois par semaine pendant 3 semaines. - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse :
Impact sur les animaux
Gavage => nuisances en lien = stress de courte durée lié à la contention. Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés => nuisances en lien = stress lié à l'anesthésie
Devenir
Les animaux peuvent être inclus dans la mesure du possible dans un autre protocole. Autrement, ils seront proposés à l'adoption (placement).
Remplacement
La lipémie postprandiale est le résultat de plusieurs processus physiologiques impliquant la digestion, l'absorption, l'hydrolyse et la captation tissulaire. Son évaluation exige donc une expérimentation in vivo. Il n'existe aucune méthode alternative (in silico ou in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques impliqués dans la réponse postprandiale.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude, nous avons prévu la réutilisation des animaux, dans chacun des 2 cycles, avec des périodes de wash-out de minimum une semaine. En effet dans notre étude nous avons trois groupes correspondant chacun à une fraction lipidique. En théorie, il aurait fallu 54 animaux, au total, pour avoir 9 animaux/groupe/cycle d'expérience, alors que nous prévoyons seulement 18 hamsters pour la totalité de l'étude, soit une réduction de plus de 50%.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux pour chaque procédure sont optimisés afin d’obtenir le maximum d’informations et des résultats fiables. Les procédures utilisées étant de sévérité légère, nous utilisons des points limites adaptés qui consistent essentiellement à surveiller le poids des animaux, un animal ayant perdu du poids ne sera pas utilisé après la période de wash-out. Les points limites retenus pour la procédure expérimentale de ce projet seront déterminés lors du suivi quotidien des animaux. Une mauvaise hygiène, un repliement sur soi, une diminution de l’activité, une diminution de la prise alimentaire (boisson et nourriture), une perte de poids (>10%) représentent des critères d’observation traduisant la présence d’une souffrance. En cas de souffrance, l’animal est mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, l’animal est euthanasié.
Choix des espèces
Le hamster syrien doré est un animal qui présente de nombreuses similitudes en ce qui concerne le métabolisme des lipides. Il présente une gestion de l'absorption des lipides ainsi qu'une répartition de cholestérol présence du bon et du mauvais cholestérol) similaires à ce qu'on retrouve chez l'homme. Nous avons fait le choix d'utiliser des hamsters adultes (âgés de plus de 8 semaines, environ 100g) ce qui nous permet de réaliser les différents prélèvements dans de bonnes conditions.
Evaluation du MALDI-Imaging pour la détection et localisation de marqueurs palustres dans un modèle de neuropaludisme expérimental
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Injectées dans l'abdomen avec Plasmodium berghei, piquées à la queue tous les deux jours pour un frottis, contenues à la main deux à trois minutes par jour pendant cinq jours pour recevoir un traitement, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir du onzième jour, elles peuvent présenter des signes neurologiques comme une paralysie, et sont alors tuées afin de prélever leurs organes. Quatre d'entre elles servent uniquement à entretenir la souche parasitaire par prélèvement sanguin derrière l'œil, avant d'être tuées elles aussi. Le porteur écrit que les points limites ont été fixés de façon à prendre en compte les signes neurologiques "sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche", et toutes les souris finissent tuées pour l'analyse de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins.
Objectifs
L’objectif du présent projet est d’utiliser, pour la première fois, l’approche innovante du MALDI-IMS pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques d’infections/évolutions palustres en utilisant un modèle murin avec atteinte neurologique. Il est nécessaire de présenter l’approche par MALDI IMS. La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) permet l'analyse de molécules directement à partir de coupes de tissus, permettant l'étude de la distribution spatiale des composés, qui peuvent être des molécules biologiques telles que des protéines et des peptides, lipides, éléments chimiques, métabolites. Ainsi, la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est capable de déterminer la distribution de centaines de molécules à la fois directement à partir de coupes de tissus. Puisque les tissus sont analysés intacts sans homogénéisation, les relations spatiales des molécules sont préservées. L’objectif du présent projet est donc d’ouvrir de nouvelles pistes sur la compréhension des infections palustres dans un modèle animal en utilisant pour la première fois l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI ou MALDI-IMS, mais également de faire la preuve du concept de l’intérêt de cette technologie pour évaluer la distribution d’un traitement anti-palustre et notamment déterminer si la molécule thérapeutique co-localise avec la cible parasitaire, et connaitre les conséquences de ce traitement au niveau des lésions neuronales. Enfin, savoir si la molécule thérapeutique est dégradée au niveau central avec la détection de changements métaboliques. Il est également envisagé d’étudier les effets indésirables du traitement tels qu’une activité hors cible et son effet toxique (eg, altération du fonctionnement d’un organe sain). Outre une analyse sur des coupes de cerveaux, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins seront prélevés pour les analyses en MALDI IMS
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera notre compréhension des partenaires protéiques participant à la formation des obstructions capillaires et il permettra d’identifier des marqueurs protéiques pour le diagnostic précoce d’une atteinte cérébrale. Par ailleurs, il améliorera notre connaissance sur les mécanismes neurodégénératifs de cette atteinte centrale, une analyse spatiale et temporelle de ces marqueurs protéiques semble indispensable. L’imagerie MALDI ou MALDI-IMS est un outil de choix pour répondre à ces attentes. Cette technologie a déjà fait ses preuves pour d’autres pathologies avec atteinte centrale offrant la possibilité d’identifier rapidement et facilement des zones cibles du cerveau ainsi que la bio distribution d’un médicament. La visualisation de la distribution des médicaments dans les tissus a permis d’orienter les chercheurs sur le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques.
Procédures
Il faudra injecter aux souris avec une souche donnant des atteintes neurologiques (injection intrapéritonéale dure moins d'une minute). Les souris seront piquées pour administrer les traitements par voie intrapéritonéale avec contention (prise manuelle) pendant 3 jours consécutifs après détection des premiers parasites sanguins (la contention et la piqure dure entre 2 à 3 minutes). Les souris subiront également des piqures sans contention au niveau de la queue pour les frottis tous les 2 jours (la piqure à la queue dure moins d'une minute). 4 souris subiront un prélèvement sanguin rétro orbitaire afin d'entretenir la souche mais également assurer l'infection des lots expérimentaux (l'ensemble du rétro orbitaire dure environ 5 minutes). Une pesée sera également réalisée en alternance avec les frottis tous les 2 jours (la pesée dure 2 minutes). Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’apparition des symptômes est importante pour avoir une chronologie des mécanismes cérébraux impliqués.
Impact sur les animaux
L'infection des groupes « infectés » et « infectés traités » entrainera des atteintes neurologiques, et la mort pour les souris concernées. L'administration des médicaments et les infections obligeront les souris à être manipulées, contentionnées - les souris concernées ne seront pas libre de leur mouvement pendant 1 à 2 minutes (pendant 5 jours consécutifs). Le recueil de la goutte de sang pour les frottis entrainera une piqure et une douleur au niveau de la queue pendant 1 minutes tous les 2 jours. La réalisation des lots expérimentaux grâce aux 4 souris entrainera consécutivement l'anesthésie, le prélèvement rétro orbitaire (5 minutes environ) et l'euthanasie de ces 4 souris. La pesée entrainera une manipulation de moins de deux minutes. Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L'infection des souris entrainera également une perte de poids modérée 1 à 2 grammes pendant 2 jours (3 jours après l'infection).
Devenir
L'étude se portant sur la recherche de marqueurs protéiques et tissulaires propre au paludisme, l'ensemble des souris seront euthanasiées
Remplacement
Les objectifs généraux sont de réaliser pour la première fois, des cartes protéiques permettant de visualiser les variations d’expression et d’abondance protéique en fonction de leur localisation in situ mais également suite à l’atteinte cérébrale par une infection palustre, et enfin étudier les conséquences d’un traitement anti-palustre sur ces répertoires protéiques. Afin de mener à bien ce projet, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable. Plasmodium berghei, qui est la souche spécifique du paludisme murin, peut léser, en plus du système nerveux central, un certain nombre d’organes simultanément. La complexité de son cycle ainsi que notre intérêt pour l’analyse de répertoires protéiques, pour une méthode inédite, obligent à l’utilisation d’un modèle animal. Les modèles de cultures cellulaires ne permettront pas de répondre aux objectifs fixés dans le présent projet. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier. Par ailleurs il n’existe pas pour le moment de modèle alternatif complet ou même partiel d’organoïdes, sphéroïdes ou organe sur puce reproduisant la complexité du système nerveux et sa réponse immunitaire face à une infection
Réduction
En accord avec le principe de réduction des effectifs, le nombre de souris par groupe sera calculé par rapport au nombre statistique d’échantillon nécessaire à une analyse en MALDI-MSI (triplicate) tout en tenant compte de la prévalence de la forme neurologique dans ce modèle et de la contribution des deux sexes. Nous avons trouvé un effectif minimum de 6 souris par groupe. Nous prenons 8 individus par groupe infecté pour les deux expériences car si n< 6 l’analyse des données sur les souris restantes ne sera pas possible et demanderait de recommencer la manipulation. Ces nombres ne compromettent pas les objectifs du projet en permettant l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
En accord avec le principe de raffinement, les signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement des rongeurs, de manière à limiter l’anxiété des animaux. Des abris, des morceaux de cartons et des éléments à ronger seront placés dans les cages et les souris seront habituées à la manipulation. N’ayant pas trouvé de donnée contraire dans la littérature scientifique sur l’utilisation d’anesthésiant dans le cadre du MALDI MIS toutes les mesures correctives possibles nécessitant une analgésie ou une anesthésie seront utilisée afin de soulager les signes de douleurs. Les animaux sont hébergés en groupe afin de maintenir les interactions sociales. Des points de soin (point of care) et des points limites ont été mis en place afin de prendre en compte les signes neurologiques sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche.
Choix des espèces
Afin d’atteindre les objectifs de cette étude, une modèle animal comprenant un parasite du genre Plasmodium et un hôte permissif pour ce parasite afin de développer des atteintes centrales proches du paludisme cérébral humain est indispensable. Ce modèle doit permettre de mettre en évidence les molécules protéiques impliquées dans l’initiation et maintien d’une atteinte parasitaire centrale mais également de l’effet « recovery » du traitement anit-palustre. Le système « souris + P. berghei » est un modèle reconnu pour l’analyse de l’invasion centrale par le parasite ainsi que pour évaluer un composé à activité antipaludique. Nous choisirons des souris C57BL6J pour leur aptitude à développer aussi bien les formes cérébrales que de fortes parasitémies. Les souris C57BL6 seront des individus adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 10 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond à l’âge de maturité sexuelle (adulte).
Etude des effets biologiques d’un faisceau d’électrons à haute énergie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Les souris dont le poids passe sous un seuil de référence, qui présentent des difficultés respiratoires ou une fibrose avancée au scanner sont mises à mort. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Une partie reçoit une irradiation du thorax à 13 ou 15 grays, qui provoque une inflammation pulmonaire pendant un à trois mois puis, en cas de forte toxicité, une fibrose des poumons à quatre ou cinq mois. Les autres reçoivent des cellules tumorales sous la peau de la patte, avec des risques de dermite, d'ulcération et de nécrose cutanée, pour comparer un nouveau faisceau d'électrons de haute énergie à un faisceau témoin en vue de son intégration dans de futures machines de radiothérapie.
Objectifs
La radiothérapie induit des effets secondaires qui affectent la qualité de vie des patients atteints de cancers. Pour améliorer les traitements de la radiothérapie et limiter ses effets secondaires, nous explorons de nouvelles méthodes d’irradiation comme la radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. Afin de pouvoir explorer son potentiel clinique, nous caractériserons dans ce projet les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie en étudiant d’une part, les toxicités qu’elle pourrait induire, et d’autre part, son pouvoir à éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons déterminé le potentiel clinique d’une nouvelle méthode de radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. En cas de résultats positifs, cette nouvelle méthode pourrait être intégrée, aux futures machines de radiothérapie et permettre une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans une première procédure, 3 lots d’animaux seront irradiés avec une nouvelle méthode de radiothérapie et ils seront ensuite suivis par scanner pour petit animal. Ils seront anesthésies pendant 5 à 10 minutes pendant l’irradiation et environ 5 minutes pour chaque scanner mensuel. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée aux animaux vigiles constituant 3 lots d’animaux : - 1 premier lot ne subira aucun autre geste technique - 1 second lot sera anesthésié en vue d’être irradié avec le faisceau contrôle sur les tumeurs implantées en sous cutanées. La durée de l’anesthésie sera de 2 minutes par animal - 1 troisième lot sera irradié avec le faisceau d’intérêt sur les tumeurs implantées en sous cutanées. L’anesthésie durera entre 5 et 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la toxicité sur tissu sain, les animaux, ayant reçu une irradiation thoracique, développeront une phase d’inflammation pulmonaire(1 à 3 mois post-irradiation) qui évoluera après 4 ou 5 mois vers une fibrose pulmonaire en cas de forte toxicité radio-induite (dose de 13 et 15 Gy). Suite au développement de la fibrose, une perte de poids des animaux pourra être observée. Pour l’analyse de l’efficacité antitumorale, les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée au niveau de la patte développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. L’injection de cellules tumorales provoquera une douleur et gêne de courte durée. Les potentielles toxicités cutanées (dermites, ulcération, nécrose) à court terme induites par le traitement seront évaluées par une grille de score adaptée
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des modèles in vitro (i.e lignée de cellules en culture) existent et sont utilisés dans le cadre d’études préliminaires des effets radiobiologiques d’un faisceau d’irradiation. Des études préliminaires ont été réalisé avec certains de ces modèles au laboratoire et nos résultats préliminaires sont encourageants (lignée de cellules tumorales/modèle ex vivo de coupes d’organe mis en culture. Cependant, ces modèles restent simples et ne permettent pas de prendre en compte la complexité du développement des toxicités induites par la radiothérapie chez le patient, ce qui nécessite le recours à l’animal
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études pilotes ont été réalisées sur un autre faisceau d’irradiation (faisceau contrôle) au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour évaluer les effets radiobiologiques du nouveau faisceau. De la même manière, des études pilotes utilisant des tumeurs greffées sous la peau nous ont permis d’évaluer les temps optimaux d’irradiation post-greffe ainsi que les doses de traitements adaptées 2-Dans le cadre de l’étude des effets secondaires de la radiothérapie dans le poumon, le bras contrôle avec notre faisceau se base sur des données déjà acquises par le laboratoire ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé pour avoir une puissance statistique suffisante lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications pulmonaires par imagerie scanner permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombres d’animaux utilisés pour cette étude. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour étudier la « survie sans complication » des animaux dans le cadre de l’étude sur le tissu sain. Pour la partie tumorale, des tests seront réalisés pour l’étude de la survie avant qu’un point de limite éthique soit atteint.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, plusieurs critères seront pris en compte : 1-Le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire dans la période de 1 à 4 mois post-irradiation (i.e. pendant la phase de pneumopathie). Ensuite, de 5 à 7 mois post-irradiation, le poids des animaux sera suivi de manière bi-hebdomadaire (en début et fin de semaine) afin de surveiller les potentielles pertes de poids. Les animaux pour lesquels le poids sera inférieur au poids limite de référence seront mis à mort pour éviter toutes souffrances. 2-Si des difficultés respiratoires et/ou un isolement sont observés, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. 3-Le suivi scanner sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires. Si un animal présente des signes de fibrose avancée sur les images scanner, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. Pour la procédure d’évaluation de la réponse antitumorale sur un modèle de tumeurs sous cutanée, plusieurs critères seront pris en compte : 1-La taille de la tumeur sera un élément important et déterminant pour assurer le bien-être de l’animal. Le poids des animaux et la taille de leurs tumeurs seront évalués de manière bi-hebdomadaire. 2-De potentielles lésions cutanées peuvent survenir dans la zone d’irradiation de la tumeur. Une grille de score spécifique mise en place lors d’études pilotes et antérieures permettront d’évaluer le grade de ces lésions et limiter les douleurs chez l’animal (mise en place de traitements antalgiques ou mise à mort de l’animal si stade trop avancé) Pour les deux procédures, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée sera réalisée au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions. Les animaux seront hébergés dans des conditions standards
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires (e.g. fibrose radique) des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 10 semaines Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Etablissement et maintien de modèles précliniques en oncologie (poumon, foie, pancréas, rein vessie, prostate et mélanome)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un taux de prise de greffe de 2 % pour la prostate, 9 % pour le rein, 18 % pour la vessie : 27 500 souris nude vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère, toutes tuées à l'issue, pour établir et entretenir des tumeurs humaines greffées sous leur peau. Chacune reçoit un fragment de tumeur prélevé sur un patient au cours d'une intervention de cinq minutes sous anesthésie, puis le volume tumoral est mesuré au pied à coulisse chaque semaine. Le porteur écrit qu'aucune nuisance particulière n'a été rapportée dans ce type d'expérimentation et que la greffe ne génère pas de douleurs particulières, tout en indiquant que la mise à mort finale sert aussi à "soulager les douleurs éventuelles". Les souris choisies ont cinq à six semaines pour que leur système immunitaire soit encore immature, condition de la prise de greffe, et les lignées tumorales ainsi entretenues seront proposées à des laboratoires publics et privés.
Objectifs
Actuellement, les cancers sont la 2ème cause de mortalité dans le monde avec 19,3 millions de cas pas an/monde, et 10 millions de décès en 2020 an/monde. Dans ce projet, nous nous intéressons à plusieurs cancers, dont la majorité fait partie des cancers qui intéressent plus particulièrement notre laboratoire, à savoir ceux du poumon, du foie, du pancréas, du rein, de la vessie et de la prostate et le mélanome (6,3 millions de cas par an/monde, 3,9 millions de décès par an/monde). Ces cancers sont des pathologies pour lesquelles de nouvelles options thérapeutiques doivent être impérativement développées. La réalisation d'études précliniques nécessite l'utilisation de modèles animaux reproduisant fidèlement les caractéristiques des tumeurs humaines et notamment l’hétérogénéité entre les individus et au sein même de la tumeur. La validation préclinique d'un nouveau traitement passe donc par l'utilisation d'un vaste panel de modèles porteurs de tumeurs aux caractéristiques moléculaires variables. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales en culture qui, d'une part ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ et d'autre part, ne permettent pas de reproduire le microenvironnement tumoral dont le rôle dans le développement tumoral et la réponse aux traitements n'est plus à démontrer. Ainsi, les modèles animaux s'avèrent indispensables pour cette problématique préclinique. L'approche par xénogreffe chez la souris nude de tumeurs humaines obtenues au moment de la chirurgie, apparaît comme le modèle expérimental prédictif de la réalité clinique le mieux adapté aux études en oncologie, et ce sont ces modèles que nous nous proposons de développer dans ce projet.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer des modèles précliniques pertinents pour les tests thérapeutiques de molécules nouvelles ou en repositionnement. Ces modèles pourront être utilisés en interne au sein de notre Unité, ou en externe pour le public ou le privé. Les retombées de notre projet ont donc des implications potentielles très importantes pour la clinique, et permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de ces cancers. Du fait que les patients deviennent généralement résistants aux thérapies anti-tumorales classiques, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients notamment aux stades avancés. Ils permettront également d’appréhender les mécanismes de résistance aux thérapies, qui sont souvent un frein au développement de thérapies efficaces, et qui sont en grande partie dues à l’hétérogénéité tumorale, que les autres modèles, cités plus haut, ne peuvent pas reproduire.
Procédures
Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'expérimentation durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique.
Impact sur les animaux
Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible. Par ailleurs, la xénogreffe étant située en haut du dos, elle n’engendre aucune gêne de déplacement des animaux et ne génère pas non plus de douleurs particulières ; Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX, pour Patient-Derived tumor Xenografts) existent depuis quelques décennies, pour virtuellement tous les cancers, et ils sont développés par de nombreux laboratoires publics comme privés, en France, en Europe et à travers le monde, sans que des nuisances particulières aient pu être reportées. Aucun impact sur le comportement n’a été non plus répertorié dans ce type d’expérimentations.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.
Remplacement
Le cancer se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.
Réduction
Les taux de prise de xénogreffe en primo-implantation pour chaque type tumoral (indiqué chapitre 3.3.2.2 sont : Poumon, 29% ; Foie, 38% ; Pancréas, >50% ; Rein, 9% ; Vessie, 18% ; Prostate, 2% : Mélanome, 27%, pouvant légèrement différer suivant les sources bibliographiques et les caractéristiques des tumeurs utilisées). Notre volonté est de pouvoir disposer et proposer entre 30 et 40 modèles PDX par type de cancer. Un large panel est nécessaire pour tenir compte de l’hétérogénéité tumorale, qui est très important dans les réponses disparates aux thérapies existants, en repositionnement et très probablement aux thérapies émergentes à venir. Par conséquent, nous estimons devoir récupérer environ 50 tumeurs par an pour chaque cancer, soit un total d'environ 350 tumeurs (environ 1750 tumeurs sur 5 ans). Il s’agit donc d’un nombre minimal d'animaux nous permettant d'une part d'optimiser la prise de greffe et d'autre part d'obtenir assez de matériel à la fois pour le maintien du modèle et les analyses/expériences éventuelles ultérieures. Par ailleurs, étant limité par la quantité de matériel biologique, le prélèvement initial (issu du patient) sera greffé au maximum sur 10 souris (entre 2 et 10 souris). Pour l'entretien du modèle, du passage 2 au passage 10 ; 5 souris par passage et par modèle sont suffisantes pour atteindre l'objectif du projet. En conclusion, 27500 animaux seront requis pour la durée du projet. Nous avons ainsi réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet. Le but étant d’établir des modèles stables, aucune analyse statistique n’est nécessaire à cette étape. Ces modèles serviront aux tests thérapeutiques par des laboratoires publique et/ou privées ainsi que par notre laboratoire.
Raffinement
Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la xénogreffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.
Choix des espèces
Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.
Evaluation in vivo de l’efficacité thérapeutique de bactériophages et protéines de bactériophage pour le traitement d’infections dans un modèle murin de pneumonie à Klebsiella pneumoniae
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue, la plupart pour le prélèvement de leurs organes, 5 160 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 5 010 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont anesthésiées puis infectées par voie intranasale avec des souches cliniques de Klebsiella pneumoniae, avant de recevoir des bactériophages, des enzymes de bactériophages ou un antibiotique par voie intranasale, intrapéritonéale ou par gavage, en injection unique ou trois jours de suite. L'infection peut provoquer maladie, soif, perte d'appétit et de mobilité, et conduire à leur mort, que le porteur tente de retarder par deux réhydratations quotidiennes sous la peau. Le bénéfice avancé, une réponse aux bactéries multirésistantes, est renvoyé à un développement chez l'humain à envisager à "plus long terme", quand la souffrance sévère concerne dès maintenant 5 010 individus.
Objectifs
La diffusion des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques représente un problème majeur de santé publique. Dans un contexte de faible développement d’antibiotiques réellement innovants et face à des infections qui deviennent non traitables, des alternatives sont nécessaires. Nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique d'enzymes issues de bactériophages ou de bactériophages entiers, seuls ou en combinaison avec des antibiotiques, pour lutter contre des infections à Klebsiella pneumoniae. Dans un premier temps, les doses infectieuses optimales de 10 souches cliniques différentes, représentatives de clones d’intérêt de Klebsiella pneumoniae, vont être déterminées dans un modèle murin de pneumonie. Ensuite l'absence de toxicité aigüe de ces enzymes thérapeutiques et des bactériophages sera évaluée. Enfin les animaux infectés seront traités par injection i) d'enzymes thérapeutiques, ii) de bactériophages, iii) d’antibiotique ciblant la membrane bactérienne et des combinaisons de ces 3 produits pour observer un effet thérapeutique et une potentielle synergie entre ces différents produits. Les infections sont réalisées chez la souris car elles reproduisent une pathologie pulmonaire similaire à celle observée chez l'homme.
Bénéfices attendus
Les avantages attendus de ce projet sont d'évaluer et démontrer l'activité et l'efficacité thérapeutique de nouveaux agents thérapeutiques issus de bactériophages actifs contre les bactéries Klebsiella pneumoniae. C'est une étape nécessaire avant de proposer une nouvelle approche thérapeutique active contre des bactéries multi-résistantes et envisager à plus long terme un développement chez l'homme.
Procédures
La grande majorité des animaux de ce projet seront anesthésiés puis infectés par des bactéries par voie intranasale (N=5010). Ils recevront ensuite différents traitements par les agents thérapeutiques par voie intranasale, injection intrapéritonéale ou gavage en injection unique ou pendant 3 jours consécutifs. Une partie des animaux (N=150) seront injectés par voie intranasale ou intrapéritonéale avec les candidats agents thérapeutique en seule injection. Les infections et injections par voie intranasale seront effectuées sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse de 15 minutes maximum). Les injections intrapéritonéales et gavage seront effectués sur animaux vigile et réalisés en moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
La nuisance majeure résultera principalement de l'infection qui pourra engendrer maladie, soif, perte d'appétit, de mobilité et conduite à leur mort. Les injections intrapéritonéales, intranasales et par gavage pourront entraîner une douleur modérée de courte durée. Les anesthésies seront de courte durée. Cependant une hypothermie temporaire ainsi que des perturbations du rythme respiratoire pourront éventuellement être observés, mais ces effets devraient négligeables de par la courte durée de l'anesthésie. La toxicité éventuelle des enzymes de bactériophages et des bactériophages sera évaluée dans ce projet. Ces candidats thérapeutiques ne devraient pas induire par eux-mêmes de nuisances ou effets indésirables. Si ceux-ci surviennent, des pertes de poids, modifications du comportement (diminution de mobilité, prostration, diminution d'alimentation et de toilettage) des effets sur l'activité respiratoire pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. La plupart des animaux sont utilisés pour prélèvement d’organes. Les autres ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés ni adoptés.
Remplacement
Tous les bactériophages et enzymes de bactériophages auront au préalable été testés in vitro : - activité bactéricide des bactériophages . - activité des enzymes sur la capsule et sensibilisation des bactéries au système immunitaire avec des tests de résistance au sérum et de survie intracellulaire dans des cultures de cellules. La synergie des enzymes ou bactériophages avec l'antibiotique sera aussi préalablement démontré in vitro. Toutefois, comme nous voulons observer l'action de nos nouveaux agents thérapeutiques lors d'un processus infectieux complexe avec toutes les composantes de la réponse immunitaire (implication d'organes différents pour la mise en place de la réponse immunitaire, relations entre organes, multiples populations cellulaires impliquées), les expériences avec les composés ayant démontré l’activité maximum in vitro ne peuvent être réalisées que chez l'animal afin d'évaluer leur efficacité in vivo.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, conduisant à un nombre total d’animaux de 5160 pour ce projet. La taille des groupes a été calculé pour obtenir des résultats statistiques et fiables en utilisant le moins d’animaux possible, et correspond aux données observées dans la littérature récente sur cette thématique. Les données obtenues seront analysées en utilisant les tests statistiques appropriés pour déterminer la robustesse des résultats.
Raffinement
Le projet a été construit en intégrant les mesures permettant de réduire le stress et la souffrance des animaux. Le raffinement sera assuré par l'enrichissement mis à disposition des animaux (litière en copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting ou BedR’ Nest permettant de faire des nids). Les animaux sont hébergés par groupe de 6 souris maximum dans des cages respectant les normes en vigueur. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée à l’arrivée des animaux avant le début des expériences. Les animaux seront évalués quotidiennement en utilisant la grille de scoring. Les animaux seront euthanasiés lorsqu'un point limite sera atteint . Pour réduire l'effet de l'infection sur les animaux, les animaux seront réhydratés 2 fois par jour par injection sous-cutanée de solution de Ringer pour permettre aux animaux pour qui le traitement serait actif de pouvoir récupérer. Une alimentation humide disposée dans des coupelles au fond de la cage sera fournie aux animaux infectés Les animaux sur lesquels des prélèvements ne sont pas prévus seront euthanasiés. La mort des animaux est confirmée par une vérification de l'arrêt respiratoire et de l'arrêt cardiaque. La vérification de ces paramètres est réalisée pendant une minute
Choix des espèces
La souris est un modèle robuste et fiable de pneumonies causées par K. pneumoniae. Il reproduit fidèlement l’inflammation aigüe caractéristique de la pneumonie à K. pneumoniae telle qu’observée chez l’homme. Le modèle d’infection par K. pneumoniae est largement utilisé par la communauté scientifique. Les infections sont robustes et reproductibles dans de nombreuses lignées murines telles que BALB/c. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines. Les animaux de cet âge reproduisent de façon fiable les pneumonies causées par Klebsiella pneumoniae telles qu’observées chez l’homme et sont donc un bon modèle de la pathologie humaine décrits dans de multiples publications.
Chirurgie au laser: sélectivité et monitoring pour un traitement optimal des tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour valider une technique de destruction des tumeurs du foie et du pancréas par fibre optique laser, 43 cochons de 45 à 60 kg vont être utilisés, 32 dans des procédures menées sous anesthésie sans aucun réveil et 11 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués en fin de protocole pour des analyses anatomopathologiques. Les interventions durent de quatre à huit heures sous anesthésie générale, avec insertion d'aiguilles par voie percutanée ou endoscopique, et cinq contrôles d'imagerie hebdomadaires de trente minutes suivent, chacun sous anesthésie. Le porteur liste parmi les risques l'hyperthermie maligne, la défaillance cardiorespiratoire, l'infection et la douleur, et indique que des points limites permettront d'arrêter l'expérience en cas de souffrance, sans préciser lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l’utilisation du laser pour détruire des tumeurs des tissus mous. L’application clinique visée est le traitement mini-invasif des cancers digestifs, avec un focus particulier sur le pancréas et le foie. La chimiothérapie et la radiothérapie ne suffisent en général pas à la guérison, et elles sont associées à la chirurgie, qui reste encore très intrusive et applicable seulement chez certains les patients. Le laser apporte des avantages non négligeables car il est applicable par voie percutanée et endoscopique, donc beaucoup moins invasif que les chirurgies traditionnelles qui nécessitent des semaines de convalescence. La lumière laser est amenée directement dans l’organe grâce à une fibre optique très fine (
Bénéfices attendus
Le projet vise à développer une nouvelle approche thérapeutique mini-invasive pour lutter contre les cancers de l’appareil digestif avec un focus sur les tumeurs du foie, du pancréas et du rein.
Procédures
Les animaux sont soumis à une chirurgie mini-invasive sous anesthésie générale de 4 à 8 heures, incluant des imageries type scanner/IRM, des insertions d'aiguilles pour traitemnt laser/mesures de température par accès percutané ou endoscopique. Cinq contrôles post opératoires non invasifs de 30 minutes en imagerie IRM/scanner sont réalisés sous anesthésie à un rythme hebdomadaire. Des prises de sang peuvent être réalisées à la faveur des anesthésies pour des bilans biologiques.
Impact sur les animaux
Les nuisances et éventuels effets indésirables pour les animaux sont liés aux actes suivants : - Anesthésie : injection intra-musculaire, risque d’hyperthermie maligne, risque de défaillance cardiorespiratoire - Thérapie laser : réaction inflammatoire, hyperthermie, douleur, infection
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour des analyses anatomopathologiques.
Remplacement
Des tests ex vivo préalables ont été mis en œuvre pour déterminer la dosimétrie du laser et les températures maximales associées. Mais les méthodes alternatives ex vivo existantes (simulateurs informatiques, modèles in silico de l’anatomie humaine, organes) ne permettent pas la modélisation intégrale de procédures chirurgicales complexes de façon réaliste. Dans notre cas, elles ne permettent pas de reproduire la réaction de tissus perfusés face à une ablation laser durant laquelle il nous faut mesurer en direct comment la température se disperse dans les tissus adjacents. La circulation sanguine « refroidit » la zone d’ablation et les effets thermiques observés in vivo ne peuvent être fidèlement reproduits sur des organes isolés. Une mise en œuvre sur organisme vivant entier est nécessaire pour parvenir à l’objectif scientifique du projet. Les tests ex vivo restent utiles et seront combinés aux tests in vivo pour optimiser le nombre de capteurs de température à utiliser dans les organes et la distance relative entre ces capteurs et la fibre optique du laser.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au mieux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les points d'ablation laser et mesures de températures seront répétés en grand nombre sur différents organes dans le cadre d'une procédure sans réveil, afin de réduire les effectifs tout en optimisant le nombre de mesure par individu.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à macher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiances sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation de quelques jours permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Tous les gestes expérimentaux sont réalisés sous anesthésie. Le jour de l’intervention, les porcs sont sédatés pour être transportés dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant toute la procédure. Le suivi post opératoire est assuré avec une évaluation quotidienne de la douleur, le vétérinaire désigné intervient en cas d’anomalie détectée. Des points limites sont définis pour arrêter l’expérience en cas de souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Le Porc est un modèle de choix pour la recherche translationnelle, car son anatomie, sa physiologie et sa taille sont similaires à celles de l’Homme. Cela permet d'utiliser des équipements d'imagerie et des systèmes médicaux de même taille que ceux qui seront déployés chez les patients. Les animaux utilisés seront dans une tranche de poids moyen comprise entre 45 et 60 kg correspondants à un stade de développement de 3 à 5 mois.
Investigation par IRM de la neurotoxicité des ganglions de la racine dorsale induite par des AAV chez le primate non humain 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Une laminectomie de quatre heures, quatre anesthésies, des jeûnes hydriques allant jusqu'à seize heures et des ponctions de liquide céphalorachidien : trois macaques à longue queue subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du projet. Un virus adéno-associé leur est injecté dans l'espace sous-arachnoïdien pour provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à visualiser par IRM. Chaque jour, l'animal est isolé de ses congénères le temps d'évaluer sa vision et sa motricité faciale, et une seconde technique de cathétérisation, moins documentée, est essayée juste avant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un gain de bien-être qui supprimera le recours à la chirurgie, alors que son protocole repose sur une chirurgie lourde et se termine par le prélèvement du cerveau et des ganglions.
Objectifs
Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.
Procédures
Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.
Devenir
Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.
Remplacement
Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.
Réduction
Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.
Raffinement
Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.
Choix des espèces
Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.