Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Phénotypage de porcs issus de races, lignées et croisements pour la sélection, le développement de nouveaux critères et le suivi des évolutions
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Soumis à des prélèvements de cartilage d'oreille, de sang, de salive et de fèces, parfois avec une corde passée autour du groin, 13 230 cochons sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué au titre de la procédure, tous réintégrant leur groupe d'engraissement jusqu'à 115 ou 125 kg, le RNT mentionnant par ailleurs des mesures effectuées à l'abattoir. Le porteur indique que la décision de les garder en vie revient au responsable du projet, au responsable de l'élevage et à la structure chargée du bien-être des animaux non-humains. L'objet déclaré est d'affiner les critères de sélection génétique de la filière porcine française, la surface allouée étant de 1,1 m² par animal.
Objectifs
Le projet consiste à participer au contrôle des performances des animaux de races et lignées et au suivi des performances des animaux croisés qui en sont issus, à travers un protocole de contrôle de performances du post-sevrage vers trois semaines d’âge à la fin de leur engraissement vers 115 ou 125kg. L’obtention de performances classiquement relevées en élevages de sélection, en parallèle de mesures novatrices ou plus complexes à recueillir, ainsi que de mesures à l’abattoir, permet de conforter l’évaluation des animaux des races utilisées couramment en France mais aussi de tester de nouveaux critères d'évaluation et leur applicabilité sur le terrain afin d’explorer de nouvelles voies d’amélioration génétique.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont pérennes, en recueillant en un lieu unique des données d’animaux de différentes origines, mais apparentés, pour une meilleure précision des schémas de sélection porcin français ou la connaissance des croisements qui en sont issus. Ces données sont évolutives avec l’avancée de la sélection et nécessitent une veille en continu. En outre, le recueil de performances nombreuses sur peu d’animaux peut permettre d’éprouver de nouveaux critères de sélection.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : prélèvements de cartilage d'oreille : 1 à 2, ce prélèvement ne prend que quelques instants ; prélèvements de fèces : 4 maximum (5 minutes maximum) ; prélèvements de sang : 3 maximum (2 minutes maximum) ; prélèvements de salive : 5 maximum (30 secondes maximum, avec un second essai en cas d’échec, sur une durée de 5 minutes maximum).
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvre dans ce protocole sont d'un degré de sévérité modérée du fait de la possible accumulation de certains prélèvements sur une partie des animaux : prélèvements de cartilage à l'oreille, sang, salive, fèces, mesures par échographie à ultrasons. Les contentions, si elles sont nécessaires aux prélèvements ou observations, sont le maintien en cage individuelle, ou dans les bras par un technicien animalier ou à l'aide d'une corde autour du groin, toujours brèves, inférieures à 5 minutes et assurées par du personnel compétent sur l'espèce porcine.
Devenir
L’ensemble des animaux réintégreront leur groupe d’engraissement à la fin de la procédure expérimentale. La décision de garder en vie les animaux revient au responsable du projet en coordination avec le responsable de l’élevage et la Structure de Bien-Etre Animal de l'établissement utilisateur.
Remplacement
Les mesures sur animaux sont requises car l’objectif est la sélection des animaux, le suivi de l’évolution de leurs performances et l’exploration l’intérêt de caractères prospectifs (l’efficacité digestive, etc.) sur eux ou leurs issus croisés.
Réduction
Certaines mesures restent uniquement réalisables en station ou à l’abattoir sur les animaux phénotypés en station, pour celles-ci il n’existe pas d’alternative satisfaisante et peu de corrélation avec les mesures réalisées en élevages. La station est aussi un outil privilégié pour la réalisation d’expérimentations et de comparaisons de performances d’animaux de différentes races, lignées ou croisement, ou élevages intra type génétique, dans un environnement unique. Les effectifs sont ceux autorisés par la capacité de la station et permettent d’améliorer la précision des valeurs génétiques estimées et l’efficacité des programmes de sélection. Tous les animaux ne sont pas soumis à l’intégralité du protocole, les mesures invasives sont limitées au nombre strictement nécessaire : l’apposition d’une seconde boucle munie d’un système de suivi à distance pour enregistrer les mouvements des animaux, les prélèvements de fèces, les prises de sang ou recueil de salive ne concerneront chacun pas plus du tiers des animaux ; un animal pouvant être soumis à aucune de ces procédures comme au protocole complet. Les effectifs de porcs croisés entrant en station doivent être suffisants pour permettre de déceler des différences sur les critères de consommation, croissance et qualité des carcasses.
Raffinement
Ce protocole est réalisé dans un bâtiment entièrement dédié. Les salles de post sevrage sont équipées d'auges collectives avec aliment sec, d'un abreuvoir, de lampes chauffantes, radiateurs mobiles et les cases sont enrichies avec des jeux manipulables. Les salles d'engraissement que les porcelets rejoignent après le post sevrage, sont équipées chacune d'une station d'alimentation automatique individuelle avec plateau de pesée automatique et d'un abreuvoir permettant de mesurer les consommations d'aliment et croissances individuelles des animaux élevés en groupe en conditions proches de celles rencontrées pratiquement en élevage de sélection. L’environnement des animaux en engraissement est aussi enrichi par des jeux manipulables. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des porcs sera limitée à 5 minutes. Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes. Les collectes de fèces ou de salive seront aussi interrompues si sans succès au bout de 5 minutes. Les animaux sont surveillés quotidiennement et le seront plus particulièrement après chaque intervention.
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible des projets. Leur but est en effet de participer à la plus fine connaissance des races et leurs issus et le cas échéant de participer à l’élaboration de nouveaux critères pouvant être mis à la disposition de la filière porcine. Les animaux sont élevés en groupes de 14 individus issus d’un même élevage. Chaque bande regroupe neuf lots de 14 individus d’âges proches, et est hébergée dans une salle de neuf cases collectives. Les porcelets entrent en station en post-sevrage (3 ou 4 semaines d’âge) où ils restent cinq à sept semaines selon leur poids de livraison. Ils sont ensuite transférés en salle d’engraissement par case entière, en une ou deux fois par bande, et y demeurent jusqu’à la fin de leur engraissement (vers 115 à 125kg). Les animaux sont hébergés dans des conditions similaires à celles des animaux de ferme élevés dans un but commercial. La surface par animal (1,1 m² / animal) répond aux normes fixées dans les directives 98/58/CEE,91/629/CEE et 91/630/CEE (>0,65 m² / porc pour les animaux jusqu’à 110kg).
Thérapie génique de la perte d’audition
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Toutes tuées à l'issue, y compris les reproducteurs transgéniques tués à six mois puis remplacés, 8 132 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester des vecteurs de thérapie génique contre la surdité. Elles subissent cinq à six tests auditifs sous anesthésie, des injections intrapéritonéales de tamoxifène et une chirurgie intracochléaire de vingt minutes. Le porteur reconnaît que cette chirurgie peut léser l'oreille injectée et faire perdre l'audition, tout en indiquant qu'il ne s'attend à aucun signe de souffrance ni d'inconfort, la surdité provoquée restant unilatérale. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, faute de pouvoir mettre en culture les systèmes auditifs périphérique et central.
Objectifs
Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.
Procédures
Les animaux des modèles de surdité seront soumis à des tests auditifs, au nombre de 5 à 6 maximum, avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à P16. Des animaux seront soumis à des injections avec une dose unique ou fragmentée (3 fois maximum sur une même semaine) par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui seront réalisées par voie intra cochléaire une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Pour réaliser nos analyses histologiques sur les oreilles internes, les animaux seront mis à mort. Post mortem nous prélèverons donc les cochlées pour évaluer infra cliniquement performances de nos stratégies de vectorisation.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire. De plus nous nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 0 et 21 jours après la naissance. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence.
Choix des espèces
Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.
Optimisation de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par une approche d’ultrasons chez le porc pour la délivrance ciblée de médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour régler un système à ultrasons qui ouvre la barrière entre le sang et le cerveau, dans une collaboration entre entreprises privées et laboratoire public, 6 cochons d'environ trois mois vont être opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Pendant trois à cinq heures, chacun reçoit des cathéters dans la veine jugulaire et la carotide, subit une ouverture du crâne avec pose d'un implant, puis des injections de produits de contraste et des examens IRM. Le porteur annonce une hausse locale de température de 1,5 °C et une micro-hémorragie, sans douleur ni souffrance selon lui puisque l'animal reste anesthésié. Les gestes nouveaux sont d'abord répétés sur les corps d'animaux non-humains tués dans d'autres protocoles. Le porteur justifie la mise à mort finale par une chirurgie qui ne permettrait pas une récupération "sans nuisance majeure".
Objectifs
Les systèmes de génération d'ultra-sons pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique (BHE) sont utilisés dans le traitement de certains cancers du cerveau. Leur utilisation pour d'autres maladies cérébrales à ouvert de nouveaux espoirs. Cependant, leur utilisation pour des méthodes ne visant pas la destruction cellulaire, requière de nouveaux tests et mise au point en recherche pré-clinique. Ce projet est une collaboration entre des entreprises privées et un laboratoire publique. Grâce à une première collaboration sur modèle rongeur, nous avons pu optimiser les paramètres acoustiques et développer une nouvelle méthode d'analyse d'image utilisant 2 marqueurs de perméabilité membranaires afin de mieux quantifier l'ouverture de la BHE. L'objectif technique de la présente étude pré-clinique vise à valider notre méthode et sa performance sur un modèle plus proche de l'homme (pour les paramètres ultrasonores d'ouverture de la BHE), sur une autre modalité d'imagerie plus proche de la clinique (IRM) en comparant deux agents de contrastes de tailles différentes.
Bénéfices attendus
L'objectif moyen-terme du projet vise à permettre le démarrage des essais cliniques dans le traitement de maladies cérébrales afin d'évaluer si la méthode permet d'augmenter l'entrée des médicaments dans le cerveau. En effet, une première version du système est déjà utilisée en cancérologie. Néanmoins, l'utilisation à des fins de protection cellulaire et non de destruction cellulaire, pour d'autres pathologies cérébrales nécessite une meilleure caractérisation et calibration du système ultrasonores de sorte à ne pas induire de lésions thermiques. L'intérêt long-terme réside l'utilisation de cette méthode en pratique clinique courante dans le traitement pharmacologique des maladies cérébrales.
Procédures
L’animal est anesthésié profondément tout au long de l’expérimentation, jusqu’à l’euthanasie, soit environ 3-5h. L’expérimentation consiste en : - La pose de cathéters au niveau de la veine jugulaire et de la carotide - D’une craniotomie avec mise en place d’un implant - L’injection des produits d’intérêt par le cathéter, activation de l’implant et examens IRM
Impact sur les animaux
Deux effets liés au traitement par ultrasons peuvent survenir : une augmentation locale de la température de 1,5°C (n’engendrant donc pas de brûlure du tissus) et une micro-hémorragie localisée (ne remettant pas en cause la vie de l’animal pendant l’expérimentation et n’entrainant ni douleur, ni souffrance, ni angoisse sur l’animal anesthésié). Il s’agit de procédure sans réveil après l’expérimentation.
Devenir
Il s'agit d'une procédure sans réveil. La chirurgie prévue dans le protocole ne permet pas une récupération sans nuisance majeure pour l'animal. Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de la procédure.
Remplacement
L’ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons a déjà été validée sur modèle in vitro, sur un modèle in vivo de rongeur et est déjà utilisé en clinique dans le traitement de certaines tumeurs cérébrales. Dans ce dernier cas, les ultrasons permettent de favoriser l'entrée de chimiothérapies dans la tumeur et génèrent un effet thermique destructeur supplémentaires. L'application à des pathologies dans lesquelles on voudrait apporter un traitement pharmacologique sans destruction cellulaire requière une amélioration et une évaluation du protocole de stimulation ultrasonore. L’impact sur le cerveau nécessite d’expérimenter sur animaux. Notre étude antérieure réalisée sur la souris a permis de tester un nombre important de configuration ultra-sonores et le présent projet vise à valider les meilleurs sur le modèle pré-clinique de porc.
Réduction
- Les effectifs ont été calculés au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement exploitables : le nombre d’animaux a été fixé à 6 afin de pouvoir comparer la diffusion des deux agents de contraste. Cette procédure étant une preuve de concept expérimentale sur gros animal, une augmentation des effectifs pour avoir plus de puissance statistique n'est pas nécessaire. - Afin de réduire le nombre d’animaux, nous réaliserons des tests de positionnement, de chirurgies et d’imagerie sur des animaux en post-mortem, à la fin d’autres protocoles expérimentaux. Ceci nous permettra d’acquérir une expérience pour réaliser notre procédure dans les meilleures conditions. - Enfin, l’utilisation de l’imagerie IRM permet de limiter le nombre d’animaux, chaque animal étant son propre contrôle.
Raffinement
L’intégralité de l’expérimentation (depuis la pose des cathéters jusqu’à la mise à mort de l’animal) sera réalisée sous anesthésie générale profonde et sous couverture analgésique adaptée . En outre, une partie de la chirurgie prévue dans ces procédures est une chirurgie acquise depuis longtemps par nos expérimentateurs : pré-anesthésie, pose de voie centrale veineuse et artérielle. La partie nouvelle de chirurgie, à savoir l’implantation du système à ultrasons, sera travaillée sur des animaux d’autres protocoles en cours, en post-mortem. Une fois les protocoles réalisés, notre équipe viendra travailler, en présences de neuro-chirurgiens afin d’acquérir les gestes adéquats à la réalisation du protocole. Le protocole ne commencera qu’après cette étape, et l’assurance que les gestes sont maîtrisés.
Choix des espèces
Suite à notre étude sur la souris, réalisée pour tester et affiner les paramètres ultrasonores utilisés et mettre au point une nouvelle technique d'analyse d'image permettant de quantifier l'ouverture de la BHE, et avant de pouvoir proposer des essais cliniques chez l'homme, nous avons choisi le porc qui est un bon modèle animal pré-clinique et qui permet d'utiliser le matériel d'usage clinique (poids de corps, volume de la tête et volume sanguins sont assez proches de ceux de l'homme) et de valider l’ouverture de la BHE et l’innocuité sur le tissu cérébral par l’IRM clinique. En outre, les protocoles déjà en cours au sein du laboratoire, nous permettrons d’acquérir les gestes chirurgicaux nécessaires, en amont de la phase pilote, sur des animaux en post-mortem. Nous utiliserons de jeunes porcs d’environ trois mois ayant un poids compris entre 35 et 40 kg. Notre laboratoire a une bonne expérience de l’utilisation de ces animaux, à cet âge. En effet, les résultats obtenus ont fait l’objet de nombreuses publications, issues de notre laboratoire. En outre, pour des raisons pratiques, les animaux de plus de 45-50 kg sont non adaptés à nos installations La taille de ces animaux sera suffisante pour l’implantation et la réalisation des images. Ces tailles seront comparables et transposables à des données cliniques.
Développement d’une immuno-oncothérapie basée sur des vecteurs lentiviraux contre le cancer du sein et évaluation de son effet anti-tumoral dans un modèle orthotopique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 992 reçoivent une injection intramammaire de cellules tumorales sous anesthésie, suivie de trois à quatre semaines de croissance tumorale, d'une à deux vaccinations intramusculaires et de deux à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur précise que même les souris dont la tumeur a disparu sont tuées, leur système immunitaire modifié empêchant selon lui toute réutilisation, replacement ou adoption. Il affirme qu'aucun système cellulaire in vitro ne peut remplacer la recherche vaccinale et que la réponse anti-tumorale doit s'observer dans un "organisme entier".
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, capables de détruire les cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des vecteurs lentiviraux ayant pour cible des antigènes tumoraux pertinents dans le cancer du sein, pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle immunitaire de la prolifération tumorale. L’objectif du projet est d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du sein et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une immuno-thérapie basée sur des vecteurs lentiviraux. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité anti-tumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept d'utilisation des vecteurs lentiviraux dans la vaccination contre le cancer du sein. Les vecteurs lentiviraux codant pour des antigènes pertinents se sont révélés sûrs et efficaces comme des candidats vaccins contre des flavivirus (ZIKA et Dengue), le SARS-CoV-2, Mycobacterium tuberculosis, d'autres agents pathologiques, ainsi que des tumeurs induites par des «Human Papilloma Virus» (HPV). Le dernier est en cours d’obtention de l’approbation de la FDA pour entrer en phase clinique I/IIa de traitement des cancers du col de l’utérus ou oro-pharyngés résultant des infections par HPV aux USA en 2024. Avec le projet actuel du cancer du sein, nous espérons prouver que les vaccins à base de vecteurs lentiviraux pourront être plus efficaces que les vaccins à base de peptides ou protéines adjuvantés ou d'ARN messager dans le cancer du sein. Les avantages à long terme seront l'utilisation de ces vaccins en clinique contre le cancer du sein.
Procédures
Dans une procédure de sévérité légère, environ 72 souris au maximum seront immunisées avec un candidat vaccin (quelques secondes), et mises à mort au bout de 30 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire. Les autres procédures de sévérité moyenne, et à appliquer à un maximum de 992 souris, comprennent dans un premier temps l'injection intra-mammaires de cellules tumorales (quelques secondes) sous anesthésie gazeuse puis la surveillance de la croissance tumorale pendant 3 à 4 semaines. La vaccination sera ensuite réalisée en intramusculaire via 1 à 2 injections espacées de 3 semaines (quelques secondes). Dans le cadre de la dernière procédure, les souris subiront également 2 à 4 injections en intrapéritonéale (quelques secondes) sous deux semaines.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection mammaire du petit volume de suspension cellulaire. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans certains cas s’associer à une perte d'activité normale, en particulier si la tumeur atteint la taille limite. La période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours.
Devenir
Les souris présentant des tumeurs seront mises à mort pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce aux différents traitements, elles seront suivies pendant deux mois. Même les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’humain. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale et immuno-thérapeutique sur les animaux.
Réduction
Sur les conseils d’un biostatisticien, les groupes seront constitués de 5 à 10 animaux, en fonction de la nature de l’expérience, et du fait de la variabilité de la croissance tumorale de façon à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes, pourra être réduit si la variabilité observée est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination avec des vecteurs lentiviraux et de définir la cinétique de vaccination permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vecteurs lentiviraux seront préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses cellulaires T spécifiques des tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes, qui devraient permettre de comprendre le mécanisme d'action d'un vaccin, ne seront pas réalisées.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de vecteurs lentiviraux n’induit aucun signe clinique chez les souris. L’implantation de tumeurs mammaires peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Les tumeurs seront implantées seulement au niveau des 4èmes glandes mammaires (gauche ou droite) où, par rapport aux glandes mammaires situées plus haut, il y a plus d’espace pour la croissance tumorale et par conséquent sans gêner la mobilité des souris afin de limiter à minima la gêne occasionnée par la tumeur. Les animaux seront observés pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance, si un point limite (nécrose ou la taille de tumeur) est atteint. La souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises, incluant l’ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose quand les tumeurs seront palpables pour éviter l’irritation par les coupons de bois.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogéniques chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Preuve de concept de l’efficacité d’un produit vétérinaire pour le contrôle du prurit induit par une cytokine chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Pour la commercialisation d'un produit vétérinaire contre la dermatite atopique, 60 chiens reçoivent des injections intraveineuses d'une cytokine qui provoque délibérément des démangeaisons, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Pendant environ deux heures après chaque injection, ils se grattent, se lèchent, se mordillent les pattes, le flanc ou la région anale, secouent la tête et se frottent le corps, sous surveillance vidéo. Chacun subit deux à quatre injections de cytokine par phase, plus quatre à six prises de sang. Aucun n'est tué dans ce projet, tous restant disponibles pour d'autres procédures expérimentales après un temps de repos.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité chez le chien de produits vétérinaires sur les démangeaisons induites par une cytokine. L’objectif final étant la commercialisation de nouveaux produits permettant de traiter la dermatite atopique qui est la plus fréquente des maladies cutanées allergiques du chien.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la production de nouveaux produits dans le cadre de développement de nouvelles options thérapeutiques dans la prise en charge de la dermatite atopique chez le chien. La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique qui réduit significativement la qualité de vie de l’animal.
Procédures
La première procédure expérimentale se déroulera sur plusieurs semaines de prétests incluant les interventions suivantes pour les chiens inclus (jusqu’à 15 par test) : 1) 2 à 4 Injections intraveineuses d’une cytokine sur animaux vigiles (avec pose d’un cathéter ou micro-perfuseur) à 6 ou 7 jours d’intervalles pour induire le prurit et l’évaluer pendant environ 2 heures (ex : J-20, J-14 et J-7). 2) Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles pour la réalisation d’analyses sanguines avant la seconde procédure (ex : J-7). Puis la seconde procédure expérimentale se déroulera sur plusieurs semaines pour les chiens inclus (8 à 12 par test) avec les interventions suivantes : 1) Une administration de produit d’essai sur animaux vigiles, selon la voie recommandée par le fournisseur, au démarrage de l’étude (J0). 2) 2 à 4 injections intraveineuses d’une cytokine sur animaux vigiles (avec pose de cathéter ou micro-perfuseur) pour induire le prurit et l’évaluer pendant environ 2 heures et à différents temps après administration du produit d’essai le lendemain de l’administration du produit d’essai puis à intervalle régulier (ex : J1, J30 et J61). 3) 4 à 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles pour analyses sanguines au démarrage de l’étude puis à intervalle régulier (ex : J0, J14, J30 et J61).
Impact sur les animaux
L’injection de la cytokine provoque délibérément une démangeaison transitoire chez le chien qui se dissipe naturellement en 1 à 2 heures. Le chien peut se gratter, se lécher, se mordiller les pattes, le flanc ou la région anale, trottiner, secouer la tête et se frotter le corps. Aucune lésion durable n'est attendue. Un érythème au niveau des zones léchées ou grattées plus intensément est cependant possible et réversible très rapidement, soit en moins de 24 heures. Les effets indésirables potentiellement attendus suite à l’administration du produit d’essai ou de référence seront déterminés pour chaque élément d’essai en fonction de la molécule testée et de la bibliographie communiqué par le sponsor. Ainsi des points limites adaptés seront établis avant le démarrage de l’étude afin de mettre en place des traitement adéquates en cas d’effets indésirables pour pallier rapidement à ces nuisances. Au moment des prélèvements sanguins ou injections de produit, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction de l’aiguille sous la peau entraînant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction.
Devenir
A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. D’autre part, aucune étude alternative ne peut à ce stade remplacer l’étude sur l’espèce cible. Il s'agit d'une étude pilote "preuve de concept" avant de s’engager sur la voie des études d’enregistrement. Cependant, le Sponsor s’engage à avoir effectué tous les tests in vitro possible et nécessaire avant la réalisation de l’étude.
Réduction
Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables. Ce nombre ne permet pas une analyse de non-infériorité mais permet d'une part de démontrer que le produit test réduit le prurit chez les chiens recevant le challenge avec la cytokine et d'autre part que cette réduction est comparable à celle du produit de référence et ou supérieure au placébo.
Raffinement
La salle de test est séparée des autres salles d’hébergement. Les chiens, par groupe de 2 à 4 individus, seront habitués à l’environnement de cette salle de test pendant minimum 14 jours avant le début de l’étude pour limiter leur stress. Des enrichissements seront présents dans les box (jouets, radio…). Durant l’étude, les volumes administrés respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration. Après l’injection de la cytokine, les animaux seront suivis et ou filmés en continue pendant environ 2 heures afin de détecter tout signe de prurit très intense. Dans ce cas, la personne suivant les animaux (derrière le moniteur) alertera immédiatement le vétérinaire et l’animal concerné sera pris en charge. Les mesures mises en place dépendront de la gravité et la nécessité de l’exclusion de l’étude sera évaluée au cas par cas. Durant toute la durée du projet l’état clinique des chiens sera suivi et documenté (poids, état de la peau, condition générale, appétit, état des selles). Des analyses hémato biochimiques pourront être réalisées pour surveiller les paramètres physiologiques des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes compétentes avec du matériel adapté. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor en fonction de la voie d’administration.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du produit testé. Tester l’efficacité du produit d’essai sur une autre espèce que l'espèce cible ne serait pas informatif. Chiens adultes d'âge et de poids correspondant à celui indiqué pour le traitement.
Prévention de l’affection du système digestif du porcelet par Lauwsania intracellularis
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Soumis à une vaccination intradermique puis à quatre prises de sang jugulaires en 42 jours, dont deux avec une contention par lasso en acier passé autour du groin, 18 porcelets sevrés à 28 jours sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Tous sont tués à l'issue pour prélever leurs contenus intestinaux. L'objet réel est d'évaluer si un additif à base de vitamine D3 renforce l'effet d'un vaccin contre l'iléite, maladie qui réduit jusqu'à 60 % la croissance et l'efficacité alimentaire des porcs atteints. Le porteur rattache le projet à la réduction des antibiotiques et au bien-être des animaux non-humains, tout en indiquant que l'évaluation exige de connaître le mode d'action "chez l'animal auquel il est destiné".
Objectifs
Malgré l’amélioration des conditions d’élevage, notamment grâce aux contrôles vétérinaires réguliers, et de l’état sanitaire des élevages porcins, certaines affections bactériennes subsistent avec notamment les affections du système digestif se traduisant par une diarrhée touchant fortement les jeunes porcelets. Une bactérie particulièrement préoccupant pour les producteurs de porcs est Lauwsonia intracellularis, elle est responsable de la maladie de l’iléite chez les porcs en croissance. La bactérie est endémique aux élevages porcins, avec une présence dans les élevages mondiaux approchant les 96 %, et est responsable de réductions de croissance et d’efficacité alimentaire allant jusqu'à 60 % chez les porcs cliniquement atteints. Dans une perspective globale de développement durable, il est important de définir des solutions alimentaires et de conduite d’élevage face aux maladies des animaux permettant la réduction des antibiotiques, de manière à améliorer la sécurité alimentaire et le bien-être animal. Une des stratégies clé pour protéger les porcs et réduire l’utilisation des antibiotiques, est la vaccination dès le premier âge. Il a été démontré que la vaccination des porcs réduit l'excrétion fécale bactérienne et améliore les performances de croissance par rapport aux porcs non vaccinés. Néanmoins, tout approche vaccinatoire dépends de la capacité de réponse des animaux vacciné, réponse elle-même conditionnée en partie par les taux circulant de certaines vitamines. En effet, il est bien connu qu'une carence en vitamines nuit à la résistance immunitaire des porcs, et en particulier des porcelets, entrainant des déficiences dans la réponse aux maladies infectieuses et inflammatoires. La vitamine D joue un rôle central dans la réponse immunitaire des porcs et plus efficacement, sous sa forme active que sous sa forme classique du fait de sa meilleure biodisponibilité. Ce projet a pour objectif d’évaluer une stratégie de prévention contre Lawsonia intracellularis fondée sur la combination de la vaccination avec une supplémentation nutritionnelle de vitamine D sous forme active chez le porcelet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir si la combinaison de la vaccination contre Lauwsonia intracellularis avec une supplémentation de la forme active de la vitamine D3 dans la ration alimentaire chez les porcelets post-sevrés permet de renforcer le système immunitaire des animaux comme stratégie de protection face à la maladie de l’iléite. Ce projet permettra d’évaluer l’effet synergique des deux approches (vaccination-nutrition) qui ont déjà démontré leur effet bénéfique individuellement. Il permettra en outre de prendre en compte toutes les interactions cellulaires complexes qui ont lieu in vivo et qui peuvent influencer la réponse immunitaire. Ce projet permettra aussi de déterminer les paramètres les plus pertinents pour évaluer la réponse immunitaire dans des conditions expérimentales standardisées et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires et suffisant pour répondre à l’hypothèse de l’étude en maitrisant mieux les écarts types de nos paramètres d’intérêts et raffiner les tests statistiques utilisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 42 jours. Au cours de la procédure, les animaux seront nourris avec un aliment standard répondant à leurs besoins nutritionnels et supplémenté avec de la vitamine D3 (groupe T1) ou supplémenté pour le groupe T2 avec la forme active de la vitamine D3 plus disponible. Les animaux seront soumis à une vaccination 14 jours après leur arrivée en injection intradermique (temps d'injection ne dépassera pas 5 secondes), à 4 prélèvements sanguins à J0, J14, J36 et J42 au niveau de la veine jugulaire avec une période de récupération d’au moins une semaine entre les prélèvements. A chaque temps de prélèvement, un volume de 4 ml de sang nécessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguins sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute
Impact sur les animaux
Selon les caractéristiques du produit, des réactions locales au site d’injection du vaccin, se limitant à un léger gonflement (< 5 cm de diamètre) peuvent fréquemment survenir et disparaissent dans les 4 semaines suite à la vaccination. Inconfort et stress dû à la contention des animaux pour la vaccination et les prises de sang répétées.
Devenir
Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à l’issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements d’échantillons biologiques (contenus intestinaux)).
Remplacement
L’évaluation d’un additif alimentaire avec une activité immunostimulante supposée implique de prendre en compte toutes les interactions cellulaires complexes entre les organes qui ont lieu in vivo et donc d’avoir recours aux animaux et de connaitre son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné.
Réduction
Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux maximum a utilisé pour évaluer l’hypothèse de ce projet exploratoire. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter des bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d’informations possible par animal pour valider la solution explorée dans ce projet (vaccination-nutrition). Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont été établis en suivant une approche statistique validée par un biostatisticien.
Raffinement
Le stress dû à la contention des animaux en vue de leur pesée individuelle est réduit en réalisant les opérations de contention dans le calme et sans brutalité en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en attrapant les porcelets de 5 à 20 kg par la patte arrière juste au-dessus du jarret et en le soulevant en plaçant l’autre main sous la poitrine pour les sortir. A J14, les activités sont réalisées de manière à manipuler les animaux le moins possible et les pesant d’abord puis en faisant la prise de sang (décubitus dorsal) et la vaccination intradermique avant de les remettre dans leur cage. Lors des prises de sang à JO et J14, chaque animal est présenté en décubitus dorsal. Pour les prises de sang à J36 et J42 chaque animal est présenté à l’aide d’un lasso en acier souple en bon état maintenu à la main et tiré vers l’avant afin que la tête soit alors présentée légèrement relevée (méthode assurant la protection des animaux et des manipulateurs). L’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux par les applicateurs de la procédure, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie, par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement et en respectant les périodes de récupération nécessaires entre les prises de sang. A la fin de la prise de sang, l’animal peut-être gratouiller au niveau du groin ou sous le cou. Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques. Dès l'observation d'un signe clinique une grille de score de point limites est utilisée. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (jouet en caoutchouc et en matière organique suspendu), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Les porcelets sont hébergés en respectant 0.5 m2 de surface minimale d’hébergement par porc jusqu’à 30 kg de poids final plus 0.24 m2 d’aire de repos. Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux porcins (porcelets) qui représentent de ce fait la cible privilégiée de la solution testée. Procédure expérimentale réalisée en utilisant des porcelets sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 6-8 kg en moyenne. Les animaux seront utilisés au stade de porcelets post sevrés de 28 jours pour favoriser l’immunité active des porcs au jeune âge.
Manipulation transgénique des taux d’acides gras polyinsaturés dans des populations neuronales spécifiques: conséquences sur la prise de décision
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, une privation alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines et treize semaines de régimes lipidiques modifiés, puis un conditionnement opérant où il faut appuyer sur un levier pour obtenir de la nourriture. 720 sont tuées pour analyse histologique et les 120 géniteurs à sept ou huit mois, à la fin de leur période de reproduction. Le porteur qualifie les effets de la privation alimentaire de "très limités" et justifie le recours aux souris par des dimensions comportementales qu'il déclare non modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les types de neurons qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations spécifiques de neurones en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision par des tâches comportementales de conditionnement opérant où l'animal doit appuyer sur un levier pour obtenir une récompense alimentaire. Nous mesurerons l'activité neuronale par des approches d'imagerie in vivo chez l'animal se comportant.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI - qui est perturbé dans plusieurs pathologies psychiatriques- influence les processus de prise de décision.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes modifiés en lipides pendant environ 13 semaines
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes modifiés en lipides n'a pas d'impact évident pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (720). Les géniteurs (120) seront mis à mort à l'âge de 7-8 mois, à la fin de la période de reproduction.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille et seront consignés sur une fiche de scorage. Si un score élevé persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.
Evaluation de sources d’astaxanthine d’origine naturelle sur la pigmentation des filets chez la truite arc en ciel.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Pour comparer des sources d'astaxanthine et colorer la chair des filets, 320 truites arc-en-ciel sont utilisées pendant 84 jours dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour la levée des filets. Elles sont anesthésiées et pesées toutes les trois semaines, prélevées de sang, et soumises à deux collectes d'excréta par compression de l'intestin, que le porteur associe à une inflammation de l'anus. Les 40 poissons du groupe contrôle positif sont tués avant d'être donnés à un zoo. Le porteur affirme que l'astaxanthine est "indispensable" à la santé des poissons et qu'il est "nécessaire" d'identifier des sources naturelles pour satisfaire les préférences des consommateurs pour des filets bien colorés.
Objectifs
L’astaxanthine est un caroténoïde qui joue un rôle prédominant dans la pigmentation des espèces aquacoles comme les salmonidés. Cependant, comme les poissons ne peuvent pas en produire il doit être apporté dans la ration alimentaire. Ainsi, en élevage aquacole, l’astaxanthine constitue un ingrédient essentiel de la composition des aliments car il est indispensable pour la santé des poissons et permet également de satisfaire les préférences des consommateurs pour des filets de salmonidés bien colorés. Enfin, la demande sociétale de produits animaux élevés avec des aliments exempts de produits synthétiques étant croissante, il est nécessaire d’identifier des sources d’astaxanthine d’origine naturelle, présentant une efficacité de pigmentation optimale pour les espèces aquacoles cibles et être commercialement accessible à tous. Une source naturelle d’astaxanthine issue d’une algue non génétiquement modifiée cultivée dans des bioréacteurs (Haematococcus pluvialis, HP) a été testée lors d’un précédent projet. Ce projet consistait à suivre la biodisponibilité de cette source d’astaxanthine, par dosage plasmatique. Les résultats ont montré que l’astaxanthine provenant des extraits d’HP était retrouvée dans le plasma mais à des quantités plus faibles que la version synthétique. Ces résultats pourraient s’expliquer soit par la paroi cellulaire épaisse des algues empêchant l’absorption des pigments, soit par la forme estérifiée de l’astaxanthine d’algues, moins disponible pour la pigmentation que la forme libre de l’astaxanthine synthétique. Un traitement chimique au préalable permettant de dégrader la paroi cellulaire pour rendre le pigment plus disponible serait envisageable. Cependant, il serait plus couteux et moins naturelle que de soumettre l’astaxanthine à une augmentation de température et de pression par le processus d’extrusion pour dégrader les parois cellulaires. Le processus d’extrusion qui constitue la transformation incontournable des aliments à destination des poissons apparait comme la solution la plus simple pour améliorer la disponibilité des pigments. Ce nouveau projet propose d’évaluer si un processus d’extrusion appliqué aux aliments pour poisson permet d’améliorer la biodisponibilité d’extraits d’astaxanthine d’HP en déterminant alors la pigmentation des filets de poisson, mais aussi d’évaluer spécifiquement l’impact de la forme estérifiée de l’astaxanthine sur la disponibilité du pigment.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de déterminer si le processus de transformation (extrusion), étape nécessaire à la fabrication des aliments pour poisson est suffisant pour rendre plus biodisponible les pigments en provenance de la source naturelle d’astaxanthine en comparaison à la source synthétique d’astaxanthine. Ce projet permettra aussi de statuer si c’est la structure cellulaire de la biomasse d'algues séchées en provenance d’Haematococcus pluvialis qui est à l’origine de la moindre absorption de l’astaxanthine de HP et donc déterminer si un traitement de la biomasse en amont est nécessaire en plus afin de rendre biodisponible les pigments et de favoriser la pigmentation de la chair, produit final pour les consommateurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 84 jours. Au cours de la procédure, les poissons de tous les groupes seront pesés toutes les 3 semaines après anesthésie. Lors du transfert des poissons du bac d’élevage au bac d’anesthésie, les poissons ne restent pas plus de 30 secondes en dehors de l’eau. Les poissons des groupes 1 et 4 seront soumis à un prélèvement sanguin en fin de procédure après anesthésie pour l'analyse de la concentration plasmatique en caroténoïdes et la détermination de paramètres antioxydants. Pour chaque prise de sang, le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute. Les poissons sont soumis à deux collectes d’excréta avec un période de récupération d'au moins 7 jours.
Impact sur les animaux
Stress dus à la capture et à la sortie des bassins pour la pesée et la collecte des excréta. Saignement mineur au niveau du site de prélèvement sanguin. Inflammation de l’anus dû à la compression de l’intestin pour la collecte des excréta.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser les prélèvements de filet de poisson. En ce qui concerne les animaux du groupe contrôle positif soit 40 poissons, ils seront mis à mort avant de faire l’objet d’une donation dans un Zoo.
Remplacement
La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mettre en évidence la biodisponibilité des caroténoïdes spécifiquement destinés aux poissons. L’efficacité des caroténoïdes ne peut être évaluée qu’en utilisant l’animal auquel il est destiné.
Réduction
Des calculs statistiques ont été réalisés afin de déterminer le nombre d’animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats obtenus dans d’autres études sur les paramètres de pigmentation de la chair des poissons. Le nombre d’animaux à utiliser permettra d’apporter de bonnes conditions d’élevage en favorisant une hiérarchie sociale nécessaire au bien-être des animaux et d’obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d’informations possibles par animal.
Raffinement
Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours d’une étude, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins pour la pesée par groupe des animaux et les prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Le stress dû à la manipulation répétée pour la collecte des excréta est réduite en appliquant une période de récupération d’au moins sept jours et pas plus de 2 collectes. Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques. Dès l'observation d'un signe clinique une grille de score de point limites est utilisée. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les produits d’astaxanthine évalués chez la truite arc en ciel sont destinés à être incorporés dans les aliments comme colorant pour les salmonidés. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats pourront être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée. Seulement des poissons femelles diploïdes sont utilisés dans l’étude. Les poissons sont triés en fonction de leur poids afin de pouvoir constituer des bassins de poids homogène au démarrage de l’étude . Utilisation de truites de 120 grammes. Cette taille permet d’élever les poissons pendant 12 semaines dans de bonnes conditions d’élevage avec un poids final estimé à 700 g nécessaire pour pouvoir effectuer le prélèvement sanguin et les levées de filets demandées par la procédure.
Evaluation préclinique du potentiel thérapeutique d’un mélange polymérique pulvérisable sur l’évolution d’une plaie.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Pour tester un spray polymérique censé accélérer la cicatrisation, 336 souris subissent une incision chirurgicale de la patte droite, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des prélèvements de tissus. Le porteur écrit que la douleur associée à la plaie "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude". Chaque souris enchaîne jusqu'à vingt-trois tests comportementaux, dont le RNT ne précise pas la nature au-delà d'une évaluation de la douleur, des troubles moteurs et du bien-être, avec pour certains un isolement d'une nuit ou un jeûne de 24 heures. Le porteur indique qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer le modèle in vivo, l'observation comportementale exigeant selon lui un animal vivant et vigile.
Objectifs
Une plaie chronique peut être définie comme une plaie qui n'a pas bien cicatrisé dans les 3 mois suivant la blessure. Les plaies chroniques sont souvent appelées ulcères et peuvent être définies comme des plaies de pleine épaisseur qui ont tendance à cicatriser lentement. Ces dernières, souvent masquées par des comorbidités, représentent une épidémie silencieuse qui touche une grande partie de la population mondiale. On estime que 1 à 2 % de la population des pays développés développera une plaie chronique au cours de sa vie. L'augmentation de la population vieillissante accroît ces chiffres, car la vitesse de fermeture des plaies est inversement corrélée à l'âge. Les plaies chroniques entraînent des incapacités qui aggravent les conséquences des blessures, ce qui crée un cercle vicieux. Les complications des plaies chroniques comprennent les infections telles que la phlébite infectieuse, la nécrose, les hémorragies voire les amputations des membres inférieurs. Pour les patients diabétiques atteints d’ulcères aux pieds, le taux d’infection avoisine les 40% et des améliorations dans l’offre de soin sont attendues par les professionnels de santé et les patients. Actuellement il n’existe pas de traitement péri ou post-opératoire satisfaisant permettant de diminuer la proportion de ces plaies. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'impact de l'efficacité d’une pulvérisation d’un mélange polymérique composé de polyarginine (PAR) et d’acide hyaluronique (HA) sur une incision dans un modèle de souris. Le but de cette étude sera d'évaluer en termes de sensibilité, de comportement et de locomotion l'effet d'un traitement par spray PAR/HA sur l'incision pendant le processus de cicatrisation, en comparaison avec un spray de solution saline.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse est que la pulvérisation de PAR/HA peut avoir un effet positif sur la cicatrisation des plaies, en réduisant le temps de fermeture des plaies, en normalisant les seuils nociceptifs et en diminuant les déficiences locomotrices. Nous avons également ajouté des tests comportementaux pour évaluer si le spray lui-même peut avoir un impact sur le bien-être des animaux.
Procédures
Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevra 4 pulvérisations d'un mélange polymérique: 2 pulvérisations au niveau du site de lésion pendant la chirurgie puis 1 pulvérisation 2h après sur la plaie et une dernière pulvérisation 24h après la chirurgie. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux durant de 3 à 10 min (maximum 23 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur, leurs troubles moteurs et leur bien-être.
Impact sur les animaux
Il y a présence d’une plaie et d’une douleur associée qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie d’incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 6 jours après la chirurgie. La chirurgie incisionnelle va induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ce modèle d’étude. Pour un test, les souris seront isolées une nuit. Pour un autre test, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h. Pas de nuisance particulière attendue par rapport à la pulvérisation du spray en lui-même en raison de l’absence de toxicité bien documentée dans la littérature des deux molécules.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique d’un mélange polymérique pulvérisable sur l’évolution d’une plaie et les troubles sensitifs et moteurs associés nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique interindividuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du mélange polymérique pulvérisable étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de tests comportementaux au sein d'une même procédure.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Une acclimatation de 2 semaines aux locaux et des habituations à l’expérimentateur (handling) et aux tests comportementaux sont systématiquement réalisés. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
Développement d’un traitement pour une maladie neurologique associée à une cardiomyopathie par thérapie génique chez les souris (1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
3 892 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un quart de chaque portée développe une cardiomyopathie fatale, avec perte de poids, difficultés de mouvement et posture anormale, et les souriceaux nouveau-nés sont anesthésiés par hypothermie sur de la glace humide avant injection. Chaque souris peut subir jusqu'à treize échocardiographies sous anesthésie, autant de tests d'open field et de grip test, et des transports vers un centre extérieur. Le porteur affirme que le recours à la souris est "nécessaire et indispensable" pour tester des vecteurs de thérapie génique contre une maladie rare qui tue la plupart des enfants atteints avant deux ans.
Objectifs
Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le cœur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés.
Bénéfices attendus
À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.
Procédures
-Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ) -échocardiographie (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -open field test (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -grip test (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - anesthésie par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris)
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie fatale. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse des tissus.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes
Etude chez la souris du rôle joué par la neuroinflammation périnatale dans la progression de la tauopathie à l’âge adulte, une composante majeure de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injectées dix fois en cinq jours peu après leur naissance, avec une substance inflammatoire ou une solution saline, puis opérées du cerveau à l'âge adulte pour une partie d'entre elles, 1 869 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, de même que les reproducteurs en fin de fertilité et les descendants au génotype non retenu. L'équipe veut savoir si cette inflammation précoce accélère ou freine l'accumulation de la protéine Tau chez des souris transgéniques ou injectées d'un vecteur viral, et une partie des souris passe quatre à cinq tests comportementaux de mémoire que le résumé ne nomme pas. Le porteur qualifie l'injection dans le cerveau d'acte "peu invasif" dont les souris récupèrent "très rapidement". Il indique aussi que, dans sa colonie, les souris porteuses de plaques amyloïdes connaissent une mortalité précoce liée à des crises d'épilepsie spontanées, de 6 % chez les mâles et 13 % chez les femelles, qui peut atteindre 30 % après une injection intracérébrale.
Objectifs
Il n'existe pas actuellement de traitement curatif de la maladie d’Alzheimer (MA) dont le nombre de cas est amené à augmenter régulièrement au cours des prochaines décennies du fait du vieillissement de la population. L'amélioration de la connaissance de la MA permettra d'identifier de nouvelles possibilités de traitements et de nouveaux marqueurs diagnostiques afin d'améliorer la prise en charge des patients, ce qui est un enjeu crucial de santé publique. Cette maladie, causée par une lente dégénérescence des neurones, se caractérise par la présence dans le cerveau de plaques amyloïdes, et de dégénérescences neurofibrillaires, résultant de l’accumulation de la protéine Tau. La protéine Tau est exprimée dans les axones des neurones, où elle régule la dynamique du réseau de microtubules (sortes d’armatures de soutien des cellules). Dans la MA, on assiste à une modification de la protéine Tau qui se traduit par une formation d'agrégats toxiques s’accumulant dans les neurones entrainant leur mort. Ce phénomène, appelé tauopathie, joue un rôle majeur dans la maladie d'Alzheimer, car il existe une très bonne corrélation entre la progression de la tauopathie et celle des symptômes de la maladie. Les recherches récentes désignent la neuroinflammation (mécanisme de l'immunité cérébrale pour protéger le cerveau des agressions) comme acteur majeur parmi l’ensemble des causes de la MA. Il est bien établi que la microglie, cellule immunitaire cérébrale, joue un rôle dans l’élimination des plaques amyloïdes. Le rôle de la microglie dans la tauopathie est cependant moins étudié. Pourtant, des études récentes suggèrent que la microglie joue un rôle dans la propagation de la tauopathie entre neurones connectés. Il est donc crucial de déterminer quel état microglial favorise ou au contraire ralentit la progression de la tauopathie. Pour répondre à cette question nous utiliserons deux modèles murins de la maladie d’Alzheimer dans lequel un syndrome inflammatoire sera induit par des injections de protéines stimulant la réaction immunitaire. Ce protocole sera appliqué sur différents animaux modèles de la MA soit transgéniques, soit par transfert de gène à l'aide de vecteurs AAV. Cela permettra d'analyser l'effet de la modification à long terme de la microglie sur l'évolution de la tauopathie, et de déterminer quel état d'activation microgliale il faut favoriser pour lutter contre la progression de la tauopathie.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est une maladie incurable et mortelle causée par la dégénérescence progressive des neurones,ayant pour conséquence des déficits cognitifs importants évoluant invariablement jusqu’à la démence et la perte d’autonomie complète. Elle touche près d’une personne sur 5 au-delà de 75 ans. Les traitements disponibles actuellement ne font que ralentir très modérément la progression de la maladie. Il est donc nécessaire de mettre au point des nouveaux traitements qui représenteront de réelles avancées thérapeutiques pour les patients et leurs proches. Pour mettre au point ces nouveaux traitements, il est nécessaire de mieux comprendre quelles sont les causes de la maladie, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. C’est l’objectif principal de ce projet qui vise à mieux comprendre l’implication d’un type de cellules cérébrales impliquées dans la réaction immunitaire, les cellules microgliales, dans la progression de la maladie d’Alzheimer. Ces cellules sont les macrophages résidents du cerveau et sont activées concomitamment à la neurodégénérescence. Nous utiliserons un modèle d’activation à long terme de la microglie obtenu par administration d’une cytokine pro-inflammatoire dans les jours qui suivent la naissance. Ce protocole sera combiné à des modèles murins de maladie d’Alzheimer. Afin de mieux cerner le rôle de la microglie dans le développement de la pathologie, les effets de l’injection de la substance activant la réaction inflammatoire sur l’évolution des symptômes cognitifs et des lésions tissulaires seront étudiés. Nous réaliserons également une étude des gènes exprimés par la microglie afin de caractériser les voies de signalisation et les processus métaboliques dérégulés. En plus de l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’activation microgliale en fonction des phases de la maladie d’Alzheimer, et quelle(s) stratégie(s) thérapeutique(s) adoptée(s) aux différents stades de la pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - L’ensemble des animaux inclus dans les cohortes expérimentales recevront une injection d’une substance inflammatoire) ou de solution saline (10 injections sur 5 jours sur souriceaux vigiles [30 secondes par injection]). - Une partie des animaux recevra une injection intracérébrale à l’âge adulte (entre 3 et 9 mois en fonction des groupes) par une technique de chirurgie spécifique au cerveau (durée de la chirurgie : 20 à 30 minutes. Cet acte est peu invasif et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. - Une partie des animaux recevra une injection unique de vecteur utilisé pour apporter le gène d’intérêt aux cellules cibles à l’âge adulte (2-3 mois). Cet acte dure moins d’une minute et se pratique sous anesthésie légère. Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités cognitives et mnésiques. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué sur une période de 4 à 6 semaines en fonction du nombre de tests prévus (4 à 5).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront des effets indésirables différents : - L’injection de la substance inflammatoire aux souriceaux entraîne des effets secondaires minimes, principalement une inflammation périphérique et centrale, ainsi qu’une hypothermie transitoire. Tous ces effets cessent après l’administration. - Les effets secondaires liés à l’injection intracérébrale se limitent à une douleur transitoire au niveau de l’abord chirurgical (incision du scalp et pose d’agrafes). - Deux des trois modèles de souris utilisés ne présentent pas de symptômes plus invalidants que les déficits cognitifs décrits dans la littérature. - Les souris présentant des plaques amyloïdes ont un phénotype dommageable (présence d’un caractère qui altère gravement l’état général de l’animal) car elles présentent des crises d’épilepsie spontanées conduisant à une mortalité précoce avec un pic entre 1 et 3 mois d’âge. Dans notre colonie, la mortalité est de 6% chez les mâles et 13% chez les femelles, mais elle peut atteindre 30% suite à une injection intracérébrale. - L’injection intraveineuse peut entraîner une hémorragie légère qui se résorbe spontanément en quelques minutes. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Ce stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement.
Devenir
Tous les animaux qui seront inclus dans des cohortes expérimentales sont in fine destinés à une étude histologique (analyse des tissus) et/ou transcriptomique (analyse de l’expression des gènes) des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie pour prélever cet organe. L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Les animaux reproducteurs des différentes lignées transgéniques utilisés pour générer les souris incluses dans les cohortes expérimentales seront euthanasiées en fin de période de fertilité. Ces animaux ne seront en effet plus utilisables dans le cadre du projet, et ne pourront pas non plus être recyclés dans d’autres projets du fait des potentiels biais expérimentaux induits par la période de reproduction active (effets des changements hormonaux chez les femelles et développement de l’agressivité envers les congénères chez les mâles). L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Afin de minimiser le temps d’élevage en captivité, les animaux issus de ces accouplements dont le génotype n’est pas souhaité pour le projet seront euthanasiés immédiatement à l’issue de la procédure de génotypage par les mêmes méthodes. Le fond génétique de ces différentes lignées, qui peut diverger de celui des souches de souris initiales, ne permet pas la reutilisation des animaux pour d’autres projets afin d’éviter tout risque de biais expérimental dû au fond génétique.
Remplacement
Ce projet fait appel à des modèles de souris déjà caractérisés de la maladie d’Alzheimer. A l’heure actuelle, ce projet ne peut ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, les modifications de l’activation microgliale qui surviennent au cours du vieillissement normal et pathologique ne peuvent pas être reproduit dans des modèles cellulaires 2D ou organoïdes. Enfin, l’étude des relations entre cellules gliales et neurodégénérescence requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est à dire possédant un cerveau complexe doté d’un système limbique permettant d’exprimer des comportements sophistiqués. De plus la proximité entre l’espèce humaine et la souris maximisera la pertinence des cibles thérapeutiques identifiées au cours de ce projet.
Réduction
Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues en fonction des analyses pratiquées pour chaque procédure. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les valeurs que nous avons observées dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 1869 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum, qui comprend 66 groupes expérimentaux et 52 groupes témoins de référence qui seront étudiés tout au long des 5 années du projet, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les cohortes incluses dans les différentes procédures puissent être étudiées sur différents paramètres. Par exemple certains animaux seront utilisés à la fois pour des études transcriptomiques et histologiques.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. L’état de santé des souriceaux sera surveillé de manière biquotidienne tout au long de la période de traitement périnatal. Leur état de forme sera évalué grâce à une grille de score permettant de définir le point limite au-delà duquel le traitement ne pourra être poursuivi pour l’animal en question. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.
Choix des espèces
Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la maladie d’Alzheimer afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. La région initialement et la plus gravement atteinte dans la MA est le système limbique (connu sous le nom de cerveau émotionnel) qui gère la mémoire et les émotions. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas de système limbique. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent un système limbique très proche de celui de l’espèce humaine. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de MA. Elles présentent également des altérations cognitives (défauts de mémoire spatiale et de mémoire de travail) qui sont caractéristiques de la MA. Ces déficits peuvent être quantifiées par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : Les administrations de cytokines seront réalisées à la période périnatale pour respecter le protocole d’activation microgliale à long terme largement validé et publié par nos collaborateurs. La MA se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits subtils apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les modèles animaux à un temps précoce et a un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin du processus pathologique, soit entre 5 et 14 mois selon les différents modèles de MA qui seront étudiés au cours du projet.
Caractérisation et recherche d’indicateurs de la santé globale du veau en races Holstein et Normande
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Soumis à quatre prises de sang, cinq écouvillonnages rectaux, des écouvillons nasaux et buccaux et trois tontes dorsales, 270 veaux femelles Holstein et Normande sont maintenus au cornadis ou en cage de contention, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Aucun n'est tué dans ce projet, tous étant destinés à d'autres expérimentations qui prolongeront celle-ci. L'objectif déclaré porte sur des indicateurs de santé du jeune bovin, que le porteur rattache à la "durabilité" économique de l'élevage et à son "acceptabilité sociétale". Il revendique aussi l'une des premières utilisations mondiales d'un outil de biotechnologie, testé "à grande échelle" par comparaison avec la formule sanguine.
Objectifs
La santé a longtemps été considérée sous la forme d’un caractère binaire : l’animal est sain ou malade au regard d’une affection ou d’une maladie donnée, à un instant donné. Toutefois, l’état de santé général est multifactoriel et évolutif. Il possède un fort impact sur le bien-être de l’animal, de même que sur ses performances zootechniques et sa longévité. De ce fait, il s’agit d’un caractère clé pour la durabilité tant environnementale qu’économique de l’élevage, ainsi que pour son acceptabilité sociétale. Dans une optique de re-conceptualisation de la santé pour prendre en compte son caractère continu, explorer ses mécanismes biologiques, et étudier ses liens avec les autres performances, un collectif de scientifiques a défini ensemble les contours d’une nouvelle expérimentation de long terme en bovins laitiers. Le projet que nous vous soumettons aujourd’hui est la première brique de cette expérimentation et porte sur les veaux. Le jeune âge est un moment critique, marqué par des taux de mortalité importants et pouvant avoir une influence sur la vie entière de l’animal. L’objectif de ce projet est d’obtenir une caractérisation biologique fine et longitudinale (i.e. à plusieurs temps au cours des six premiers mois) des différentes couches de la variabilité individuelle, de manière à établir des liens entre ces paramètres et la santé de l’animal, à court et à long terme. Afin de pouvoir distinguer ce qui est liée à la génétique des animaux par rapport aux conditions environnementales, un effectif d’animaux important sera nécessaire. Toutefois, certains paramètres mesurés pourraient rapidement s’avérer inutiles à certains temps (absence de variabilité individuelle, corrélation très forte entre plusieurs paramètres…). Aussi, la présente demande possède un second objectif, celui d’identifier, sur la base des deux premières cohortes de veaux, les phénotypes (ce que l'on peut mesurer) et les temps de la vie du jeune animal les plus pertinents à analyser sur l’ensemble des cohortes et ainsi alléger le protocole.
Bénéfices attendus
Tout d’abord, nous attendons de ce projet des avancées de connaissances scientifiques, avec une meilleure caractérisation des phénotypes mesurés (variabilité individuelle, sensibilité environnementale, évolution au cours du temps), et des relations qui les unissent, afin d’identifier les synergies et les compromis entre fonctions physiologiques. L’ensemble de ces résultats servira également à déterminer quelles sont les mesures clés à reproduire dans les prochaines cohortes, et ainsi à raffiner le protocole. Par ailleurs, il s’agira de l’une des toutes premières utilisations mondiales d'un outil de biotechnologie. Il s'agira de tester à grande échelle ce nouvel outil et il pourra être validé par comparaison avec la formule sanguine. Si cette efficacité est vérifiée, il pourra à terme être utilisé sans nécessité d’avoir en parallèle la formule sanguine. Ce développement serait fort utile pour la gestion quotidienne des expérimentations, surtout dans le cadre de dates de vêlage étalées dans le temps. Par la diversité des phénotypes explorés et grâce à l’utilisation d’outils innovants, ce projet se positionne en front de science. Il représente également une opportunité forte pour tisser et renforcer des collaborations de manière concrète entre des scientifiques d’horizons différents de par son caractère transdisciplinaire.
Procédures
Pour la caractérisation fine des animaux, des prélèvements sanguins et des écouvillons nasaux, buccaux et rectaux seront effectués 4 fois (5 pour les rectaux) au cours de l’expérimentation sur les femelles vigiles, maintenues en cage de contention ou au cornadis. Une tonte dorsale sera effectuée 3 (ou 4 fois pour un sous-échantillon d’animaux) dans les mêmes conditions. Les mesures de poids (une fois tous les deux semaines) se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux. Voici le temps estimé pour chaque acte : Prise de sang : 2 minutes Microbiote : quelques secondes pour chacun des trois sites Poils : quelques secondes
Impact sur les animaux
Les prélèvements prévus (prises de sang, tonte de poils et écouvillonnages nasaux, rectaux et buccaux) seront réalisés dans le cadre d'une contention adaptée au poids des veaux (animal au cornadis ou animal bloqué dans une cage). Cette contention, ainsi que la simple présence humaine et la manipulation associée peuvent générer un stress ponctuel chez l'animal. Le prélèvement en lui-même (en particulier le prélèvement sanguin) peut générer sur le moment une douleur limitée et fugace. De part les interventions d'élevage, une phase d'imprégnation à l'homme est réalié dès la naissance de chaque veau. Cela réduit grandement le stress généré par la présence de l'homme lors des prélèvements, d'autant que ce sont les mêmes personnes qui interviennent. Il n'est attendu aucun dommage ni effet indésirable à moyen ou long terme. Il n'y a pas de mise à mort des animaux.
Devenir
Les procédures n’entravent pas le devenir de l’animal et n’ont qu’un effet limité et de court terme sur son bien-être. Aussi, l’ensemble des animaux inclus dans cette expérimentation va poursuivre une vie normale d’un animal de renouvellement dans un troupeau de bovins laitiers. La suite de leur vie fera l’objet de nouvelles expérimentations poursuivant celle-ci.
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico.
Réduction
La présente demande porte uniquement sur la fin de la cohorte 2024 et sur les deux cohortes suivantes complètes, soit un total d’environ 270 veaux. Le choix de faire porter ce projet exploratoire sur 270 animaux a été déterminé à partir des éléments suivants : - la plupart des paramètres sont analysés en une seule fois pour tous les animaux à la fin de chaque campagne, il nous faut donc considérer des campagnes entières - Analyser une unique campagne représente un risque de non-représentativité si l’effet campagne est important - l’effectif de deux campagnes complètes (120*2=240 animaux) nous semble suffisant pour évaluer la redondance ou l’absence de variabilité. - la présente demande est formulée en cours de campagne 2024. Si une réponse positive était obtenue avant la fin des vêlages de cette année, nous estimons pertinent de réaliser également les prélèvements sur les dernières naissances de la campagne (maximum 30 femelles), aussi bien pour pouvoir mieux évaluer les variabilités annuelles que pour avoir des premiers a priori sur les paramètres. Les données de ces 270 premiers veaux s’ajouteront aux données de futures expérimentations afin de constituer une population assez grande pour une étude génétique (généralement 600 individus nécessaires pour une puissance statistique suffisante).
Raffinement
Plusieurs dispositions ont été prises afin de raffiner ce protocole. Tout d’abord, les différentes mesures ont été regroupées sur les mêmes temps afin de limiter le nombre d’interventions sur les animaux. Ensuite, chaque intervention a été pensée de manière à limiter les nuisances pour les animaux (limitation des volumes de sang prélevés, utilisation de tondeuse vétérinaire silencieuse pour limiter le stress…) Enfin, il est attendu, compte tenu du caractère exploratoire du projet et du nombre de paramètres mesurés, que certains caractères ne s’avèrent au final pas pertinents (redondance, absence de variabilité individuelle…). Une étape supplémentaire du raffinement sera, sur la base des résultats obtenus sur ces premières cohortes, de réduire le nombre et les volumes de prélèvements afin de ne garder que ceux apportant de l’information pour inscrire dans la durée un protocole allégé. La procédure impliquée dans le projet est de classe légère et appliquée par des opérateurs expérimentés. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage en intérieur avec une aire paillée et, suivant son âge, une ration de colostrum, de lait puis d’alimentation solide dans des distributeurs en accès libre. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ne sont pas modifiés par la mise en oeuvre du projet. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage, et, au besoin, le vétérinaire praticien sera consulté. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Holstein et Normande, grandes races laitières françaises (et internationale pour la Holstein). Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des veaux femelles de leur naissance à 6 mois d’âge car nous souhaitons étudier la santé du jeune bovin.