Recherche appliquée

Opérées du crâne pendant 45 minutes pour recevoir dans le cervelet un vecteur qui y fait sécréter une molécule inflammatoire, 59 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent cinq injections abdominales d'une molécule supprimant les cellules régulatrices de l'immunité, un prélèvement de sang dans le sinus de l'œil, puis une injection cardiaque de fixateur sous anesthésie profonde sans réveil. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant le point limite pourrait survenir si cette molécule se révèle toxique, et qu'un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient apparaître si l'inflammation se disséminait dans le cerveau. Les tests de motricité sont précisés, avec traversée sur barre, cage refuge et récompense en fin de test, et le porteur conclut qu'un modèle animal est "indispensable" faute d'échantillons de patientes en nombre suffisant.

Objectifs

La pathologie qui fait l’objet de cette étude est caractérisée par une dégénérescence des neurones du cervelet. Les symptômes associés sont des troubles de l’équilibre et de la coordination conduisant à un handicap sévère en quelques mois. Elle touche principalement des femmes atteintes d’un cancer gynécologique (ovaire, sein). Chez ces patientes, le système immunitaire normalement responsable de détruire la tumeur, s’attaque également aux neurones du cervelet et les détruisent. Le diagnostic est confirmé par la détection d’anticorps présents dans le sang et dans le cerveau dont la caractéristique est de reconnaître les neurones du cervelet ainsi que la tumeur des patientes. La théorie en vigueur suppose que la tumeur est responsable de l’activation du système immunitaire et par des mécanismes encore mal compris, le système immunitaire va également s’activer dans le cerveau et détruire les neurones du cervelet. Afin d’étudier les mécanismes à l’origine de la pathologie, le recours à un modèle animal est indispensable à cause de la rareté des échantillons disponibles auprès des patients. Ce modèle permettra des analyses plus approfondies depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. L’objectif est donc de développer un modèle de la maladie chez la souris qui soit au plus proche de la maladie humaine. A ce stade l’objet de cette demande d’autorisation est d’évaluer et valider 2 méthodologies qui seront employées pour modéliser la maladie chez la souris. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Grâce à la modélisation de la maladie chez la souris, l’identification des mécanismes qui conduisent à l’activation des défenses immunitaires contre les neurones du cervelet permettra à terme de développer une thérapie efficace pour guérir les femmes atteintes par la maladie.

Procédures

Interventions réalisées à l’EU1 : -En début de protocole une chirurgie d’environ 45 minutes est réalisée sous anesthésie et analgésie pour l’injection dans le cervelet, à travers un orifice minime d’un millimètre dans l’os cranien, d’un vecteur capable de faire sécréter une molécule inflammatoire localement par les cellules immunitaires. -Un prélèvement de sang est effectué en quelques secondes sur animal anesthésié avant mise à mort. -Cinq injections d’une molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité seront faites par voie abdominale sur 2 semaines à 3 jours d’intervalle. Intervention réalisée à l’EU2 : une injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral est réalisée sous analgésie et anesthésie profonde sans réveil.

Impact sur les animaux

-Stress modéré induit par la manipulation répétée des animaux et leur contention -Une perte de poids engageant le point limite pourrait survenir dans le cas d’une toxicité de la molécule employée pour induire la suppression des cellules régulatrices de l’immunité. -stress lié à la contention pour réaliser le prélèvement de sang au niveau du sinus de l’oeil -douleur causée par les actes invasifs lors de la chirurgie sous anesthésie -Stress post-opératoire (physique, thermique, nutritionnel) et douleur potentielle sur la zone cutanée après suture. -Un état fébrile ou une perte de mobilité pourraient être induits si l’inflammation est trop disséminée dans le cerveau. Elle devrait néanmoins rester localisée car l’injection est faite localement dans le cervelet et pas en intra-veineuse. -douleur causée par les actes invasifs nécessaires à l’injection par voie cardiaque d’un fixateur du tissu cérébral sous anesthésie profonde sans réveil

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Procédure N°1 : Les animaux seront mis à mort pour contrôler et analyser l’efficacité et la durée de la suppression des lymphocytes régulateurs de l’immunité. Procédure N°2 : Les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse du cervelet afin de valider la production intra-cérébelleuse d’une molécule pro-inflammatoire.

Remplacement

La maladie neurologique qui nous intéresse est caractérisée par la perte des neurones du cervelet et reste encore mal comprise. Les analyses possibles à partir des biopsies des patients sont très réduites de par la rareté de la maladie et concernent essentiellement les liquides biologiques (sérum, liquide céphalorachidien), et les tumeurs. Les biopsies de cerveau n’ont fourni que des informations sur la phase terminale de la maladie. Seul l’impact des anticorps sur le fonctionnement des neurones a pu être étudié sur coupe fraîche de cervelet de rat, mais l’effet observé n’est pas confirmé à l’échelle de l’animal. L’objectif de notre modèle est d’accéder aux mécanismes de la réponse immunitaire qui est dirigée initialement contre la tumeur pour en comprendre le rôle dans l’inflammation du système nerveux central. Aucun modèle cellulaire actuel ne permet de récapituler ces éléments de manière concomitante in vitro. Un modèle animal est donc indispensable pour atteindre nos objectifs et permettra une analyse complète depuis l’apparition de la tumeur jusqu’à la destruction des neurones. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance.

Réduction

Notre protocole vise à évaluer la fonctionnalité biologique de nos méthodologies et à déceler d’éventuels effets indésirables sur les capacités motrices de nos souris. En préambule, la qualité de 2 lots de molécule suppressive des cellules régulatrices de l’immunité sera évaluée grâce à un effectif réduit à 6 animaux contrôles sans consommer inutilement l’effectif total prévu aux tests en cas de toxicité d’un lot. Pour assurer la significativité des résultats obtenus aux tests de motricité, un effectif minimum de 16 animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique de puissance pour chacune des 2 méthodologies. Avant la réalisation des tests de motricité, 3 ou 4 animaux supplémentaires devront être mis à mort à 3 moments clés pour réaliser les analyses biologiques et évaluer la fonctionnalité de la méthodologie employée. Ces moments clés ont été choisis sur la base des études publiées sur nos méthodologies et réduites au minimum sans compromettre le but visé en sus. De plus, les animaux employés aux tests de motricité serviront à un 4ème et dernier point d’analyse qui viendra compléter en terminal les 3 points d’analyse précédents. Ainsi aux 16 animaux précédemment mentionnés, s’ajoutent 12 animaux pour la 1ère méthodologie et 9 animaux pour la 2ème. Ainsi sont nécessaires au projet un total de 34 (6+16+12) et 25 (16+9) animaux, soit 59 animaux.

Raffinement

-Pour limiter le stress des animaux, les souris sont habituées quotidiennement à l’expérimentateur pendant une semaine avant le début de l’expérimentation (5 min par animal. -Une surveillance accrue du bien-être de l’animal grâce à un système de scorage permettra d‘anticiper la perte de poids, de la mobilité et du toilettage pour anticiper au maximum la survenue des points limites. -Une phase d’habituation aux tests de motricité est réalisée sur 4 jours. Une récompense type céréale est donnée en fin de test. Une cage refuge permet de réduire le stress de la traversée sur barre. Les appareils sont nettoyés pour éviter un stress lié à l’odeur des animaux précédents. - des animaux morts n’ayant subi aucune procédure expérimentale seront utilisés pour la mise au point des protocoles d’analyse avec des prélèvements effectués en post-mortem, et pour l’entrainement aux gestes de la chirurgie -Le prélèvement de sang dans le sinus de l'oeil est réalisé avant la mise à mort sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous analgésie sur animaux anesthésiés. Après induction de l’anesthésie, les griffes des animaux sont écourtées pour éviter les infections par grattage de la zone suturée en post-opératoire. Des soins post-opératoires sont appliqués : l’animal est placé dans une enceinte chauffée à une température de 36-38°C pour un réveil optimal en cage individuelle pendant 24h avec mise à disposition facilitée de nourriture (pâté de croquettes humidifiées) et de boisson (en gelée) renouvelées les 2 jours suivants, et avec du matériel de nidification neuf pour contrôler le maintien d’un comportement stéréotypé. L’injection d’analgésique sera répétée les jours suivant. Une surveillance du bien-être sera effectuée les heures suivant le réveil et quotidiennement les jours suivants grâce à une grille de scorage jusqu’à la cicatrisation, puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. Selon l’évolution de la cicatrisation, on appliquera de la crème cicatryl ou dermaflon sur la zone suturée pendant 3 jours. En point final, tous les prélèvements seront effectués après la mise à mort.

Choix des espèces

La souris sera utilisée en raison de l’abondance de littérature sur ce modèle couramment utilisé pour l’étude des pathologies neurologiques. En effet, il s’agit d’une espèce dont l’architecture cérébrale est proche de l’architecture du cerveau humain. La souris est également un bon modèle car il existe un répertoire important de cellules cultivées au laboratoire capables de former une tumeur chez la souris. Il existe aussi de nombreuses lignées de souris génétiquement modifiées, comme celle que nous utilisons pour manipuler le système immunitaire qui nous aidera à comprendre les mécanismes pathologiques responsables de la maladie. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 à 8 semaines car elles sont sexuellement matures et ont presque atteint leur taille définitive.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau, puis jusqu'à quatre injections hebdomadaires d'un composé bactérien immunostimulant encapsulé, avec des mesures de tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique une gêne à la locomotion et des nuisances possibles quand le volume de la tumeur atteint le point limite, ainsi qu'un risque d'infection pour les souris génétiquement modifiées. Il affirme que la diffusion du composé et la réponse immunitaire qu'il déclenche imposent de travailler sur un "organisme entier", après une validation préalable in vitro.

Objectifs

Le rôle du système immunitaire dans l'évolution des cancers est indéniable. Ces dernières années, des avancées significatives ont été réalisées dans le traitement des patients grâce à de nouvelles immunothérapies qui modulent le système immunitaire. Une molécule présente dans les bactéries a été identifiée comme particulièrement efficace pour stimuler le système immunitaire. Cependant, en dépit de ses bienfaits, sa toxicité a empêché son utilisation clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. Il a été décrit que le composé activait deux voies différentes pour stimuler l’immunité, ayant différentes finalités lorsqu’elles sont activées. Ainsi, le but de cette étude serait de mettre en évidence l’efficacité du composé encapsulé seul, ou en combinaison avec un anticorps thérapeutique utilisé en clinique, lorsque l’une de ces voies est entravée. Cela pourrait également permettre de discerner 1) si l’efficacité antitumorale est liée à l’une ou l’autre des deux voies, et 2) si une des deux voies est privilégiée par le composé encapsulé. Également, cette étude pourrait caractériser si des mécanismes alternatifs sont mis en place pour compenser ces entraves.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes d’action du composé immunostimulant encapsulé, en monothérapie ou en combinaison, à savoir 1) les voies activées par le composé, 2) si le composé est toujours efficace malgré les inactivations, 3) si des mécanismes alternatifs sont mis en place lorsqu’un élément de ces voies n’est plus fonctionnel.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - durée < 1 minute. - 1 contention + 1 injection du composé testé dans la veine de la queue et/ou 1 injection en intra-péritonéale /semaine - durée < 5 minutes. - Mesures de volumes tumoraux 3x/semaine- durée < 1 minute Pour les souris non génétiquement modifiées : 3 injections en intra-péritonéale sous anesthésie - durée < 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour toutes les souris (génétiquement modifiées ou non) Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes). Douleur lors d’injection : - Pour toutes les souris : lors de l’implantation des cellules tumorales (durée de quelques minutes, une fois), et lors de l’injection du/des traitement(s) (durée de quelques minutes, maximum 4 fois, chaque semaine). - Pour les souris non génétiquement modifiées : lors de l’injection du réactif entravant les voies activées par le composé encapsulé (durée < 1 minute, 3 fois). Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec le modèle tumoral utilisé. Risque d’infection pour les souris génétiquement modifiées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à la présence de cellules tumorales

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activées par le composé, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Selon les précédentes expériences dans les mêmes conditions de traitement et de contrôles avec des souris non génétiquement modifiées, nous avons pu déterminer grâce à un logiciel statistique le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Pour les souris génétiquement modifiées, celles-ci seront manipulées stérilement pour éviter les infections. Une double paire de gant ainsi que des manchettes seront utilisées, et changées entre chaque cage manipulée pour éviter la transmission de germes. Les maisons, tunnels, nids de cotons et paillage, l’alimentation et la litière sont stérilisés. L’eau, distribuée via des poches à usage unique, est filtrée et stérilisée. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats statistiquement significatifs. Nous prévoyons d’utiliser des souris mâles et femelles afin de s’affranchir des biais et des différences d’effet du traitement qui pourraient être liés au sexe. Le modèle de souris immunocompétent va permettre d’étudier l’efficacité du composé immunostimulant dans des cancers induits chez les souris puisque la réponse immunitaire complète y est représentée. Les souris génétiquement modifiées choisies sont commercialisées et bien décrites dans de nombreuses publications scientifiques. Elles vont permettre de répondre aux problématiques posées de par leur particularité, en rapport avec les mécanismes et réponses ciblés par le composé immunostimulant. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 6 à 12 semaines en fonction des lignées. En effet, il s’agit parfois de petites colonies d’animaux et le fournisseur ne peut garantir l’âge exact des animaux. Cette tranche d’âge permet néanmoins aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale.

Toutes tuées à l'issue parce qu'elles ne sont plus "naïves" et ne peuvent servir à d'autres projets, 720 souris subissent des douleurs inflammatoires et neuropathiques provoquées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un agent inflammatoire est injecté dans leur queue, une chirurgie de vingt minutes lèse la patte d'un autre groupe, puis viennent jusqu'à dix-sept tests de douleur thermique et huit tests de douleur mécanique, avec sept injections quotidiennes du composé testé. Le porteur indique attendre un abaissement du seuil douloureux, des œdèmes, des infections et des troubles de la locomotion. Il affirme que la nociception ne s'évalue que sur "l'animal entier et vigile" et présente la souris comme un modèle "incontournable" en neurosciences.

Objectifs

La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs malgré leurs nombreux effets indésirables. Des résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide, et notamment le récepteur GPR103, sont impliqués dans ces effets indésirables. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques et anti-hyperalgésiques sur cette cible peu ou pas caractérisée jusqu'à présent le récepteur GPR103. Pour ce faire, nous avons récemment identifié deux composés capables de bloquer sélectivement ce récepteur RFamide. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur (inflammatoire et neuropathique), et parfois en co-administration avec la morphine, chez la souris nous permettra notamment de mieux comprendre l’implication de ce récepteur dans la modulation du signal nociceptif. Nous espérons que ces nouveaux traitements permettront seuls de soulager la douleur chronique et/ou de diminuer les effets secondaires de la morphine lorsqu’ils sont donnés en co-administration avec cette dernière. Ce projet est un projet complémentaire d’un autre projet déjà autorisé.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, les résultats de ce projet permettront d’affiner le rôle du récepteur GPR103 dans la modulation de la nociception et le développement de la tolérance induite par un traitement chronique par les opiacés. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur notamment en combinant l’utilisation de morphine à l’un de ces 2 composés afin de réduire les effets indésirables de cette dernière.

Procédures

Un lot d’animaux subira une injection d’agent inflammatoire dans la queue sous anesthésie générale (10 secondes) puis 3 jours après ils auront au total 7 injections sous-cutanées de composé (sur animal vigile) espacées de 24 heures ainsi que 17 tests nociceptifs thermique d’une durée de 30 secondes espacés de 1h minimum. Un second lot d’animaux subira une injection d’agent inflammatoire dans la queue sous anesthésie générale (10 secondes) puis 3 jours après 1 test nociceptif thermique d’une durée de 30 secondes puis une injection sous-cutanée de composé (sur animal vigile). 30 min après cette injection sous-cutanée, ils subiront 7 prélèvements sanguins de 5 µL, à la queue, sous anesthésie locale, espacés d’au minimum 30 min. Un troisième lot d’animaux subira des tests nociceptifs mécaniques pendant une semaine (20 min environ, espacés de 24h minimum) puis une chirurgie sous anesthésie générale au niveau de la patte d’une durée de 20 minutes environ. Puis 10 jours après ils auront au total 7 injections sous-cutanées de composé (sur animal vigile) espacées de 24 heures ainsi que 8 tests nociceptifs mécaniques d’une durée de 20 min environ, espacés de 24h. Un quatrième lot d’animaux subira 2 injections par jour (10 secondes) espacées de 4h pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.

Remplacement

Les 2 molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier et vigile ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour le récepteur RFamide GPR103 disponible au laboratoire collaborateur de ce projet dans les mêmes modèles de douleur.

Réduction

En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, nous avons pu estimer par une analyse statistique que 12 animaux sont requis pour obtenir une analyse statistiquement robuste au vu du pourcentage de variation attendu. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et les femelles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Une acclimatation et une habituation à l’expérimentateur (handling) et aux tests comportementaux de 2 semaines sont systématiquement réalisés. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées, un gel ophtalmique sera appliqué et un tapis chauffant servira à réduire l’hypothermie des animaux. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Une analgésie sera mise en place pour les prélèvements sanguins. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands du récepteur RFamide GPR103 la tolérance induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

128 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses histologiques du cerveau. Certaines subissent une chirurgie d'environ une heure pour recevoir une injection dans l'hippocampe, d'autres, porteuses de la mutation du syndrome de Dravet, sont exposées à 43 degrés pour déclencher des crises d'épilepsie, puis toutes passent quatre séances d'IRM sous anesthésie pouvant atteindre quatre heures. Le porteur indique que ces inductions peuvent entraîner des douleurs et une perte de poids, et que les anesthésies répétées peuvent fragiliser les animaux. Il écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le fonctionnement du cerveau et qu'il n'a donc "pas d'autre choix", l'objectif restant de calibrer une méthode d'IRM avant un éventuel passage chez l'humain.

Objectifs

L’épilepsie est une maladie neurologique courante, et malgré les multiples molécules antiépileptiques disponibles, environ 30% des patients présentent une résistance aux médicaments. La chirurgie cérébrale visant à enlever les zones épileptogènes (ZE) est une thérapie efficace pour un grand nombre de ces patients mais nécessite une identification précise de ces ZE, caractérisées par une excitation neuronale accrue. La stéréo-encéphalographie, technique d’enregistrement des activités intracérébrales à l’aide d’électrodes implantées à l'intérieur du cerveau, est à ce jour la méthode de choix utilisée pour l’exploration des ZE. Cependant, cette technique présente des limites de par son caractère invasif et son échantillonnage limité du volume cérébral à l'aide des électrodes. L’amélioration de la localisation des ZE et la cartographie des altérations fonctionnelles cérébrales restent un besoin non satisfait. Des techniques permettant une évaluation précise de ces altérations permettraient d'approfondir notre connaissance de la maladie. Une approche IRM alternative a été mise au point pour aider à localiser les ZE par quantification du glucose et du glutamate. Malheureusement, la validation d'un protocole clinique robuste n'a pas encore été effectuée. L’objectif de ce projet est donc de faire progresser l'utilisation de l'IRM pour localiser les ZE dans des modèles animaux et pouvoir par la suite l’appliquer chez l’homme et ainsi leur permettre d’avoir accès au traitement chirurgical.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de faire progresser l'utilisation de l'IRM de nouvelle génération pour localiser les ZE dans des modèles animaux d’épilepsie. Si nous arrivons effectivement à calibrer chez la souris cette nouvelle méthodologie IRM alors c’est un grand espoir pour un passage en clinique, ce qui facilitera la prise en charge de tous les patients qui nécessitent une chirurgie cérébrale.

Procédures

Les souris que nous utiliserons seront anesthésiées pendant quelques minutes pour la pose d'un cathéter à demeure. Ensuite, certaines souris subiront une intervention chirurgicale pour induire l'épilepsie ou bien les souris modèle du syndrome de Dravet (une pathologie génétique qui provoque des crises d’épilepsie graves chez l’enfant) seront exposées à 43 degrés pendant quelques minutes pour induire des crises d'epilepsie. Les chirurgies seront d’environ 1 heure et les inductions des crises pour le modèle du syndrome de Dravet quelques minutes. Pendant toute la durée du protocole, les souris subiront quatre examens IRM pour lesquels elles devront être anesthésiées. Ces scanners n’excéderont pas un par semaine. La durée des séances d’IRM sera de 4 heures maximum.

Impact sur les animaux

Les inductions du phénotype épileptique, que ce soit par des injections intra-hippocampiques de substance pro-épilepsie ou bien par hyperthermie, ainsi que les chirurgies nécessaires pour placer un cathéter da façon pérenne, pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. Les souris modèles du syndrome de Dravet sont prédisposées à l'épilepsie, mais seulement si elles sont exposées à des hyperthermies de manière répétée. Dans le cas contraire, il s'agit de souris que l'on peut considérer comme non malades. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux induisant une modification du comportement et/ou une perte de poids. L'anesthésie est nécessaire pour éviter à l'animal le stress de la position contraignante et pour éviter tout mouvement qui invaliderait les acquisitions IRM.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des analyses histologiques du cerveau avec la réalisation notamment de marquages histologiques de coupes de cerveau pour caractériser leurs propriétés moléculaires. Les analyses ex vivo sont nécessaires pour confirmer que les ZE indiquées par l'IRM sont bien des ZE.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro du fonctionnement normal ou pathologique du cerveau ainsi que de son organisation anatomique, tissulaire et cellulaire. Pour mettre au point une nouvelle méthode de diagnostic d’épilepsie, nous n’avons pas d’autre choix que de recourir à des modèles animaux de l’épilepsie. Notre choix s’est porté sur deux modèles animaux très couramment utilisés. La souris constitue un modèle adapté pour les expériences proposées, où le couplage entre neurones et vaisseaux sanguins complètement fonctionnels est requis pour investiguer les effets des crises. De plus, un des modèles utilisés est issus de lignées génétiquement modifiées ayant la même mutation génétique que les patients.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux a été soigneusement calculée sur la base d'études similaires déjà publiées, afin de minimiser leur taille. Comme les analyses basées sur l'IRM visent à identifier les régions du cerveau responsables des crises d'épilepsie, si nous obtenons de bons résultats dans la localisation, nous n'utiliserons pas la totalité du nombre d'animaux prévu. De plus, un examen minutieux de la littérature scientifique qui sera publiée pendant ce projet permettra d'éviter d'éventuelles expériences redondantes.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés au quotidien par les zootechniciens et, si nécessaire, par le vétérinaire, tout au long de la procédure. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, en fonction de son état, par de l'analgésie ou bien une sortie d'expérimentation. Des critères précis ont été établis, en accord avec le vétérinaire de l’installation, pour évaluer le bien-être des animaux selon une grille de score établissant des points limites. Pendant les interventions chirurgicales les souris sont anesthésiées et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthétiques locales. Pour le suivi post chirurgie d’injection intra-hippocampique ainsi que pour le suivi post induction par hyperthermie des souris, là aussi des critères ont été établis en accord avec le vétérinaire pour évaluer l’état de l’animal. Si l’un des critères n’était pas respecté, alors une prise en charge adaptée sera mise en place, allant de l’analgésie jusqu’à une sortie possible d’expérimentation.

Choix des espèces

Les souris sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie. La littérature fournit des preuves de la fiabilité des approches in vivo pour l'évaluation des modifications patho-physiologiques des tissus et de la réponse à des traitements antiépileptiques. Les animaux seront des adultes âgés de 6-10 semaines, l'âge idéal d'induction de l'épilepsie. La préférence pour l'induction du phénotype à l'âge adulte est due aux risques inhérents de mortalité chez les souris plus jeunes. Des études antérieures ont montré des phénotypes très similaires induits à différents âges.

Irradiées sans anesthésie puis greffées avec des cellules leucémiques humaines, 1 600 souris dépourvues de système immunitaire seront toutes tuées pour prélever rate et moelle osseuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à dix ponctions de moelle osseuse dans la patte, six prises de sang à la joue et des cycles de traitement quotidien de 28 jours répétés jusqu'à trois fois. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, non invasives et maîtrisées", tout en indiquant que la prolifération des cellules leucémiques peut faire souffrir l'animal, avec perte de poids et diarrhées. Il juge le recours à un animal entier vivant "nécessaire et indispensable" au motif que les lignées cellulaires ne reproduisent pas la diversité des leucémies des patients.

Objectifs

Les leucémies aiguës (LA) sont des cancers agressifs du sang affectant les différents types de cellules de notre système immunitaire. Notre objectif est de générer des modèles d’étude de ces leucémies humaines en injectant les cellules leucémiques humaines provenant des prélèvements faits sur les patients dans des souris dépourvus de système immunitaire (absence de rejet de greffe). L’établissement de ces modèles nous permettra d’élucider les mécanismes biologiques de ces leucémies et de tester l’efficacité thérapeutique de molécules déjà utilisées en médecine humaine dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la transformation des cellules normales en cellules leucémiques mais aussi des mécanismes responsables des résistances aux traitements par la chimiothérapie et des rechutes. A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer les thérapeutiques futures en proposant des traitements ciblés plus efficaces et moins toxiques dans le but d’améliorer le devenir des patients.

Procédures

Pour mettre en place le modèle d’étude, des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à une irradiation de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules leucémiques humaines injectées. Le lendemain les cellules leucémiques humaines seront injectées en une fois soit par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 30 secondes) soit directement dans la moelle osseuse au niveau de la patte des souris anesthésiées et analgésiées. (durée 3 min maximum). Afin de suivre le développement du cancer, des prélèvements de moelle osseuse dans la patte des souris anesthésiées et analgésiées (3 minutes maximum) seront réalisés une fois par mois et au maximum 10 fois. En complément, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris (30 secondes maximum) sans anesthésie seront réalisés 2 fois par mois et au maximum 6 fois. Les molécules thérapeutiques seront administrées quotidiennement aux souris sans anesthésie soit oralement (avec une sonde de gavage ; durée 1 min) soit par voie intraveineuse (dans la veine de la queue ; durée 30 sec) soit par voie intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen ; durée 30 sec). Des cycles de traitement d’une durée de 28 jours seront réalisés et pourront être répétés au maximum 3 fois De l’imagerie non invasive sur souris anesthésiées (ayant reçu une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant la visualisation des cellules leucémiques) pourra dans certains cas remplacer les prélèvements de sang ou de moelle osseuse pour le suivi de la réponse aux molécules thérapeutiques testées (durée de l’imagerie= 15 min).

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides, non invasives et maîtrisées par l’ensemble du personnel. Cependant, l’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. Les prélèvements de sang et moelle osseuse peuvent causer une douleur légère et brève au niveau du site de prélèvement. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. La prolifération des cellules leucémiques peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage ; le plus souvent une perte de poids et des diarrhées précéderont ces évènements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales et au plus tard 12 mois après l’implantation des cellules leucémiques humaines en cas d’échec de greffe afin de collecter les différents organes tels que la rate et la moelle osseuse. Cela permettra de réaliser des analyses complémentaires sur les cellules leucémiques mais également de les conserver afin de permettre des utilisations mutualisées.

Remplacement

Les lignées de cellules leucémiques existantes ne permettent pas de représenter la diversité des leucémies observées chez les patients ni de modéliser les étapes de passage de cellules normales en cellules cancéreuses ni les mécanismes biologiques responsables des résistances aux traitements et des rechutes. De plus à ce jour il n’existe que quelques modèles de culture en milieu artificiel (in vitro) qui permettent seulement de maintenir temporairement des cellules leucémiques humaines mais leur pertinence reste partielle car cela ne récapitule pas la complexité de l’environnement physiologique ou pathologique des cellules humaines. Au contraire, l’utilisation d’un modèle animal entier vivant assure la présence d’un environnement complexe récapitulant les conditions retrouvées chez les patients. Ainsi l’utilisation d’un modèle utilisant un animal entier vivant est donc nécessaire et indispensable pour étudier la biologie des leucémies et tester des molécules thérapeutiques dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients.

Réduction

Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Pour certains modèles, de l’imagerie in vivo non invasive sera réalisée permettant de faire un suivi en direct de l’évolution de la maladie et de l’efficacité des traitements. De plus cela permettra d’anticiper les signes cliniques visibles.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou les expérimentateurs. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux dépourvus de système immunitaire seront hébergés dans des conditions permettant d’éviter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du comportement, de l’apparence physique, du poids sera effectuée par les expérimentateurs dès l’implantation des cellules leucémiques humaines et jusqu’à la fin de la procédure (ou au plus tard 12 mois après l’implantation en cas d’échec de greffe). Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de moelle osseuse et bimensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter et quantifier la prolifération des cellules leucémiques humaines implantées. Le suivi des animaux se fera en à l’aide d’une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs avec un système de scores. Toute souris présentant des signes de souffrance ou atteignant les points limites pendant la durée de l’expérience sera euthanasiée sans attendre et analysée. De plus, le recours à de l’imagerie in vivo non invasive permettra de suivre en direct l’évolution de la maladie et d’anticiper les signes cliniques visibles.

Choix des espèces

L’utilisation de souris adultes dépourvues de système immunitaire est largement décrite dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour la greffe de cellules leucémiques humaines. Ce modèle permet également d’étudier la biologie des leucémies humaines, et de servir de modèles précliniques permettant de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un environnement tumoral complexe se rapprochant de ce qui se passe chez les patients. De plus, nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et de souffrance des souris et donc de leur prise en charge Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 12 semaines, afin de garantir une prise de greffe maximale des cellules leucémiques humaines.

16 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées pour prélever leurs organes, à l'exception de celles dont la tumeur régresse complètement et qui pourront être inoculées une seconde fois. Elles reçoivent des cellules cancéreuses humaines par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique ou intra-mammaire, puis des injections de composés jusqu'à quotidiennes, sur des protocoles pouvant durer cent jours. Le porteur indique que la greffe de cellules immunitaires humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, et qu'un surdosage peut provoquer un orage cytokinique avec atteintes du pelage, plaies et perte de poids. Il qualifie d'"indispensables" les données produites pour faire progresser des candidats médicaments vers les dossiers réglementaires, à raison d'une cinquantaine d'études par an.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en place les études et modèles permettant d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés modulant le développement et la fonction du système immunitaire dans différents modèles de pathologies sur le rongeur. Les informations générées seront indispensables pour permettre la progression du médicament au travers des futures étapes de développement et inclus l’identification des doses minimales produisant une efficacité, détermination de la pharmacocinétique et pharmacodynamie essentielle pour mettre en place les schémas de traitement appropriés et enfin les études d’efficacités. Ces données pré-cliniques sont un préalable aux essais cliniques et à l’enregistrement de molécules candidates et figureront dans les différents dossiers réglementaires. Le projet se décompose en plusieurs programmes de recherche chacun ciblant un aspect de la fonction du système immunitaire associé à une pathologie donnée pour atteindre un but clinique. 3 grands axes sont utilisés dans ce projet : 1- Evaluation de la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’une molécule modulant la réponse immunitaire (environ 15 études par an) 2- Evaluation de l’efficacité d’une molécule sur la réponse immunitaire humaine chez le rongeur pour le contrôle de croissance de tumeur humaine (xénogreffe) (environ 20 études par an) 3- Vaccination visant à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice anti-tumorale (environ 15 études par an).

Bénéfices attendus

En recherche préclinique, les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie (PK/PD) permettent de démontrer le lien direct entre la présence de la molécule d’intérêt dans le tissu et son activité in situ. Le but est de s’assurer qu’après traitement, les expositions de la molécule d’intérêt dans un ou plusieurs compartiments (sang, organes) sont associées à une activité du composé sur sa cible. De plus, certains de ces paramètres de pharmacodynamie mesurés chez l’animal peuvent devenir des biomarqueurs d’activité en clinique chez les patients. Ces modèles sont reconnus comme étant très prédictifs de l’efficacité de composés et permettent de rapidement écarter et abandonner des composés avant de mettre en œuvre un nombre important d’études d’efficacité nécessitant beaucoup d’animaux. Les immunothérapies sont de plus en plus nombreuses en cliniques et leur qualité est de plus en plus raffinées. Les composés développés aujourd’hui visent de plus en plus à être spécifique de protéines humaines et n’interagissant pas avec les protéines de souris. De plus, certains mécanismes immunologiques ne sont pas reproductibles de la souris à l’homme et inversement. Le développement de souris présentant un système immunitaire partiellement humain permet une évaluation pré-clinique plus précise des composés et une meilleure anticipation de possible effets secondaires dû à une sur activation du système immunitaire (orage cytokinique). L’évaluation de l’immunogénicité sur animaux est l’une des méthodes décrites pour démontrer l’efficacité préclinique des candidats vaccins avant d’envisager des études cliniques chez l’homme. Ces tests d’immunogénicité sont également très utiles pour mettre en place des tests libératoires des lots de vaccins pour leur utilisation en clinique humaine (libération des lots et suivi de la stabilité au cours du temps). Les essais d’immunogénicité permettent d’évaluer le bénéfice de différentes préparations vaccinales, d’identifier les composés nécessaires à la formulation vaccinale, d’évaluer les nouvelles voies d’administration, de nouvelles molécules adjuvantes ou les nouvelles formes pharmaceutiques qui permettent d’améliorer la performance du vaccin. Enfin, les mécanismes d’action et la caractérisation de la réponse immunitaire doivent être évalués pour comprendre la réponse immunitaire, voire, l’améliorer.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Tatouage (1 fois, 1min) sur animal vigile • Rasage (1 fois, 2min) sur animal vigile • Injection des cellules cancéreuses (1 fois) intra-péritonéale (20s) sur animal vigile ou par voie sous-cutanée (30s), intra-dermique(30s), intra-mammaire (30s), intra-veineuse au niveau de la veine caudale (30s), sur animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux • Injection de composés, unique ou répétées plusieurs fois (de quotidienne à 1 fois par semaine) sur animaux vigile par voie intra-péritonéale (10s), intra-musculaire (30s) ou Per Os (30s) ou intra-veineuse (30s) à la veine caudale. L’inoculation peut être faite sur animaux anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux par voie intra-veineuse à la veine caudale (30s), sous-cutanée (30s) ou intra-dermique (30s). • Pesée (3 fois par semaines) sur animal vigile (1min) • Mesure de la croissance tumorale sur animal vigile (3 fois par semaine) (2min) • Prise de sang (unique à hebdomadaire) à la veine sub-mendibulaire ou la veine caudale sur animaux anesthésie par anesthésie gazeuse (30s). Au total, la procédure 1 dure maximum 72h ;la procédure 2 dure maximum 100 jours. la procédure 3 :8 semaines à 6 mois selon les protocoles.

Impact sur les animaux

L’injection de composés modulant le système immunitaire peut conduire, si utilisé à des doses trop fortes à des effets secondaires indésirables tels qu’une activation excessive des cellules immunitaires conduisant à la libération de cytokines pro-inflammatoires trop forte. Ceci se traduira par des signes cliniques chez la souris tels que atteintes du pelage, perte de poids, apparition de plaies sur la peau. Afin de palier à ces effets, les animaux seront observés tous les jours et monitorés tous les 2 à 3 jours. Tout signe indiquant une atteinte de points limites anticipés préalablement définis conduira au sacrifice de l’animal. L’injection de cellules immunitaires humaines dans une souris peut conduire au développement d’une maladie du greffon contre l’hôte qui peut apparaitre dans les 70 à 100 jours après la greffe. Celle-ci se manifeste par des signes cliniques tels que la perte de poids, une apathie, une inattention au pelage. Les animaux seront observés tous les jours et monitorés tous les 2 à 3 jours. Tout signe indiquant une atteinte de points limites anticipés préalablement définis conduira au sacrifice de l’animal.. Une réponse immunitaire forte contre une protéine antigénique nécessite que l’antigène soit injecté de façon concomitante avec des adjuvants ; l'adjuvant est par définition une substance qui permet d'augmenter l'immunogénicité d'une protéine qui lui est associée ; les adjuvants choisis sont approuvés en clinique humaine pour leurs effets mineurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Seuls les animaux qui présenteraient une régression complète de la tumeur pourraient être inoculés de nouveau avec la même lignée de cellules tumorale ou une lignée différente dans le cadre d’une utilisation continue pour évaluer la réponse immunitaire mémoire.

Remplacement

Des essais in vitro sur cellules animales et humaines permettent de réaliser une pré-sélection de composés candidats mais ne sont à ce jour pas suffisants pour comprendre leurs mécanismes d’actions. Les tests in vivo sont donc nécessaires et vont également permettre d’évaluer l’efficacité des composés sur l’élimination des cellules tumorales et cellules infectés. De plus, nombres de pathologies comme les cancers impliquent de nombreux tissus et organes dont les voies biologiques sous-jacentes sont encore très peu connues et ne peuvent donc être mimées de façon fiable dans les modèles in vitro. Seul un modèle chez l’animal peut reproduire les interactions entre les différents systèmes biologiques complexes lors de l’évaluation de l’efficacité de composés à tester.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera basé sur des études similaires rapportées par la littérature. Des analyses de puissance statistique seront utilisées sur les données préliminaires pour déterminer si le nombre d’animaux par groupe puisse encore être réduit

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires. Ils seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse de courte durée. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de l’étude. Des consignes seront mises en place pour définir les procédures à suivre en cas de complications. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous autorité du vétérinaire ou euthanasiés selon les critères définis dans la consigne.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. Des données sur les modèles de tumeurs chez la souris (présentant un système immunitaire murin ou humain) existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car son système immunitaire est bien caractérisé. Les études peuvent être réalisées sur des souris immunocompétente avec système immunitaire murin, ou système immunitaire humains et les résultats peuvent être comparés à de souris immunodéficientes permettant de bien comprendre le rôle du système immunitaire. La souris est aussi un modèle pour lequel il existe de nombreux outils adaptés (cytokine, marqueurs cellulaires…). Les souris sont utilisées au stade adulte pour pour avoir un systémè immunitaire développé.

15 750 épinoches à trois épines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 14 100 tuées, les 1 650 témoins et leur descendance retournant en salle d'élevage. Les géniteurs sont anesthésiés puis tués pour récupérer spermatozoïdes et oeufs, et les deux générations suivantes sont exposées à des perturbateurs endocriniens de l'oeuf au stade adulte avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur attend une perte de qualité des gamètes, des anomalies du développement, une féminisation du sex-ratio, une baisse des défenses immunitaires, une obésité et des effets négatifs sur la croissance et la survie, tout en indiquant que la nature exacte et la durée de ces effets restent inconnues. Les polluants retenus et les doses ne sont pas encore choisis et le seront "en fonction des données de la littérature et de l'avancement du projet".

Objectifs

L'objectif du projet est de mieux appréhender l'impact d'une exposition aux perturbateurs endocriniens tout au long du cycle de vie de l'épinoche. L'intérêt du projet est de faire le lien entre les capacités de défense, le métabolisme énergétique et la reproduction et la capacité de maintien de l'organisme. Au cours du projet les perturbateurs endocriniens retenus ainsi que les doses environnementales proposées seront à définir en fonction des données de la littérature et de l'avancement du projet.

Bénéfices attendus

L'intérêt du projet est de faire le lien entre les capacités de défense, le métabolisme énergétique et la reproduction et la capacité de maintien de l'organisme et de la population dans son ensemble suite à une exposition à des perturbateurs endocriniens. Les impacts sur la croissance et la survie sont également recherchés.

Procédures

Pour les géniteurs, lors des fécondations in vitro, les mâles sont anesthésiés (moins de 10 min) et mis à mort (quelques secondes) avant de récupérer les spermatozoïdes. Les femelles sont anesthésiées (moins de 10 min) puis leurs oeufs sont prélevés (moins de 2 min) avant d’être mises à mort (quelques secondes). Concernant la première et la seconde génération, les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation (moins de 1 min) et différents organes sont prélevés. Les poissons adultes exposés sont anesthésiés (moins de 10 min) et mis à mort avant de prélever les organes (quelques secondes).

Impact sur les animaux

Est envisagé un effet sur : 1. la reproduction : perte de la qualité des gamètes, anomalies du développement, modification de la distribution mâles /femelles en faveur des femelles ; 2. diminution de la défense immunitaire ; 3. augmentation des réserves de gras (obésité) ; 4. effets négatifs sur la croissance et la survie. La durée et la nature exacte des effets n'est pas encore connue actuellement, les nuisances et effets éventuels seront suivis à l'aide d'une grille d'évaluation des points limites.

Devenir

Les individus de la première génération exposés aux perturbateurs endocriniens et leur descendance seront tous sacrifiés en fin d'expérimentation (=13350), les individus témoins de la première génération et leur descendance (=1650) seront remis en salle d'élevage. Les poissons issus de l'exposition au stade adulte seront tous sacrifiés en fin d'expérimentation pour les analyses multi-biomarqueurs (=750).

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation animale pour valider l'importance des perturbateurs endocriniens sur les stades de vie précoces (stade oeuf) et sur la physiologie générale des poissons et leurs capacités de reproduction tout au long de leur cycle de vie.

Réduction

Les premières fécondations in vitro, sont réalisées à partir d'animaux d'élevage. Pour chaque procédure, suite aux expérimentations, des tests statistiques seront effectués. Les 2250 oeufs produits seront exposés (150 organismes par aquarium en triplicats = 450 organismes par condition à raison de 4 doses et 1 témoin) et maintenus jusqu'au stade adulte (1 à 1,5 ans). Les 150 organismes par aquarium et par triplicat sont nécessaires, d'après la littérature pour pouvoir différencier les effets entre les différentes conditions. Aux différents temps de prélèvement, 10 individus par condition de l'oeuf aux juvéniles et 10 individu par condition et par sexe chez les adultes sont suffisants pour atteindre une bonne puissance statistique pour les analyses multibiomarqueurs. Ces organismes seront prélevés sur les 150 organismes par aquarium. Lors de la création de la seconde génération, 750 oeufs seront maintenu jusqu'à 1 mois post fécondation des oeufs. Ce chiffre se base sur les données de la littérature afin de pouvoir différencier les effets entre les différentes conditions. Concernant le suivi des organismes pour les marqueurs phénotypiques (croissance, mortalité) de la première (100 individus par condition) et seconde génération (50 individus par condition) et les traits d'histoire de vie chez les adultes (15 individus par condition et par sexe), nous avons évalué l'effectif nécessaire en se basant sur des données de la littérature. Pour l'exposition des adultes (indépendante de la première procédure), nous utiliserons : 150 individus = 15 mâles et 15 femelles par condition à raison de 4 doses et 1 témoin : suffisants pour atteindre une bonne puissance statistique dans l'analyse des traits d'histoire de vie.

Raffinement

Afin de veiller au bien-être animal, les géniteurs, les juvéniles et les individus adultes bénéficieront d’enrichissements (tubes et plantes artificielles). Les poissons seront maintenus dans un environnement optimale dont les paramètres seront vérifiés a minima une fois par semaine. Les animaux seront nourris tous les jours avec une alimentation diversifiée et appropriée à leur stade de développement (3% du poids/jour). Au niveau expérimental, lors du sacrifice des animaux, les poissons sont placés dans un bain anesthésiant pour réduire le stress puis rapidement mis à mort. Tout au long du projet, les animaux adultes sont observés. Afin de limiter la souffrance animale, la mise à mort par balnéation est effectuée par surdose d’anesthésique. Cette étude servira également de base pour mieux définir des points limites applicables aux autres stades de développement (notamment juvéniles) et pourront être proposés à notre Structure chargée du Bien Etre Animal.

Choix des espèces

L’épinoche à trois-épines est une espèce de poisson largement utilisée pour les études écotoxicologiques et présente des intérêts pour l’étude des contaminations environnementales. D'autre part, l'épinoche est une espèce qui s'adapte à tout type de milieu (eau douce, salée et saumâtre). Dans une optique d'étudier de façon spécifique la gamétogenèse, des expositions au stade embryonnaire semblent pertinentes puisque cette fonction physiologique est mise en place dès le stade embryon. De même pour mieux percevoir les relations avec les traits d'histoire de vie, se baser sur les individus adultes et les stades embryonnaires est pertinente. L'exposition de la première génération sera effectuée uniquement du stade oeuf à 40 jours post éclosion afin d'encadrer les stades précoces de développement et la mise en pace des réponses physiologiques précoces. L'exposition suivante sera effectuée sur les individus adultes pour mieux comprendre le lien entre les modifications physiologiques et les réponses sur les traits d'histoire de vie. Les animaux adultes et juvéniles seront tous maintenus en condition d'élevage classique après l'exposition.