Recherche appliquée
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Traitement de l’allergie à l’insuline par administration intranasale d’insuline modifiée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Les souris utilisées développent spontanément un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'à la mort en trois semaines environ. 802 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections dans la peau du dos sous anesthésie en trois semaines, jusqu'à six administrations intranasales d'insuline modifiée, une injection rétro-orbitaire et un prélèvement de sang, pour mettre au point une allergie cutanée à l'insuline que le porteur décrit comme jamais décrite dans la littérature. L'apparition du diabète, d'érythèmes sévères ou d'un état général affaibli déclenche la mise à mort anticipée.
Objectifs
L'allergie à l'insuline est une complication rare mais qui pose de sérieux problèmes pour la prise en charge des patients diabétiques. Les manifestations allergiques incluent urticaire, éruption cutanée, hypotension, essouflement. Dans des cas extrêmes, ces réactions intenses et rapides sont susceptibles de provoquer la mort. Elles sont induites par des anticorps IgE dirigés contre l'insuline injectée. Les traitements actuels consistent en l’utilisation d’agents anti-histaminiques, de corticoïdes, mais également la sélection de préparations d’insuline moins allergènes et des pompes à insuline intrapéritonéale plus invasives. Cependant, aucun traitement de référence n’existe ciblant les causes immunologiques de cette maladie. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une nouvelle stratégie visant à diminuer les réponses allergiques, et induire ainsi une désensibilisation vis-à-vis de l’insuline. Nous utiliserons de l’insuline modifiée qui sera administrée par voie intranasale, ayant comme objectif d’être le moins invasif possible pour à terme facifiter le transfert à la clinique de cette stratégie. Ce choix a été motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses. Dans ce projet, nous travaillerons dans un modèle de souris qui développe un diabète. Tout d'abord, nous mettrons au point un modèle de réaction allergique cutanée induite par sensibilisation d'insuline (mimant ainsi ce qui se passe chez les patients diabétiques), modèle qui n'a jamais été décrit dans la littérature. Nous testerons ensuite notre approche thérapeutique avec l'insuline modifiée administrée par voie intranasale et nous analyserons les mécanismes immuntaires induits.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de notre insuline administrée par voie intranasale dans le contexte de l’allergie à l’insuline. Ainsi, en cas de succès, ces recherches pourraient aboutir rapidement à des essais cliniques chez les patients diabétiques présentant une allergie à l’insuline, pour laquelle il n’existe aucun traitement de référence à l’heure actuelle. Des résultats positifs sur les manifestations allergiques pourraient à plus long terme permettre d’envisager une application de la thérapie intranasale par insuline dans d’autres indications, en particulier le diabète de type 1 qui touche principalement les enfants et adolescents. En effet, des efforts sont développés pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir cette maladie. Les thérapies envisagées doivent montrer une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour être attractives pour une application clinique. Notre insuline intranasale remplit ces exigences.
Procédures
Injection intradermiques (au niveau de la peau du dos) sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois, 2 fois par semaines pendant 3 semaines. Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). Injection intraveineuse (rétro-orbitaire) sous anesthésie généralependant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois.
Impact sur les animaux
Les souris femelles que nous utilisons développent un diabète (hyperglycémie). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. L'allergie cutanée à l'insuline, développée par le protocole mis en place, peut se manifester par des démangeaisons locales modérées et de courte durée (quelques minutes) ou des irritations légères de la peau. Enfin, les souris peuvent subir un léger stress lié aux injections intradermiques ou à l’anesthésie.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Remplacement
Des tests in vitro appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour le traitement de l’allergie à l’insuline et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé. Les espérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les différents stades de la réponse allergique.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris allergique, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions, et peau pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé nous ferons un premier élevage très restreint des souris afin de définir quelle est la lignée la plus adaptée pour l'induction de l'allergie à l'insuline avant de lancer un plus grand élevage pour les expériences d'immunothérapie avec l'insuline intranasale.
Raffinement
La réponse allergique cutanée sera induite par injections intradermiques d’insuline sur la peau rasée des souris. Afin de réduire au minimum la douleur et le stress des animaux, cet acte se fera sous anesthésie générale. Les souris sont sujettes à une surveillance accrue pendant les 20 minutes suivant l’anesthésie avec un réveil complet et une récupération de la mobilité. Aussi l’endroit de l’injection sera surveillé plusieurs fois par semaine afin de s’assurer qu’il n’y a pas d’irritation majeure de la peau suite à l’injection. De plus, travaillant sur un modèle de souris susceptible au diabète, des tests de glucosurie (concentration du glucose dans les urines) seront réalisés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de la maladie. Enfin, de manière générale, la consommation d’eau, de nourriture, la motricité et le comportement de l’animal seront surveillés de manière hebdomadaire par les soigneurs et les expérimentateurs. La survenue du diabète (hyperglycémie), d’érythèmes sévères ou l’observation d’un état général affaibli entraineront la mise à mort anticipée de l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix dans les études de l’allergie cutanée étant donné la bibliographie existente sur le sujet et la caractérisation des réponses allergiques chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Nos expériences seront réalisées chez des souris adultes (entre 8 et 15 semaines d’âge) avec un système immunitaire mature..
Etudes de gènes impliqués dans l’hétérotopie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle de gènes responsables chez l'humain d'une malformation cérébrale appelée hétérotopie, 4 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 171 d'entre elles et modéré pour 1 981. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes sous anesthésie pour une électroporation in utero, des juvéniles et des adultes subissent une chirurgie de dix minutes sans jamais se réveiller, et des femelles gestantes éveillées reçoivent des injections intrapéritonéales. Le porteur présente l'électroporation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport à la création de lignées transgéniques, tout en portant l'effectif du projet à 4 152 individus. Aucune de ces souris ne peut entrer dans un autre protocole après les injections reçues, et toutes sont tuées pour les analyses histologiques.
Objectifs
Le développement du système nerveux comprend des phases de prolifération et de migration cellulaires et des phases de différenciation au cours desquelles les neurones établissent des connexions entre eux. Il est important d'identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent ces processus pour améliorer notre compréhension du développement normal et physiopathologique du cerveau. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les rôles de gènes dont les mutations sont responsables chez l’homme de malformation d’une région du cerveau appelée « hétérotopie ». Notre stratégie repose sur l’étude de souris génétiquement modifiées. Nous avons d’abord étudié une lignée porteuse d’une mutation spontanée responsable d’hétérotopie comme celle observée chez l’homme. Nous avons plus récemment créé d'autres lignées permettant de contrôler l’inactivation du gène spécifiquement dans le temps et l’espace. Ainsi, nous pouvons générer des souris dont la mutation n’est exprimée que pendant la phase de prolifération, alors que chez d’autres souris, la mutation ne sera exprimée que pendant la phase de différenciation des neurones excitateurs. Ces inactivations spécifiques vont nous permettre de décortiquer les mécanismes responsables de l’hétérotopie. En analysant les capacités de prolifération et de différenciation de neurones par des études d'injection de produits et d’immunohistochimie, nous identifierons le défaut primaire lié à une perturbation de ces gènes. L’utilisation de protéines fluorescentes spécifiques de certaines structures subcellulaires nous permettra de préciser et de localiser les anomalies par des techniques dynamiques de videomicroscopie. Nous testerons l’action d’agents pharmacologiques pour pallier les défauts de prolifération, de différentiation et de migration observés aux stades embryonnaires. Nous ferons ensuite des essais de thérapie génique par une approche de chirurgie par électroporation in utero visant à traiter les souris mutantes et donc à mieux comprendre les fonctions des gènes électroporés pendant le développement cortical.
Bénéfices attendus
Les malformations corticales sont des maladies rares (incidence 1: 100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Femelles gestantes vigiles : une injection d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale (1 minute). Juvéniles et adultes : chirurgie sous anesthésie et analgésie, sans réveil (durée : 10 minutes). Femelles gestantes: chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur) pré et post opératoire.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale implique une douleur légère au point de piqûre ainsi qu’une contention et donc un stress momentané. Un risque mineur de péritonite est possible. Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Le niveau de douleur sera estimé par rapport à une échelle de grimace et l’observation des difficultés de mouvements. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.
Remplacement
Une partie de notre projet est réalisé in vitro (biochimie et biologie cellulaire). Nous utilisons également la culture cellulaire : transfections de lignées cellulaires, afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Nous comparerons également des souris de type sauvage et mutantes issues de la même portée, avec une répartition mendélienne. De même, tous les animaux générés (femelles et mâles) sont étudiés. Nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les lignées de souris mutantes représentent des modèles de déficits intellectuels, pour lesquels il est important de continuer la caractérisation afin d’éclaircir la physiopathologie. Pour cela, nous analyserons l’anatomie et la morphologie du système nerveux centrale de ces souris, par des méthodes d’histologie, d’immunohistochimie et de microscopie. L’objectif est d’identifier et d’étudier les anomalies associées aux inactivations de gènes d’intérêt. Des travaux précédents nous ont permis de valider l’analyse des régions cérébrales considérées avec une excellente reproductibilité et donc de réduire le nombre d’animaux requis. L’inactivation de gènes ou l'expression de protéines (par exemple, protéines fluorescentes rapportrices) de manière locale et aigüe chez la souris, in utero ou dans le cerveau postnatal, a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaire par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris transgéniques. Cette approche est donc la méthode de choix quand nous testons la fonction de nouveaux gènes de pathologies humaines. Grâce à cette méthode nous éclaircirons les voies biochimiques et les mécanismes subcellulaires essentielles pour le développement cortical. L’étude des mécanismes physiopathologiques liés aux déficits des différents gènes d'intérêt, et réalisée par les approches ci-dessus, est nécessaire à la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques. Des approches par chirurgie seront aussi réalisées afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à l'étude. Le projet impliquera l'utilisation de 4152 animaux.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les souris sont stabulées en portoir ventilés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température, de l’hygrométrie et des pressions, un cycle nycthéméral de 12 :12 et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, un autoclave et un sas chimique comme barrière, comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d'une maison. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois/jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. Les souris sont placées dans les cages avec la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, avec une anesthésie générale par ventilation et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré et post-opératoire, ainsi qu’une analgésie locale sur le site. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (surveillance et traitement des plaies). En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture...), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 12,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles 1 et 10 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype.
Evaluation de candidats vaccins contre les maladies infectieuses émergentes induites par les virus Chikungunya et Zika.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Environ trente anesthésies et trente prélèvements sanguins par animal, quatre ponctions de moelle osseuse, quinze prélèvements urinaires dont trois par sonde vésicale : 168 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est infectée par le virus Zika ou par le chikungunya après immunisation avec des candidats vaccins, puis hébergée seule pendant quatre à huit semaines pour éviter les contaminations croisées. Aucun n'est tué à l'issue selon le champ de devenir, le porteur indiquant qu'ils seront gardés en vie sur avis vétérinaire et inclus dans d'autres projets, ce qui réduit le nombre d'animaux comptés dans chacun. Le macaque est présenté comme le "seul modèle" possible avant les essais chez l'humain, pour sa proximité phylogénétique et sa réponse vaccinale semblable.
Objectifs
Les agents du Zika et du chikungunya appartiennent à la famille des arbovirus, large famille de virus véhiculés par des insectes qui se nourrissent du sang d’animaux. Ils sont essentiellement transmis par les moustiques du genre Aedes (hémisphère Sud) et Culex (hémisphère Nord). . Restreint il y a encore quelques années à des zones tropicales, le moustique tigre se répand de plus en plus en Europe, étant maintenant implanté dans les pays du nord de la méditerranée (France, Italie, Croatie, Albanie, Grèce). Il pourrait être le point de départ de nouvelles épidémies. Actuellement, la surveillance sur le chikungunya et zika a été renforcée en France métropolitaine. Si la plupart des infections qu’ils provoquent sont sans gravité, ces virus peuvent parfois conduire à des complications sévères voire mortelles : - une microcéphalie chez des bébés nés de mères infectées par le virus Zika et dans de très rare cas des atteintes neurologiques (syndrome de Guillain Barré). - des douleurs articulaires persistantes et sévères en cas d’infection par le chikungunya. Le virus Zika est déjà à l’origine de plusieurs épidémies en Océanie (2006, 2013) et plus récemment sur le continent Sud-Américain en 2015. Le 1er février 2016, l’OMS a déclaré que le virus Zika constitue une urgence de santé publique. Le virus Chikungunya est endémique en Asie du Sud et en Afrique mais s’est étendu en 2005 dans l’océan indien, notamment à l’île de la Réunion suite à une forte épidémie. En 2007, la maladie est arrivée en Europe, avec des cas autochtones dans le sud de la France en 2010. Les facteurs tels que le réchauffement climatique, l’élargissement du biotype des vecteurs, l’émergence de cas autochtone de certains arbovirus en Europe, conduisent dernièrement à une menace accrue d’épidémie qui nécessite de chercher et tester des candidats vaccins, idéalement pouvant protéger contre plusieurs type d’arbovirus.L’objectif du projet est d’évaluer sur des modèles précliniques l’immunogénicité (le type de réponse immunitaire déclenchée) et l’efficacité de candidats vaccins lors d’infection par les virus Zika et Chikungunya.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats permettront de justifier le passage à des essais cliniques du candidat vaccin sélectionné. A long terme, la preuve de concept d’un vaccin ciblant plusieurs arbovirus permettrait d’envisager des constructions plus complexes, protégeant les populations selon les circulations endémiques des virus en une seule injection. Que ce soit pour les nourrissons et jeunes enfants, pour les populations ayant un accès limité aux soins ou même pour les touristes se vaccinant avant leur voyage, la simplification du régime vaccinal devrait être très bien accepté. De plus, économiquement, les coûts de développement et le prix final d'un vaccin unique seraient fortement réduit.
Procédures
Les différentes interventions dans ce projet sont : - immunisation avec des candidats vaccins (pouvant aller jusqu’à 3 fois selon les résultats de l’étude pilote d’immunogénicité, 5 minutes, tous les groupes) - Infection par le virus Chikungunya (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Infection par le virus Zika (une fois, 5 minutes, groupes exposés) - Anesthésie des animaux (30 fois environ, 30 minutes, tous les groupes) - Prélèvements sanguins (30 fois environ, 5 minutes, tous les groupes) - Prélèvements de moelle osseuse (4 fois, 10 minutes, tous les groupes) - Prélèvements salivaires (15 fois, 2 minutes, tous les groupes) - Prélèvements urinaires (15 fois, 15 minutes, tous les groupes) - Implant puce de température (1 fois, 30 minutes, tous les groupes) - Sonde vésicale (3 fois, entre 2 à 30minutes, groupes exposés) - hebergement individuel (1 fois, 4 semaines pour les infections avec Zika et 8 semaines pour les infections avec Chikunguya, groupes exposés)
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent survenir selon le type d’intervention : Nuisances suite à l’immunisation (peu attendu) : Réaction locale, écoulement de pus, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances suite à l’infection (attendu pour les animaux non vaccinés, peu attendu pour les vaccinés) : Chikungunya : L’infection du macaque se caractérise, comme chez l’homme, par une infection par le virus transitoire détectable entre les jours 1 et 5, accompagnée d’un épisode fébrile (1 ou 2 jours d’après les précédentes études), d’un gonflement transitoire des articulations, principalement les chevilles et les poignets, 4 ou 5 jours entre les jours 6 à 10, d’une éruption cutanée transitoire diffuse et d’intensité variable pendant les 3 premiers jours ainsi que d’infiltrations persistantes de monocytes/macrophages (cellules immunitaires) infectés dans les tissus lymphoïdes et à un moindre niveau dans les muscles et les articulations. Ces nuisances ne sont pas accompagnées d’une modification de comportement et se résolvent en quelques jours. Zika : Nausées, vomissements, fièvre, déshydratation (évaluation du pli cutané lors des prélèvements). Nuisances suite aux prélèvements de sang, de moelle osseuse, urine et anesthésies répétées : Troubles de l’appétit avec plus ou moins des pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Pour le prélèvement urinaire par sonde, les nuisances possibles sont un risque d’abrasion des muqueuses et de contamination avec la sonde. Nuisances suite à l’hébergement individuel : L’hébergement en individuel peut entrainer un stress. Nuisances possibles chez les animaux après la pose de puce de température: Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie sur avis vétérinaire et pourront être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Remplacement
L’étude et la caractérisation de la réponse immunitaire induite lors de l’immunisation avec les vaccins candidats contre les maladies virales Zika et Chikungunya nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions systémiques à l’échelle de l’organisme entier. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux. Les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettant pas de construire des modèles pertinents des interactions hôte-pathogène, de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire à une infection ou une vaccination. L’espèce macaque cynomolgus a été choisie pour sa proximité phylogénétique et physiologique de l’homme permettant ainsi une transposition des résultats. Les modèles d’infection par le virus Zika et par le virus Chikungunya ayant déjà été développés chez cette espèce, il est plus opportun de poursuivre chez celle-ci.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Des études préliminaires sont prévues avec des groupes réduits au minimum à 2 individus pour permettre de sélectionner les meilleures conditions pour les études d’efficacités. Pour ces dernières, le nombre d’animaux a été réduit à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique adaptés aux petits échantillons.Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriquesstatistiques adaptés aux petits échantillons, comprenant 6 animaux par groupes expérimentaux.
Raffinement
Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie. Si possible, les prélèvements seront groupés lors d’une seule anesthésie. Si trouble alimentaire/anorexie suite aux anesthésies répétées, une diversification/complémentation alimentaire sera instaurée (monkey dough, fruits secs, fruits frais additionnels, fortimel etc.). Puce de température: Une réaction locale au site d’incision peut être observée comme un gonflement, suintement de la plaie (rare). Les réactions sont signalées au vétérinaire (traitement symptomatique). Prélèvements: Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum. Si apparition de réaction locale un traitement symptomatique pourra être instauré. Immunisation Si réaction locale à l’injection du vaccin (écoulement de pus (suppuration), démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection) => signalement au vétérinaire, un traitement symptomatique local pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale si la douleur est marquée). Si la réaction locale est exacerbée (suppuration intense avec nécrose, absence de récupération après mise en œuvre des traitements), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. Hébergement individuel: Les animaux seront hébergés individuellement pendant la phase d’exposition virale pour éviter une contamination croisée et/ou une surinfection. Un enrichissement complémentaire sera apporté lors de cet hébergement individuel. Infection: Suite à une infection avec le virus Zika, les animaux peuvent avoir des nausées, vomissements, fièvre et déshydratation. Un signalement au vétérinaire sera fait en cas d’apparition de ces symptômes. Si les symptômes sont plus sévères (type paralysie) la sortie d’étude de l’animal sera envisagée. Les données issues d’un projet précédent n’ont pas montré de dégradation de l’état de santé de l’animal ni de mortalité. Suite à une infection par le virus chikungunya, une surveillance accrue sera mise en place sur les 10 premiers jours avec suivi de la température des animaux, mesure des articulations proches des sites d’injection et d’éventuelles rougeurs cutanées. Ces nuisances n’entrainent pas de changement de comportement et disparaissent au bout de quelques jours d’après les données d’un projet précédent.
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus est le modèle animal retenu pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de candidats vaccins avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme, la réponse immunitaire et vaccinale étant similaire à celle de l’homme. De plus, il a déjà été utilisé dans des modèles specifiques de ces infections dans la littérature et au laboratoire pour étudier l’efficacité de vaccin avec des phases cliniques. Enfin, notre laboratoire maîtrise les techniques d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale chez le macaque ce qui permet une exploration complète de ces réponses. Le suivi immunologique et la réponse à l’infection sont des paramètres majeurs dans ce projet, nous avons donc besoin d’animaux adultes avec un système immunitaire pleinement mature, au minimum 3 ans.
Evaluation de la privation de sommeil sur l’activité cérébrale par mesures électrophysiologiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 552
Les souris et les rats sont tués en fin d'étude parce qu'ils s'habitueraient à l'expérience, leur niveau de stress baissant avec le temps et faussant les mesures. 552 souris et 552 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie d'environ deux heures pour implanter des électrodes cérébrales, puis jusqu'à quatre privations de sommeil de douze heures sur un tapis roulant ou sur une plateforme entourée d'eau, certains étant hébergés seuls pendant tout ou partie de l'étude. Le porteur prévoit d'évaluer s'il peut utiliser les mêmes animaux sur trois à quatre semaines, ce qui réduirait les effectifs des études suivantes.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer l'efficacité de nouvelles substances anxiolytiques sur les troubles du sommeil et de manière plus générale sur le cycle circadien. Des personnes souffrant d'anxiété peuvent développer des troubles physiques associés à leur pathologie tels que des troubles digestifs, des douleurs et tensions musculaires ou encore des insomnies, qui sont la cause de somnolence dans la journée ou d'un état de fatigue global. Un état d'anxiété et/ou des crises d'angoisses retardent l'endormissement d'un sujet mais aussi modifie l'architecture globale du sommeil. Les phases de sommeil lent et de sommeil paradoxal peuvent être allongées pendant les périodes de récupération d'un sujet alors qu'elles sont inexistantes lors d'insomnies. La mesure de l'activité cérébrale et motrice permet de déterminer l'état de vigilance de l'animal et d'évaluer l'effet pharmacologique de substances.
Bénéfices attendus
Il existe différents traitements pour lutter contre les troubles de l'anxiété en plus de la prise en charge des patients par psychothérapie. Néanmoins, pour certains patients, les troubles de l'anxiété ne diminuent que faiblement avec les traitements médicamenteux ou réapparaissent dans le temps. La recherche de nouveaux traitements reste donc indispensable pour améliorer les conditions de vie des patients, en limitant l'apparition de symptômes secondaires indésirables. La mise en place de modèles précliniques translationnels reste également une priorité dans ce domaine pour pouvoir tester de nouvelles thérapeutiques. Les tests décrits dans ce projet sont utilisés dans la littérature pour modifier l'architecture du sommeil et évaluer de nouveaux candidats médicaments.
Procédures
Les animaux seront opérés sur une durée d'environ 2 heures pour implanter des électrodes cérébrales (chez la souris et le rat). Le cas échéant, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Après une période de récupération, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées par télémétrie sur plusieurs heures (12 à 24 heures) et sur plusieurs jours consécutifs (minimum de 3 jours). Les animaux seront placés sur un tapis roulant à faible vitesse ou sur une petite plate-forme entourée d'eau (entre 2 et 5 cm d'eau en fonction de la taille du rongeur) pendant 12 heures. Les mesures électroencéphalographiques et la privation de sommeil seront répétées un maximum de 4 fois par animal. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés (maximum de 3 fois sur une durée de quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. A la suite des chirurgies, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte. Les animaux sont parfois hébergés seuls pendant toute ou partie de l'étude ce qui peut causer un stress bien qu'ils conservent un contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères. La privation transitoire de sommeil peut conduire à un stress modéré, en raison de l'environnement dans lequel est placé l'animal. Un état de fatigue peut également être observé lorsque les animaux sont obligés de bouger sur le tapis roulant.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin des expériences car ils auront subi 2 à 3 procédures de privation de sommeil, considérées comme des conditions stressantes. Il ne sera pas possible de les utiliser à nouveau car ils seront déjà familiarisés avec cet environnement et leur niveau de stress va diminuer dans le temps, impactant les données.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro à notre connaissance. Néanmoins, les molécules testées sont préalablement sélectionnées dans des modèles in vitro permettant de déterminer leurs potentiels effets sur une cible.
Réduction
Le nombre d'animaux a été ajusté en fonction des données de la littérature et a été déterminé selon une approche statistique. Il sera également évalué, lors de la première procédure, l'impact de la réutilisation des animaux sur les résultats électroencéphalographiques afin de déterminer si les animaux peuvent être réutilisés sur 3 à 4 semaines et ainsi diminuer le nombre d'animaux par étude.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour les phases chirurgicales, une anesthésie et une analgésie seront réalisées. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire et une couverture chauffante est placée sous l'animal anesthésié pour maintenir sa température corporelle pendant la chirurgie.Les animaux isolés (minimum de 7 jours pour la période de récupération post-chirurgie) sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger et en présence de coton ou de frisure. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. A la fin de la période de récupération, les souris sont regroupées par deux. Des points limites stricts ont été définis. Pendant les périodes de privation de sommeil (animaux placés sur un tapis roulant ou sur une plate-forme, placée dans de l'eau), les animaux sont surveillés par un technicien, permettant l'intervention de ce dernier immédiatement si un animal montre des signes de fatigue en se retrouvant dans une position inconfortable. Les rongeurs seront également séchés avant d'être remis sur la plate-forme pour éviter tout risque d'hypothermie.
Choix des espèces
Les études sur le cycle circadien sont effectuées chez le rongeur (rat et souris) car ces modèles, basés sur la mesure de l'activité cérébrale, sont translationnels. Les substances mises sur le marché pour traiter les troubles psychiatriques ou du sommeil ont été découverts en utilisant des modèles chez le rongeur. Dans ce projet, le rat sera utilisé de préférence car le laboratoire a plus d'expérience avec cette espèce pour évaluer le rythme circadien mais la souris pourra être utilisé au besoin. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 4 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique
Evaluation de l’efficacité d’hydrogels enrichis ou non en principes actifs ou de principes actifs seuls dans un modèle d’arthrose induit par chirurgie chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Ligament croisé antérieur sectionné et ménisque partiellement retiré au cours d'une opération de trente à quarante-cinq minutes, pour installer une arthrose du genou : 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Six semaines plus tard commencent les injections dans l'articulation opérée, jusqu'à trois par genou, complétées par des prélèvements sanguins à la jugulaire sur animal éveillé une fois par semaine. Le porteur attend des cris, de l'agitation, un oedème articulaire et une boiterie. Les hydrogels testés ont déjà été évalués in vitro, mais le porteur affirme que le passage par les rats reste "indispensable" pour observer les interactions avec l'ensemble des organes.
Objectifs
Alors que les affections ostéoarticulaires chroniques touchent tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans, il n’existe encore aucun traitement permettant de guérir l’ensemble des signes cliniques associés aux rhumatismes, comme la dégradation du cartilage dont l’évolution conduit assurément à la pose de prothèse articulaire. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques (gel associé à des principes actifs) dans un modèle d’arthrose chez le rat, modèle d’arthrose très largement décrit dans la littérature et obtenu par chirurgie déstabilisatrice de l’articulation du genou. L’arthrose est causée par une altération des articulations suite à une usure progressive du cartilage associée à un remodelage des os situés à proximité, la formation d’excroissances osseuses, un affaiblissement des ligaments et des muscles et une inflammation articulaire. Si les traitements médicamenteux actuels soulagent en partie les douleurs intenses et l’inflammation de ces maladies aucun de ces traitements n’est capable de freiner la dégradation du cartilage ou guérir la maladie. Aujourd’hui, seuls les traitements chirurgicaux très invasifs, comme la pose de prothèse permettent de retrouver la mobilité perdue due à l’arthrose. Ainsi, la découverte et le développement de nouveaux traitements agissant de façon globale sur l’inflammation, les atteintes osseuses et cartilagineuses ainsi que la douleur, caractéristiques de l’arthrose, est un enjeu majeur de santé publique alors que le vieillissement de la population ne fait qu’augmenter. L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’hydrogels à limiter la dégradation du cartilage et/ou régénérer le cartilage dégradé dans un modèle d’arthrose chez le rat, dont les signes cliniques sont proches de ceux observés chez l’homme, obtenu par section du ligament croisé antérieur et ménisectomie partielle. Différents types d’hydrogels réalisés à base de glucose ou d’acide hyaluronique seront testés. Ces hydrogels sont des traitements de type « viscosupplémentation » et visent à rétablir une viscosité suffisante du liquide synovial afin de limiter les effets des contraintes mécaniques. Afin de potentialiser les effets de ces hydrogels, ils seront associés à différents principes actifs à des sous-produits de culture cellulaires (exosomes), ou à des cellules de classe 1 (cellules souches mésenchymateuses).
Bénéfices attendus
Chaque étude réalisée au sein de cette procédure permettra de générer des informations sur l’efficacité de nouveaux hydrogels testés, tant sur l’inflammation que sur la reconstitution du cartilage ou le ralentissement de l’apparition des lésions dans un modèle d’arthrose induit par chirurgie au niveau du genou. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des données importantes dans le cadre du développement de nouvelles approches pour le traitement des lésions arthrosiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie et avec analgésie afin de réaliser la section du ligament croisé ainsi que l’ablation d’une partie du ménisque. Cette opération dure 30 à 45 min par animal, et la prise en charge analgésique s’étale les jours suivant l’opération. Les traitements seront réalisés par injection intra articulaire, ou intra-musculaire réalisée au plus tôt 6 semaines après la chirurgie sur le membre opéré. Ces injections durent moins de 5 min par animal, et sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Elles pourront être répétées au maximum 3 fois par articulation au cours du protocole (injection au maximum 1 fois par semaine par articulation) ou 5 fois au cours du protocole si administration intra-musculaire (injection au maximum 1 fois par jour). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire pourront également être réalisés. Ces prélèvements auront lieu sur animal vigile, et dureront moins de 5 min par animal. Ils pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.
Impact sur les animaux
La réalisation de la chirurgie peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau de l’articulation opérée. De la même manière, l’apparition progressive des lésions arthrosiques est susceptible d’entrainer gène ou douleur. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris/agitation pendant l’administration du traitement, ou le prélèvement de sang, une inflammation au niveau du site d’injection, un œdème articulaire ou une boiterie. Pour prévenir ces différents cas de figure, les animaux seront suivis avec précaution et des grilles d’évaluation clinique associée aux conduites à tenir en cas d’observation de ces signes ont été prévues.
Devenir
A l’issue de chaque protocole tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les articulations, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer les modifications de différents marqueurs induits par les traitements. Les organes et articulations prélevés seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques, histopathologiques et/ou d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les hydrogels que nous évaluons in vivo, ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir de produits testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies arthrosiques, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes de déstabilisation mécanique de l’articulation à l’origine de l’apparition des lésions arthrosiques. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce procédure.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours d’un protocole. Etant donné la variabilité probable des réponses aux produits, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. L’effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu (par exemple : traitement de référence), et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente). Lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements, nous utiliserons un anesthésique, et des antalgiques dès l’apparition des premiers signes cliniques. Lors des traitements expérimentaux et lors des prises de mesures, nous maintiendrons les animaux dans une situation d’inconfort et de douleur pendant un minimum de temps. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus tôt possible au moment des suivis et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge ou euthanasié.
Choix des espèces
Il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer les lésions ostéoarticulaires. L’animal demeure indispensable à l’évaluation de produits. De plus le modèle d’arthrose par chirurgie chez le rat, utilisé depuis de nombreuses années, est maintenant reconnu pour être un modèle très prédictif pour la recherche médicale humaine et vétérinaire. En effet, le rat est l’espèce mammifère dont les caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires sont proches de celles observées chez l'homme. Le rat, est fréquemment utilisé à des fins de recherche, car les résultats de produits thérapeutiques sont facilement transposables à l'homme, par simple approche/méthode statistique. La taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques analysables. Enfin, le rat est préféré à la souris pour l’étude de lésions cartilagineuses car le cartilage est plus épais et les effets d’une chirurgie chez le rat s’approchent de la pathologie humaine. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté au schéma thérapeutique des traitements étudiés. Bien que les pathologies rhumatiques puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation de ces maladies donne des résultats plus homogènes avec des rats adultes âgés de 8 à 10 semaines au début du protocole.
Production d’immunserum felin et évaluation de différentes souches virales félines afin de mettre au point des vaccins innovants
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Des écouvillons dans les yeux, la bouche, le nez, le rectum ou le vagin, parfois chaque jour, et des prises de sang régulières : 188 chats de moins d'un an vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les études, ils reçoivent sous anesthésie, par le nez, la bouche, l'œil ou le péritoine, le calicivirus félin, le virus de la panleucopénie, l'herpèsvirus félin ou Chlamydia felis, et peuvent souffrir d'abattement, de fièvre, d'ulcères buccaux, de diarrhées, de vomissements ou de douleurs abdominales, au plus fort pendant trois à cinq jours. Le projet vise à produire du sérum de chat, à choisir des souches récentes pour de nouveaux vaccins félins et à vérifier leur efficacité. Au plus 16 chats pourront être adoptés et 40 réutilisés, les 132 autres étant tués pour des prélèvements de sang ou d'organes. Les jeunes chats sont retenus, selon le porteur, parce qu'ils forment "la population la plus sévèrement touchée" par ces virus.
Objectifs
Le projet vise à développer de nouveaux vaccins pour les chats, notamment dirigé contre le calicivirus félin (FCV), le virus de la panleucopénie (FPV), le virus de l'herpes félin (FHV), et Chlamydia felis. Les objectifs principaux sont la sélection de souches de FCV récentes à inclure dans un nouveau vaccin plus efficace, la mise au point de modèles félins d'infection par les différents pathogènes à partir de souches récentes collectées sur le terrain, la vérification de sûreté/innocuité des vaccins mis au point, ainsi que la vérification de leur efficacité.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mettre au point de nouveaux vaccins à destination des chats, afin d'offrir une meilleure protection contre des maladies courantes et potentiellement graves, telles que le coryza, le typhus, la rhinotrachéite virale et la chlamydiose.
Procédures
Les animaux recevront des administrations intranasales, orales, intra-oculaires ou intrapéritonéales, sous anesthésie générale et dans le respect des ligne directrices sur les volumes reçus. Cela représente environ 15 minutes/animal Des prises de sang seront effectuées régulièrement, en respectant les volumes maximaux, non préjudiciables aux animaux (quelques millilitres/semaine). Afin de ne pas stresser les animaux, elles pourront être effectuées sous sédation. (env. 2 minute par prise de sang) Des écouvillons seront également effectués, parfois quotidiennement, au niveau oculaire, buccal, nasal, rectal ou vaginal, pour mesurer la présence des virus ou bactéries. Le matériel utilisé est des très petite taille, de façon à être compatible avec la taille des animaux, et à ne pas générer de douleur (env. 2 minutes par jour)
Impact sur les animaux
Le projet nécessite d'administrer des microorganismes pathogènes aux chats, ils vont donc potentiellement développer les symptomes des maladies: - pour le calicivirus felin, symptomes du coryza: abattement, perte de poids, hyperthermie, jetage nasal et/ou oculaire, éternuements, toux, ulcères buccaux et/ou nasaux, conjonctivite, dyspnée - pour le virus de la panleucopénie, symptomes du typhus: abattement, perte de poids, hyperthermie, perte d'appétit, diarrhées, vomissements, déshydratation, douleurs abdominales Les symptomes pourront durer 1 à 2 semaines sous des formes légères, mais leur expression maximum n'est attendue que sur quelques jours (3-5 jours). - pour le virus de l'herpès ( rhinotrachéite infectieuse) et la chlamydiose: encombrement des voies respiratoires, éternuements, écoulement au niveau des narines, conjonctivite, kératite, et écoulements oculaires. Les animaux seront également soumis à des contraintes liées à des contentions brèves (quelques minutes au plus) et anesthésies pour la réalisation des différents actes techniques. Un conditionnement positif permettra de réduire la contrainte et le stress.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux de sang et/ou d'organes ou pourront être réutilisés si ces prélèvements ne sont pas nécessaires. Quelques animaux pourront être adoptés, à condition d'avoir retrouvé un état de santé compatible, de ne présenter aucun risque de contagion pour l'humain ou d'autres animaux et sous réserve de la validation de l'adoption par les autorités sanitaires.
Remplacement
La production d'immunserum felin contre différentes souches virales de FCV necessite un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel et un système sanguin, qui ne peuvent être reproduits artificiellement. Il s'agit d'anticorps polyclonaux ne pouvant être produits à partir de banques de phages / culture cellulaire. La mise au point de modèles d'infection par différents virus félins, l'évaluation ultérieure de vaccins innovants, ainsi que l'évaluation de sureté et d'immunogénicité de souches bactériennes ou virales necessitent également un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel, un système sanguin et la présence des organes cibles des pathogènes, qui ne peuvent être reproduits artificiellement du fait de la complexité des mécanismes / intéractions.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit au strict minimum nécessaire, et ajusté selon les exigences de la pharmacopée européenne: 2 chats / souche de FCV justifié par la quantité d'antisérums nécessaires pour réaliser l'essai de neutralisation croisée contre un panel de 25-50 isolats de terrain du FCV (tests in vitro). Quatre chats / souche de FPV: la pharmacopée correspondante indique 5 chats par groupe témoin infecté non vacciné pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant qu'il s'agit d'études de mise au point il a été décidé d'utiliser un nombre inférieur jugé suffisant pour l'obtention de données cliniques. Cinq chats / groupe de FHV: la pharmacopée correspondante indique 10 chats par groupe pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant que cela est suffisant pour une étude d’efficacité visant à évaluer la protection contre la rhinotrachéite féline causée par une souche du FHV pré-selectionnée. Pour les autres pathogènes, le nombre sera également réduit au minimum nécessaire à l'obtention de données pertinentes, tout en respectant les exigences réglementaires, soit 3 à 8 chats par groupe expérimental.
Raffinement
Les animaux seront retirés de l'étude s'ils doivent suivre un traitement concomitant qui compromet leur aptitude à participer à l'étude, ou si leur état de santé se détériore au point de compromettre leur bien-être. Afin d'éviter de compromettre le bien-être des animaux pendant l'essai, les chats seront évalués quotidiennement par du personnel qualifié et, si le bien-être des animaux est compromis, des mesures correctives seront appliquées. Des tableaux de signes cliniques seront utilisés afin de déterminer un score journalier d'état clinique. Dans le cas où l'animal présenterait de la douleur, de la souffrance ou de la détresse, selon la ponctuation obtenue dans l'évaluation des signes cliniques, un vétérinaire examinera l'animal afin de déterminer l'origine de la douleur, de la souffrance ou de la détresse et des actions correctives seront appliquées (traitement si possible, ou sortie d'étude) Les animaux seront hébergés en groupe d'individus compatibles, dans de grandes salles d'hébergement, avec un enrichissement adapté à l'espèce et à leur âge, et avec des intéractions positives quotidiennes avec le personnel en charge des soins. Un programme d'entrainement basé sur le renforcement positif sera mis en place afin de limiter le stress engendré par les manipulations nécessaires à l'étude, et de diminuer autant que possible le recours aux sédations.
Choix des espèces
Le chat est l'espèce cible des vaccins mis au points et des virus utilisés Les animaux seront de jeunes chats âgés de moins d'un an, correspondant à la population la plus sévèrement touchée par les virus étudiés.
Régénération axonale sous un champ électrique après une transsection du nerf sciatique chez la souris adulte
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le nerf sciatique de 136 souris est sectionné sous une anesthésie de trente minutes, puis un implant à électrodes en or est posé pour tester si un champ électrique accélère la repousse nerveuse. Toutes seront tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 72 d'entre elles subissant en plus une étude électrophysiologique à dix semaines. Le porteur reconnaît que la lésion peut causer des douleurs intenses, une restriction de la mobilité, une déshydratation et des comportements d'automutilation, avant que toutes les souris soient fixées pour prélever moelle épinière, nerf et muscle. Il annonce des tests comportementaux hebdomadaires qu'il qualifie de non invasifs et non douloureux, sans préciser lesquels.
Objectifs
Notre approche est novatrice et consiste à mettre au point un dispositif électrique implantable pour réparer des nerfs périphériques sectionnés ou écrasés. Un protocole expérimental a été validé in vitro pour optimiser l'effet d’un champ électrique local exogène sur les processus de régénération nerveuse in vivo. Le dispositif expérimental est constitué d’un tube sur lequel des électrodes en or sont imprimés. Il offre des possibilités polyvalentes pour des études physiques, biochimiques et biologiques approfondies. L'application potentielle de ce neuro-implant sur une lésion du nerf sciatique (modèle biologique) semble prometteuse pour améliorer la régénération nerveuse, en particulier dans le cas des lésions à gap important (au-delà de 3 cm chez l’homme) du nerf sectionné pour lequel la réparation est problématique.
Bénéfices attendus
La priorité de ce projet est de mettre au point un dispositif non invasif qui permette la repousse d’un nerf après traumatisme. Ce projet repose sur le développement d'une interface entre les neurosciences, la biophysique, la science des biomatériaux et les techniques d’imagerie appliquées aux systèmes biologiques. Les développements seront à la fois fondamentaux et techniques, y compris l’étude de nos hypothèses sur la capacité du champ électrique à modifier l’activité cellulaire, ce qui constituerait de grandes avancées en neurosciences, et la compréhension de l’interaction champ électrique-protéine, qui peut apporter de nouvelles perspectives en biophysique et en biomatériaux. Notre objectif à terme, est de proposer un traitement dans le cadre de la prise en charge de ce type de traumatisme chez l’Homme et d’étendre cette méthode thérapeutique à d’autres types de pathologies nerveuses.
Procédures
136 souris seront utilisées dans ce projet. La transsection du nerf sciatique et l’implantation du neuro-implant seront réalisées sous anesthésie générale d’une durée totale de 30 min. Toutes les souris réaliseront des tests comportementaux, ces expériences sont non-invasives et non douloureuses et se feront sur animal vigile. Ces expériences commencent à J7 post-lésionnelle et elles seront effectuées de manière hebdomadaire. L’étude électrophysiologique ne concernera que les souris de la deuxième procédure (n=72), elle sera réalisée sous anesthésié générale à J(10 semaines). L’ensemble des animaux (136 souris) seront fixés. Pour la première procédure, la fixation sera réalisée à deux stades post-lésionnels (J(5 semaines) et J(10 semaines)) afin de récupérer la moelle épinière. Pour la deuxième procédure, la fixation se réalisera à J(10 semaines) afin de prélever le nerf sciatique et le muscle gastrocnémien.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie. - La lésion du nerf sciatique, peut causer des douleurs intenses avec restriction de la mobilité, diminution marquée de la prise de nourriture, déshydrations ou comportement d’automutilation. Les animaux seront surveillés et la prise en charge de la douleur sera adaptée en fonction des indices révélant la douleur ressentie par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour les prélèvements de tissus.
Remplacement
Il est important de noter que nous avons étudié in-vitro l’effet de cette approche thérapeutique sur la repousse axonale sous forme d’étude préliminaire qui a abouti à la création d’un neuro-implant électroactif. Ce travail démontre la potentialité d’utiliser un champ électrique sans contact pour accélérer et orienter la pousse des axones. Cette étude nous permet aussi de comprendre l’impact du champ électrique sur les cellules et le substrat d’adhésion. Notre objectif est d’optimiser l’effet d’un champ électrique exogène et local sur les processus de neuritogenèse et de régénération, via la conception d’un dispositif expérimental original utilisant des électrodes en or. Des tests in-vivo utilisant des modèles de dénervation chez des souris adultes fourniront une preuve de concept de la capacité de réparation nerveuse de ces nouveaux implants électroactifs. Nous avons choisi de nous concentrer, pour cette étude, sur la réparation axonale après un trauma / axotomie. Nous avons donc besoin d'une approche intégrée allant du comportement au cellulaire pour à terme pouvoir juger de l'efficacité de cette approche chez l'Homme et développer des projets de recherche clinique.
Réduction
- Le groupe d’animaux contrôle sera utilisé dans le cadre des différents traitements. Pour chaque protocole, le nombre de souris par groupe est suffisant pour obtenir des données statistiquement valides, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 animaux selon des études antérieures. - 12 souris/groupe seront utilisées pour l’histologie de la moelle épinière (n=6 à J(5semaines) et n=6 à J(10semaines)). 12 souris/groupe seront utilisées à la fois pour l’histologie des nerfs sciatiques et des muscles gastrocnémiens. Il est à noter que 40 souris sont utilisées dans les tests préliminaires (pour rappel les tests préliminaires portent sur la taille du gap (1, 2 ou 3mm) et la sur durée de pré-stimulation (4, 8 ou 24h)). - Une veille bibliographique sera effectuée dans ce contexte scientifique afin d'éviter tout emploi injustifié des procédures expérimentales.
Raffinement
- Les interventions douloureuses ou angoissantes sont réalisées sous anesthésie et un monitoring de l’analgésie pré, per et postopératoire sera envisagé. Avant et pendant l’intervention chirurgicale, dès l’apparition d’un ou des premiers signes d’allègement de l’anesthésie (réflexes, accélération du pouls et de la respiration, mouvements des vibrisses, réaction à un stimulus douloureux), l’animal reçoit immédiatement une dose supplémentaire d’anesthésique équivalent au quart de la dose initiale. L’intervention ne reprend que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio-respiratoire régulier, pas de réaction à un stimulus douloureux comme le pincement d’une patte). Une injection SC d’antalgique sera effectuée 20 minutes avant le début de la chirurgie et deux injections en post-chirurgie avec un intervalle de 4h durant les premiers 24h post-lésionnelles, de façon à réduire la gêne fonctionnelle et les douleurs. Un antalgique sera mis dans le biberon durant la première journée post-opératoire.- Des gouttes du gel oculaire seront appliquées sur les yeux des souris durant la procédure chirurgicale pour éviter toute lésion cornéenne. - Un score de douleur sera établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines et selon le résultat une analgésie sera mise en place ou l’animal sera exclu ou sacrifié. Pour réduire le stress éventuel engendré par les procédures, un enrichissement de l'environnement est essentiel, les cages seront pourvues d’un rouleau en carton ainsi que du coton et des bâtonnets de bois et isolées des vibrations grâce à un tapis en mousse. Les souris seront placées dans une pièce au calme et manipulées de façon journalière.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est d'étudier les effets d'un champ électrique sur le processus de régénération nerveuse après lésion. Nous travaillons sur la souris pour deux raisons : (i) facilités des observations : évaluation comportementale des sorties motrices et sensitives et accessibilité aux motoneurones. (ii) possibilité d'avoir des souris mutantes dans certaines pathologies inflammatoires et démyélinisantes. Ce travail sera réalisé sur des souris adultes de 8 semaines parce qu’elles présentent un degré de myélinisation optimal. De plus, l’objectif à terme est de réparer des nerfs chez des patients essentiellement adultes.
Déterminer les liens entre le CD95 ligand soluble (FasL ou CD95L) et la ferroptose dans les pathologies autoimmunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rendues malades d'une colite hémorragique par un produit administré une semaine durant, ou d'un lupus par une injection de pristane dans la membrane entourant l'intestin, 1 080 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le lupus se déclare huit semaines après l'injection, et des prélèvements sanguins sont réalisés chaque mois sous anesthésie, pour évaluer deux molécules mises au point par l'équipe. Le porteur décrit une injection qui "n'induit peu d'inconfort et de douleur", puis annonce que certaines souris développeront des atteintes pulmonaires sévères et seront tuées en détresse. Il conclut que l'essai préclinique sur des souris récapitulant les manifestations humaines est "indispensable" avant tout essai chez les patients.
Objectifs
La Rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie inflammatoire digestive sévère dont les causes sont mal comprises. De plus, cette pathologie peut être caractérisée par une résistance du traitement. Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie auto-immune pouvant engendrer des atteintes cutanées, rénales, articulaire et vasculaire dont les cause ne sont pas encore bien comprise. De plus, les traitements actuellement disponibles ne permettent que de partiellement contrôler la pathologie. C'est pour ces raisons que le développement de nouveaux outils thérapeutiques tant pour le LES que pour la RCH est nécessaire pour une meilleure prise en charge des patients. De nouveaux mécanismes pathologiques communes à ces deux pathologies ont récemment été décrit et nous avons développé de nouvelles molécules afin de réguler ces mécanismes pathogéniques et de diminuer les atteintes d'organes. Les objectifs de ce travail seront donc d'évaluer le pouvoir thérapeutique des deux molécules développées par notre équipe et de les comparer aux traitements de référence ou en combinaison avec ces derniers pour amplifier leurs effets. Ces thérapeutiques étant nouvelles, et nécessitent une validation préclinique avant le passage éventuel chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les thérapeutiques actuellement disponibles pour les patients atteints de recto-colite hémorragique (RCH) ainsi que celles disponibles pour le lupus érythémateux systémique (LES) sont imparfait. En effet certains patients peuvent être résistant au traitement, de plus ces derniers peuvent aussi engendrer de lourds effets indésirables. En partant de ce constat, notre équipe essaye de développer de nouveaux outils thérapeutiques en rapport avec les derniers avancés sur la compréhension de la physiopathologie de ces deux maladies. Avant tout, essaie sur les patients l'essai pré-clinique sur des modèles murins permettant de récapituler les manifestations cliniques humaines est indispensable. Le bénéfice attendu à long terme est donc la génération de nouvelles molécules thérapeutiques pour traiter la RCH et le LES.
Procédures
Le modèle de colite induit en 1 semaines est utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20% du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Pour les prélèvements sanguins, les souris seront anesthésiées pendant 2 minutes le temps du prélèvement pour limiter leur inconfort. Le modèle murin de lupus est induit par une injection rapide durant moins de 30 secondes au niveau de la membrane entourant l'intestin, ce type d'injection est classique et n'induit peu d'inconfort et de douleur. La maladie lupique est induite a partir de 8 semaines après l'injection.
Impact sur les animaux
Le modèle de colite utilisé pour cette étude est largement validé et utilisé dans la littérature engendrant de l'irritation et inflammation au niveau intestinal. La sensibilité des animaux a la maladie peut varier selon les individus et la détérioration de l’état général peut être plus rapide chez certains. Le poids et l’état général seront donc surveillés quotidiennement pendant la durée du traitement. Il est admis que si l’animal perd plus de 20 % du poids du corps, il doit être euthanasié plus rapidement que prévu. Le modèle murin de lupus induit par le pristane est un modèle validé, certains animaux peuvent développer dans les premières semaines des atteintes pulmonaires sévères, mais ces souris vont rapidement être reconnu comme étant en détresse et seront rapidement euthanasié afin de limiter le plus possible la durée de leur detresse. Les animaux qui n'auront pas développé d'atteinte pulmonaire vont progressivement avoir une légère détérioration de leur fonction rénale.
Devenir
Tous les animaux utilisé seront euthanasié conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE. Cette mise a mort des animaux est neccesaire afin d'évaluer les paramétres immunologiques et l'évolution de la pathologie en fonction des différents traitements.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l’homme peut apporter la preuve de l’intérêt d’un traitement ciblant GPX4 ou le s- CD95L dans la RCH et le LES. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé statistiquement comme étant le nombre minimum d'animaux pour réaliser des tests statistiques robustes et permettant de conclure quant à l'efficacité thérapeuque de nos molécules.
Raffinement
1. Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance, perte de poids trop importante. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: certaines souris auront un prélévement sanguin une fois par mois et afin de limiter leurs stress, incomfort et douleurs ce geste sera fait sous anésthésie générale.
Choix des espèces
Souris C57Bl/6 : nous utiliserons ces souris car elles ont largement été utilisées dans la littérature avec le modèle DSS ou pristane et y sont sensibles.
Etude du profil pharmacocinétique de formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Le protocole sert à classer six formulations d'un médicament déjà utilisé en clinique humaine, pour le compte du laboratoire client qui les a mises au point. 48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit onze prélèvements sanguins à la veine de la queue, le porteur reconnaissant que ces ponctions répétées peuvent provoquer des lésions et des hématomes. Il qualifie le recours à l'animal entier d'étape "nécessaire et obligatoire", et retient le rat pour sa volémie, qui autorise davantage de prélèvements par individu et réduit d'autant l'effectif de l'étude.
Objectifs
Le laboratoire pharmaceutique client a développé des matrices de type gel qui peuvent être complexées avec des composés thérapeutiques et être administrées par voie sous-cutanée afin d'induire une libération prolongée du composé complexé. Ce type de formulation (ou galénique) permet ainsi, en théorie, de réduire très sensiblement la fréquence d'administration de médicaments dont la voie d'administration est sous-cutanée. Néanmoins, il es nécessaire de tester, pour chaque composé à complexer, sa stabilité à moyen long terme dans la matrice afin que ce dernier conserve son efficacité. Par ailleurs, la durée de libération va également dépendre étroitement de la composition du gel. Le présent projet vise ainsi à explorer le profil pharmacocinétique de 6 formulations à libération prolongée du médicament X administrées par voie sous-cutanée chez le rat, dans le but d'optimiser son développement. Les données obtenues seront comparées aux profils pharmacocinétiques obtenus après administration d'une galénique classique du composé X par voie intraveineuse et sous-cutanée. La formulation permettant la meilleure stabilité du compose X et de ses paramètres pharmacocinétiques sera conservée pour la suite du développement, notamment dans un cadre clinique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de catégoriser les formulations à libération prolongées du médicament X de notre client en fonction de leur paramètres pharmacocinétiques et de prioriser les meilleures formulations pour la suite du développement préclinique et clinique. La formulation à libération choisie prolongée devrait à terme permettre de réduire considérablement la fréquence d'administration du composé X qui est déjà utilisé en clinique humaine sous sa forme galénique classique.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Pesée (1min ; 2 fois). Habituation aux boîtes de contention (5min ; 2 fois). Anesthésie gazeuse (5min ; 1 fois). Administration sous-cutanée du composé d'intérêt (1min ; 1 fois). Prélèvements sanguins (5min ; 11 fois).
Impact sur les animaux
La répétition des prélèvements sanguins via la veine de la queue est de nature à induire un stress aux animaux. Par ailleurs, ces prélèvements répétés pourraient s'avérer générateurs de lésions problématiques au niveau de la queue. Afin de limiter le stress, les animaux seront manipulés de façon quotidienne par les expérimentateurs et habitués aux systèmes de contention utilisés au cours des prélèvement. Afin de se prémunir de lésions potentielles au niveau du site de prélèvement sanguin, ceux-ci seront pratiqués à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Une attention particulière sera portée à la queue des animaux. Si un hématome venait à apparaitre, les prélèvements suivants seraient pratiqués sur le côté opposé de la queue. Par ailleurs, le volume de sang prélevé pour chaque point est limité au volume minimum possible pour la réalisation des analyses pharmacocinétiques (PK) ultérieures.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Après euthanasie, certains organes seront prélevés (coeur, poumons, cerveau...) afin d'étudier une accumulation éventuelle à leur niveau du composé X ou d'éléments constituants de la matrice de libération prolongée.
Remplacement
Le présent projet vise à déterminer les paramètres pharmacocinétiques de formulations à libération prolongée d'un médicament X. Le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire et obligatoire d'un point de vue règlementaire pour ce type d'étude. Le choix du modèle rat a été préféré à la souris du fait des capacités accrues de prélèvements sanguins sur ce modèle (volémie plus importante).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure d'obtenir des données significatives sur les paramètres pharmacocinétiques étudiés. Le nombre d'animaux par groupe a été choisis selon les recommandations d'un ouvrage de référence. Le nombre de 6 animaux par groupe a été choisi en tenant compte d'une possibilité de variabilité plus importante de la biodisponibilité des drogues progressivement libérées par la matrice en sous-cutanée par rapport à une administration classique (libération immédiate).
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études pharmacocinétiques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Notamment, les volumes des prélèvements sanguins en série seront limités au strict nécessaire pour l'élaboration des dosages. Par ailleurs, les prélèvements seront réalisés par ponction de la veine de la queue à l'aide de microperfuseurs à ailettes, ces derniers autorisant un prélèvement sanguin en n'insérant que le premier millimètre de l'aiguille dans la veine. Les animaux seront hébergés avec un enrichissement du milieu de vie qui sera assuré par l'ajout de petites briquettes en bois et de tubes cartons spécifiques pour rat. Enfin, un suivi journalier des animaux permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis (administration d'analgésiques).
Choix des espèces
Le rat a été préféré à la souris compte tenu du nombre de prélèvements et des volumes sanguins nécessaires à l'étude. La même étude sur la souris aurait nécessité de limiter drastiquement le nombre de prélèvements par animal, ce qui aurait eu pour conséquence d'augmenter considérablement les effectifs de l'étude. Par ailleurs à ce stade, les études sur animaux non rongeurs n'ont pas été envisagées par soucis de Remplacement (Règle des 3Rs). Il nous apparait que les études sur les mammifères non murins devraient être limitées aux études règlementaires sur des molécules actives déjà sélectionnés. Or dans le cas présent il s'agit d'une étude de sélection de formulations, permettant d'optimiser la recherche et développement du client et de limiter le développement ultérieur aux formulations présentant les meilleurs propriétés pharmacocinétiques. Les animaux utilisés seront des rats adultes (300 g à réception/350g env. au démarrage des expérimentation). Ce stade de développement a été choisis: - en se basant sur le recommendations d'un ouvrage de référence. - en considérant le nombre de prélèvements et les volumes sanguins nécessaires à la bioanalyse.
Rôle de l’épithélium alvéolaire dans le maintien de l’immunité entraînée pulmonaire, chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
La moitié des souris reçoit une irradiation puis une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitaire sous anesthésie, toutes subissent une administration intratrachéale, et une partie reçoit des cellules cancéreuses par voie intraveineuse alors qu'elles sont éveillées. 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le RNT qualifie les métastases pulmonaires de modèle "sans souffrance jusqu'à J21", jour de la mise à mort. Sur le remplacement, l'équipe affirme que les paramètres étudiés ne peuvent pas être reproduits in vitro et que le recours aux souris est "indispensable" pour saisir l'immunité entraînée dans sa globalité.
Objectifs
Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Evaluation pharmacocinétique et pharmacodynamique de molécules pharmacologiquement actives chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 1290
Une perte de poids supérieure à 20 % maintenue trois jours déclenche la mise à mort immédiate. 3 180 souris et 1 290 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 4 290 d'entre eux et modéré pour 180. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 28 administrations, une par jour pendant 28 jours, et jusqu'à cinq prélèvements sanguins sous anesthésie. Le laboratoire indique ne pas connaître la nature des molécules testées, propriété de ses clients, ce qui rend selon lui les effets indésirables difficiles à anticiper.
Objectifs
Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. L'ensemble de ces analyses permettra de déterminer la dose à administrer pour les molécules testées et d'optimiser les modalités de traitement.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces analyses permettra de déterminer la dose à administrer pour les molécules testées et d'optimiser les modalités de traitement.
Procédures
Une administration unique ou plusieurs administrations (maximum 28 à raison de 1 par jour pendant 28 jours) pourront être réalisées. La durée de chaque administration est inférieure à 1 minute (quelques secondes). Des prélèvements sanguins (de 1 à 5 maximum) seront réalisés sous anesthésie. La durée d'anesthésie pour un prélèvement est d'environ 5 minutes, le prélèvement dure 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation, les administrations, les anesthésies et prélèvements répétés peuvent provoquer du stress chez les animaux. Des effets indésirables liés à l'administration des molécules thérapeutiques (mauvaise tolérance...) peuvent être observés mais sont difficiles à anticiper car nous ne connaissons pas la nature des molécules de nos clients.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements de sang total seront réalisés. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront également être réalisés.
Remplacement
Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe et calculé en utilisant des tests statistiques. L'évaluation pharmacocinétique d'un composé est faite par analyse du sang, du plasma ou des organes à l'aide de techniques analytiques ou immunodosages. Ces techniques d'analyse nécessitent des volumes d'échantillons définis souvent faibles (
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des zones ayant reçu le traitement topique...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Les procédures pourront être réalisées sous anesthésie générale, avec utilisation de tapis chauffants. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (rat, souris) sont recommandées par les agences de réglementation pour les études de métabolisme, de pharmacocinétique et de toxicologie. Ces espèces sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entre ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Prélèvement de produits biologiques d’origine animale sur lapin
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tués par exsanguination, 3 750 lapins sont exploités pour leur sang, leur sérum et leur plasma, 2 000 d'entre eux saignés au cœur sous anesthésie et tués avant tout réveil, 1 750 soumis sur animal vigile à des ponctions répétées de l'artère ou de la veine de l'oreille. Le porteur décrit des prélèvements pouvant atteindre 20 % du sang circulant, et annonce comme nuisances des saignements, des inflammations aux points de ponction, une anémie et une fatigue, tout en affirmant par ailleurs que ces volumes n'entraînent pas de fatigue. La mise à mort intervient dès que les veines et artères de l'oreille ne sont plus utilisables. Ces lapins, présentés comme des "excédents de production", fournissent des réactifs de diagnostic et des matériaux d'étalonnage que le porteur déclare non substituables.
Objectifs
L’objectif du projet est de fournir aux scientifiques des produits biologiques d’origine animale de lapins (sang, sérum, plasma). Ceux-ci ne pouvant pas être produits par des méthodes alternatives.
Bénéfices attendus
Les produits biologiques d’origine animale (PBOA) sont utilisés à des fins scientifiques. Ils permettront la préparation de diagnostics ou réactifs pour des tests biologiques comme par exemple les tests immunologiques , mais également comme matériaux d’étalonnage ou de contrôle.
Procédures
Les techniques utilisées pour réaliser les prélèvements de sang sont les suivantes : L’artère médiane et la veine marginale de l’oreille sont les voies décrites et utilisées chez le lapin vigile pour réaliser des prélèvements de sang. La quantité prélevée ne dépassera pas les recommandations éthiques en vigueur. Le volume prélevé ; la date de prélèvement ; le poids de l’animal ainsi que la voie de prélèvement et le temps de récupération nécessaire sont reportés dans un registre. Dans le cadre d’un prélèvement unique par jour, plusieurs choix sont possibles en fonction du temps de récupération : -0,75% du sang total circulant peut être prélevé sur 24 heures de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 1mL -7,5% du sang total circulant peut être prélevé sur 1 semaine de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 12mL -10% du sang total circulant peut être prélevé sur 2 semaines de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 17mL -15 à 20% du sang total circulant peut être prélevé sur 4 semaines de récupération. Exemple pour 1 lapin de 3kg : 25 mL En cas de protocole prolongé (> 1 semaine) – une pesée hebdomadaire sera effectuée. Le prélèvement par voie intracardiaque sera réalisé après anesthésie générale. L’état général des animaux sera vérifié avant la réalisation du prélèvement. Une mise à jeun alimentaire peut être demandé par le scientifique.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de la production de produits biologiques d’origine animale (PBOA), sont les saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, l’anémie/fatigue de l’animal suite au(x) prélèvement(s), la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener du stress chez l’animal.
Devenir
Mise à mort dès lors que les voies d’accès aux prélèvements ne sont plus disponibles. L’animal décède par exsanguination terminal (mort de l’animal).
Remplacement
Les produits biologiques d’origine animale (PBOA) sont des produits utilisés par les scientifiques comme outil de diagnostics ou réactifs pour tests biologiques à partir du sang de lapin, non substituables par des méthodes in vitro ou composés chimiques.
Réduction
Les animaux sont prélevés uniquement en fonction des demandes des scientifiques sur l'année auprès de l’Etablissement Utilisateur, dans le respect des recommandations éthiques, notamment en termes de volume et de temps de récupération. Il n’y a pas de production d’animaux spécifique pour ces procédures. Les animaux utilisés sont des excédents de production.
Raffinement
Les lapins sont hébergés en groupe sociaux à partir du sevrage. Néanmoins en cas de conflit entre individus, certains animaux peuvent être isolés ; il apparait ici que reformer des groupes sociaux à postériori engendre de nouveaux conflits. Certains animaux peuvent être isolés si l’un ou plusieurs des congénères d’une même cage ont été retirés pour raison de vente . De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin et/ou balle plastique …), un cycle jour nuit est présent (16h/08h). Une anesthésie générale est réalisée avant le prélèvement par voie intra-cardiaque. Les prélèvements sont effectués sur des sites sans hématome - ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. Également, la peau de l’animal est désinfectée avec de l’alcool avant prélèvement. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de colle chirurgicale sera appliqué pour assurer l’arrêt du saignement. De par notre expérience – les volumes et fréquences des prélèvements n’entrainent pas de fatigue chez l’animal. L’équipe chargée de réaliser cette procédure est formée à la détection des signes cliniques et des points limites sont mis en place (terminaux non spécifiques, terminaux spécifiques et intermédiaire). Tous les animaux sont observés de manière quotidienne pendant toute la durée de l’étude et une observation minutieuse est réalisée au retour dans la cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les scientifiques demandent des produits biologiques type sang, sérum, plasma, issus du lapin. Ceux-ci ne peuvent pas être produits par des méthodes alternatives. Le lapin est âgé de minimum 5 semaines (âge du sevrage) afin que l’artère ou la veine soient accessibles. L’âge et le sexe du lapin sera ensuite adapté selon la demande spécifique du scientifique. Des femelles gestantes pourront aussi être utilisées selon la demande spécifique du scientifique. Le prélèvement par voie intracardiaque pourra être réalisé sur des lapins à partir de 3 semaines, en fonction de la demande du scientifique. Également le sexe du lapin est adapté à la demande du scientifique.