Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Hétérogénéité des astrocytes dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à douze mois pour analyse de leurs tissus, 808 souris subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, une fenêtre implantée dans le crâne et des séances mensuelles d'imagerie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 720 d'entre elles. Le projet porte sur des sous-populations d'astrocytes chez des souris modèles de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Huntington. Le porteur détaille huit tests comportementaux qu'il qualifie de "peu stressants", auxquels s'ajoutent des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine sur les femelles, puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Soixante souris ne servent que de stimulus social ou de source d'urine pour les tests des autres, et seront transférées vers d'autres projets ou tuées.
Objectifs
Les astrocytes sont des partenaires clés pour les neurones dans le cerveau. Ils remplissent des fonctions importantes pour le bon fonctionnement des neurones. Les astrocytes sont des cellules hétérogènes, qui sont impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (MA), dans lesquelles ils présentent des changements importants et peuvent avoir des effets délétères ou bénéfiques. Des études récentes montrent que des populations distinctes d'astrocytes coexistent dans les cerveaux atteints de la MA mais leurs impacts sur les neurones sont encore inconnus. Nous avons développé des outils qui permettent de mettre en évidence des sous-populations d'astrocytes dans le cortex d'un modèle murin de la MA et de les analyser fonctionnellement. Ce projet vise à 1) compléter la caractérisation des ces sous-populations dans un modèle plus progressif et reproduisant plus fidèlement les atteintes moléculaires de la MA, 2) analyser leur dynamique d’apparition, 3) comparer ces sous-populations à celles présentes dans le cerveau de souris modèles de la maladie de Huntington, une autre maladie neurodégénérative, 4) cibler une sous-population identifiée comme délétère pour l’inhiber et en évaluer les effets thérapeutiques sur les altérations typiques de la MA dans une souris modèle.
Bénéfices attendus
La MA touche plus de 900 000 personnes en France et représente un fardeau sociétal majeur. Jusqu'à présent, la plupart des stratégies thérapeutiques ont ciblé directement les neurones et ont malheureusement échoué en clinique. Les astrocytes assurent des fonctions clés dans le cerveau qui peuvent être perturbées dans la MA, lorsque les astrocytes sont réactifs. Manipuler ces cellules de soutien pour les rendre plus favorables aux neurones apparaît comme une stratégie alternative potentielle. Les astrocytes sont des cellules hétérogènes qui changent de manière spécifique lors de maladies. Ces changements doivent être définis avec des techniques dédiées. Notre approche permet la caractérisation fonctionnelle des sous-populations d’astrocytes et leur manipulation. Si elle une sous-population d'astrocytes réactifs du cortex de souris est identifiée comme défectueuse en 1ère partie du projet, nous la ciblerons dans la 2e partie de ce projet. Notre approche thérapeutique basée sur le ciblage spécifique de sous-populations d'astrocytes pourrait être plus efficace que des stratégies centrées sur les neurones. En se focalisant sur les astrocytes, ce projet générera de nouvelles connaissances sur la MA et sera facilement transférable à d'autres maladies cérébrales.
Procédures
Les souris recevront une injection intracérébrale sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris). Après 1 mois, certaines souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse de 5 minutes. D’autres souris passeront 8 tests de comportement, 4 mois après une injection unique. Ces tests durent entre 5 min et 1h chacun et seront réalisés sur 6-7 semaines en laissant 2-3j de repos entre chaque test. Ces tests sont peu stressants et se basent principalement sur des comportements naturels (exploration, interactions avec congénères). Certaines souris seront implantées avec une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie, pour réaliser de l’imagerie cérébrale sur souris habituées à la contention. Huit sessions de 30 min maximum, seront réalisées chaque mois de l’âge de 5 mois jusqu’à leur euthanasie à 12 mois. Certaines femelles seront prises en contention pendant quelques minutes pour réaliser un frottis vaginal (1 fois par souris) et prélever leur urine (4 fois à 4 jours d’intervalle). Enfin, certaines souris auront un prélèvement de liquide céphalorachidien sous anesthésie et analgésie avant leur euthanasie (prélèvement de 30 min maximum). Les changements comportementaux liés à la modélisation de la maladie d’Alzheimer (réduction fine de la mémoire, légère anxiété mesurées sur des dispositifs dédiés et sensibles) et de la maladie de Huntington (changements légers de motricité mesurés par des dispositifs sensibles, et moins de gain de poids) représentent des nuisances extrêmement légères, qui n’entravent pas la capacité des souris à se nourrir, déplacer, et réaliser leurs comportements habituels en captivité
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris utilisées dans ce protocole sont les suivantes : douleur liée à la chirurgie et l’implantation d’une fenêtre crânienne pendant les quelques jours suivants la chirurgie et faible stress ponctuel lié à la contention lors de l’imagerie biphotonique et aux tests comportementaux (qui durent moins d’1h chacun).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’âge de 12 mois, pour analyse post mortem complète des tissus. Les 20 souris femelles et 40 souris mâles naïves servant de stimulus pour les tests de comportement d’interaction sociale et d’exposition à l’urine de femelle, n’ayant pas reçu d’injection ou de chirurgie seront proposées pour utilisation dans d’autres projets et dans le cas contraire seront euthanasiés.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones (les cellules vulnérables dans la maladie d’Alzheimer) et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes. Ces interactions cellulaires ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. De plus, la vulnérabilité de certaines régions cérébrales nécessite de comparer sur l’organe entier les différentes régions cérébrales qui ont parfois des connections anatomiques et fonctionnelles cruciales pour expliquer cette vulnérabilité sélective, et ne sont pas reproduites in vitro dans toute leur complexité. En particulier, il existe des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui possèdent des mutations génétiques impliquées dans les formes familiales de la maladie d’Alzheimer et reproduisent de nombreux altérations typiques de la maladie d’Alzheimer. Ces modèles permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui a un rôle clé pour moduler l’inflammation cérébrale. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques typiques de la maladie d’Alzheimer (ex. déficits mnésiques, anxiété), ainsi que leur potentielle restauration par notre stratégie thérapeutique. Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre d’identifier le rôle de sous-populations d’astrocytes dans les déficits caractéristiques de la maladie d’Alzheimer, en les ciblant par des stratégies thérapeutiques adaptées.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 868 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par example, certaines souris auront une évaluation de leur comportement puis seront analysées au niveau biochimique, histologique ou transcriptomique. Les analyses de types « omiques » permettent d’obtenir un grand nombre d’informations à partir d’une souris, de même l’imagerie longitudinale permet d’analyser la même souris au cours du temps au lieu de devoir euthanasier des souris différentes à chaque temps d’analyse. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation (points limites évalués par une grille de suivi), permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris. L’habituation des souris à la contention et à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant les tests comportementaux permet de réduire le stress des souris. Seules les souris hétérozygotes modèles de la maldie de Huntington seront générées et utilisées dans ce projet, qui ne présentent pas de perte de poids.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère. Les souris modèles de la maladie d’Alzheimer utilisée dans ce projet permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes corticaux dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Elles présentent aussi des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de cette maladie. La maladie d’Alzheimer se déclare chez l’adulte. Les altérations histologiques, biochimiques, transcriptionnelles ainsi que les altérations fines du comportement apparaissant dans ce modèle de la maladie d’Alzheimer vers 6-9 mois. Les souris seront analysées entre 5 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.
Evaluation de phénotype dommageable lors de la création par croisement ou de la réception de lignées de souris sur le plateau d’élevage. Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
122 000 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage de lignées génétiquement modifiées, 12 000 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'activité déclarée tient en une biopsie d'oreille pour génotypage et en la surveillance des lignées dont la modification génétique altère la santé, par exemple par une susceptibilité accrue aux tumeurs. Environ 107 800 souris seront tuées, 12 200 gardées pour la reproduction et 2 000 réutilisées, le porteur indiquant que les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort quand aucun autre projet ne peut les prendre. Sur les 122 000 déclarées, la très grande majorité n'existe donc que pour faire naître les quelques individus porteurs du bon génotype.
Objectifs
Il s'agit de définir et de détecter des lignées de souris pouvant altérer leur bien-être dans un élevage de souris génétiquement modifiées et de produire des souris génétiquement modifiées nécessitant une caractérisation génétique.
Bénéfices attendus
Ceci permet de produire et de maintenir des lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à des projets de recherche en raffinant les techniques d'élevage de ces lignées. Ceci permet à la fois de détecter et de prendre en charge l'apparition de caractères dommageables. Ce projet permet d'anticiper la prise en charge des signes nécessitant des soins et de permettre une réaction immédiate en cas d'apparition de ces signes.
Procédures
Identification et prélèvements pour caractérisation des souris (moins d'une minute). Biopsie pour génotypage qui concerne les souris du projet. Conditions d'élevage spécifique des modèles adaptés en fonction de l'évaluation de l'impact du modèle sur le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés au caractère dommageable des lignées entretenues : par exemple, une susceptibilité plus grande à l'apparition de tumeurs... La biopsie pour génotypage qui sera faite à l’oreille.
Devenir
Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures expérimentales dans d'autres établissements utilisateurs ou peuvent servir en tant que reproducteur. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux sont soit utilisés pour d’autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs quand c’est possible, soit euthanasiés s’il n’y a pas de possibilité de les utiliser dans d’autres procédures.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques).
Réduction
La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).
Raffinement
Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des signes attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, batonnet de coton, maison en carton si besoin, mise à disposition si besoin de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions sanitairess sont élevées afin de réduire le risque de caractère dommageable lié au statut sanitaire. La biopsie pour le génotypage se fait à l'oreille.
Choix des espèces
Souris, car on peut facilement créer et produire de nouveaux modèles pour répondre à une question scientifique. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.
Evaluation de la dégradabilité et de la digestibilité de nouveaux aliments chez la vache
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Des personnes habilitées introduisent puis retirent des sachets d'aliments par les canules dont des vaches laitières sont équipées au rumen ou à l'intestin, et les maintiennent à l'attache par périodes de cinq jours pour les mesures de digestibilité intestinale. 17 vaches Prim'Holstein vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réintégrées au troupeau, certaines pouvant rejoindre de nouveaux projets après deux mois au moins. Le projet vise à établir des tables de valeur nutritive des aliments pour bovins, et à terme une méthode de laboratoire qui se passerait des vaches. Le porteur qualifie la pose et le retrait des sachets de geste "non invasif", tout en notant que l'attache peut causer "un ennui de la vache" et, dans de rares cas, des inflammations des jarrets. Il ne dit rien de la pose de ces canules ni de leur durée de port.
Objectifs
Le projet participe aux thématiques qui visent à « accélérer les transitions agroécologiques et alimentaires » et à optimiser la circularité des flux d’azote et de carbone entre les ressources alimentaires, les animaux et leurs effluents pour diminuer les problèmes environnementaux. Il est important de caractériser de nouveaux aliments et des aliments favorisant l’autonomie protéique de la France et de l’Europe. Ce projet a pour objectif principal de mieux connaître la valeur nutritive réelle des aliments ingérés par les ruminants et digérés en partie dans le rumen et en partie dans l’intestin. Ces valeurs servent de base au système d’alimentation des ruminants. Ceci permettra notamment la mise à jour régulière des recommandations d’apports nutritionnels des bovins laitiers et allaitants ainsi que des tables de valeur des aliments. La présente demande concerne l’ensemble des projets dont le but est de constituer une base de données des dégradabilités ruminales et des digestibilités intestinales d’une banque d’aliments de référence. Cette banque d’aliment servira à trouver une méthode d’analyse enzymatique au laboratoire ne nécessitant plus d’animaux à l’avenir.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont de déterminer la valeur nutritive « vraie » d’une banque d’aliments collectés dans des projets scientifiques et notamment à l’échelle française, pour déterminer une banque de valeurs de référence sur un très large panel d’aliments classiques et nouveaux pour lesquels il n’existe pas à ce jour de valeurs de référence : concentrés de type énergétique ou protéique, fourrages classiques comme des fourrages verts de prairies, des ensilages, des foins, mais aussi des fourrages nouveaux ou pouvant se développer à l’avenir dans le contexte actuel de changement climatique, comme des espèces plus résistantes à la sécheresse (sorgho, chicorée) ou des feuilles d’espèces végétales arbustives ou d’arbres dans le cadre du développement de l’agroforesterie d’élevage. Ces valeurs de référence vont notamment permettre de calibrer des méthodologies alternatives de laboratoire, pour la dégradabilité ruminale de l’azote et de l’amidon, ainsi que pour la digestibilité intestinale de l’azote, éléments déterminants l’utilisation des nutriments par la vache et la valeur protéique réelle des aliments. A long terme, nous espérons que les méthodes de laboratoire seront suffisamment précises pour ne plus utiliser de vaches en expérimentation pour déterminer ces paramètres de la valeur des aliments.
Procédures
La seule intervention est la pose et le retrait des sachets ou bolus. Pour les mesures de dégradabilité ruminale, les aliments seront testés par séries de 4. Il y aura donc une intervention de pose et 6 interventions de retrait pour 4 aliments. En moyenne 40 aliments seront testés chaque année, ce qui représente 10 poses et 60 retraits. Pour 40 aliments à tester chaque année, cela représente donc 5 semaines d'invention sur les animaux. Pour les mesures de digestibilité intestinale, il y aura donc 7 à 9 poses de sachets par an dans le rumen et 7 à 9 poses des mêmes sachets dans l'intestin. Pour les deux types de mesure, les interventions sur l'animal sont très courtes (quelques minutes) sans engendrer de stress ni douleur. Les interventions se font pratiquement sans aucune contention de l'animal.
Impact sur les animaux
L’introduction dans le rumen de certains bolus pourrait dans de très rare cas diminuer l’ingestion. Pour mesurer la digestibilité intestinale des aliments, les animaux sont conduits à l’attache sur des périodes de 5 jours, ce qui peut entrainer un ennui de la vache. Le fait d'être à l'attache peut, dans de très rares cas, entrainer des problèmes d’aplomb (inflammation des jarrets) ; cependant ce temps est limité à 5 jours consécutifs.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront réintégrés dans le troupeau de vaches et seront conduits comme dans un élevage classique. Aprés un délai minimum de deux mois, certaines de ces vaches pourront participer à de nouveaux projets expérimentaux sur avis favorable du vétérinaire prenant en considération le sort des animaux concernés sur toute la durée de leur vie.
Remplacement
Le projet n’est pour l’instant réalisable qu'avec des animaux expérimentaux, seul moyen d’accéder aux différents compartiments digestifs. A terme, et notamment dans le projet de plus grande envergure, il est prévu de remplacer ces mesures par des mesures de laboratoire. Le projet actuel est en grande partie basée sur cet objectif.
Réduction
La valeur d’un aliment est déterminée sur uniquement 3 vaches en expérimentation (répétitions) par essai. Ce nombre ne peut pas être réduit car il est nécessaire pour tenir compte et corriger de la variabilité biologique naturelle connue entre individus, liée à leur poids, leur volume de rumen, leur capacité digestive. Les 3 répétitions permettent de généraliser les résultats.
Raffinement
La conduite des animaux sera respectueuse de leur bien-être. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et de traiter si besoin les animaux malades. La seule intervention sur les animaux sera la pose et le retrait des sachets via les canules du rumen ou de l'intestin. Cet acte trés rapide (quelques minutes) est non invasif et n'engendre aucune douleur ni mal-être pour l'animal. Pour cela les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation. Elles ne subiront donc aucun stress lié à ce blocage qui est habituel pour elles. Les vaches seront maintenues dans un environnement d'élevage (stabulation logettes) et ne seront jamais en isolement social. Les poses et retraits de sachets ou bolus ainsi que la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées.
Choix des espèces
La problématique de l’étude, spécifique des ruminants et assez spécifique des vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les animaux utilisés sont des vaches adultes car les résultats sont majoritairement utilisés pour diffuser des recommandations d’alimentation d’animaux adultes
Comprendre une maladie rare du sang, la maladie de Vaquez, grâce à deux modèles de souris génétiquement modifiées.
- Recherche appliquée
- Cancers
16 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À trois semaines, les souriceaux reçoivent une bague métallique dans l'oreille et se font couper deux millimètres de queue sur animal éveillé, puis une partie est rendue anémique par injection, une autre irradiée avant une greffe de moelle osseuse, avec prélèvement de sang chaque semaine. Le porteur indique que les lignées génétiquement modifiées présentent un risque accru de caillots et de cancer du sang, et que l'irradiation provoque diarrhées et infections. Le nombre déclaré tient à l'élevage requis pour obtenir les génotypes voulus, le porteur justifiant la réduction par le seul recours à des tests statistiques.
Objectifs
La maladie de Vaquez est une maladie qui se caractérise principalement par ses complications de caillots sanguins liées à une production excessive de globules rouges et de plaquettes. Elle survient vers 55-60 ans en moyenne chez l'homme et peut se compliquer dans environ 20% des cas en cancer du sang impactant directement le pronostic vital. Les approches thérapeutiques actuelles demeurent palliatives pour la plupart. Depuis plusieurs années, les travaux de recherche ont permis d'identifier une modification au niveau d'un gène présente chez environ 85 % des maladies de Vaquez. Un modèle souris exprimant cette modification génétique permet de disposer d'un modèle d'étude reproduisant la pathologie humaine. Notre projet aura pour but de comprendre les mécanismes qui entrainent l'apparition d'un cancer et de tester de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
L'analyse fine des mécanismes impliqués dans l'apparition d'un cancer du sang dans la maladie de Vasquez et le développement d'un nouveau modèle de souris doit permettre d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes qui pourront être testées dans des essais cliniques chez l’Homme afin d’espérer éradiquer les cellules initiatrices de cette maladie. Ces nouvelles approches thérapeutiques permettront d’améliorer l’espérance de vie et la qualité de vie des patients atteints de ce type de cancer du sang.
Procédures
Pour réaliser ce projet, nous réaliserons dans un premier temps l'élevage de plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Cela nous permettra d'avoir à disposition un modèle reproduisant la pathologie humaine. Cet élevage consiste à mettre en accouplement des souris mâles et femelles et lorsque les souriceaux seront âgés de 3 semaines, nous réaliserons une identification (pose d'une bague métallique numérotée au niveau d'une oreille, réalisée sur souris éveillée; durée: 30 secondes) et le prélèvement de 2 mm de l'extrémité de la queue (sur souris éveillée; durée: 5 secondes). Ce fragment de tissu permettra d identifier les animaux qui présentent la ou les mutations génétiques d'intérêt. Nous utiliserons ensuite une partie de ces souris pour créer une anémie. Pour cela les souris seront injectées dans l'abdomen avec une substance induisant la destruction des globules rouges (durée de l'injection: 10 secondes sur souris éveillées). 29 jours après cette injection, les souris recevront (injection dans l'abdomen sur souris éveillées) une injection d'une molécule permettant de mesurer la prolifération des cellules sanguines. 24h plus tard, les souris seront euthanasiées. Une autre partie des souris produites seront irradiées (étape réalisée sur souris éveillées permettant d'éliminer les cellules de la moelle osseuse avant de réaliser une greffe; durée: 15 minutes). Ces souris recevront ensuite la greffe (injection par voie intraveineuse; durée 1 min) de cellules de la moelle osseuse de souris non génétiquement modifiées. Chaque semaine, un prélèvement de sang (durée 20 sec) sera réalisé afin de suivre la prolifération et le développement des cellules greffées. Un partie de ces souris recevront un traitement médicamenteux minant ce qui est fait chez l'homme lors de protocole de thérapie.
Impact sur les animaux
Une partie des souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet présenteront des altérations affectant leur bien-être (modification de la composition sanguine entrainant de risque de coagulation et de formation de caillots, risque accrue de développer un cancer du sang). Les autres nuisances sont directement liées au protocoles expérimentaux mise en place: destruction des globules rouges (= anémie) entrainant un affaiblissement de l'état général de la souris; irradiation provoquant des troubles digestifs (diarrhées) et une plus forte susceptibilité aux infections; la répétition des prélèvements sanguins entrainant une douleur passagère (piqure) et un stress à l’animal; injection des drogues associés à des effets secondaires d’ordre digestifs en général (diarrhées, nausées…); injections répétées des traitements pouvant entrainer des lésions au site d’injection et une irritation du tube digestif dans le cas du gavage.
Devenir
L’évaluation de l’efficacité du traitement nécessite la mise à mort de l’animal, notamment en point final. Ils seront donc tous euthanasiés. La moelle osseuse, la rate et le sang seront récupérés en post-mortem pour l’évaluation en point final à l’issue des expériences menées (mesure de l’efficacité d’un traitement, récupération et étude des cellules du système sanguin).
Remplacement
Le remplacement sera proposé à chaque fois que cela sera possible (évaluation en première intention des nouvelles thérapies par des tests en milieu artificiel dans des plaques de culture cellulaire). Cependant, certaines questions nécessitent d’avoir recours à des approches utilisant un organisme vivant entier. L'évaluation des nouvelles stratégies thérapeutiques nécessitent en effet d'avoir une vision d'ensemble (biodisponibilité du médicament, rôle de l'environnement à proximité des cellules sanguines, interaction entre les différentes populations de cellules sanguines).
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à ce projet, nous nous sommes appuyés sur l'utilisation de tests statistiques, afin d'obtenir des données interprétables statistiquement tout en utilisant le nombre minimum de souris.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En cas de signes de souffrance, une administration d'anti-douleur sera réalisée. Si aucune amélioration n'apparaît, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement et la génétique est bien connu et proche de l’humain. En effet, il existe des souris génétiquement modifiées pour le gène trouvé comme étant anomal chez les patients atteints de la maladie de Vasquez. De plus, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. Dans la partie élevage, les souris sont mises en accouplement à l'âge de 8 semaines (maturité sexuelle) et l'identification des souriceaux se fera à l'âge de 4 semaines (âge où il est facile d'identifier les souris mâles des souris femelles et de les séparer de leurs parents). Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (modèle de greffe ou injection de traitement), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.
Induction de maladie démyélinisante chez le petit animal de laboratoire à la Cuprizone. Et évaluation de l’action de cellules thérapeutiques par injection intracérébrale dans ce modèle animal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1125
Nourris quotidiennement à la cuprizone pour provoquer une dégénérescence du cerveau, puis injectés dans le cerveau sous anesthésie, 1 125 souris et 1 125 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue pour un donneur d'ordre extérieur des cellules thérapeutiques dont la nature n'est pas précisée, avec mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires et autopsie systématique. Interrogé sur le remplacement, le porteur ne mentionne aucune alternative sans animaux et recopie mot pour mot son paragraphe sur la surveillance des effets indésirables. Il justifie le choix du rongeur par la transposition des doses aux "premiers patients", et présente l'injection intracérébrale comme porteuse de "grands espoirs thérapeutiques sur le long terme".
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)
Procédures
L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Dans le cas ou leur hébergement ne pourra se faire en groupes, un enrichissement adapté sera fourni et un suivi renforcé sera effectué. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.
Rôle du système d’activation du plasminogène dans le lait maternel et de son importance au cours du développement post-natal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Anesthésiées cinq fois en huit jours pour une ponction de lait précédée d'une injection d'ocytocine, 70 femelles allaitantes sont au centre de ce projet, qui déclare 420 souris au total dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur veut doser les protéines du système d'activation du plasminogène dans le lait de souris normales et de souris privées du gène tPA, pour comprendre leur rôle dans le développement du cerveau. Aucune souris ne sera tuée à l'issue, toutes doivent être réutilisées dans d'autres projets, ce que le porteur avance comme un argument en faveur du protocole. Il répète trois fois, dans les mêmes termes, que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux.
Objectifs
Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (i.e. tPA, uPA, PAI-1, neuroserpine, thrombine) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central (cellules gliales, neurones) et pouvant jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, le tPA, considéré comme un neuromodulateur, joue un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral et de la lignée oligodendrocytaire. Son absence au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de ces protéines présentes dans le lait maternel dans le développement cérébral et de pouvoir par la suite, effectuer un enrichissement du lait maternel en ces protéines pour corriger d’éventuelles anomalies neurodéveloppementales. La première étape du projet consistera au dosage des divers acteurs du système d’activation du plasminogène chez des souris contrôle et déficientes pour un de ces acteurs (tPA). Pour ce faire, le lait des souris allaitantes sera prélevé manuellement, tous les 2 jours, du 7ème au 15ème jour post-partum afin d’analyser sa composition grâce à des techniques de biologie moléculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude de la composition de lait maternel implique que celui-ci soit prélevé sur des mères allaitantes, in vivo. De plus, les méthodes de ce projet seront de classe légère et les animaux ne seront pas mis à mort, ce qui leur permettra d’être réutilisés dans d’autres projets.
Procédures
Seules les femelles allaitantes seront soumises à l’anesthésie et au prélèvement de lait un jour sur deux du 7ème jour post-partum au 15ème post-partum (soit 5 anesthésies / prélèvements par femelle ; n = 70 ; durée de la procédure = 20 minutes). Chacun de ces prélèvements nécessitera une injection d'ocytocine en bolus au préalable (2 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-anesthésies, du stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être, grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
Les procédures subies par les animaux ne dépassant pas la classe légère et n’ayant pas le besoin de récupérer des tissus, les animaux pourront être gardés en vie et réutilisés dans un autre protocole à l’issu de ce projet.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, sur l’implication du lait maternel dans le développement du système nerveux central.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, une procédure de mise au point permettra l'élaboration d'un protocole efficace pour prélever un maximum de lait sur chaque mère allaitante, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés par la suite. Le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour l’étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne s'isolent pas de leurs congénères. Les femelles allaitantes seront également placées dans un environnement enrichi : 2 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser. Durant le prélèvement, les souris seront sous anesthésie générale selon le mode identifié comme le plus adapté au moment de la mise au point (gazeuse ou injectable). Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de prévenir de la déshydratation. Les animaux seront manipulés progressivement tous les jours. Cette habituation à l’expérimentateur et à leur environnement permettra de limiter le stress possiblement occasionné lors des phases de manipulations.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches transgéniques disponibles au laboratoire. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les 2 procédures concernent le prélèvement de lait maternel chez des souris allaitantes, tous les deux jours, du 7ème au 15ème jour post-partum (période où la production de lait est la plus importante). De plus, le dosage des différentes protéines à plusieurs stades post-partum permettra de mettre en évidence leur cinétique et pic d’expression en fonction de la période de développement post-natal des souriceaux.
Modèles de douleur viscérale (induction et traitement)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
Rats : 4060
Cochons d'Inde : 1220
8 990 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures de douleur viscérale, dont 5 640 dans celles classées au niveau de souffrance le plus élevé. Les équipes leur induisent la douleur par administration d'un réactif ou par chirurgie, puis mesurent leur réaction à des stimulations tactiles ou thermiques appliquées sur la zone rendue douloureuse, et prélèvent sang et urine. 270 rongeurs seulement seront réutilisés, tous les autres tués, le porteur indiquant que les animaux modélisant une douleur chronique ne peuvent pas être maintenus en vie dans de bonnes conditions. L'objectif déclaré reste de tester l'efficacité analgésique ou anti-inflammatoire de nouveaux traitements, et le porteur affirme que les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne reproduisent pas les interactions au sein du "corps entier".
Objectifs
En France, la douleur est la première cause de consultation en médecine générale et dans les services d’accueil d’urgence. Parmi les douleurs fréquemment observées, les douleurs viscérales (et autres troubles digestifs) sont très représentées. Un sondage IFOP de 2021 relevait que près de la moitié de la population française (45%) était concernée par des troubles digestifs, les principaux troubles représentés étant les douleurs abdominales et le transit irrégulier. Globalement, tout le monde (ou presque) a ressenti, au cours de sa vie, des douleurs abdominales, qui peuvent se traduire par des crampes, des brûlures, des élancements, des torsions... Apparaissant de manière soudaine ou progressive, d'une durée qui peut être courte ou très longue, et d'intensité variable. Tous les tissus abdominaux peuvent être à l'origine du mal de ventre (intestins, reins, vaisseaux, muscles...) et les douleurs abdominales peuvent également être présentes en cas de maladies des organes du thorax (cœur, plèvre...) ou du pelvis (organes génitaux, vessie...). Dans la majorité des cas, ces douleurs sont liés à une mauvaise digestion, un mauvais transit, ou une colopathie fonctionnelle (syndrome du colon irritable), mais les causes potentielles sont multiples (gastrite, ulcères, cystite, endométriose, maladie de Crohn...). La prise en charge doit donc être adaptée à l'origine de la douleur, et la nature des traitements est multiple (antispasmodiques, pansements digestifs, anti-inflammatoires...). Certaines maladies (notamment chroniques) n'ont à ce jour pas de traitement permettant de les guérir (par exemple, la maladie de Crohn, l'endométriose...). Il apparait donc nécessaire de poursuivre la recherche de traitements permettant de traiter les causes et les symptômes des douleurs abdominales. Egalement, il est parfois nécessaire de vérifier l'absence d'effet algésiques (douloureux) causés par de nouveaux candidats médicaments. Ce projet met en place différents modèles de douleur viscérale, permettant d'étudier l'efficacité (analgésique, anti-inflammatoire, etc) ou d'évaluer l'absence d'effets secondaires de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Les douleurs viscérales sont extrêmement répandues, d'origines diverses et leur prise en charge est parfois compliquée, notamment dans le cadre de douleurs chroniques. La recherche de traitements permettant de traiter les causes et les symptômes des douleurs abdominales se poursuit donc. Ce projet permettra d'étudier l'efficacité (analgésique, anti-inflammatoire, etc) ou d'évaluer l'absence d'effets secondaires de nouveaux traitements dans différents modèles de douleur viscérale chez le rongeur.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). L'induction sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie) ou par chirurgie (quelques minutes, sous anesthésie). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non). Un prélèvement d'urine (après isolement 24 h max) pourra être réalisé dans le modèle de cystite.
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors d'un prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Le cas échéant, la phase d'isolement ou de mise à jeun peut également causer un stress. En cas de phase chirurgicale, il est possible qu'elle entraîne une douleur post-opératoire au site concerné. Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone potentiellement douloureuse peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal). Les modèles décrits ici sont des modèles de douleur viscérale. En fonction du modèle étudié, l'animal peut présenter une douleur abdominale, des crampes, ou une altération de l'état général (baisse de l'activité locomotrice, perte transitoire de poids, voire difficulté à uriner dans le modèle de cystite).
Devenir
Les animaux de ce projet (sauf animaux sham) seront tous euthanasiés à la fin de l'étude car ils modélisent des douleurs chroniques viscérales, et leur maintien en vie ne peut être assuré dans de bonnes conditions. De plus, dans la plupart des cas, des organes seront collectés en fin d'étude afin d'analyser les tissus (marqueurs d'inflammation, histologie...). Les animaux Sham (c'est-à-dire soumis aux mêmes manipulations (injections, tests...) que les animaux modélisant une pathologie, mais sans que la pathologie/les symptômes ne soient induits) pourront être maintenus en vie à la fin de ce projet s'il n'y a pas de prélèvement d'organe nécessaire, et à la condition qu'ils ne présentent aucun signe de douleur ou de mal être.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ces modèles car les douleurs abdominales sont d'origines diverses (pouvant provenir de multiples organes) et peuvent faire intervenir le système immunitaire, notamment dans le cas des maladies inflammatoires. Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité des traitements (analgésiques, anti-inflammatoires...) nécessite l'utilisation d'animaux vivants (étude de l'efficacité contre la douleur, ou encore réduction de l'inflammation...). Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude et des prélèvements d'organe en fin d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). En cas de phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Si pertinent, une anesthésie légère sera appliquée pour certaines administrations ou prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Rats, souris et cobayes sont bien décrits dans la littérature comme modèles de douleurs viscérales de différents types. Principalement animaux sevrés (à partir de 21 jours, jusqu'à l'âge adulte) car les troubles étudiés dans ce projet commencent plutôt à être détectés et soignés à partir de l'adolescence ou l'âge adulte (ne sont pas principalement des maladies pédiatriques).
Hébergement de rongeurs génétiquement altérés présentant une altération de la réponse immunitaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées pour 2 700 d'entre elles dans des projets sur le cancer ou le système nerveux central, tuées pour les 620 autres, 3 320 souris génétiquement modifiées sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans intervention prévue. Le projet porte sur leur hébergement en cages ventilées et matériels stérilisés, l'immunodéficience de ces lignées les rendant vulnérables aux infections. Parmi elles, 320 souris "sentinelles" servent de détecteurs du statut sanitaire de l'animalerie, précisément parce que leur déficit immunitaire prononcé les rend très sensibles aux agents infectieux, et sont tuées entre quatre et cinq mois après lecture des contrôles. Les 300 reproductrices sont tuées à six mois, et le porteur présente l'ensemble du dispositif comme un objectif de raffinement destiné à empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable".
Objectifs
Le projet est porté par une plateforme qui élève des souris génétiquement modifiées au service de laboratoires qui les utilisent dans différents projets autorisés. Les animaux en élevage sont particulièrement fragiles ; différentes mesures sont mises en place pour les protéger en particulier des infections. Parmi ces mesures, en accord avec le vétérinaire référent de notre structure, nous utilisons des souris "sentinelles" du statut sanitaire, qui, du fait de leur déficit immunitaire prononcé, ont une grande sensibilité aux agents infectieux. De plus, parmi les souris élevées, certaines ont un déficit immunitaire modéré ; ces souris sont utilisées dans des projets d'études des cancers ou de maladies du système nerveux central qui nécessitent d'avoir recours à des greffes de cellules dites "étrangères". Les souris avec une immunodéficience modérée ne rejettent pas les cellules étrangères greffées. Le projet consiste à mettre en place des conditions environnementales adaptées pour héberger des souris présentant une immunodéficience et empêcher que l'immunodéficience ne conduisent à un état de mal-être. L'objectif du projet est donc d'empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable" dans le respect des 3R.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : la réduction du nombre d'animaux élevés par maitrise du statut sanitaire et le raffinement des conditions d'hébergement permettant de minimiser au maximum les situations de mal être des souris hébergées.
Procédures
Aucune intervention prévue sur les animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable prévus sur les animaux dans les conditions d’hébergement mises en place dans le projet.
Devenir
La plupart des animaux (2700) seront réutilisés dans des projets scientifiques en cancérologie ou étudiant des maladies du système nerveux central. Les animaux reproducteurs seront mis à mort après 6 mois d'âge (300). Les animaux sentinelles pour la gestion sanitaire de l'animalerie seront mis à mort après obtention des résultats des contrôles sanitaires soit entre 4 et 5 mois d'âge (320).
Remplacement
Les animaux hébergés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe à ce jour aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Les animaux sentinelles étaient initialement utilisés dans l'ensemble de l'animalerie pour surveiller le statut sanitaire ; nous les utilisons maintenant uniquement dans la zone d'élevage où les animaux sont particulièrement fragiles. Pour les élevages, l'utilisation d'animaux sentinelles est considérée comme le moyen le plus efficace de repérer des agents infectieux.
Réduction
La mise en œuvre de conditions d'hébergement limitant la contamination des souris immunodéficientes par des micro-organismes permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en limitant les infections qui pourraient avoir un impact sur la viabilité de ces souris. De plus, pour les lignées en élevage sur site, la stratégie d’accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter également la production d'animaux surnuméraires. L'utilisation des animaux sentinelles permet de contrôler la qualité du statut sanitaire et la bonne santé de l'ensemble des animaux dans la zone d'élevage ; les animaux sentinelles contribuent ainsi à une meilleure maitrise du nombre d'animaux élevés sur site.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'hébergement passe par un hébergement en cage ventilée avec filtration de l'air sur filtre à haute efficacité de filtration pour exclure toute contamination dans l'air entrant et sortant cage à cage ; l'air de la zone d'élevage étant lui-même filtré et renouvelé à haute fréquence. Cette approche est couplée à une décontamination/stérilisation de l'ensemble des matériels pouvant être au contact des animaux (matériels d'hébergement, aliments, litière, matériel d'enrichissement, eau de boisson...etc): décontamination thermique,chimique, par irradiation aux rayons gamma ou par ultrafiltration avec stérilisation aux ultra-violets pour l'eau d'abreuvement. Enfin, le port d'équipements de protection individuelle pour les manipulateurs permet également de renforcer la barrière sanitaire mise en oeuvre pour éviter une contamination de l'animalerie et l'apparition de situations de mal-être chez les souris immunodéficientes en particulier. Le suivi des animaux est réalisé quotidiennement par des personnels expérimentés formé à l’utilisation d’un outil développé par le centre national 3R en Angleterre : l’échelle de la grimace de la souris qui permet d’identifier la douleur de façon précoce. Cette échelle est basée sur l’observation fine des yeux, du nez, des joues, des oreilles et des moustaches avec 3 niveaux d’expression. Les expressions faciales s’intensifient en réponse à une douleur, et peuvent être utilisées comme un élément de l’évaluation clinique. Des critères stricts et précoces de prise en charge de la douleur ont été définis.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisés dans notre l'animalerie. Pour les animaux élevés sur site, ils sont transférés aux laboratoires pour une inclusion dans les projets de recherche à l'âge adulte soit entre 2 et 3 mois. Pour les animaux non élevés sur site, les animaux arrivent en provenance d'élevages agréés juste après leur sevrage. Pour les animaux sentinelles, ils sont remplacés à l'âge de 5 mois par des animaux dits "naifs". Le délai de 4 mois au sein de notre animalerie est un compromis pour repérer rapidement des contaminations récentes tout en utilisant un minimum d'animaux.
Développement d’une thérapie combinatoire basée sur l’injection d’exosome et d’IL-2 dans un modèle murin de brûlure radiologique musculo-cutanée
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester un traitement des brûlures par irradiation, 3 108 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 2 528 d'entre elles et léger pour 580, toutes tuées à l'issue. Leur membre inférieur est irradié pendant vingt-cinq minutes sous anesthésie, ce qui provoque une lésion du muscle et de la peau, puis elles reçoivent jusqu'à sept injections et subissent jusqu'à onze analyses fonctionnelles du muscle de trente minutes chacune. Le porteur indique que certaines souris pourront avoir des difficultés à se déplacer et présenter un dos rond, une piloérection ou un amaigrissement. Sur le raffinement, il annonce un suivi quotidien et une mise à mort anticipée en cas de signes de souffrance, sans décrire d'analgésie ni de soin de la lésion.
Objectifs
Le but du projet est de proposer un traitement des brûlures radiologiques par des approches de médecine alternative basée sur l’injection des vésicules issues de cellules souches mésenchymateuses améliorant la création de nouveaux vaisseaux et cicatrisation cutanée et d’une protéine pour favoriser la régénération musculaire afin d’obtenir un effet combiné des deux produits.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est de contribuer à la proposition d’une nouvelle approche thérapeutique innovante, qui pourrait permettre la prise en charge d’un grand nombre de patients avec une amélioration de leur qualité de vie.
Procédures
Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie avant euthanasie : environ 30 secondes Irradiation du membre inférieur sous anesthésie (1 fois) : 25 min Injection intra-musculaire sous anesthésie (max 4 injections i.m.) : environ 1 min par injection Injection i.p. sous anesthésie (max 3 injections i.p.) : environ 1 min par injection Analyse musculaire fonctionnelle (11 fois au max) : sous anesthésie, environ 30 min par test
Impact sur les animaux
Après irradiation, un animal va développer une lésion musculo-cutanée localisée au site d’irradiation. Il est possible que certains animaux aient des difficultés à se déplacer et aient une apparence extérieure modifiée telle que piloérection, dos rond ou amaigri Après injection musculaire, l’animal peut présenter transitoirement une patte gonflée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements pour les analyses nécessaires.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent d’évaluer le réseau vasculaire ni la régénération musculaire. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les conditions d’expérimentation animal présentent une certaine variabilité de réponse. De plus, le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticien déterminent qu’un nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque condition expérimentale est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Un suivi des animaux quotidien sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. Si un animal présente des signes de souffrance son euthanasie anticipée sera réalisée.
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.
Etudes de toxicologie rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 20000
40 000 animaux non-humains, 20 000 souris et 20 000 rats, vont être utilisés et tous tués pour analyse histopathologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament, un vaccin ou un produit chimique par voie orale ou par injection, chaque jour ou chaque semaine, sur des études pouvant durer un, trois ou douze mois, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine, des prises de sang en tube de contention sur animal vigile, une mise à jeun et jusqu'à seize heures en cage à diurèse. Le porteur retient comme effets attendus l'inconfort, le stress, la douleur transitoire et la perte de poids, et parle de "sacrifices" pour désigner les mises à mort intermédiaires. Il indique que ces essais répondent à une exigence réglementaire et affirme qu'il n'existe pas encore de méthode in vitro pour certains effets, en raison de la complexité des organismes vivants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent lors de plusieurs phases du développement (précocément pour les études préliminaires, en prérequis avant tout essai clinique chez l’Homme pour les études subchroniques, ou dans les dernières étapes du développement d’un médicament avant sa mise sur le marché pour les études chroniques). Ces études permettent l’évaluation du risque pour l’Homme ou l’animal, en fournissant des informations sur les organes cibles et sur les effets toxiques majeurs, en déterminant notamment une dose sans effet adverse intégrée dans les critères de marge de sécurité pour l’utilisation ou l’exposition humaine ou pour un usage vétérinaire.
Bénéfices attendus
Le nombre minimal d’animaux par groupe et ou/sexe suit les recommandations des lignes directrices dans le but de garantir suffisamment d’animaux pour permettre la détection des signes de toxicité au début des premiers essais chez l’Homme ou l’animal). Ces effectifs minimums sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques [tests de normalité variance , comparaison de moyennes par exemple] afin d'interpréter les résultats. L'ensemble des études du projet vise à identifier la tolérance locale des produits, une toxicité d'organe, un potentiel clastogène et aneugène d'une substance, un profil métabolique et pharmacocinétique, et/ou des seuils de toxicité (dose maximale tolérée, dose sans effet...) permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique), la sécurité d’utilisateurs (industrie chimique) ou le bénéfice pour l’animal (industrie vétérinaire).
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3, ou 12 mois pour les études règlementaires]. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.
Devenir
Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments/produits chimiques selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène...) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout isolement d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.
Choix des espèces
Au-delà des aspects pratiques (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent cité car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou connue pour plus de sensibilité à certaines molécules) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’Homme (exemple paramètres immunologiques), le Hamster pour son métabolisme, le cobaye pour la voie dermale ou pour paramètres immunologiques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.
Thérapie cellulaire dans la gestion du diabète et de ses complications
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 232
Rendus diabétiques par une injection unique puis greffés d'îlots pancréatiques sous anesthésie, 232 souris et 232 rats sont tous tués pour des prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ une heure suivie d'une semaine d'isolement, des tests de tolérance au glucose avec jusqu'à dix prélèvements sanguins sur trois à six heures, des prises de sang jusqu'à trois fois par semaine pendant six mois, et une évaluation de la neuropathie par stimulation tactile et thermique des pattes. Alors que la gravité déclarée est sévère, le porteur ne décrit que des "effets indésirables légers", perte de poids, épisodes d'hypoglycémie, jeûne de seize heures et stress lié aux administrations. Il affirme que les modèles animaux "restent indispensables" pour valider la tolérance et l'efficacité du dispositif chez l'humain.
Objectifs
Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires, (4) à un stress lié à l'administration de substance. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).
Devenir
Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.
Etude systémique entre les os et les reins, par analyses morphologiques et fonctionnelles, après une exposition chronique à faible dose d’uranium chez des souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de l'uranium dans leur eau de boisson pendant six mois, passent jusqu'à seize heures seules en cage à métabolisme pour le recueil des urines et des fèces, et subissent des échographies doppler de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever le sang, les reins et les os. Le projet dispose déjà de sphéroïdes, d'organoïdes rénaux et de modèles osseux biomimétiques, et le porteur indique que les souris servent d'abord à évaluer la robustesse de ces modèles sans animaux, puis à observer la relation entre os et rein qu'il juge irréalisable in vitro. Il présente la mutualisation des prélèvements entre partenaires du projet comme sa mesure de réduction.
Objectifs
L’uranium est un métal lourd radioactif naturellement présent dans l’environnement. Du fait de cette présence naturelle mais également de ses propriétés de radioéléments il est utilisé par l’Homme pour diverses applications civiles et militaires. La population générale peut y être exposée par ingestion d’eau de boisson et/ou d’aliments contaminés. Diverses études épidémiologiques et expérimentales ont auparavant montré qu’une exposition environnementale, ou professionnelle à l’uranium peut induire des effets délétères sur les reins et les os connues comme étant les organes cibles de la toxicité aiguë de ce radioélément. Cependant d’importantes lacunes subsistent sur la compréhension des mécanismes à l’origine de cette toxicité ; de plus l’impact de cette toxicité sur la relation qui existe entre ces deux organes est très peu documenté - notamment dans le cadre d’une exposition chronique à faible dose qui correspond au risque d’exposition professionnelle ou de la population générale. Le présent projet permettra de comprendre les réponses biologiques et biochimiques existantes après une exposition chronique à de faible dose d’uranium au niveau des reins et des os ainsi qu’entre ces deux organes qui possèdent une relation physiologique importante. Le projet s’appuiera sur un modèle in vivo de souris non modifiées génétiquement qui a déjà prouvé être un modèle pertinent lors de précédentes études de toxicologie rénale. De plus, afin de limiter l’utilisation d’organismes vivants, le projet s’appuiera également sur différents modèles cellulaires 3D innovants (osseux et rénaux). Ils permettront d’évaluer en amont les mécanismes toxicologiques mis en jeu au cours d’une exposition chronique à faibles doses d’uranium. Les mécanismes et les voies cellulaires altérées au cours des études de toxicologie cellulaire seront par la suite analysés plus finement à l’aide du modèle in vivo dont il est fait mention. L’étude de ces réponses et de ces interactions physiologiques sera effectuée en collaboration avec des spécialistes du tissu osseux ainsi que des spécialistes des interactions protéines-ligands.
Bénéfices attendus
A court terme ce projet a pour objectif de mieux comprendre le comportement et le devenir de l’uranium (séparation en différence espèce chimique, interaction, distribution spatiale) dans les compartiments intra et extra-cellulaires des différents modèles osseux et rénaux chez l’animal, d’identifier les voies de signalisations cellulaires impactées, et différents biomarqueurs au sein et entre ces deux organes après une exposition chronique à faible dose. A plus long terme, ce projet a pour objectif de permettre une meilleure compréhension et une meilleure prise en charge des risques pour les populations et la santé humaine à la suite d’une contamination interne aux radionucléides.
Procédures
L’exposition par eau de boisson sera faite avec une surveillance du poids des biberons et du poids des animaux ; il n’est pas attendu de nuisance importante par rapport à l’exposition en cohérence avec les précédentes études publiées ; l’exposition interne à l’uranium doit conduire à une irradiation dans le domaine des faibles doses. Les animaux seront hébergés pendant un maximum de 16 heures individuellement en cage à métabolisme à 2 mois et/ou, 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Les analyses échographiques sont non-invasives et effectuées sous anesthésie : l’échographie aura lieu sous anesthésie légère pendant 30 à 45 minutes sous monitoring cardiaque et respiratoire. Elles seront réalisées avant l’exposition et à 2 mois et/ou 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Un prélèvement de sang est réalisé sur animal anesthésié juste avant son euthanasie de l’animal (2 min).
Impact sur les animaux
L’étude est susceptible de provoquer un léger stress chez les animaux qui seront amenés à être manipulé notamment lors du passage en cage spécifique pour la collecte d’urines et de fèces ; ainsi que pour le suivi par échographie doppler qui nécessitera une anesthésie préalable.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés avant d’être mis à mort à la fin de l’exposition pour prélèvement terminaux (sang, reins, os) qui seront par la suite utilisés à des fins histologiques (marquages des tissus pour localisation de biomarqueurs cibles au sein des tissus), ainsi qu’en biochimie et biologie moléculaire (expression de gènes cibles, quantification de protéines et de marqueurs d’atteintes toxicologiques/pathologiques).
Remplacement
Le projet comprend l’utilisation de modèles cellulaires innovants dont des sphéroïdes et organoïdes rénaux ainsi que des modèles osseux biomimétiques qui permettront d’évaluer une réponse toxicologique et de mettre en avant des voies de signalisation propres à l’organe d’intérêt du modèle utilisé (reins ou os). L’utilisation d’animaux au sein de ce projet permettra dans un premier temps d’évaluer la robustesse du développement de nos nouveaux modèles 3D (application des principes de remplacement) ; mais également d’analyser les réponses biologiques et biochimiques à l’uranium au niveau systémique et donc d’intégrer les relations hormonales existantes entre les os et le rein ce qui n’est pas réalisable à l’heure actuelle avec des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide de calcul statistique afin d’aboutir à un effectif minimal qui permettra un traitement des données statistiques à la suite de la procédure expérimentale. Les souris euthanasiées permettront de fournir des échantillons biologiques de façon mutualisées (os, reins, fluides biologiques etc) pour tous les partenaires impliqués dans le projet et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés si les études in vivo avaient été divisés entre les partenaires du projet.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe maximum de 5, avec un enrichissement supplémentaire (ouates, maisons…) comme mesure de raffinement. L’isolement pourra être fait uniquement en cas d’agression entre congénères. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Les points d’arrêt définis dans le projet seront appliqués à tous les animaux de l’étude présentant des signes comportementaux ou cliniques d’atteinte et conduiront à la mise à mort anticipée de l’animal (application du principe de raffinement).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est un modèle bien décrit dans la littérature. De plus les précédentes études sur la physiopathologie rénale effectuées au laboratoire après exposition interne à l’uranium ont permis à l’équipe porteuse des procédures d’expérimentation animale d’acquérir une expertise sur ce modèle de souris. Les animaux seront des adultes de 6-8 semaines au moment du début de l’exposition chronique. A cet âge, la physiologie rénale et osseuse est mature. Les animaux seront hébergés et mis en groupe à l’âge de 5 semaines afin de limiter les agressions entre congénères.