Recherche appliquée

Pour mesurer l'effet de pesticides alimentaires sur le métabolisme, 256 souris sont utilisées pendant vingt-six semaines dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les organes. Nourries avec un régime riche en graisse contenant des pesticides seuls ou en mélange, elles développent une obésité, un diabète et une accumulation de graisse dans le foie. Le porteur décrit ces perturbations comme survenant "sans souffrance visible des animaux", et retient parmi les nuisances le stress de contention, les piqûres, les gavages et l'isolement de vingt-quatre heures en cage à urines. Le lien entre pesticides et troubles métaboliques a déjà été rapporté chez l'humain par la cohorte NutriNet-Santé, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit le dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux.

Objectifs

L’incidence des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2 et stéatose hépatique) a augmenté ces 30 dernières années et constitue un enjeu majeur de santé publique. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation riche en lipides), de nombreuses études appuient l’hypothèse que l’exposition à des contaminants environnementaux, tels que les pesticides, est un facteur de risque au développement de ces pathologies. Dans ce projet nous travaillerons sur un modèle murin d’exposition alimentaire aux pesticides pour mimer l’exposition des consommateurs. Les animaux seront exposés à des pesticides seuls ou en mélange à des doses non toxiques telles qu’elles sont définies par les agences réglementaires, dans des conditions d’alimentation équilibrée ou déséquilibrée (riche en graisse). Nous suivrons les marqueurs caractéristiques des pathologies hépatiques non alcooliques, du diabète et de l'obésité tout au long de l’expérience qui durera 26 semaines.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire aux pesticides seuls ou en cocktail dans un contexte d’alimentation équilibrée ou d’alimentation déséquilibrée source de troubles métaboliques. Ce projet apportera des arguments en faveur ou non du lien entre exposition aux pesticides et le risque de développer des pathologies métaboliques rapporté dans des études récentes réalisées dans la cohorte Française Nutrinet santé.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime contrôle ou un régime riche en graisse contenant les pesticides. Au cours des 26 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests pour évaluer la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour ces tests, le glucose et l’insuline seront administrés après 6h de jeûne. Les gestes de contention et de gavage dureront moins de 30 secondes par animal. Pour les mesures de taux de glucose sanguin (glycémie), le prélèvement d’une seule goutte de sang sera réalisé à la queue. Ces tests seront réalisés en alternance et espacés au minimum d'une semaine, et réalisé seulement 2 fois au cours des 26 semaines. Des prélèvements intermédiaires de sang qui prennent environ 15 secondes, pourront aussi être réalisés. Les animaux seront placés individuellement pendant 24h dans des cages adaptées à la récolte des urines. Avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la joue.

Impact sur les animaux

Le régime utilisé dans cette expérience est riche en graisse. Il induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées comme un diabète, une accumulation de graisse dans le foie, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le prélèvement sanguin et l’administration de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, à la piqûre, bien que légère, au gavage, bien que très rapide, ainsi qu’une légère douleur (piqûre). L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine peut entraîner un stress de l’animal.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires). En effet, la stéatose hépatique non alcoolique est caractérisée par une accumulation de lipides dans le foie qui viennent majoritairement du tissu adipeux ; de plus le microbiote intestinal joue un rôle prépondérant dans son développement et sa progression.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur des études similaires précédentes et en respectant la règle des 3R. Le nombre idéal d’animaux par groupe est donc de 16, et avec un total de 256 animaux.

Raffinement

Comme il est convenu réglementairement, les animaux seront hébergés dans des cages de 4 à 5 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. En ce qui concerne les cages à métabolisme, les souris disposeront également d'un abri en inox. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme respiratoire) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal, une absence totale et pérenne des 5 signes indiqués, ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition de la MASLD. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques.

Réutilisés pour 2 000 d'entre eux dans d'autres projets, tués pour les autres afin de prélever leurs organes, 3 000 souris et 3 000 rats sont soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des substances jusqu'à trois fois par jour pendant cinq jours, subissent l'insertion d'une bille dans la partie terminale du colon, une privation de nourriture jusqu'à vingt-quatre heures sur grille et un hébergement individuel sur sol grillagé pour que soient comptés et pesés leurs excréments. Une partie reçoit une substance qui provoque artificiellement une diarrhée ou une constipation, afin de tester si un candidat médicament la corrige. Le porteur qualifie ces atteintes de gêne ou d'inconfort, et affirme que les modèles animaux "restent plus adaptés" que les tests in vitro pour évaluer la motilité intestinale humaine.

Objectifs

Les troubles gastrointestinaux constituent un large éventail de pathologies qui affectent l’appareil digestif depuis la cavité buccale jusqu’au rectum affectant plus de 40 % de personnes dans le monde. La diarrhée et la constipation sont les principaux symptômes des troubles de la motilité intestinale. Ils sont associés à un certain nombre de maladies chroniques (tel le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l’intestin) ou à la médication. La constipation est définie par une diminution de la fréquence des selles associée à une difficulté pour les évacuer et se caractérise par un ralentissement du transit et une déshydratation des selles. A l’inverse, la diarrhée est une émission de selles fréquentes, abondantes et de consistance très molle à liquide. Ces troubles sont associés à une morbidité accrue, à un inconfort, à la perte de productivité au travail et à la consommation de ressources médicales. Le présent projet consiste à évaluer d’une part l’effet des substances sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces) et d’autre part le potentiel effet à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives lors de l’évaluation clinique de nouveaux candidats médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament.

Bénéfices attendus

Ces études ont pour objectifs d’évaluer l’efficacité de potentiel nouveaux candidats médicaments à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives et d’autre part évaluer leurs potentiels effets indésirables sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces).

Procédures

Les substances d'essais sont administrées par bolus durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées ( 3 fois par jours au maximum) pendant plusieurs jours (maximum 5 jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont mis à jeun sur grille pour une période n’excédant pas 24h (test compris). L’effet des substances sur le transit du colon est évalué soit après insertion d’une bille dans la partie distale du colon (durée de quelques minutes) ou après évaluation du nombre et de la consistance des fèces récupérées aprés hébergement inviduel des animaux sur sol grillagé (6 h maximum). Dans certains cas, les animaux peuvent recevoir une substance réactive ralentissant artificiellement le transit clonique (administration unique , durant quelques secondes). L’effet reverse des substances sur la diarrhée ou la constipation est évaluée après administration unique ou répétée (2 fois par jours au maximum / durée de quelque seconde) d’une substance réactive induisant la diarrhée ou constipation. Pour les modèles de constipation la prise de poids et la consommation d'eau et de nourriture sont monitorées au cours de l'étude nécessitant un hébergement individuel des animaux pendant au maximum 24h. Enfin, des prélèvements de sang (8 maximum) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire : un stress lié à la privation de nourriture temporaire (pour une durée n’excédant 24 h),à un hébergement individuel (pour une durée n’excédant 24 h), à une gêne ou un inconfort lié à l’induction des modèles symptomatiques de diarrhée ou de constipation, ou à une incommodité lors de l’insertion de la bille dans la partie distale du colon. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, des points limites clairement établis permettraient de sortir l'animal de l'étude.

Devenir

Dans le cas où des prélèvements terminaux d'organes (estomac, intestin...) sont obligatoires, les animaux ne pourront pas être maintenus en vie à la fin de l'étude et seront donc euthanasiés. Dans le cas contraire, (i.e; prélèvements terminaux d'organes non nécessaires pour atteindre les objetifs de l'étude) les animaux seront réutilisés dans un autre projet pour évaluer l'impact de la substance sur le transit intestinal par exemple.

Remplacement

De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne représentent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central et le système endocrinien. Ainsi, les modèles animaux, restent plus adaptés pour évaluer l'effet global des médicaments sur la motilité intestinale pour le développement de nouvelle thérapie et pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) présentent une motilité intestinale similaire à celle de l'Homme et réagissent de la même manière aux substances dont les effets prokinetique ou ralentisseur du transit sont connus. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage, car les substances testées dans ce projet sont principalement destinées pour l'Homme adulte).

Pour étudier le rôle d'une cytokine dans le vitiligo, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements. Elles reçoivent sous la peau du flanc des cellules de mélanome qui déclenchent une réaction auto-immune, puis des injections d'anticorps neutralisants, une résection chirurgicale de la greffe au douzième jour, et des séances répétées d'anesthésie gazeuse pour être pesées, mesurées et photographiées pendant plusieurs mois. Le porteur écrit que le protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris, chiffre supérieur aux 400 déclarées dans les gravités attendues. Sur le remplacement, il indique que les cibles ont été identifiées par des travaux in vitro et in silico, et affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend "nécessaire" le recours aux expériences in vivo.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.

Gavés deux fois par jour pendant cinq jours avec un candidat médicament déjà reconnu cardiotoxique, 8 chiens beagles sont tués à l'issue pour l'examen de leur cœur, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit quatorze prises de sang, une surveillance télémétrique continue et des interventions de nuit, le porteur annonçant une accélération du rythme cardiaque, une prostration possible, des vomissements et une hypersalivation. La cardiotoxicité avait déjà été observée chez le chien lors d'une étude précédente, ce projet servant à la confirmer et à tester un agent censé l'atténuer. Le porteur indique que les résultats décideront de la poursuite du développement du candidat médicament.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur le cœur d’une dose d'un candidat médicament ayant montré dans une précédente étude une cardiotoxicité, et en parallèle d’investiguer un possible mécanisme d’action et de mitigation pour le futur développement du candidat médicament. Pour cela, 2 groupes d’animaux recevront la même dose de candidat médicament avec ou sans un traitement préalable avec un agent mitigateur. Les résultats de ce projet permettront de décider la poursuite du développement du candidat médicament et le cas échéant les modalités de ce développement.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de permettre de confirmer ou non la cardiotoxicité d’un candidat médicament et, dans le cas de cardiotoxicité, de potentiellement identifier un mécanisme d’action avec un moyen pharmacologique de mitigation, afin d'en poursuivre le développement. A plus long terme, le bénéfice pour la santé humaine serait le possible développement d’un candidat médicament. Il est à noter qu'il est attendu que ce futur produit (antibiotique) combatte un problème infectieux et de santé publique mondial pour lequel aucun médicament actuellement disponible n'est efficace sans générer de résistance.

Procédures

Pour chaque animal inclus dans le projet, une administration biquotidienne par voie orale (environ 30 secondes par administration) sera réalisée sur animal vigile pendant 5 jours consécutifs pour le candidat médicament avec une administration quotidienne par voie orale pour l’agent mitigateur ou son contrôle négatif. Également chaque animal subira des prélèvements de sang vigile (quelques secondes par prélèvement) tout au long du projet (14 prélèvements au total répartis sur 5 journées). Enfin chaque animal sera anesthésié une fois avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets ou effets indésirables prévus sur les animaux sont : - Stress, inconfort ou douleur brève, lors des procédures d’administration par voie orale (gavage), de prélèvement de sang - stress, inconfort lors d’intervention ponctuelle pendant la phase nuit pour surveillance des animaux, administration et/ou prélèvements sanguins - effets indésirables potentiellement attendus et liés à l’administration candidat médicament (liste non exhaustive) : inconfort liée à l’augmentation de la fréquence cardiaque, activité diminuée à prostration/abattement, vomissements et/ou hypersalivation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de permettre l’évaluation histopathologique du tissu cardiaque.

Remplacement

Le projet visant à évaluer une possible cardiotoxicité chez le chien après administration répétée sur 5 jours consécutifs par voie orale et d’investiguer un possible mécanisme d’action pour la cardiotoxicité par l’ajout d’un possible agent mitigateur, il ne peut pas être réalisé in vitro ou ex vivo car les interactions complexes et la régulation du système cardiovasculaire ne peuvent s’exprimer que chez un animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé comme étant le minimum nécessaire (4 par groupe ; total de 8) pour obtenir une puissance statistique satisfaisante et une pertinence biologique des résultats en limitant l’effet des variations individuelles afin de permettre de conclure sur la cardiotoxicité de manière fiable.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés dans des conditions environnementales adaptés à l’espèce (groupes sociaux, jouets, période d’exercice quotidienne, …). Pour les actes contraignants pour l’animal (administration par voie orale, prélèvements de sang) une habituation des animaux à la manipulation est mise en place avec distribution de récompense. En relation avec les signes cliniques potentiellement attendus et liés à l’administration candidat médicament, un suivi clinique continu (observations cliniques, suivi en temps réel de la fréquence cardiaque) avec un monitoring vidéo pendant toute la durée de la période de traitement sera mis en place afin d’identifier au plus tôt l’apparition des signes cliniques liés à la cardiotoxicité. Ce suivi permettra de prévenir le vétérinaire au plus tôt. De plus des points limites spécifiques sont définis pour décider de l’euthanasie des animaux afin de réduire au minimum les nuisances sur leur bien-être.

Choix des espèces

Le chien beagle a été choisi pour ce projet car c’est une des espèces acceptées par les instances réglementaires pour l’évaluation préclinique des médicaments. De plus le candidat médicament a été associé à des lésions histologiques au niveau du myocarde et des vaisseaux sanguins dans une étude précédente réalisée sur le chien. Cette étude est à l’origine de la conduite du projet. Jeunes adultes afin de reproduire les conditions de l’étude précédente dans laquelle la cardiotoxicité a été observée

1 704 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen espacées de 48 heures, vivent seuls pendant cinq à seize semaines et subissent un prélèvement de sang dans l'artère mésentérique avant la mise à mort. Le porteur indique que l'irradiation peut toucher l'intestin grêle et provoquer des signes cliniques irréversibles, amaigrissement et gonflement de l'abdomen, et que le régime cétogène testé entraîne une forte perte de poids puis de fortes carences. L'hébergement individuel imposé à des animaux sociaux pendant plusieurs mois figure parmi les procédures, quand la rubrique raffinement met en avant un tunnel et une étagère.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le bénéfice thérapeutique de différents régimes alimentaires sur la toxicité digestive radio-induite. Plus précisément, ce projet visera à démontrer, via l’utilisation de régimes alimentaires renforçant ou fragilisant l’homéostasie au sein de l’écosystème colique, qu’après irradiation, la dégradation des relations de symbiose entre le système immunitaire de l’hôte et le microbiote, joue un rôle important dans les lésions digestives et notamment dans celles de l’épithélium colique. Ce travail revêt un intérêt majeur pour réduire la prévalence de patients souffrant de « Pelvic Radiation Disease » (PRD) ou améliorer leur prise en charge. La PRD est une maladie de certains patients bénéficiant d’une radiothérapie pelvienne et souffrent de complications gastrointestinales.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche scientifique vise à apporter des bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites du côlon dans un contexte de complications gastrointestinales après une radiothérapie pelvienne. Cela passe en premier lieu par une meilleur compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites. Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites de l’épithélium colique. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, et son évolution, ici interactions entre microbiote et système inflammatoire de l’hôte au sein de l’écosystème colique. Cette étude pourrait permettre d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques personnalisées basées sur l’alimentation (facilement applicable en clinique, prescrit par un nutritionniste), qui en renforçant de façon préventive l’intégrité de la barrière épithéliale colique permettraient de réduire la toxicité digestive au cours de la radiothérapie pelvienne, d’augmenter la tolérance au traitement antitumoral et ainsi d’optimiser son efficacité tout en préservant la qualité de vie des patients. D’un point de vue fondamental, la partie mécanistique de cette étude viserait à proposer une signature du microbiote, comme prédictifs des lésions radio-induites du côlon (i.e., « biomarqueur »), mais aussi de nouvelles cibles thérapeutiques sur la base d’une modulation des interactions hôte/microbiote et enfin pourrait appuyer le passage de l’étude expérimentale vers un transfert clinique éventuel.

Procédures

- Hébergement individuel pendant toute la durée de l’étude (min 5 semaines, i.e., pour la majorité des protocoles et max 12 à 16 semaines (dépendant de la longueur du régime alimentaire) pour 3 expériences potentielles et impliquant 432 rats maximum au total - Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Prélèvement de fèces de façon hebdomadaire pendant tout le temps de l’expérimentation. Ce prélèvement sera effectué au moment de la pesée de l’animal (réduction de la fréquence de manipulation des animaux et de leur stress). - Prélèvement de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les deux modèles d’irradiation localisée du côlon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. Les régimes alimentaires pourraient favoriser des modifications de la masse graisseuse des animaux entraînant une variation de leur métabolisme. Le régime alimentaire dit « occidental » sera celui qui pourrait le plus induire d’effets néfastes (prise de poids, réduction de la mobilité, troubles métaboliques). Une attention particulière sera également portée à la suite du régime cétogène et notamment durant les 3 premières semaines de prise (perte de poids importante pendant cette période et période latence de l’efficacité de ce régime sur la santé). A long terme ce régime nécessitera des compléments alimentaires car il induit de fortes carences. Il est possible que les animaux sous ces deux régimes alimentaires présentent des signes cliniques et comportementaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Dans le but d’évaluer les bénéfices thérapeutiques de certains régimes alimentaires sur la sphère digestive après exposition aux rayonnements et particulièrement pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo. Il n'existe pas de test in vitro substitutif permettant de répondre aux questions soulevées dans ce projet. Le bénéfice thérapeutique d’un traitement passe par une action multiple au sein de l’organe d’intérêt, en agissant sur différents systèmes de cet organe, ici écosystème colique i.e., microbiote et hôte (système immunitaire, la barrière épithéliale mais aussi le micro-environnement, le système nerveux…). Seul un modèle animal intégré permet de façon pertinente de tester une telle efficacité, ici celle de différents régimes alimentaires sur la fonction de barrière du côlon.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 8 à 12 individus selon le paramètre analysé. Pour certaines parties de l’étude, 2 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de reproduire un effet observé (2x6 animaux par expérience et par groupe). A minima, une analyse statistique sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). Les animaux seront pesés toutes les semaines. De plus, des dispositifs d'enrichissement (tunnel rouge et cage haute avec étagère) seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.

Choix des espèces

Le modèle rat est approprié dans notre étude et a été validé au laboratoire dans le cadre de l’étude des complications gastro-intestinales radio-induites. Nous utilisons au laboratoire, le modèle d’irradiation localisée au niveau colorectal sur une fenêtre de 2cm/3cm La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. Les lésions obtenues au cours du temps sont histologiquement proches de celles qui ont pu être observées chez des patients ayant bénéficié d’une radiothérapie pour le traitement de tumeurs abdomino-pelvienne. D’autre part, nous avons choisi le rat qui possède l’intégralité de son patrimoine immunitaire nécessaire à la réparation tissulaire. De plus, le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique mais aussi dans le cas plus précis de cette étude pour l’étude des variations fonctionnelles du microbiote, en raison de sa similitude avec l'être humain (par rapport à la souris). Les animaux seront reçus à l’âge de 13 semaines, ceci correspondant au stade adulte qui a été choisi afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Ils seront irradiés à l’âge de 17 semaines minimum soit 4 semaines minimum après leur arrivée et leur accessibilité aux différents régimes alimentaires testés et ce, afin de permettre la modification et la stabilisation du microbiote à la suite du changement alimentaire.