Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Mise en place d’un modèle porcin de greffe utérine en vue de l’ouverture d’un centre de greffe dans le cadre d’un Programme Hospitalier de Recherche Clinique multicentrique national.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
18 truies vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, neuf donneuses tuées lors du prélèvement de l'utérus et neuf receveuses après la greffe, dans des procédures impliquant pour ces dernières un niveau de souffrance sévère. Les receveuses subissent une transplantation d'utérus, la pose d'un cathéter central, des prises de sang, des injections d'immunosuppresseurs et des biopsies, avec un risque déclaré d'hémorragie, d'infection, de rejet et de douleurs postopératoires. Le porteur présente ce modèle comme un prérequis pour qu'un hôpital devienne centre de greffe et pour former plusieurs chirurgiens. Il indique que la technique peut s'acquérir ailleurs mais que cela ne permet pas de former plusieurs praticiens.
Objectifs
L’infertilité utérine absolue, définie comme l’infertilité par absence d’utérus, peut être d’origine congénitale, ou en lien avec une hystérectomie pour cause obstétricale (hémorragie de la délivrance) ou pour cause gynécologique (cancers). Pour les patientes atteintes d’une infertilité utérine absolue, les moyens d’accéder à la parentalité sont limités. La transplantation utérine, qui connait un essor mondial depuis la 1ère naissance d’un enfant vivant en bonne santé issu de cette technique en 2014, apparaitrait comme une solution intéressante dans cette indication. A ce jour plus de 80 transplantation utérine ont été réalisées dans le monde et plus de 40 enfants sont nés. Le greffon est issu d’une donneuse vivante ou d’une donneuse en état de mort encéphalique. En France, 3 greffes utérines ont à ce jour été réalisées à l’Hôpital Foch à Paris, à partir de donneuses vivantes, conduisant à 2 naissances vivantes chez la même patiente. L’objectif global de ce projet est d’acquérir la technique de greffe utérine, par la réalisation de 3 allo-transplantations utérines avec succès, avec réveil et surveillance sur une durée de 3 mois.
Bénéfices attendus
L’objectif à terme est de pouvoir offrir la greffe utérine chez les patientes atteintes d’infertilité utérine absolue.
Procédures
Les animaux vont subir une transplantation utérine, la pose d’une voie centrale avec accès externe pour réaliser des prises de sang (16, une minute), des injections d’immunosuppresseurs (12 fois, 20 secondes). La réévaluation du greffon se fera par échographie Doppler (8 fois, 15 minutes), biopsies d’endomètres de la paroi de l’utérus et prélèvement de fluide utérin sous sédation (3 fois, 30 minutes).
Impact sur les animaux
- Malgré l’utilisation d’un prolongateur un stress peut être ressentit par l’animal lors de l’injection d’anesthésique pour les prémédications. - Per-opératoire : risque de plaie urologique (uretère, vessie), plaie vasculaire avec hémorragie aigue, plaie digestive - Post-opératoire : hémorragie postopératoire, arrêt du transit, douleur, infection post opératoire (pulmonaire, abcès, ou du site opératoire), infection du greffon (en lien avec le traitement immunosuppresseur), rejet aigu ou chronique, stress physique.
Devenir
Mise à mort des 9 donneurs car la technique de prélèvement ne permet pas de les laisser en vie. Mise à mort des 9 receveurs pour prélèvement et études histologiques du greffon.
Remplacement
L’acquisition de la technique de transplantation peut être réalisée dans d’autre centre, ce qui a été réalisé. Cependant, on ne peut pas former plusieurs chirurgiens ainsi et la mise en place d’un modèle de greffe animale est un prérequis pour un hôpital pour devenir centre de greffe.
Réduction
Les chirurgiens se sont entrainés sur cadavres de porcs d’autres projets et la technique a été récupérée chez un autre centre pour éviter la phase de mise au point.
Raffinement
Des points limites généraux et adaptés au modèle permettront l’arrêt de la procédure si nécessaire. La prémédication sera effectuée à l’aide d’un prolongateur, ce qui permet de réaliser une injection intra musculaire sans contention. Les porcs sont hébergés sans caillebotis et avec de la sciure et du foin et sont promenés dans un espace plus grand que leur cage pour leur permettre de courir. Un système de cathéter avec accès externe permettra de réaliser les prélèvements de sang et les injections de produit anti rejet sans aucune douleur pour l’animal. La chirurgie sera effectuée sur animaux anesthésiés et un protocole antidouleur adapté sera administrée pendant et après la chirurgie.
Choix des espèces
Le porc est un modèle couramment utilisé dans le développement de nouvelles techniques chirurgicales en gynécologie, comme l’illustrent le développement de la chirurgie robotique. En effet, la vascularisation pelvienne de la truie similaire à la vascularisation chez la femme. C’est également pour cette raison que cette espèce a été utilisée à plusieurs reprises afin de construire un modèle pré-clinique de transplantation utérine. L’intervention consistant en l’explantation et la transplantation d’un utérus porcin, les animaux donneurs et receveurs devront être matures sexuellement afin d’avoir des organes génitaux suffisamment développés soit ayant plus de 6 mois.
Étude de la production d’anticorps anti-Interleukine-6 (IL-6) chez le chien après immunisation avec un conjugué peptidique spécifique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
6 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés. Ils reçoivent, vigiles, trois injections sous-cutanées d'un vaccin expérimental et neuf prélèvements sanguins de 20 mL sur six mois, pour évaluer la production d'anticorps contre une molécule de l'inflammation en vue d'un traitement de l'arthrose canine. Le porteur indique n'attendre aucune séquelle et un stress léger, ce qui justifie selon lui la réutilisation des animaux. Il précise que la réponse immunitaire ne peut être évaluée in vitro et que le chien est l'espèce cible du vaccin.
Objectifs
L’arthrose est une maladie courante chez le chien, touchant différentes articulations et ayant un impact significatif. Près de 20% des chiens souffrent d’arthrose. Les traitements actuels se concentrent sur le soulagement des symptômes à l’aide d’analgésiques et d’infiltrations. Malheureusement, comme chez l’Homme, la maladie tend à s’aggraver avec le temps. L’immunothérapie active propose une approche alternative en induisant la production d’anticorps contre des protéines du « Soi ». Pour ce faire, des peptides (petites protéines), qui font partie du « Soi » et donc n’induisent pas de réponse immunitaire initialement, sont couplés à une protéine porteuse étrangère. En vaccinant ainsi contre les molécules responsables de l’inflammation, on peut espérer soulager l’animal durablement. L’objectif de cette étude est de confirmer la bonne tolérance et d’évaluer la réponse immunitaire suite à l’utilisation de cette stratégie de vaccination chez le chien, déjà testée avec succès chez la souris et le lapin, en amont d'un essai clinique vétérinaire. Deux groupes de trois chiens seront l’objet d’immunisations avec le vaccin par voie sous-cutanée et la production d’anticorps sera évaluée au fil du temps. Des tests in vitro seront également réalisés pour confirmer la capacité des anticorps à neutraliser leur cible.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir des données de tolérance et d'immunogénicité sur deux doses différentes, indispensables à la préparation d'un essai clinique vétérinaire sur des chiens de compagnie atteints d'arthrose. En effet, l’arthrose est une affection prévalente chez les chiens, touchant différentes articulations et ayant une incidence significative. Selon plusieurs études, l’arthrose concerne 20% des chiens et est la cause la plus fréquente de douleur chronique chez le chien. De plus, des chiens plus jeunes peuvent également développer de l’arthrose en raison de contraintes articulaires intenses, comme c’est le cas chez les chiens de course. Les articulations les plus couramment touchées chez les chiens sont celles des membres, du rachis ou encore du bassin. Comme chez l’Homme, les traitements reposent sur le traitement des symptômes avec l’utilisation d’analgésiques et des infiltrations. Malheureusement, bien que les traitements visent à atténuer la douleur et à ralentir la progression de la maladie, il est important de noter que l’arthrose chez le chien tend à s’aggraver au fil du temps. De plus, l’administration d’anti-inflammatoires aux chiens est liée à de nombreux effets indésirables tels que des hémorragies gastro-intestinales et des lésions rénales et la gestion de ces effets indésirables demeure difficile. L’approche thérapeutique testée ici consiste à inciter l’organisme hôte à produire son propre traitement en stimulant une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre la cible impliquée dans l’arthrose et la douleur associée.
Procédures
Trois injections sous-cutanées seront effectuées sur chacun des chiens vigiles, espacées d’un mois puis de 3 mois. La durée de la manipulation des animaux est estimée à 5 minutes environ. Neuf prélèvements sanguins de 20 mL seront également réalisés sur chacun des chiens vigiles et étalés sur 6 mois, avec un intervalle entre chaque prélèvement d’au moins 14 jours. La durée de la manipulation des animaux est estimée à 5 minutes environ.
Impact sur les animaux
Lors d’essais réalisés sur les souris, les lapins, les singes et l’Homme, aucun effet indésirable grave n’a été observé. Cependant, une induration au point d’injection du conjugué a été observée chez certains patients ainsi que chez les singes, de façon transitoire (Desallais et al. 2016). Un tel phénomène pourrait être observé chez les chiens de cette étude. Les chiens seront également soumis à 9 prélèvements sanguins ce qui peut constituer une source de stress.
Devenir
Nous ne nous attendons pas à ce que ce projet induise de séquelles sur les animaux et le stress lié à la procédure est léger. Il n’y a donc pas de contre-indication a priori à la réutilisation de ces animaux.
Remplacement
Nous souhaitons développer un vaccin qui, à terme, pourrait traiter l’arthrose inflammatoire chez le chien. Après avoir testé l’immunogénicité du conjugué et la capacité neutralisante des anticorps chez la souris et le lapin, il est nécessaire de déterminer la dose optimale de conjugué à utiliser chez le chien ainsi que de valider le schéma vaccinal avant de réaliser un essai clinique plus large sur des chiens souffrant d’arthrose. La réponse immunitaire induite par le vaccin chez le chien, cible du vaccin, ne peut pas être évaluée in vitro.
Réduction
Deux études préliminaires ont été réalisées chez la souris et le lapin afin d’encadrer la dose optimale à injecter pour induire une production d’anticorps chez les animaux. Cet encadrement nous a permis de sélectionner deux doses à tester chez le chien. Il s’agit d’un protocole de preuve de concept, le nombre de chiens par lot est volontairement réduit au minimum de 3 chiens/lot afin d’évaluer si le protocole est sujet à la variabilité inter-individus. Aucun test statistique ici n’est nécéssaire, pour établir un nombre minimum de chien par lot. Ces données préliminaires serviront aux futurs tests cliniques qui seront réalisés ultérieurement. Suite à l’accord du vétérinaire référent, chaque chien provient d’un projet précédent, cette réutilisation participe ainsi à la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux, réutilisés, sont déjà habitués à l’environnement des locaux ainsi qu’aux personnes qui les manipuleront : le stress global sera ainsi réduit. Une attention particulière sera portée à la minimisation du stress au moment des manipulations : injections et prélèvements. Les chiens seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage habituel. Le temps sera pris avant le prélèvement pour rassurer le chien. À la fin du prélèvement, une friandise sera donnée au chien, qui sera également félicité par la voix et des caresses, afin d’induire un renforcement positif. Sur le plan de l’hébergement, les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, avec leurs congénères habituels (animaux déjà présents dans l’EU, les groupes d’animaux ayant été constitués selon les affinités de caractères), dans des boxes extérieurs. Leur alimentation reste inchangée et de l’eau est proposée ad libitum. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (niche, chauffée de novembre à avril), une plateforme et des jouets. Ils bénéficieront d’interactions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux) et d’une sortie quotidienne (hors week-end et jours fériés) dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.
Choix des espèces
Le vaccin que nous souhaiterions tester est un conjugué peptidique composé d’un peptide issu de l’interleukine-6 de chien et d’une protéine porteuse. Il a été développé à des fins de traitement chez des chiens arthrosiques. Après deux études pilotes réalisées chez la souris et le lapin, nous souhaiterions tester l’immunogénicité de notre conjugué chez le chien, espèce cible. Le système immunitaire des animaux doit être compétent, ainsi les chiens utilisés seront des chiens adultes, mâle ou femelle.
Identification des mécanismes de résistance aux hormonothérapies dans le cancer de la prostate résistant à la castration : une approche multi modèles
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
1 413 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un fragment de tumeur de patient sous anesthésie générale, puis des mesures répétées et des injections de molécules deux fois par semaine sur quatre à six semaines, pour identifier les mécanismes de résistance à l'hormonothérapie du cancer de la prostate. Le porteur affirme que le développement tumoral n'est pas douloureux et n'attend pas de perte de poids. Il revendique un "besoin urgent" de nouvelles cibles et conclut qu'il est "indispensable" d'utiliser la xénogreffe de tumeur de patient.
Objectifs
Le cancer de la prostate (CaP) représente 1 400 000 nouveaux cas et 375 000 décès dans le monde par an (57 000 cas, 9 000 décès en France). Il est dépisté par mesure du PSA (Antigène Spécifique de la Prostate) et toucher rectal. Aux stades localisés, la chirurgie, la radiothérapie, la Curiethérapie, et des ultrasons sont curatifs. Au stade métastatique, l’hormonothérapie est le traitement de 1ère ligne, avec une problématique de taille, l’échappement hormonal, qui fait que le cancer reprend son développement. En conséquence il est actuellement proposé à ces patients une hormonothérapie de 2ème génération, notamment l’abirotérone ou l’enzalutamide, qui vont bloquer les hormones responsables du développement du cancer de la prostate, en combinaison avec des inhibiteurs de PARP (Poly(ADP-ribose) polymérase), qui représentent une classe de médicaments anticancéreux ciblant les cancers caractérisés par une surexpression des enzymes de type PARP (comme l’olaparib, le talazoparib, ou le niraparib), comme c’est le cas du cancer de la prostate. Pour améliorer la survie des patients de nouvelles avancées sont nécessaires, tant pour le diagnostic que pour le traitement de la maladie, et cela passe également par l’identification des mécanismes de résistance aux thérapies de référence actuelles. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer les mécanismes moléculaires de la résistance à l’hormonothérapie de 2ème génération en combinaison avec les inhibiteurs de PARPet de contourner cette résistance en inhibant les mécanismes moléculaires impliqués. Ces études permettront ainsi de développer des approches thérapeutiques pour le traitement du CaP, dans une logique de médecine personnalisée, c’est-à-dire adaptée aux caractéristiques de chaque patient.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre d’identifier et de contrer les mécanismes de résistances à l’hormonothérapie de seconde génération, notamment l’abiratérone, en association avec les inhibiteurs de PARP (Poly(ADP-ribose) polymérase), actuellement en thérapie de première ligne dans le cancer de prostate résistant à la castration. Les inhibiteurs de PARP, représentent une classe de médicaments anticancéreux ciblant les cancers caractérisés par une surexpression des enzymes de type PARP (comme l’olaparib, le talazoparib, ou le niraparib), comme c’est le cas du cancer de la prostate. Les retombées de notre projet ont ainsi des implications potentielles très importantes pour la clinique. Nos résultats permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate. Du fait que les patients deviennent résistants aux thérapies anti-tumorales classiques dans ce cancer, il y a un besoin urgent d’identifier les mécanismes à l’origine de cette résistance, mais bien sur également de découvrir, de développer et de valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients aux stades avancés de la maladie. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour contenir la maladie, voire l’éradiquer
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales (modèles de xénogreffes de lignées cellulaires humaines) ou un implant tumoral en sous-cutané (modèles de xénogreffes de tumeurs de patients) au cours d’une chirurgie d’implantation sous anesthésie générale. L’intervention dure environ 15 secondes pour l’injection sous-cutané de lignées et environ 5 minutes pour l’implantation du fragment de tissu tumoral. Le volume tumoral sera suivi par mesure de la tumeur (longueur, largeur, profondeur) 2 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Pour les traitements ils recevront des injections sous anesthésie générale répétées, sur 4 à 6 semaines, à raison de 2 injections par semaine durant environ 15 secondes, soit entre 8 et 12 injections avec les molécules thérapeutiques.
Impact sur les animaux
Comme il s’agit de xénogreffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. La chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois pour obtenir la taille tumorale initiale, pour l’initiation des thérapies. Une inflammation au site d’injection est aussi possible. En outre, concernant la procédure principale, comme il s’agit d’injections répétées, il peut y avoir un stress à la contention, et lors des injections, mais cela est minimisé par le fait que l’ensemble des gestes est réalisé sous anesthésie générale gazeuse à l’isoflurane, qui permet une induction et un réveil rapide. Cependant, il faut noter que nous avons une très forte expérience de ces protocoles, non seulement dans le développement de modèles CDX avec plusieurs lignées de divers types de cancers, mais également de modèles PDX avec des xénogreffes de près de 1000 tumeurs, et nous restons vigilants afin que les effets indésirables éventuels puissent être minimisés au maximum. Nous n’avons pas reporté de perte de poids, que ce soit dans nos observations ou celles d’autres investigateurs. Idem pour l’alimentation et l’hydratation (qui rejoint le poids), aucune différence n’est notée les animaux continuant à prendre du poids au cours de l’expérimentation de manière tout à fait normale. Aucun impact sur le comportement n’a été non plus répertorié dans ce type d’expérimentations.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.
Remplacement
Le cancer de la prostate, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, mais en permettant les études statistiques, par les tests classiques et adaptés aux expérimentations. Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.
Raffinement
Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie gazeuse avec une anesthésie au site d’implantation, et en appliquant une analgésie (Meloxicam 5mg/kg/j en IP pendant 3 jours). Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Il est à noter que le développement tumoral n'est pas douloureux pour les animaux. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.
Choix des espèces
Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.
Mise en place de test d’exposition au froid pour étudier la thermogenèse et le métabolisme chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie une sonde de température sous la peau, subissent des prélèvements sanguins, un isolement de 24 heures en calorimétrie et une exposition au froid à 4 °C pendant six heures qui abaisse leur température corporelle, pour mettre au point un test d'étude de la thermogenèse. Le projet vise à "compléter l'offre" d'analyse du métabolisme énergétique de l'établissement. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour étudier le métabolisme d'un organisme complet.
Objectifs
Les mammifères ont acquis la capacité de maintenir une température corporelle constante dans des environnements à température variable grâce à un processus physiologique adaptatif appelé la thermogenèse. Le tissu adipeux est considéré comme le principal site de thermogenèse et de production de chaleur, ce qui permet aux rongeurs de maintenir l'euthermie à des températures inférieures à la thermoneutralité. Les altérations de la thermogenèse sont actuellement considérées comme étant à la fois potentiellement responsables et capables de contrer l'obésité. Une compréhension et une évaluation adéquate de la thermogenèse sont donc primordiales pour les études métaboliques. En effet, des gènes impliqués dans la thermogenèse peuvent être facilement induits dans les adipocytes du tissu adipeux en réponse à une exposition au froid. Lorsqu'ils sont activés, les cellules adipeuses consomment une grande quantité de lipides circulants et de glucose. Dans ce contexte, notre projet est de mettre en place et de valider le test d’exposition au froid combiné à l’analyse de l’énergie par calorimétrie indirecte pour compléter notre offre d’étude du métabolisme énergétique chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif la mise en place et la validation d'un test d'exposition au froid pour analyser la thermogenèse et le métabolisme énergétique chez la souris. Cela nous permettra d'offrir un test qui permet de compléter l'analyse des effets métaboliques de certains gènes impliqués l'obésité.
Procédures
Implantation sous-cutanée de mini-sondes de température par chirurgie (durée 30 min par animal) -Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire (moins de 5min par animal) -La calorimétrie indirecte : l’isolement des animaux pendant 24 heures. - Exposition au froid (+4°C) pendant 6h.
Impact sur les animaux
Notre protocole d’étude peut induire les contraintes suivantes : -les animaux subiront une implantation sous-cutanée de mini-sondes de température. Celles-ci restent sous la peau durant l’ensemble du projet, et ont une longueur de 15.5 mm, un diamètre de 6.5 mm et pèse 1.1 g. la chirurgie dure 30 min par animal. -Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire peuvent induire du stress et douleur (moins de 5min) - La calorimétrie indirecte : l’isolement des animaux pendant 24 heures - Exposition au froid (+4°C) pendant 6h : chute de température corporelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques.
Remplacement
Cette étude a pour but d’étudier la thermogenèse et le métabolisme chez la souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier le métabolisme énergétique à l’échelle d’un organisme complet.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable des résultats. Une approche statistique basée sur la variabilité inter-individu constaté dans les études précédentes en calorimétrie indirecte, et de la revue de la littérature pour la mesure de la température corporelle (sous exposition au froid) nous permet de fixer le nombre d’individu à 10 par groupe. De ce fait, nous prévoyons au total 20 souris (10 mâles et 10 femelles).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté avant les tests. -Implantation des mini-sondes : Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. -Afin de diminuer le stress et la douleur liées aux prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle, ces prélèvements se feront sous anesthésie par inhalation d’isoflurane. De plus un volume maximum de 200 μl et correspondant donc à moins de 20% du volume sanguin de l'animal sera prélevé et afin de compenser ce prélèvement, une solution de NaCl 0,9% correspondant au volume de sang prélevé sera injectée par voie intrapéritonéal. -Concernant les tests de calorimétrie indirecte, ceux-ci se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 24 heures. A la fin de ce test, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement) -Exposition au froid : les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 6h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Afin d’éviter de trop grandes variations dans les mécanismes d’adaptation au froid, les animaux seront placés dans des cages individuelles comprenant de la litière. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C , montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test, et placé sur une plaque chauffante. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour la création et l’étude de modèle avec des mutations genetique. De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude du métabolisme energetique et la thermogenèse. Enfin, il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier des alterations de la thermogenèse d’un organisme complet. Nous allons étudier le metabolisme et la thermogenèse chez des souris adultes, en effet, nous souhaiterions mettre en place et valider ce test dans le cadre des études du métabolisme en âge adulte chez la souris.
Etude de l’impact de la perte de fonction de CFTR sur le développement de l’ostéoporose chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent le retrait chirurgical des ovaires sous anesthésie générale pour induire une ostéoporose, puis jusqu'à trois séances d'imagerie par an, pour étudier le lien entre une anomalie génétique de la mucoviscidose et la perte osseuse. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque de mortalité et prévoit d'abandonner la procédure si ce risque dépasse certains seuils. Il affirme qu'à sa connaissance il n'existe "pas d'alternative non animale efficace" et que les régulations en jeu ne sont pas modélisables sans un "animal complet".
Objectifs
L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Les patients souffrant de mucoviscidose présentent une forme particulière d’ostéoporose appelée maladie osseuse liée à la mucoviscidose. Cette maladie est due à un problème génétique dont l’effet précis sur l’os n’est pas aujourd’hui connu. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs a pour objectif donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de la problématique génétique sur la qualité osseuse, en étudiant les os de souris où l’ostéoporose sera induite par le retrait chirurgical des ovaires au cours du temps. Ces approches expérimentales permettent de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause chez la Femme, et de façon plus globale dans les deux sexes en lien avec le vieillissement de l’organisme. Ce travail permettra donc, à terme, de mieux comprendre l’impact de la problématique génétique sur les altérations osseuses dans des populations de plus en plus agées et donc de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre la pathologie osseuse liée à la mucoviscidose et plus généralement contre l’ostéoporose.
Bénéfices attendus
L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse, ou des substituts des hormones, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques et ne présentent qu’une efficacité limitée chez les patients souffrant de mucoviscidose. Les résultats de cette étude permettront une meilleure compréhension de l’impact de la problématique génétique dans l’établissement de l’ostéoporose post-ménopause ou liée à l’age et pourront orienter vers de nouvelles pistes thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30 min sous anesthésie générale pour la procédure de retrait des ovaires au sein du premier établissement utilisateur. Ils seront également soumis au maximum à trois séances d’imagerie de 30 min, sous anesthésie générale, par an, au sein du second établissement utilisateur
Impact sur les animaux
Toute approche chirurgicale implique un risque de mortalité lors de l’intervention et après. Néanmoins, si la mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie est supérieure à 10% pour le groupe d’animaux ne portant pas de problème génétique et supérieure à 50% pour le groupe portant l’anomalie génétique, la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée après les interventions chirurgicales est attendue dans les tous premiers jours avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques et biomécaniques.
Remplacement
A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace qui permet d’étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme, ou en lien avec le vieillissement de l’organisme. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.
Réduction
Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre optimisé d’animaux (10 par groupe) sera employé pour ces procédures afin que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique en fin d’expérimentation. Une logique d’arrêt des procédures est de plus mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux par groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés.
Raffinement
Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de d’acclimatation d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur cage. A chaque intervention les animaux seront endormis afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’intervention chirurgicale pour la procédure portant sur l’ostéoporose post-ménopause, une douleur après l’opération sera anticipée avec l’utilisation de médicaments antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les deux jours suivants la chirurgie et si des signes d’inconfort étaient détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours ensuite sur la première semaine puis deux fois par semaine ensuite. Les animaux engagés pour la procédure 2 seront visités deux fois par semaine. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés après anesthésie générale. Afin de réaliser les analyses par imagerie, sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de consevrer une température optimale pour les animaux de 20°C, (8 km, environ 10 minutes). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, spécifiquement préparées, et les animaux seront remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.
Choix des espèces
La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.
Evaluation de l’effet du vieillissement du collagène du type I sur l’efficacité des traitements dans des modèles de xénogreffe de tumeurs de mélanome chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome enrobées dans du collagène d'âges différents, puis des mesures et des injections de traitement trois fois par semaine sous anesthésie gazeuse pendant une cinquantaine de jours, pour tester si le vieillissement de l'environnement tumoral réduit l'efficacité d'une thérapie ciblée. Le porteur classe la procédure en modérée en raison d'un risque de métastases ou d'ulcération qu'il ne peut exclure. Il affirme que les méthodes in vitro ne prennent pas en compte la complexité d'un organisme et qu'il est "indispensable" de confirmer l'hypothèse sur un modèle vivant.
Objectifs
Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel du fait de son agressivité. Environ la moitié de ces cancers développent une protéine anormale responsable de cette agressivité. De nouvelles thérapies ont été développées, elles ciblent spécifiquement cette protéine anormale afin de bloquer son effet. Elles ont permis d'améliorer la survie globale des patients en stoppant la progression du cancer. L’effet anticancéreux de cette thérapie ciblée est rapide mais, après quelques semaines de traitement la tumeur peut développer une résistance. La résistance à cette thérapie est peu étudiée dans les cancers chez des patients âgés. Pourtant, le facteur vieillissement pourrait être impliqué dans l'échec de la réponse à ces nouvelles thérapies ciblées et, plus précisément, le vieillissement de l’environnement dans lequel se trouvent les cellules cancéreuses. En effet, la peau en vieillissant subit processus naturel qui modifie son organisation et qui pourrait empêcher le bon fonctionnement de la thérapie anticancéreuse. La population âgée étant en constante augmentation, il est indispensable d’évaluer les bénéfices/risques de cette nouvelle thérapie sur des organismes vivants tels que des souris. Les techniques d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont améliorées pour s’approcher au mieux de ce qu’il se passe dans le corps humain. Cependant, ces techniques ne tiennent pas compte de la complexité d'un organe ou d'un organisme vivant complet. C'est pourquoi nous devons confirmer nos hypothèses en utilisant des modèles vivants. Notre projet de recherche se concentre sur l'impact du vieillissement sur l'efficacité d'un traitement. Nous avons plusieurs objectifs : d'abord, confirmer que nous pouvons effectuer nos observations sur notre modèle vivant ; ensuite, comprendre comment l'environnement autour des tumeurs change avec l'âge et comment cela affecte leur évolution ; enfin, examiner comment le vieillissement de cet environnement influence la réaction des tumeurs à un traitement médicamenteux.
Bénéfices attendus
Ce protocole est un nouveau modèle d’étude mimant le vieillissement de l’environnement tumoral. En effet si le protocole d'injection de cellules cancéreuses enrobé de collagène a déjà été décrit, l'injection de ces mêmes cellules enrobées dans du collagène de différents âges n'a jamais été réalisée. Le bien-être animal sera amélioré avec un temps d’expérimentation réduit. Ce protocole représente donc une approche innovante dans l’étude de l’efficacité de traitements anticancéreux dans un organisme âgé.
Procédures
Injections des cellules cancéreuses (1 fois, sous anesthésie gazeuse), mesure des tumeurs (3 fois par semaine sous anesthésie gazeuse) , injections pour le traitement tumoral (3 fois par semaine pendant 4 semaines, sous anesthésie gazeuse). L'anesthésie gazeuse 3 fois par semaine pendant maximum 50 jours consiste en un flash anesthésique durant quelques secondes et permettant de réaliser nos mesures et nos injections en diminuant le stress chez la souris.
Impact sur les animaux
L'injection des cellules cancéreuses et l'injection du médicament pour traiter les tumeurs peut entrainer chez les souris de la douleur et du stress. La manipulation pour l’anesthésie peut entrainer du stress. Il n’est pas rapporté d’impact propre à notre protocole d'injection de cellules cancéreuse. Nous utilisons un protocole sans substance irritante ou inflammatoire. Cependant, le nombre d'étude reste relativement pauvre sur le sujet. Le suivi que nous mettrons en place, conforme aux exigences de l’éthique animale sera à même d’identifier de manière précoce le possible impact de notre protocole. Les cellules cancéreuses sont agressives, la procédure a été classée en catégorie modérée du fait d’une possibilité de survenue de métastases ou d'ulcération qui ne peut être exclue. Nous surveillerons ce risque. Les observations mises en œuvre durant la première partie du protocole nous permettront de réduire si justifié la durée de la procédure pour limiter la prévalence de métastases à l’origine de souffrances.
Devenir
L’euthanasie des animaux sera rendue nécessaire car les tumeurs seront prélevées afin d’être analysées. Dans le cas où le traitement anticancéreux administré serait seul efficace (réponse complète), la réutilisation de l’animal ne serait pas possible du fait du traitement préalable et du risque de moindre réponse à un nouveau traitement (source de variabilité inter-individuelle des sujets).
Remplacement
Les méthodes d’étude du vieillissement du collagène en laboratoire se sont perfectionnées afin de rendre les recherches in vitro plus proche de la réalité in vivo. Certaines d’entre elles connues et utilisées dans notre laboratoire ont permis d’obtenir de premiers résultats. Cependant elles ne prennent pas en compte la complexité d’un organe ou d’un organisme et ne peuvent être la méthode unique de remplacement de l’animal. Il est donc indispensable de confirmer notre hypothèse sur des modèles in vivo pertinents.
Réduction
Nous testerons dans un permier temps 2 lignées de souris différentes soit 1 male et 1 femelle par lignée (donc 4 souris). Ceci nous permettra de choisir le type de souris le plus adapté à notre protocole. Ceci s'intègre à terme dans la démarche de réduction. Après validation de la lignée de souris, Un nombre de 8 animaux par groupe sera nécessaire afin de pouvoir interpéter les résultats. Les expérimentations seront réalisées en deux temps, dans un premier temps ce protocole étant très peu réalisé nous souhaitons confirmer son efficacité sur un petit nombre de souris. En cas de résultats concluant dans cette première partie d’expérimentation, 4 lots de 8 souris seront nécessaires afin de répondre au dernier objectif : étude de l’impacte du vieillissement de l’environnement des tumeurs sur la réponse au traitement anti-cancéreux. Ce programme en 2 temps permet de réduire le nombre de souris, et de l’adapter préalablement aux expérimentaitons en fonction des résultats obtenus.
Raffinement
L'hébergement des souris sera adapté à la de lignées des souris (Armoire ventilées) en groupe de 4 stables et harmonieux, nous surveillerons le risque d’agression entre congénères. Les cages seront enrichies en copeaux de papier permettant aux souris de se faire un nid / se cacher. Elles présenteront également des tunnels en carton leur permettant de ronger / se cacher, ainsi qu’un dôme avec une roue leur permettant de se dépenser (mobilité/exercice). Afin de réduire la perte de chaleur due à l’absence de poil, du coton sera ajouté dans la cage et la température de la table de manipulation sera augmentée d’un degré. Les souris seront stabulées en bas du portoir ventilé afin de limiter l’agression lumineuse. Les expérimentations ont été pensées pour être très courtes, permettant de diminuer les risques de chutes de températures et de stress de l’animal. L’injection des cellules cancéreuses, l’injection du médicament et la mesure des tumeurs se feront sous anesthésie gazeuse (flash anesthésie de quelques secondes) ceci permettra de réduire le stress lié à la procédure. La xénogreffe sera réalisée en sous cutanée sur le flanc des souris, ce site d’implantation étant considéré comme causant le moins de stress chez l’animal.
Choix des espèces
Des travaux antérieurs utilisant un protocole proche de celui que nous utiliserons ont été réalisés sur ces souris, ce qui justifie l’utilisation de cette espèce. Le traitement que nous allons tester a déjà été utilisé chez ces souris, aucun effet indésirable n’a été montré. Ces souris ont une éspérance de vie courte (8 à 9 mois), ce qui ne permet pas d’étudier le vieillissement naturel, mais qui justifie notre modèle. A notre connaissance il n’existe pas d’autre modèle animal rongeur adapté à ce protocole. Les tumeurs étudiées sont de tumeurs de l’adulte, c’est pourquoi dans le but de se placer dans conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité clinique, les souris seront âgées de 8 semaines ce qui correspond à un stade adulte. C’est l'âge de l’environnement qui sera injecté avec les cellule cancéreuses qui reproduira le vieillissement de l'environnement autour de la tumeur.
Evaluation préclinique d’une immunothérapie combinée dans la Maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
1 958 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent un modèle de maladie neurodégénérative ou un système immunitaire déficient, subissent une biopsie d'identification sur souriceau vigile, jusqu'à 35 injections dans l'abdomen, jusqu'à deux injections dans le cerveau sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, pour tester une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires dans la maladie d'Alzheimer. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées à de futurs essais cliniques, alors que le porteur a déjà lancé un essai pilote. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent qu'une fraction des interactions en jeu et conclut qu'un modèle animal est "totalement indispensable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (>1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 10 jours à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 35 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Ils auront également au maximum deux injections au niveau du crâne (intracérébroventriculaire) à l’âge de 3 mois pour la première et la seconde à un temps qui sera défini au cours du projet (environ 30 minutes par procédure chirurgicale). Ces injections seront réalisées sous analgésie et anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile à la fin des 10 premiers jours puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entraîner des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensibles aux infections. La biopsie (
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1958 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.
Induction de structures lymphoïdes par des virus oncolytiques modifiés chez la souris immunocompétente C57Bl/6
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales puis jusqu'à trois injections de virus oncolytiques modifiés, avant un prélèvement de tumeurs et d'organes. Le porteur indique surveiller d'éventuels effets auto-immuns et fixe des points limites détaillés, dont une tumeur pouvant atteindre 1000 mm³. Il décrit disposer de cultures en trois dimensions et de puces microfluidiques, mais affirme que l'étude des effets sur "l'organisme entier" impose le recours à l'animal.
Objectifs
Les virus "oncolytiques" sont de nouveaux agents thérapeutiques capables de détruire spécifiquement les cellules tumorales sans attaquer les cellules saines. Deux virus oncolytiques sont actuellement approuvés comme traitements contre le mélanome métastatique (cancer de la peau) et le glioblastome (cancer du cerveau). Les virus oncolytiques présentent trois modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront produites uniquement dans les tumeurs. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux protéines à utiliser et aux conditions dans lesquelles les virus doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques codant pour différentes protéines impliquées dans la formation de structures lymphoïdes. Ces structures sont constituées de cellules immunitaires et permettent la mise en place de réponses anti-tumorales. Si les virus oncolytiques donnent des résultats très encourageants in vitro, l’évaluation des différents mécanismes impliqués requiert l'utilisation de modèles animaux vivants qui reproduisent la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires associées avant d'envisager un transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouveaux virus oncolytiques immunoactivateurs, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections (1 challenge + 3 traitements) par animal.
Impact sur les animaux
Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant les protéines thérapeutiques codées par ces virus, il s’agit de cytokines et chimiokines connues. Les données de la littérature suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever des échantillons (tumeurs, rate, ganglions, autres tissus) qui serviront à obtenir des données supplémentaires sur ces expérimentations.
Remplacement
Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.
Réduction
Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces - Taille de tumeur égale ou supérieure à 1000mm3 •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental
Choix des espèces
L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouveaux virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la cicatrisation
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 550
Cochons d'Inde : 250
Cochons : 300
Pansements, crèmes et sutures sont testés ici pour le compte d'un donneur d'ordre, en vue de leur autorisation de mise sur le marché. 1 500 animaux non-humains, 400 souris, 550 rats, 250 cochons d'Inde et 300 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour l'examen des tissus au contact du produit. Tous sont opérés sous anesthésie, de 30 minutes à 1 h 30, pour créer les plaies où le produit est appliqué, puis subissent des changements de pansements, avec ou sans anesthésie selon l'espèce, et parfois des prises de sang. Le porteur affirme que leur utilisation est "requise dans la réglementation", et déclare un niveau de souffrance sévère sans dire quelles procédures l'atteignent, les effets décrits se limitant à la douleur opératoire, à la gêne du pansement, au risque d'infection et à une perte de poids de quelques jours.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en cicatrisation (exemple : pansements, crèmes, sutures...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en cicatrisation. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin de créer les plaies et y appliquer le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 30 minutes et 1h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et/ou gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Des observations des plaies et des changes de pansements auront régulièrement lieu, avec ou sans anesthésie selon les espèces.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlés par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - présence d’un pansement secondaire pour protéger les plaies et les articles appliqués ainsi que les risques d’infection. L’intégrité de ce pansement secondaire est vérifiée quotidiennement et peut éventuellement gêner l’animal. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal et spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétant (friandises), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanées ou assistée) ...
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en cicatrisation.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test". Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, éléments de nidification…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance et éventuellement réfection additionnelle des pansements (en plus de ceux prévus les jours de lecture), nettoyage des plaies à chaque réfection de pansement, prolongation du traitement analgésique post-opératoire). La douleur liée aux prises de sang éventuelle peut être maitrisée par la réalisation de la prise de sang sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou locale, ou encore sous sédation légère.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie en fonction des attentes du test et les similarités avec l’homme : - Structure de la peau et processus de cicatrisation similaires chez les porcins. - Plus d’exsudation des plaies chez les porcins que chez les rongeurs. - Processus normal de cicatrisation des rongeurs par contraction, comme certains types de plaies chez l’Homme (par exemple, plaies de brulures) - Lorsqu’un phénotype/génotype diabétique est nécessaire pour une étude, les espèces de petite taille, telles que les rats et les souris, sont privilégiées car ces lignées sont plus facilement générées et maintenues. - Les petits animaux (rat, souris, cobayes) sont souvent utilisés pour des raisons de facilité d’utilisation (actes techniques plus facilement réalisables car animaux moins lourds, hébergement de plus petite taille). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Thérapie génique expérimentale pour le traitement de la myopathie congénitale liée à la myopalladine
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Quatre tests de force et d'endurance musculaire répétés à 1,5 mois, puis à 3, 6, 8 et 12 mois, et la mise à mort pour prélever muscles et organes : 97 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit en plus deux prises de sang et une injection unique d'un vecteur viral, dans un muscle de la patte ou dans la veine de la queue, sous anesthésie générale. Dépourvues de myopalladine par modification génétique, ces souris sont exploitées pour décrire une myopathie congénitale rare et tester une thérapie génique, le porteur affirmant qu'elles reproduisent les caractéristiques cliniques de la maladie humaine tout en écrivant qu'elles "ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine". Il ne nomme pas les quatre tests, et fixe l'effectif à huit souris par condition d'après un calcul statistique fait sur des rats d'une lignée de myopathie de Duchenne.
Objectifs
Les myopathies congénitales constituent un groupe hétérogène de troubles neuromusculaires héréditaires dont les symptômes sont une faiblesse musculaire et des déformations squelettiques, ayant pour certaines un fort impact sur la survie et la qualité de vie des patients. Ce projet vise à combler une lacune majeure dans le traitement d'une myopathie congénitale très rare liée à des mutations du gène mypn engendrant un défaut de production de la protéine myopalladine (MYPN-CM, MYPN-associated congenital myopathy). Les mutations dans ce gène mypn entraînent une absence totale ou une diminution de la quantité de protéine MYPN fonctionnelle specifiquement dans les muscles, altérant l’intégrité du tissu musculaire cardiaque et squelettique, à l’origine de myopathies congénitales rares diagnostiquées généralement dès la naissance ou durant l’enfance. Le but du projet présenté pour une durée de 5 ans vise à caractériser plus précisément l'une de ces myopathies congénitales et de mettre au point une thérapie génique pour traiter cette maladie encore incurable, en rétablissant l’expression de la myopalladine manquante. Dans ce but, un modèle murin déficient pour cette protéine MYPN (souris MKO) sera utilisé, reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine du point de vue clinique . Un premier objectif de l'étude est de mieux caractériser les souris MKO à différents âges afin de mieux comprendre l'évolution de la maladie dans ce modèle. Cette première étude permettra également d'établir les paramètres à évaluer lors de la thérapie génique expérimentale qui constitue le deuxième objectif. Les différents paramètres seront analysés avant et après administration d'un vecteur viral permettant une expression de la protéine MYPN chez les souris MKO, afin de déterminer les bénéfices thérapeutiques de ce traitement, mais également d’écarter tout potentiel effet indésirable sur les autres organes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical non satisfait en fournissant une approche de traitement novatrice pour la MYPN-CM qui consiste en une approche de thérapie génique. Ce projet devrait produire un bénéfice à court terme avec la caractérisation en profondeur du modèle murin MKO qui pourra ensuite être comparé à la trajectoire de la maladie chez l’humain. Cela permettra de caractériser la maladie et de mieux comprendre son évolution au fil du temps. Le bénéfice à long terme sera obtenu après l’achèvement du projet grâce auquel il est attendu une rapide évolution vers une phase pré-clinique puis clinique pour la thérapie génique de la MYPN-CM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une étude de leur force/résistance musculaire par 4 tests non invasifs de courte durée. Chaque test sera réalisé à différents âges des souris 1.5, 3, 6, 8 et 12 mois. Certaines souris seront également soumises à deux prélèlements sanguins au niveau de la veine de la queue et une 1 injection unique de vecteur viral dans un muscle de la patte ou dans la veine de la queue sous anesthésie générale ne dépassant pas 10 min afin d'éviter stress et douleur.
Impact sur les animaux
Dans les conditions de vie courante en cage, les souris MKO sont de plus petites tailles mais ont une longevité comparable aux souris sauvages et du fait d'une activité réduite elles ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine. La réalisation des tests fonctionnels d'effort peut engendrer un léger stress, un essoufflement et une faiblesse musculaire. L’injection des vecteurs viraux par voie intramusculaire ou dans la veine de la queue peut engendrer une légère douleur jusqu’à quelques heures après l’injection qui sera prise en charge par un traitement antalgique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de pouvoir procéder à une caractérisation moléculaire et histologique de différents tissus. Selon les procédures, les muscles et plusieurs organes d’intérêt seront prélevés afin de vérifier les bénéfices et éventuels effets indésirables sur d'autres organes (foie, cœur, rate, etc…) que ceux ciblés par la thérapie (les muscles).
Remplacement
En amont de l'étude expérimentale chez les souris MKO déficientes en myopalladine, les vecteurs développés seront d’abord testés sur des cellules musculaires in vitro, ce qui permettra de valider leur effeicacité avant l’injection chez l’animal, et ainsi réduira le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Du fait de la visée thérapeutique de ce projet, il est cependnat essentiel de réaliser des tests pré-cliniques dans le modèle animal afin de vérifier l'expression de la myopalladine in vivo suite à l'injection des vecteurs viraux dans le muscle, et ceci sans effets secondaires tels qu'une réaction inflammlatoire violente et une hépatotoxicité, toutes deux malheureusment déjà observées dans d'autres thérapies géniques. A ce titre, il est nécessaire de tester l'efficacité de la thérapie génique in vivo, dans un organisme entier dont l’ensemble des organes est en interrelation constante afin de vérifier le tropisme et l'inocuité du traitement.
Réduction
Pour la caractérisation clinique (force et endurance), les mêmes animaux seront utilisés à différents âges (1.5, 3, 6, 8 et 12 mois), ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Ces souris seront ensuite mises à mort afin de prélever tous les muscles qui serviront pour plusieurs analyses. Pour les analyses histologiques et moléculaires à 1.5, 3, 6, 8 et 12 mois d’autres souris, seront mises à mort hors procédure pour prélèvement d'organes uniquement. Le modèle MKO n’a fait l’objet que d’une seule publication et les auteurs se sont principalement concentré sur les défauts cardiaques du modèle et n’ont pas caractérisé en profondeur le phénotype musculaire ce que nous souhaitons faire. Cette myopathie est extrêmement rare chez l’homme et n’est donc que très mal caractérisée également. La faiblesse musculaire est par ailleurs légère comparée à d’autres myopathies telle que la dystrophie musculaire de Duchenne ou même celle de Becker. Les marqueurs conventionnels utilisés comme la phosphocréatine kinase ne sont pas appropriés pour comparer les animaux sauvages et les MKO c’est pourquoi nous souhaitons conduire cette étude. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basés sur notre expérience avec d’autres modèles de myopathie notamment les rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Dans ce modèle, il a été calculé par une approche statistique que 8 rats seraient nécessaires afin d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Il se trouve que ce nombre est également celui utilisé dans la première étude de ce modèle, c'est pourquoi nous avons choisi ce même nombre de souris par condition pour cette étude. Enfin, en travaillant par étape, cela nous permettra d’appréhender et d’optimiser les expérimentations au fur et à mesure afin de réduire au mieux le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de s’habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures animales. Les méthodes expérimentales ont été choisies pour éviter au maximum les douleurs lors des interventions sur les animaux. Les tests cliniques ne sont pas douloureux et ne correspondent qu’à des exercices physiques, et les injections des vecteurs dans le muscle ou dans les veines de la queue se feront sous anesthésie et n'entraîneront qu’une très légère douleur. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.
Choix des espèces
La souris MKO présente des similarités cliniques et histologiques avec les patients MYPN-CM que nous souhaitons caractériser plus en profondeur. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée des expériences proposées, particulièrement pour la caractérisation des souris à 12 mois. Les approches de thérapie génique expérimentale sont facilement réalisables sur ce petit modèle, et sont essentielles avant de passer à une étude pré-clinique chez un modèle animal plus gros comme le chien, puis à une étude clinique chez l’homme. Les caractérisations phénotypiques se feront à partir de 1.5 mois, âge qui correspond au début de la puberté chez l’homme. En effet, nous savons que les phénotypes apparaissent à la naissance ou durant l’enfance. Ensuite, la maladie est progressive et à 3 mois, les souris MKO commencent à montrer une faiblesse musculaire. La caractérisation phénotypique se poursuivra entre 3 mois, âge correspondant au jeune adulte dont les muscles sont complètement formés, et 12 mois, âge adulte avancé chez l’homme. Cette stratégie permettra d’établir une trajectoire précise de la maladie au fil du temps, ce qui aidera à mieux comprendre l’évolution de la maladie chez l’homme. Puis ce modèle servira à évaluer les effets bénéfiques du traitement lorsque celui-ci est administré (1) avant l'apparition des symptômes (6 semaines) pour voir s’il est possible d’empêcher ou retarder l’apparition de la maladie ; et (2) après l'apparition des symptômes de la maladie (6 mois), pour voir s’il est possible de ralentir voir d’arrêter la progression de la maladie ou d’en promouvoir le décours.
Biosurveillance passive sur rivière
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
210 poissons vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Pêchés dans une rivière, ils subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie puis sont tués par dislocation cervicale pour prélever leurs gonades, afin d'évaluer la qualité chimique du milieu à partir de biomarqueurs. Le porteur indique qu'un suivi in vitro a déjà montré l'absence de perturbateurs endocriniens dans l'eau depuis plusieurs années. Il affirme qu'il reste "nécessaire" de confirmer cette absence directement sur les populations de poissons.
Objectifs
Evaluation de la qualité chimique du milieu par l'intermédiaire de biomarqueurs chez le poisson. Fait suite à une étude ayant contribué à la mise en place de l’arrêté 08/01874 par la préfecture du Puy-De-Dôme. Depuis des prélèvements ponctuels ont été effectués afin de vérifier l’amélioration de la qualité du milieu et de la santé des poissons. Lors de la dernière étude menée en 2016, près de la moitié des poissons femelles pêchés au niveau de la station aval de La Dore présentaient encore des teneurs fortes en vitellogénine et des gonades anormalement développées, avec un blocage de l’ovulation et atrésies ovocytaires. L’objectif de cette nouvelle étude est de faire le point sur la restauration du milieu et le bon état physiologique des poissons.
Bénéfices attendus
Informer sur l'état de santé des poissons de la Dore en amont et en aval de la zone étudiée.
Procédures
Prélèvements sanguins uniques sur 210 poissons anesthésiés
Impact sur les animaux
Les organismes subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie au niveau de la veine caudale.
Devenir
Les poissons seront mis à mort pour effectuer les prélèvemetns des gonades.
Remplacement
Fait suite à un suivi depuis plusierus années sur les capacités de reproduction et l'état de santé des poissons en eaux continentales. Dans le cadre du projet, un suivi par approche in vitro a été effectué démontrant l'absence de perturbateurs endocriniens dans le milieu depuis plusieurs années. Il est maintenant nécessaire de confirmer l'absence de perturbation endocrinienne sur les populations de poissons en place.
Réduction
Une analyse de la puissance statistique à partir des données historiques, nous montre qu’avec 20 poissons par station (à raison de 10 mâles et 10 femelles), nous pouvons détecter de faibles variations autour de la moyenne en situation contrôle des paramètres testés (distance minimale de détection de 10 à 70 % de la valeur contrôle). Une réduction du nombre d’individus ne serait pas statistiquement pertinente. Pour la synthèse du standard de vitellogénine issues de femelle en période de reproduction, nous utiliserons des poissons de pisciculture afin de réduire le nombre d'animaux prélevés sur le milieu.
Raffinement
Afin de veiller au bien-être animal, les poissons seront maintenus pendant moins d'une heure à raison de 1 individu adulte pour 2.5 litres dans de l'eau issue du milieu sans changement de température contenant de l'anesthésique pour sédater les animaux et réduire le stress. Pour la récupération des organes (sang, gonades), les poissons seront anesthésiés. Une fois inconscient, le sang est rapidement prélevé avant mise à mort par dislocation cervicale pour récupérer les gonades.
Choix des espèces
L'espèce est sélectionnée du fait d'un suivi régulier sur la rivière et d'effets démontrés sur la population et l'individu. L'espèce doit être retrouvée dans le milieu d'étude. Animaux matures des deux sexes pour pouvoir prendre en compte les effets sur la capacité de reproduction de l'espèce.
Thérapie pour la myopathie à agrégats tubulaires en utilisant des ASOs dans le modèle souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie rare, elles subissent des tests de force répétés chaque mois, des prises de sang sous anesthésie, des injections du traitement et une mesure terminale de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique que les souris malades sont plus petites et présentent des atteintes du muscle, de la peau, de la rate et des os. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité du muscle ni les effets sur "l'organisme entier".
Objectifs
La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes, et des myalgies. La majorité des patients montrent des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multi-systémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Afin de corréler les dysfonctions cellulaires avec le développement de la maladie, nous avons généré et caractérisé un modèle murin portant la mutation TAM/STRMK la plus commune. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes mutisystémiques. Nous avons l’intention d'inverser les symptômes des souris TAM/STRMK par une régulation négative d'un gène important pour la maladie, afin de fournir une approche translationnelle pour les essais thérapeutiques prospectifs chez les patients. Nous avons effectué des études cellulaires et déterminé une réduction de l'expression du gène d'intérêt. Ces résultats préliminaires nous encouragent à tester la même approche dans un modèle murin de la maladie, afin de pouvoir à la fois prévenir et inverser le phénotype multisystémique des souris TAM/STRMK.
Bénéfices attendus
Il est attendu que cette étude apporte la première preuve que ce concept de traitement soit efficace pour la TAM/STRMK. Etant donné que nos résultats préliminaires ont montré un effet au niveau cellulaire, il reste à démontrer qu'il en est de même au niveau musculaire après l'administration du traitement, avec la même efficacité. Et vérifier egalement l'amélioration du phénotype des plaquettes, de la peau, de la rate, et des os, après traitement par injections systémiques. L'étape suivante sera de vérifier l'effet thérapeutique chez des patients TAM/STRMK dans des tests cliniques ultérieurs.
Procédures
Des tests de comportement seront réalisés une fois par mois chez l’animal vivant, à partir de l'âge de 4 ou 16 semaines selon la cohorte jusqu’à 4 ou 8 mois d’âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque test. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test de comportement permettant de mesurer la force musculaire des pattes antérieures de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 2 fois dans la vie de la souris. Le test nécessitant le prélèvement de sang est utilisé pour évaluer la coagulation sanguine et la capacité de l'organisme à former un caillot en cas de lésions vasculaires. L'animal sera anesthésié avant chaque prise de sang afin de réduire la douleur et le stress que cela pourrait causer. Le prélèvement du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections musculaires et intraveineuse seront réalisées pour administrer le traitement. Entre l'anesthésie et l'injection, la procédure prendra environ 2 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les souris malades sont plus petites que les souris sauvages et manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, la peau, les plaquettes et l'os, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme ce qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.
Réduction
Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, de la couleur de la peau, ainsi que l'évaluation de la nécéssité de la présence d'une poche de lait sera faite tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. L'environnement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée avant le début du suivi longitudinal pour chaque test. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Les souris sont nécessaires pour ces expériences afin de nous permettre d'évaluer les changements des propriétés physiologiques des différents muscles et organes après une modification génétique. Le modèle murin nous permet d'étudier l'amélioration potentielle du phénotype musculaire, ainsi que du phénotype observé sur d'autres organes, dans ce modèle de maladie murine multisystémique. Nous devons réaliser des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur des espèces plus éloignées de l'homme, car la structure musculaire diffère davantage. C'est pourquoi nous proposons d'utiliser des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires pour réaliser ces techniques. Les tissus de souris peuvent ensuite être utilisés pour d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et réduisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal, caractérisé par une faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît à l'âge de 2 mois et s'accentue avec l'âge, présentant un phénotype modéré à l'âge de 9 mois. Les souris seront utilisées à l'âge adulte, à partir de 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu'à 4 mois, puis à partir de 16 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement de la maladie), afin d'observer le développement des souris après le traitement.