Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation des effets de composés dans des modèles cognitifs chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
22050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal peut subir jusqu'à 28 tests comportementaux non détaillés, 672 administrations de substances et 90 prélèvements sanguins, certains protocoles incluant des chocs électriques provoquant une réaction aversive. Le porteur signale désorientation, convulsions rares, apathie, perte de poids et léthargie selon les substances employées pour induire un trouble cognitif. Il reconnaît tester aussi des molécules déjà sur le marché, pour mesurer la "prédictivité" de ses propres modèles.
Objectifs
Le trouble cognitif est un trouble mental fréquent au cours du vieillissement normal puisqu'il touche jusqu'à 50 % des sujets âgés de plus de 55 ans. Les principaux types de troubles cognitifs marqués sont le délire, la démence, la perte d’attention et l'amnésie. Les cas les plus sévères sont associés aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, il y a seulement quatre médicaments (donepezil, rivastigmine, galantamine et memantine) reconnus officiellement pour le traitement des symptômes cognitifs. Les effets de ces molécules restent modestes et ne sont pas dénués d’effets secondaires dont les plus courants sont des troubles gastro-intestinaux. Ainsi, la recherche vise à trouver un médicament plus efficace sans effets secondaires majeurs et à disséquer les mécanismes conduisant aux troubles cognitifs. A l’heure actuelle, le criblage des molécules aux effets procognitifs peut se faire sur les modèles basés sur la capacité d’apprentissage et de mémoire chez le rat ou la souris non transgéniques ayant un dysfonctionnement mnésique naturel lié au vieillissement ou induit pharmacologiquement. En effet, en fonction de la situation considérée les troubles cognitifs peuvent résulter de l’altération de différents phénomènes comme l’altération de la voie cholinergique, l’altération de la voie glutamatergique, l’augmentation de l’inflammation cérébrale,… Dans ce projet, nous nous proposons de tester des traitements en développement sur leur efficacité à améliorer la cognition. Chaque procédure de ce projet utilise un moyen diffèrent pour induit un trouble cognitif chez la souris afin de mimer différentes situations pathologiques de l’altération de la fonction cognitive mais utilise le même test d’évaluation de la cognition chez la souris.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les troubles cognitifs. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles,c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux de ce projet être amenés à réaliser 28 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 672 administrations et de 1 à 90 prélèvements sanguins sur une période de 168 en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des souffrances au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements liés à la mémoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 à 15 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 360 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi par du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Lors de l’utilisation de souris âgées le nombre d’animaux par cage est réduit et l’enrichissement doublé pour limiter les phénomènes de dominance. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris dans les études des phénomènes mnésiques. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les atteintes cognitives sont des phénomènes qui peuvent être liés à l’âge mais cela n’est pas systématiquement le cas. Ainsi dans ce projet nous utilisons des souris âgées au minimum 4 à 5 semaines au début du projet.
Evaluation de l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Cancers
1080 souris vont être utilisées, toutes en souffrance sévère et toutes tuées, dans une évaluation de composés anticancéreux. Une tumeur leur est induite par injection sous-cutanée de 3-méthylcholanthrène, un cancérigène, avant des traitements répétés et de nombreux prélèvements sanguins, y compris par voie rétro-orbitaire. Le porteur prévoit des effets sévères liés à la tumeur, perte de poids, nécrose et ulcération, et des points limites déclenchant la mise à mort. Cette prestation d'évaluation vise une éventuelle utilisation clinique, formulée sans échéance.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité d’un composé à visée thérapeutique seul ou en combinaison chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée. Les doses et les fréquences de traitement seront déterminées grâce aux études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de toxicité préalablement réalisées et/ou en se basant sur les données de la littérature et notre expérience. Remarque : Le 3-méthylcholantrène est un hydrocarbure aromatique polycyclique cancérigène dont l’administration sous-cutanée chez la souris induit la formation de tumeurs solides et mime ainsi le processus de tumorigenèse physiologique. Dans une souris génétiquement modifiée pour exprimer un antigène tumoral humain, celui-ci permet, notamment, l’induction de tumeurs exprimant cet antigène de manière endogène.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de l’induction ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Injection de 3-méthylcholanthrène en en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 12 semaines maximum, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (maximum 1 fois /jour dans la limite de 292 µL sur 28 jours pour un animal de 20g, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 12 semaines maximum, 15 s).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère, liés à l’administration du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s) en intra-péritonéal, sous-cutané, per os, intraveineux ou intra-tumoral. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à l’induction tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur. Possibilité d’effets indésirables sévères liés au(x) composé(s) thérapeutique(s) : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10-15 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 10 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la SBEA. Ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local, dans le cas de prélèvements rétro-orbitaires. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Les injections intraveineuses effectués au niveau du sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le(s) composé(s) injecté(s) pourra(ont) induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 foisminimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Étude préclinique de faisabilité d’un dispositif d’illumination de la cavité péritonéale et de dosimétrie de la lumière délivrée, comme traitement par thérapie photodynamique de la carcinose péritonéale ovarienne, sur un modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
Opérés pendant environ quatre heures sous anesthésie puis tués sans réveil, 12 cochons subissent une série d'ablations, hystérectomie, splénectomie, résection digestive et curages, reproduisant une chirurgie du cancer de l'ovaire. Ces gestes ne visent aucun soin pour l'animal mais servent à tester un dispositif d'illumination de la cavité abdominale et à mesurer la lumière qu'il délivre. Le porteur qualifie cette illumination homogène d'"indispensable" à la thérapie photodynamique visée chez les patientes. Le choix du porc tient à la taille et à l'anatomie de son abdomen, proches de celles d'une femme.
Objectifs
Des études précliniques ont permis de démontrer l'efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) sur la carcinose péritonéale d'origine ovarienne, actuellement en impasse thérapeutique. Trois études cliniques ont également mis en évidence la faisabilité de la PDT dans cette indication. La PDT a pour objectif de détruire les cellules tumorales résiduelles, laissées après exérèse des tumeurs visibles à l'oeil nu, disséminées dans la cavité péritonéale afin d'éviter les récidives de la maladie. En pratique, la PDT pourrait être intégrée au standard de traitement en étant proposée durant la chirurgie de cytoréduction, une fois que l'exérèse de la maladie macroscopie est réalisée. Cependant, aucun dispositif ne permet, à l'heure actuelle, l'illumination de la cavité péritonéale de façon homogène. Or, celle-ci est indispensable à la réalisation d'une PDT efficace. C'est dans ce contexte que nous avons développé un tel dispositif d'illumination. A ce stade du projet, la dernière étape avant une étude clinique permettant de démontrer l'efficacité de la PDT sur les patientes atteintes de carcinose péritonéale ovarienne à l'aide du dispositif développé au sein de la notre laboratoire, est une étude de faisabilité sur le gros animal. Ainsi, les objectifs de cette étude préclinique sont au nombre de 4. L'objectif principal est de s'assurer de la faisabilité d'une illumination de la cavité péritonéale à l'aide du dispositif lumineux faisant l'objet de l'étude en vérifiant que celui-ci peut être installé facilement et rapidement dans la cavité péritonéale. Nous mesurerons également les quantités de lumière que notre dispositif est capable de délivrer au sein de la cavité péritonéale, une fois inséré dans le corps de la patiente. Nous nous intéresserons également à la lumière que délivre le scialytique, lampe située au dessus de la patiente pendant la chirurgie, potentiellement capable d'induire un effet de PDT. Ainsi, le second objectif est de mesurer les doses de lumière par le scialytique en association avec le dispositif développé. Le troisième objectif consiste à mesurer les doses de lumières délivrées par le scialytique durant l'intervention chirurgicale. Enfin, afin de maximiser les quantités de lumière délivrées dans la cavité péritonéale et ainsi l'effet thérapeutique de la PDT, le 4ème objectif consiste à déterminer si une illumination à l'aide d'une partie du dispositif lumineux est possible pendant la chirurgie, sans gêner le chirurgien opérant.
Bénéfices attendus
Les cellules cancéreuses persistantes à l'issue de la chirurgie de cytoréduction sont responsables du taux élevé de récidive (60 à 70%). La PDT a pour objectif l'illumination de ces cellules tumorales résiduelles. L'étude préclinnique faisant l'objet de cette DAP vise à accélérer le positionnement de la PDT comme traitement adjuvant pour les patientes atteintes de carcinose péritonéale d'origine ovarienne. L'objectif a long terme, est de réduire le taux de récidives et ainsi augmenter la survie globale de ces patientes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui durera environ 4h. Durant cette intervention, l'animal subira une série de gestes chirurgicaux : exploration de la cavité abdominale (temps estimé: 10minutes), hystérectomie avec annexectomie bilatérale (20 minutes), omentectomie infragastrique (15minutes), résection/fulguration du péritoine des coupoles diaphragmatiques (25minutes), résection digestive (30minutes), péritonectomie étendue (Espace de Morrisson, cul-de-sac de Douglas et espace vésico-utérin, 30 minutes), curages lombo-aortique (30 minutes), curages pelviens (30 minutes) et splénectomie (20 minutes), identiques à ceux réalisés chez les patientes atteintes d'une carcinose péritonéale d'origine ovarienne. La quantité de lumière délivrée au sein de la cavité abdominale sera mesurée durant chaque geste. Ces gestes ont également pour objectif de permettre la réalisation du test d'insertion du dispositif lumineux dans les conditions identiques à la pratique clinique. Des points de suture seront réalisés sur le péritoine pour permettre la fixation de 16 capteurs de lumière (11 capteurs isotropiques et 4 photodiodes) et les textiles lumineux qui composent le dispositif lumineux (1 point de suture par élément). Après réalisation de tous les gestes chirurgicaux et une fois les capteurs de lumière et le dispositif lumineux (textiles lumineux et baguette lumineuse) en place, la cavité péritonéale sera remplie d'une solution diffusante d'intra-lipide chauffée à 37°C. S'en suivra une ilumination de 30 minutes. A la fin de la procédure, l'abdomen de l'animal sera refermé avant de réaliser l'euthanasie de l'animal.
Impact sur les animaux
L'animal, sous anesthésie générale, subira une série de gestes chirurgicaux après l'exploration de la cavité péritonéale, à savoir: la réalisation d'une hystérectomie associée à une annexectomie bilatérale, une omentectomie infragadtrique, l'exérèse du péritoine en regard des coupoles diaphragmatiques ainsi qu'au niveau de l'espace de Morrisson, une résection digestive concernant l'intestin grêle, la réalisation d'un curage lombo-aortique associé à des cueages pelviens, ainsi q'une splénectomie. Ces gestes sont susceptibles d'entraîner des douleurs durant la chirurgie. Toutefois, une analgésie sera administrée au début de l'intervention et au besoin, au fil de l'intervention, afin que l'animal ressente le minimum de douleur possible. Par ailleurs, il ne sera pas réveillé à l'issue de la chirurgie, on ne prévoit donc pas de nuisance ou d'effet indésirable.
Devenir
Afin de leur éviter un réveil difficile après la procédure chirurgicale, les animaux ne seront pas réveillés de l'anesthésie. Ils seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Une étude préalable sur un modèle de cavité péritonéale, développé au sein de notre laboratoire, a permis une optimisation des emplacements dans lesquels seront placés les dispositifs lumineux et les capteurs de lumière nécessaires à la réalisation de la dosimétrie. Le banc de mesure optique (capteurs de lumière, photodiodes et puissance-mètres), associé à ce modèle de cavité péritonéale, a également été défini et calibré sur la base de ces essais sur un modèle de cavité péritonéale. Cependant, notre modèle ne tient pas compte des propriétés optiques des tissus biologiques et ne permet donc pas une estimation pertinente des quantités de lumière qui seront réellement délivrées au sein de la cavité péritonéale de la patiente en clinique. Ce modèle ne permet pas non plus de mimer une chirurgie de cytoréduction complexe, telle que réalisée sur une patiente. Or, cette chirurgie de cytoréduction est indispensable à l'étude de faisabilité de l'insertion du dispositif qui doit être faîte dans des conditions les plus proches possibles de la réalité clinique. De plus une étude précise de la littérature, ne nous permet pas d'affirmer qu'aucun modèle adapté à notre étude, commercialisé ou expérimental, n'existe à l'heure actuelle. Avant d'envisager une étude clinique, il est donc indispensable de réaliser une étude de faisabilité et de dosimétrie sur le gros animal.
Réduction
Notre protocole, précisément défini, ainsi que les études préalables sur modèle de cavité péritonéale, nous permettent de réduire au strict minimum le nombreux d'animaux inclus dans la présente étude, afin d'émettre une conclusion scientifique recevable en terme de faisabilité et de dosimétrie. Toutefois, il s'agit d'une étude pilote de faisabilité, ainsi, aucune approche statique n'a été réalisée.
Raffinement
Une attention particulière sera portée à la santé et au bien-être des animaux. Durant leur hébergement, des jouets et des confs (pour jouer tout en cherchant la nourriture) seront mis à disposition dans leur enclos. L'enclos, qui sera isolé du sol par des caillebotis, leur permettra d'avoir des interactions sociales avec leur congénères. Durant notre procédure, nous nous assurerons que l'animal ne ressente aucune douleur grâce à une analgésie une anesthésie profonde adaptées. Les points limites ont été soigneusement définis : durant la chirurgie, si une hémorragie, une hyperthermie, un trouble cardiaque ou respiratoire, ou une douleur sont observés, la procédure sera stoppée afin de se concentrer sur le rétablissement de l'animal. Afin de leur éviter un réveil difficile après la procédure chirurgicale, les animaux ne seront pas réveillés. De plus, le protocole des expérimentations prévues a été défini dans les moindres détails et validé par les chirurgiens gynécologues associés à l'étude. Cela permettra notamment de réduire le stress de l'équipe et ainsi le risque d'erreur de manipulation sur le cochon anesthésié. Les chirurgiens gynécologues opérant sur les cochons anesthésis sont des chirurgiens expérimentés ayant déjà pratiqué de nombreuses chirurgies de cytoréduction sur patientes atteintes de carcinose péritonéale d'origine ovarienne. Ils ont également pu s'entraîner à l'installation du dispositif lumineux et des capteurs de lumière sur le modèle de cavité péritonéale développé au sein de notre laboratoire.
Choix des espèces
Nous avons choisi le porc pour deux raisons. Premièrement, l'étude nécessite que la taille de la cavité péritonéale de l'animal se rapproche le plus possible de la taille de cavité péritonéale de la femme, cible de notre thérapie. Deuxièmement, le porc est l'animal donc l'anatomie (en termes d'organes présents dans la cavité péritonéale et de leurs positions) se rapproche le plus de l'anatomie de la femme. Les animaux utilisés seront adultes car nous avons besoin que les organes de la cavité péritonéale soient complètement formés et qu'ils aient atteint leur taille adulte.
Rôle de l’épithélium alvéolaire dans le maintien de l’immunité entraînée pulmonaire, chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Pour étudier la cicatrice immunitaire que laisse une pneumonie dans le poumon, 420 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Une partie est irradiée puis reconstituée en moelle osseuse par injection dans le sinus de l'oeil, toutes reçoivent une administration intra-trachéale et certaines des cellules cancéreuses par voie veineuse. Le porteur décrit une perte de poids transitoire après l'infection et annonce un modèle de métastases pulmonaires "sans souffrance" jusqu'au jour de la mise à mort. Les retombées contre les infections et le cancer restent présentées comme potentielles.
Objectifs
Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Rôle des héparanases dans l’inflammation cutanée
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Enduites de crème Aldara provoquant une dermatite proche du psoriasis, 936 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements de tissus. Elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales quotidiennes, une semaine sur deux pendant neuf semaines, et présentent stress et grattage. Le projet cherche le rôle de certaines enzymes dans l'inflammation cutanée, en vue de futures cibles thérapeutiques. Le porteur affirme avoir limité le nombre d'animaux par des travaux in vitro préalables, mais juge l'étape animale "indispensable".
Objectifs
Notre laboratoire étudie le rôle des médiateurs de l’inflammation au cours des pathologies inflammatoires chroniques de la peau telles que le psoriasis. La description de l’activité de ces médiateurs proinflammatoires permet d’identifier celles qui jouent un rôle primordial dans la physiopathologie de la maladie et de les cibler en thérapie. Bien que quelques médiateurs proinflammatoires constituent des cibles thérapeutiques validées en clinique, des mécanismes d’échappement sont toujours observés, nécessitant l’identification de nouvelles cibles originales. Dans le cadre d’une collaboration scientifique nationale, nous étudions le rôle de certaines enzymes du microenvironement inflammatoire. Les rôles respectivement pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de ces molécules sont décrits dans un contexte tumorale et des outils de blocages de ces enzymes sont en cours de validation chez l’animal. Néanmoins, leurs expressions par les cellules résidentes cutanées (kératinocytes, fibroblastes) ou par les cellules immunitaires et leurs activités biologiques sont peu caractérisées dans les maladies inflammatoires chroniques cutanées. Des résultats préliminaires montrent que l’expression de ces enzymes est modifiée dans les lésions psoriasiques humaines et que les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules immunes peuvent produire ces enzymes in vitro dans un contexte inflammatoire. Le but de notre projet est de démontrer les roles régulateurs de ces enzymes dans la dermatite psoriasiforme chez la souris en utilisant des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes et des inhibiteurs originaux spécifiques de ces enzymes.
Bénéfices attendus
Ces résultats nous permettront de mieux comprendre le rôle joué par certaines enzymes dans la régulation de l’inflammation cutanée. A terme, le développement des inhibiteurs testés dans notre projet pourrait améliorer la prise en charge des patients présentant des lésions chroniques en ciblant l'inflammation induite par ces enzymes.
Procédures
-Injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours, sur animal vigile (n=72 souris). -Anesthésie générale par injection intra-péritonéale (n=936 animaux). -Application quotidienne en vigile de crème Aldara ou de vaseline sur l’oreille et sur le dos de l’animal une semaine sur 2 pendant 9 semaines (n=936 animaux). -Injection quotidienne par voie intrapéritonéale une semaine sur 2 pendant 9 semaines (uniquement pour les animaux traités, n=468 animaux). -Administration une fois par semaine des inhibiteurs enzymatiques ou des excipients par application sur l’oreille et le dos, ou par injection intrapéritonéale pendant 9 semaines. (n=468 animaux).
Impact sur les animaux
-injections intrapéritonéales: douleur et stress légère et transitoire -Anesthésie fixe : incomfort léger et transitoire au réveil -Application de crème sur le dos et l’oreille : stress léger et transitoire. Phénomènes de grattage.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques et moléculaires
Remplacement
Nous avons limité le nombre d’animaux utilisés dans notre projet en réalisant en amont des expériences sur des modèles in vitro de kératinocytes, fibroblastes, monocytes et leucocytes. Ces données nous ont permis de cibler ces 4 types cellulaires et d’analyser les expressions et fonctions de ceraines enzymes dans l’inflammation. L’intégration de ces types cellulaires dans le tissu cutané in vivo est maintenant indispensable pour vérifier les profils d’expression et les fonctions identifiées in vitro. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes dans les types cellulaires cités est indispensable pour démontrer le rôle clé de ces molécules dans l’inflammation. De même, le blocage d’activité par des inhibiteurs originaux seront testés en amont sur des cultures in vitro. Seuls les outils validés in vitro et sans toxicité seront testés sur les souris. A ce jour, il n'existe pas de modèle in silico permettant de réaliser ce projet. La modélisation in vitro ou in silico n’est pas envisageable au vu de la complexité de la réponse inflammatoire cutanée étudiée.
Réduction
L’expérience du laboratoire sur ce modèle d’inflammation chronique et la variabilité mesurée des différents paramêtres de l’inflammation nous ont permis d’utiliser un test de puissance et de calculer un effectif pour avoir des données interprétables statistiquement et robustes. Afin de limiter le nombre d'animaux, une analyse intermédiaire sera effectuée. Si aucune différence n’est observée entre les lots, l’expérience sera stoppée. Si une différence est observée nous procéderons à la réalisation des expériences sur le dernier groupe d’animaux. De même, le test des inhibiteurs enzymatiques ne sera effectué que si un phénotype est observé chez les souris génétiquement modifiées.
Raffinement
Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues avec contrôle de la température par tapis chauffant. Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupe de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées leur permettant de se cacher (nid, tunnel, matériel à ronger). Dans certains modèles d’inflammation, une perte de poids temporaire, liée à une déshydratation de l’animal, peut être observée. Afin de compenser cette déshydratation une réhydration sera effectuée de façon préventive, un gel hydraté mis à disposition dans les cages et le poids des animaux mesuré quotidiennement pendant le traitement. Des points limites gradés précis et adaptés sont proposés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocemment en cas de besoin.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris décrit et étudié depuis des décennies, autorise des comparaisons avec le système immunitaire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’inflammation cutanée et évitent d’avoir recours à des espèces animales supérieures. De plus, le projet de recherche inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 à 14 semaines lorsque leur système immunitaire est bien développé.
Evaluation de la biodistribution et de l’efficacité de nanoparticules lipidiques comme vecteur de thérapie génique dans un modèle murin de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
718 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la dystrophie musculaire de Duchenne, elles subissent jusqu'à huit anesthésies générales par animal pour des injections et des séances d'imagerie, ainsi qu'un rasage et la pose d'une boucle à l'oreille. Le porteur teste des nanoparticules censées transporter une thérapie génique vers les muscles à la place des virus. Il présente l'ensemble comme une "preuve de concept" préclinique, sans bénéfice direct pour les patients à ce stade.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique mortelle entrainant un handicap physique qui touche 5 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques de cette pathologie, presque aucun traitement n'est disponible. Les thérapies géniques utilisant des virus inactivés peuvent induire des effets toxiques et ne sont pas applicables à tous les patients. Ce projet vise à améliorer le transport des thérapies géniques en utilisant des nanoparticules à la place des virus vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité et réduire les effets toxiques. Pour cela, nous utiliserons 2 modèles de souris de la myopathie de Duchenne : un modèle léger et un modèle modéré.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de fournir une preuve de concept pré-clinique de l’efficacité thérapeutique de nos nanosystèmes pour délivrer la thérapie génique dans un modèle de souris de la myopathie de Duchenne, en vue de fournir des traitements innovants potentiellement transférables chez les patients.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale pour des raisons d'imagerie sous anesthésie générale et juste après cela, les animaux seront soumis à une injection intramusculaire ou intraveineuse (temps d'anesthésie total inférieur à 5 minutes). Les animaux seront imagés chaque jour durant les 7 jours suivant l'administration des nanosystèmes sous anesthésie générale (temps d'anesthésie inférieur à 2 minutes). Au total, 8 anesthésies générales par animale seront donc réalisées pour les étapes d'injections et imageries. Les animaux seront identifiés par pose d'une boucle d'identification à l'oreille.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des contentions pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite à la suite de l’injection du traitement. Le rasage de la face ventrale de l'animal ainsi que la pose de la boucle d'identification à l'oreille peut occasioner du stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l’efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires et chez la souris saine. Pour aller plus loin, l’utilisation d’animaux dans un modèle pathologique de la maladie est nécessaire pour démontrer l’efficacité thérapeutique de nos nanoparticules. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l’effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L’utilisation des animaux est réduite grâce des outils statistiques au nombre minimal et nécessaire pour l’obtention de données expérimentales statistiquement exploitables. Le projet étant conçu par étapes successives, si aucun effet bénéfique n’est observé sur le modèle léger de la maladie, il ne sera pas poursuivi sur le modèle modéré et également l'obtention de résultats positifs sera nécessaire pour passer d'une étude à la suivante.
Raffinement
Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie. Les études histologiques et moléculaires permettront d'évaluer l'efficacité du traitement.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris sont très proches de ceux de l'homme. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les modèles de souris pertinents utilisés présentent des signes histologiques légers ou modérés de la pathologie des patients DMD dès l’âge de 2 mois. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils ne développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie.
Comprendre comment la colonisation de certains tissus (autres que la moelle osseuse) modifie la progression d’un cancer du sang, la leucémie aiguë myéloïde
- Recherche appliquée
- Cancers
Irradiées vigiles puis greffées avec des cellules leucémiques par voie intraveineuse, 3400 souris seront toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit pourtant une maladie qui s'installe en quelques semaines, avec amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration et hypothermie. Certaines souris subissent en plus une ponction de moelle osseuse au fémur et des prélèvements sanguins répétés à la joue. L'étude porte sur les raisons de la colonisation d'autres organes par la leucémie aiguë myéloïde, avec des applications cliniques présentées comme lointaines.
Objectifs
Depuis ces dernières années, la recherche biomédicale s’est attachée à explorer « à grande échelle » la complexité liée aux gènes et aux différentes sous-populations de cellules cancéreuses, sans pour autant parvenir à saisir précisément les mécanismes à l’œuvre lors de la propagation des cellules cancéreuses dans l’organisme. Pourtant, celles-ci pourraient acquérir des caractères d’autant plus malins lorsqu’elles migrent d’un organe primaire (l’organe où se développe initialement ce cancer) vers des sites secondaires (organes qui sont colonisés dans un second temps). Pour comprendre si l’infiltration d’un site secondaire peut conférer aux cellules cancéreuses de nouvelles capacités malignes, nous avons choisi comme modèle d’étude la leucémie aiguë myéloïde (LAM) : les cellules leucémiques n’accumulent que peu de mutations (changements au niveau des gènes) et sont capables intrinsèquement de se déplacer dans le sang. Le projet que nous proposons ici cherche à comprendre quel est le bénéfice pour les leucémies aiguës de sortir de la moelle osseuse, site où la pathologie prend initialement place, pour aller infiltrer, non pas aléatoirement, mais bien spécifiquement des organes en particulier, comme le foie, la rate, ou le système nerveux central (SNC) et le cerveau. Nous allons tenter de répondre à ces questions en les considérant sous l’angle – encore peu abordé – de la dimension métabolique (soit la manière dont la cellule choisit de produire de l’énergie qu’elle utilise) et épigénétique (modifications affectant un gène sans en changer sa composition) qui pourrait moduler grandement l’aptitude des blastes leucémiques (cellules leucémiques)à infiltrer les organes à distance.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’interroger les fondements biologiques de l’infiltration blastique (la colonisation d’un organe/tissu par des cellules leucémiques) vers des sites secondaires dans les LAM dont la cause est encore méconnue et qui contribue à l’apparition de cette maladie. Cette connaissance précise permettra d’identifier de nouvelles combinaisons thérapeutiques (association de plusieurs traitements permettant d’avoir un meilleur résultat) avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées (médicament qui cible un élément impliqué dans l’apparition ou la progression de la maladie réduisant les effets secondaires) existantes qui pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.
Procédures
Les animaux vigile (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord irradiés. L’irradiation, introduction des souris dans une machine à rayon X (semblable à une radiographie),permet d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée de l'injection: 1 min). Des prélèvements de sang au niveau d’une veine de la joue de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer la prise tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang périphérique, nous ferons une ponction de cellules au niveau du fémur (durée du prélèvement: 5 minutes; sous anesthésie et analgésie). Une fois l'invasion des cellules cancéreuses établie, les animaux recevront un traitement quotidien de durée variable selon le type de thérapie (injection sur souris éveillée soit dans la cavité abdominale pendant 5 jours et/ou par gavage). De plus, certaines souris recevront un antibiotique soit dans leur alimentation soit dans l'eau de boisson, qui ici joue le rôle d’interrupteur, permettant d’exprimer de molécules capables d'éteindre les gènes.
Impact sur les animaux
Les animaux traités avec les différentes molécules (gavage, intra-péritonéal, intra veineux), greffés (administration de cellules leucémiques) ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse (introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse), les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides (amas de cellules cancéreuses forment une masse), d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête), à distinguer avec les infiltrats de cellules leucémiques (colonisations des cellules leucémiques d’un tissu donné) sur lesquels ce projet repose et qui ne font pas de masse solide.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse, le foie, la rate et le cerveau afin de définir les caractéristiques des cellules cancéreuses.
Remplacement
Pour comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller coloniser des organes à distance, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro (expériences pratiquées au laboratoire sans utilisation d'être vivant) permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut les influencer. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés quotidiennement en faisant particulièrement attention aux signes cliniques et comportementaux tels que : niveau d’activité, agressivité, attitude/posture, réaction à la manipulation, toilettage/ consommation alimentaire et hydrique mais aussi des signes mesurables non subjectifs : perte de poids (une première pesée sera réalisé aux 9 eme jours après injection des cellules leucémiques, puis chaque 3 jours), rythme respiratoire, déshydratation (plis de la peau). Suivant la grille de suivi des souris et l’arbre décisionnel préalablement établi. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites (points qui permettent d’éviter une souffrance accrue et ou prolongée de l’animale) et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide et raisonnée sera prise pour éviter toute souffrance animale. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal chaque fois que cela ne compromet pas les résultats attendus de l’expérience, si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une mise à mort de l’animal sera réalisée.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine (prolifération anormale de cellules sanguines anormales) et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Enregistrement de neurones nociceptifs périphériques pour le criblage de candidats médicaments antalgiques chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 420
Opérés ou injectés d'une substance inflammatoire sous anesthésie pour provoquer une douleur chronique, ou rendus diabétiques, 840 rongeurs, 420 souris et 420 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Tous passent au moins deux tests comportementaux d'allodynie mécanique et thermique, sans que ces tests soient nommés, avant l'enregistrement de leurs neurones de la douleur sous anesthésie, sans réveil. Le porteur décrit cette douleur chronique comme "modérée à sévère", précise que "c'est leur but", et teste sur ces neurones des candidats antalgiques venus de l'industrie pharmaceutique. Il justifie l'emploi du rat par des "raisons historiques".
Objectifs
Le projet consiste à tester des candidats médicaments de l'industrie pharmaceutique sur l'activité des nocicepteurs chez le rat ou la souris anesthésié. Ces mesures se font chez l'animal sain, ou chez l'animal présentant un état douloureux de type inflammatoire ou neuropathique, induit expérimentalement. Il y a 2 aspects distincts dans ce projet : la procédure de mesure d'activité des nocicepteurs (réalisée chez l'animal anesthésié, dite terminale ou sans réveil) et la génération des modèles physiopathologiques qui seront utilisés dans cette procdure (modèles physiopathologiques réalisés chez l'animal anesthésié avec réveil). Ce projet implique un travail de recherche fondamental car il n'y a pas ou peu de données publiées sur l’activité des nocicepteurs chez la souris, espèces qui forment pourtant via l'utilisation des souris génétiquement modifiés le coeur des avancés dans le domaine de la recherche sur la douleur.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ce projet améliorera ou apportera une connaissance nouvelle sur l’effet de conditions physiopathologiques connus pour sensibiliser l’activité des nocicepteurs périphériques et supposé comme sous tendant un état de douleur chronique. Il permettra ensuite de déterminer l’efficacité analgésiques de candidats médicaments sur ces nocicepteurs de manière spécifique (par opposition à la mesure globale réalisée en comportement).
Procédures
630 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale ou à une injection de substance inflammatoire sous anesthésie (durée inférieure à 15 min). 210 animaux seront rendus diabétiques et subiront 3 prélèvement sanguins vigiles (durée de 20 s). Tous les animaux seront soumis à au moins 2 tests comportementaux permettant de mesurer l’allodynie mécanique et thermique (durée de 30 min).
Impact sur les animaux
Les modèles physiopathologiques mis en œuvre induisent un état de douleur chronique, modérée à sévère (c’est leur but, ce projet s’inscrit dans le développement de nouveaux traitements antalgiques). La mise au point de traitements analgésiques efficaces et dénués d’effet secondaire contre les douleurs neuropathiques nécessite l’utilisation de modèles de douleur neuropathique préclinique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les mesures électrophysiologiques sont invasives et n'autorisent pas la survie des animaux.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques). C’est seulement chez l’animal entier (et non in vitro) que l’impact des caractéristiques physico-chimiques des candidats médicaments peut être évalué. D’autre part, l’électrophysiologie in vivo (et non in vitro) permet d’aboutir à une compréhension mécanistique du mode d’action des candidats médicaments analgésiques/antalgiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable pour obtenir un taux de succès élevé dans ces expériences délicates); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie, les nocicepteurs non-myélinisés, qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle lors du test de candidats médicaments (principe des mesures répétées avant/après). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apporte des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments. Pour assurer leur bien-être, les animaux disposent dans leur cage de bois à macher, de petits abris et de matière pour faire des nids. Les animaux sont contrôlés quotidiennement et des points limites sont mise en place pour éviter toutes souffrance excessive que les animaux pourraient subir.
Choix des espèces
L’utilisation du rat est due à des raisons historiques. C’est l’espèce sur laquelle le plus grand nombre de données a été obtenus dans le domaine de l’algologie. L'utilisation de la souris permet de tirer parti d’animaux transgéniques, et certains aspects physiologiques font de la souris une espèce plus appropriée que le rat pour obtenir des prédictions d’efficacité clinique. Par exemple, il a été montré que chez la souris, seules les fibres exprimant le récepteur TRPV1 étaient insensibles aux stimuli mécaniques. Cette situation est similaire chez l’homme, mais différente chez le rat. Il existe aussi parfois une plus grande homologie dans la structure de certaines cibles thérapeutiques entre la souris et l’homme que l’homme et le rat, comme c’est le cas pour le canal au sodium voltage dépendant 1.7. Les animaux sont utilisés au stade adulte, 8-12 semaines pour les souris, 6-8 semaines pour les rats. On utilise des animaux au stade jeune adulte, car ils présentent un système neurophysiologique mature et sont en forme (ce projet ne s'intéresse ni au développement, ni à l'animal âgé).
Entretien de la lignée transgénique MAPT+ (suprexprimant le gène humain de la forme T34 de la protéine tau portant la mutation P301S)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mises à mort avant six mois, 1638 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, pour entretenir une lignée génétiquement modifiée qui surexprime une protéine tau humaine mutée. Chaque animal subit un génotypage par section de deux millimètres de queue dans ses deux premières semaines de vie. Le porteur signale que la vie en élevage peut entraîner des blessures de bagarre, un pelage dégradé et un amaigrissement, et que le tatouage et le génotypage causent stress ou douleur. La mise à mort précoce vise à éviter le "phénotype dommageable" que la lignée est justement conçue pour développer.
Objectifs
Tau est une protéine qui stabilise le cytosquelette cellulaire. Elle est abondante édans le cerveau, et beaucoup plus rare ailleurs. Des mutations de cette protéine sont retrouvées dans de nombreuses pathologies neurodegeneratives, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la démence frontotemporale… La lignée qui fait l’objet de cette saisine présente une évolution rapide de la maladie, avec des répercussions cellulaires constatées des 3 mois. Le choix de cette lignée est justifié par le modèle expérimental, la tranche d’hippocampe en culture, qui implique l’utilisation d’animaux jeunes.Le but de ce projet est l’entretien de la lignée murine transgénique surexprimant le gène humain codant pour la protéine tau portant une mutation pathologique, en vue d'utilisation à des fins de recherche fondamentales.
Bénéfices attendus
La lignée sera utilisée dans le cadre d’un grand projet de recherche impliquant cinq instituts, , dont le but est de comprendre les mécanismes communs entre 3 pathologies neurodégénérative très fréquentes : la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique. Nous espérons que ces travaux nous permettrons de disséquer les perturbations de communications cellulaires constatées dans ces 3 maladies. La lignée sera également utilisée pour des projets propres au laboratoire, dont le but sera de déterminer les altérations mitochondriales dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Toutes les animaux seront soumis à une procédure de génotypage entre lors des deux premières semaines de vie. 0,2 cm de queue seront prélevés avec un ciseau pour génotypage. La procédure de prélevement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles pouvant se declarer suite à bagarre chez les animaux maintenus en élevage à savoir blessure, plaie, pelage dégradé, amaigrissement visible. les animaux pourront également ressentir du stress ou une douleur lors des procédures de tatouage et génotypage.
Devenir
Les souris seront mises à mort avant 6 mois. Cela permet d’éviter l’apparition du phénotype dommageable. Certains animaux seront utilises pour des cultures de tranches de cerveau (modèle in vitro de la maladie d''Alzheimer) une semaine après la naissance.
Remplacement
D'un point de vue méthodologique, nous nous engageons à respecter les règles de remplacement, de réduction et de raffinement. Pour le R de remplacer : Malheureusement, les modèles in vitro de la maladie d’Alzheimer existant à ce jour sont incomplets (cellules en cultures ne représentant pas l’intégralité des communications physiologiques entre les cellules du cerveau). Les modèles s’appuyant sur des organismes simples tels que zebrafish ou c. elegans ne sont encore que préliminaires. Ainsi, le modèle murin reste la référence dans l’étude de ce type de pathologie, justifiant le maintien de leur utilisation.
Réduction
Dans le cadre du respect de la règle des 3R, pour diminuer le nombre d’animaux, la production sera contrôlée par l’établissement utilisateur. 819 animaux sont concernés par cette saisine selon le calcul suivant: Sachant que 1 femelle produit en moyenne 9 bébés par portée pour cette lignée nous aurons la production de : 1 portée toutes les 3 semaines sur 5 ans = (260/3) = 86,7 portées x 9 bébés x 2 couples = 1560 souris produites Dont 780 hétérozygotes et 780 WT (répartition du génotype 50/50). Les 28 males reproducteurs seront issus de ces 780 hétérozygotes. Nous ajoutons 5% pour tenir compte des variabilités potentielle de répartition de génotype dans les portées, ou de nombre de portées par femelle : 1560*5/100=78. 1 portée toutes les 3 semaines est suffisante au maintien de la lignée et au prélevement des individus nécessaires pour maintenir le modèle in vitro de la maladie d’Alzheimer.
Raffinement
Tout est mis en place pour le bien etre animal. Les souris seront hébergées en cages collectives avec un milieu enrichi. La production sera faite en croisant des males hémizygote pour la mutation et des femelles wild type. Afin de raffiner les procédures, les males reproducteurs hémizygotes feront l’objet d’une surveillance régulière,afin de leur assurer une vie sans souffrance. Ils seront sacrifiés à 6 mois, soit bien avant l’apparition du phénotype dommageable. Ce point pourra être ajusté en fonction du bien-être de l'animal, si les points limites définis en terme d'apparence, plaie, perte de poids ou comportement pathologique sont atteints.
Choix des espèces
La souris est le modèle de rongeur le plus utilisé à l’heure actuelle pour l’étude des mécanismes neurodégénératifs dans le cadre de la maladie d’Alzheimer. Afin de pouvoir intégrer nos résultats dans la littérature existante, nous utiliserons la souris comme modèle expérimental. Les animaux seront utilisés jusqu'à 6 mois. C’est un bon compromis entre des animaux assez âgés pour pouvoir assurer un maintien de la lignée, mais assez jeunes pour ne pas présenter les premières manifestations du phénotype dommageable.
Etablissement de modèles murins et thérapies ciblées dans les tumeurs rhabdoides
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour analyses post-mortem, 2039 souris, dont 1845 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sont utilisées pour reproduire des tumeurs rhabdoïdes, des cancers pédiatriques. Elles subissent des greffes de fragments tumoraux sous la peau ou des injections de cellules dans le cerveau, y compris chez des souriceaux de sept jours, suivies de traitements par gavage et de séances d'imagerie sous anesthésie. Selon le porteur, la localisation cérébrale des tumeurs peut provoquer des troubles moteurs, des difficultés à s'alimenter et une perte de poids. Il annonce des traitements pour les enfants "à relativement court terme", tout en développant en parallèle des organoïdes humains censés réduire le recours aux souris.
Objectifs
Les tumeurs rhabdoïdes sont des cancers très agressifs touchant des jeunes enfants et dont l’origine cellulaire est mal connue. Leur localisation est variée (système nerveux central, tissus mous, reins…) mais elles présentent des caractéristiques cliniques et histologiques communes. A ce jour, trois sous-types de tumeurs rhabdoïdes cérébrales ont été décrits (« MYC », « SHH », « TYR »), probablement en lien avec leurs diverses cellules d’origine. Aucune thérapie standard n’est établie à ce jour, les chimiothérapies fortes et l’irradiation étant peu efficaces et lourdes pour de très jeunes enfants. Il est donc nécessaire de trouver des traitements nouveaux, testés au laboratoire avant d’être donnés aux enfants. Les tests de médicaments sur des lignées cellulaires in vitro sont la première approche du projet. Ensuite, il est nécessaire de vérifier que les molécules candidates ont une efficacité sur des organismes vivants. Pour cela, nous avons développé des modèles dans lesquels des tumeurs murines issues de modèles transgéniques (mis au point il y a plusieurs années) ou issues de patients ont été greffées sur des souris et nous souhaitons traiter les souris greffées avec les molécules candidates afin de retenir celles qui méritent un développement clinique. En parallèle de ces travaux, nous développons des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’obtenir de façon très sélective des tumeurs précoces, en particulier cérébrales, très similaires aux tumeurs observées chez les enfants. Nous projetons d’isoler des cellules du cerveau des souris à un stade précédant la transformation cancéreuse en les isolant de cerveaux prélevés chez les embryons de souris génétiquement modifiées afin de tenter de les maintenir en culture in vitro, et ex vivo, dans des organoïdes de cerveaux. Par la suite afin de démontrer leur pouvoir oncogénique in vivo, nous injecterons ces cellules dans le cerveau de souris d’âges divers, tenant compte du fait que la maturation du cerveau environnant peut jouer un rôle pour ces cancers cérébraux très précoces : à 7 jours de vie, à la fin du premier mois, à l’âge adulte. Nous savons donc dorénavant cibler avec plus de précision les cellules dans lesquelles les tumeurs prennent naissance et souhaitons approfondir notre compréhension moléculaire des différents sous-types de tumeurs rhabdoïdes obtenues.
Bénéfices attendus
Gains attendus des modèles de greffes de cellules et tumeurs, et des tests réalisés sur ces greffes Le projet permettra d’une part une meilleure compréhension théorique des tumeurs rhabdoides en particulier les étapes de transformation de la cellule d’origine vers la cellule tumorale et d’autre part, de développer des modèles précliniques afin d’évaluer des thérapies. Le développement de modèles de tumeurs orthotopique chez la souris (injection intra-cerebrale comme chez les patients) permettra d’évaluer des traitements expérimentaux en tenant compte de la localisation dans le cerveau comme les 2/3 des tumeurs rhabdoides chez les patients. Ces modèles d’étude ont pour objectif d’aboutir à des traitements contre certaines tumeurs pédiatriques pour les enfants avec la meilleure chance possible d’efficacité, à relativement court terme.
Procédures
Dans une première et deuxième procédure, visant à établir les modèles précliniques pour évaluer les thérapies, les animaux sont greffés soit avec des fragments de tumeurs par voie sous cutanée soit avec des cellules tumorales par voie intracérébrale, sous anesthésie (1x par expérience sur une durée d’environ 30 min). Les animaux vigiles sont ensuite traités avec diffèrents médicaments par injection intrapéritonéale ou gavage (3 fois par semaine, pendant 4 semaines – durée du geste inf à 20sec), Dans une troisième procédure permettant de générer des tumeurs intracérébrales à suivre par imagerie, les souris (de 3 âges différents) seront injectées avec des cellules tumorales en intracérébral. Cette chirurgie s’effectue en 30 min sous anesthésie générale. Puis la croissance tumorale sera suivie par imagerie sous anesthésie générale 1 à 2 fois par semaine au long de l’expérience (durée de l’imagerie : 10min). Dans une quatrième procédure visant à générer des tumeurs murines spontanées au niveau cérébral, . Les croisements entres souches appropriées sont réalisés et les souris ne subissent aucun geste technique de leur vivant. Dans une 5ème procédure utilisant des modèles de tumeurs spontanées, certains animaux vigiles recevront un produit par gavage, 1 seule fois au cours de la procédure. Les autres ne subissent aucun geste technique de leur vivant.
Impact sur les animaux
Les greffes en sous-cutané peuvent induire des douleurs après incision cutanée et suture par agrafes pendant maximum 48h.Le développement des tumeurs en sous-cutané peut occasionnellement gêner la mobilité des animaux. Les greffes intra-cérébrales peuvent induire des douleurs dans les 48h suivant la procédure de chirurgie invasive et la possibilité de complication (infectieuse) de la plaie (évènement rare). Selon la localisation de la tumeur au niveau cérébral,des troubles de la motricité avec des difficultés à s’alimenter et donc une perte de poids peuvent apparaitre. Les nuisances attendues lors de l'administration des traitements (produits non douloureux) seront celles liées à l’injection intrapéritonéale ou au gavage (gène de courte durée).
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Au préalable à chaque étude préclinique chez la souris testant l’efficacité d’un traitement, nous réalisons des tests in vitro sur des lignées cellulaires issues des tumeurs rhabdoides nous permettant de sélectionner les molecules avec les effets les plus prometteurs pour passer ensuite chez l’animal. Il est nécessaire d’utiliser le modèle animal afin de reconstituer toutes les interactions entre tous les types cellulaires.Néanmoins, pour limiter l’utilisation des souris, nous développons également en parallèle des tumoroïdes ainsi que des organoïdes humains à partir de cellules souches. Ce qui permettrait de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales pour ensuite les évaluer sur les souris. Les modèles murins restent les modèles les plus performants pour identifier les cellules d’origine des tumeurs et permettre une description des étapes précoces de la transformation cancéreuse. A ces égards, ils ne restent qu’imparfaitement remplaçables par des modèles ex vivo.
Réduction
1.Greffes et tests sur ces greffes Avant chaque étude thérapeutique préclinique, des tests in vitro nous permettent de sélectionner les molécules à tester sur des lignées cellulaires de tumeurs rhabdoïdes. Nous limitons les expériences in vivo à celles pour lesquelles un rationnel in vitro est établi. - Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum pour des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Nous limiterons le nombre de souris greffées pour chaque modèle tumoral, mais en maximisant le nombre de modèles greffés afin de reproduire la diversité observée en essais cliniques chez l’homme. Chaque tumeur sera coupée en plusieurs échantillons afin de réaliser plusieurs analyses post-mortem sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également un suivi transversal des tumeurs et améliore la significativité des expériences. 2. Etudes de cellules neuronales génétiquement modifiées -Nous limiterons à 3 le nombre maximal de tumeurs obtenues après greffes de cellules issues de cerveaux de nos souris génétiquement modifiées. La procédure d’établissement des tumeurs ne sera pas poursuivie au-delà. - les cellules tumorales exprimeront des marqueurs bioluminescents pour être suivies au cours du temps par une caméra externe à la souris, permettant un suivi de la croissance tumorale en temps réel chez l’animal vivant, afin de limiter le nombre de mises à mort « à l’aveugle ». 3.Modèles transgéniques Pour les nouveaux modèles, le phénotype d’au moins 10 souris ayant le génotype d’intérêt devra être décrit. Si les premiers phénotypes sont très identiques, le nombre de souris étudiées ne dépassera pas 10. La caractérisation des tumeurs attendues dans ces génotypes nécessitera des analyses en histologie et biologie moléculaire ; chaque tumeur sera répartie en plusieurs morceaux pour permettre le plus grand nombre possible d’analyses par échantillon. Après description du phénotype, les lignées seront maintenues avec un génotype n’exposant pas à un phénotype dommageable
Raffinement
1.Greffes Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie par voie gazeuse sera utilisée pour réaliser les gestes techniques nécessaires à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Un gel oculaire serait utilisé pour prévenir le dessèchement de la cornée si l’anesthésie devait durer plus de 5 min. Le réveil de l’animal se fera sur tapis chauffant et sera surveillé par l’expérimentateur. Les animaux seront observés tous les jours jusqu’à ce qu’ils récupèrent de l’intervention, et leur état sera évalué selon la grille de score du SBEA. Pour les greffes sous-cutanées, la croissance tumorale sera mesurée à l’aide d’un pied à coulisse Les souris seront euthanasiées dès que des signes de dégradation clinique seront observés, tels que décrits dans la grille de score Pour les greffes intra-cérébrales : l’injection de cellules dans le cerveau exprimant une fluorescence que l’on peut quantifier par caméra externe à l’animal (marqueur bioluminescent) permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive. Cette quantification par imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie gazeuse. 2. Modèles transgéniques Afin d’aider les souris qui souffriraient de troubles de la mobilité empêchant d’accéder à la nourriture, nous veillerons à disposer dans les cages de l’aliment gélifié. L’animal peut être isolé si nécessaire afin d’éviter de mauvaises interactions avec d’autres animaux. Les animaux seront suivis grâce à la grille des scores définissant les points limites et donc la fin de l’expérience.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes en sous-cutanée et orthotopiques afin de mettre au point des traitements dans les conditions d’un organisme vivant. Par ailleurs, les modèles murins génétiquement modifiés que nous prévoyons d’étudier sont pour certains déjà développés et bien caractérisés : nous savons qu’ils sont très adaptés mais qu’ils ne recouvrent pas toute la diversité moléculaire de la maladie humaine. Les modèles génétiquement modifiés à développer devraient offrir, selon nos hypothèses, un niveau de pertinence plus complet pour l’étude des divers sous-types de la maladie humaine, en ciblant des progéniteurs plus restreints. Les souris immunodéficientes et normales arriveront à l'animalerie âgées de 5 semaines. Après une période d'adaptation d’une semaine minimum à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats. Les animaux issus des lignées génétiquement modifiées seront observés de leur naissance jusqu’à l’âge adulte. Afin d’étudier à quels stades du développement embryonnaire les cellules commencent le processus de transformation cancéreuse, nous sacrifierons des femelles gestantes (pas de phénotype dommageable) et prélèverons les embryons à divers moments de la gestation (entre le 10eme et le 18eme jour post-fécondation) .
Production d’antigenes spécifiques à but de diagnostic medical de la toxoplasmose.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
9750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de Toxoplasma dans l'abdomen, développe en trois jours une ascite riche en parasites, puis est mise à mort pour prélever cet antigène destiné à des tests diagnostiques commerciaux de la toxoplasmose. Le porteur décrit cette ascite comme "particulièrement bien supportée par les animaux", alors que la quasi-totalité des souris est classée en souffrance sévère, la complication infectieuse étant la source de cette gravité. Il justifie le recours à la souris par "l'absence d'alternative de bonne qualité" et l'échec des essais in vitro à atteindre les volumes et la sensibilité requis.
Objectifs
Le diagnostic de maladies infectieuses repose sur différents critères : signes cliniques, radiologiques, facteurs de risque associés… et sur les résultats de tests biologiques. L’utilité des tests biologiques est d’autant plus grande que certaines infections présentent peu ou pas de signes cliniques caractéristiques. Un large panel de tests biologiques existe de la culture de prélèvements à la recherche d’anticorps spécifiques dans le sang des patients. Cette recherche d’anticorps spécifiques est dans de nombreuses maladies infectieuses le seul moyen de diagnostiquer et secondairement de traiter certaines maladies. C’est dans ce but qu’une collaboration entre un laboratoire Hospitalo-Universitaire et une entreprise française a été mise en place avec l’objectif de développer des tests diagnostiques de maladies pour l’homme et/ou les animaux. Nous avons mis au point des tests fiables, spécifiques et sensibles de recherche d’anticorps de pathogènes parasitaires comme Toxoplasma gondii responsables de maladies graves et parfois mortelles chez l’Homme, et particulièrement chez les femmes enceintes et les patients immunodéprimés. L’utilisation d’antigènes de ces parasites est la clé de voute de la mise au point de tests sérologiques. En l’absence d’alternative de bonne qualité, l’obtention de tels antigènes passe par l’expérimentation animale. Suite à l’injection d’agents infectieux, l’animal va développer et produire une ascite de volume modéré (< 1 ml) riche en parasites en 3 jours. A noter que cette quantité d’ascite est très inférieure à celle obtenue pour la production d’Ac monoclonaux et est particulièrement bien supportée par les animaux. Ces ascites permettront de produire des antigènes de grande qualité pour développer des tests sérologiques permettant de faire le diagnostic de patients infectés. L’objectif de ce projet est donc de permettre la production de cet antigène spécifique pour pouvoir continuer de rendre accessible aux professionnels de santé les tests de diagnostic correspondants et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.
Bénéfices attendus
La production d’antigènes de toxoplasmose est un élément essentiel à la fabrication de nos tests de diagnostic médicaux. Ces tests, parce qu’ils sont reconnus comme des réactifs de référence, sensibles et spécifiques, sont utilisés par les laboratoires des CHU et des plateformes d’analyses médicales de France et du monde entier. Ils sont destinés aux professionnels de santé dans le cadre de diagnostic de dépistage et de confirmation de la sérologie parasitaire. Les bénéfices attendus du projet sont donc directs et immédiats : permettre de maintenir la production de tests de diagnostic de la toxoplasmose et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.
Procédures
Un seul geste technique sera réalisé sur animal vivant : il s’agit de l’inoculation inaugurale par voie intrapéritonéale. Cela nécessite la contention de l’animal de quelques secondes par un personnel qualifié afin d’éviter au maximum le stress et la douleur des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les nuisances possibles sur les animaux sont les suivantes : Peur et détresse engendré par le changement d’hébergement (arrivée à l’animalerie) (légère). - Peur, détresse, stress physique et/ou thermique engendrés par les conditions d’hébergement (légère). - Peur, détresse, stress physique, douleur causés par leur manipulation (légère). - Stress physique, douleur dus à une complication infectieuse (sévère). Le projet a été conçu de manière à minimiser les dommages causés aux animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure expérimentale afin de réaliser des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Pour pouvoir ainsi répondre à l’exigence qualitative et quantitative de la demande, l’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du présent projet et la souris reste le modèle le plus adapté. Les essais de production d’antigènes en modèles in vitro précédemment engagés au sein de nos laboratoires n’ont pas permis de retrouver les hautes performances en sensibilité et en spécificité caractérisant nos tests ni même de pouvoir assurer une production dans les volumes requis. Ainsi, pour ces raisons majeures de volume de production, de défaut de reproductibilité et de qualité médiocre de l’antigène obtenu, la culture in vitro ne permet pas une production d’antigène compatible avec le développement et la production d’un test de diagnostic présentant des performances au niveau des tests actuellement commercialisés, soumis au marquage CE, à la conformité avec la norme ISO 13485 et à l’attestation CE de conformité délivrée par un organisme notifié et devant répondre aux exigences du règlement européen. Certains fabricants se sont tournés vers l’utilisation d’antigènes recombinants. Malheureusement, ici aussi les performances des tests en sont fortement impactées tout comme leur spécificité. En conséquence, au regard de toutes ces analyses, ces expérimentations ne peuvent être conduites qu’in vivo.
Réduction
La volumétrie d’animaux utilisée pour la production d’antigènes sera fonction du volume de commercialisation des tests. Malgré une forte croissance de la demande des produits, la réévaluation du nombre d’animaux nécessaires à la production d’Ag par rapport au précédent projet est peu impactée. Ceci s’explique par les analyses réalisées par le laboratoire pour augmenter la qualité des échantillons récoltés et ainsi limiter ceux définis comme non conformes à l’utilisation requise. Une estimation a été réalisée sur la période 2018-2023 : une souris permet de produire suffisamment d’antigène pour la constitution de 1000 tests de confirmation ou de dépistage. Également, le laboratoire possède les compétences pour congeler la souche entre sessions de production d’antigènes. Le parasite n’est pas maintenu en permanence sur souris. De par les volumes de production actuellement nécessaires, cela permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront hébergés par groupes d’individus compatibles, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment que ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Chacun de ces critères étant évalué fréquemment, la détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de déterminer un animal en souffrance. Une fiche suivra le protocole tout au long de son séjour dans notre animalerie et permettra d’identifier l’arrêt du protocole (points limites). Ces points limites seront : souris prostrée et isolée, poils hérissés, manque de toilettage, léthargie, ventilation anormale, tremblements. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Les soins et les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié. Afin d’éviter que le suivi de leur santé ne devienne un stress supplémentaire pour eux, la familiarisation aux manipulateurs sera quotidienne pendant la période d’acclimatation (1 semaine minimum).
Choix des espèces
Cette souche parasitaire de toxoplasmes peut infecter aisément la plupart des animaux de laboratoire, à l’exception du rat qui est particulièrement résistant et qui ne développe jamais d’infection aiguë avec ascite. Néanmoins, la souris est l’espèce intermédiaire naturelle et celle qui présente une sensibilité importante avec une production très riche en parasites. Les souris utilisées seront de jeunes adultes (femelles) de 6 à 18 semaines (de 20 à 30g). Ces animaux sont peu agressifs et la familiarisation aux manipulateurs sera effective.
Evaluation sous-cutanée de la biocompatibilité et de la dégradation d’hydrogels injectables chez la souris C57BL/6
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie, chacune reçoit quatre injections d'hydrogels sous la peau du dos, avant une mise à mort échelonnée de 24 heures à 4 semaines pour prélever les matériaux et les tissus environnants. Le projet évalue la tolérance et la vitesse de dégradation de ces gels en vue d'applications allant de la régénération osseuse au comblement des rides. Le porteur affirme que les processus inflammatoires ne sont pas modélisables in vitro, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.
Objectifs
L'étude de la littérature et nos études préliminaires in vitro ont montré l’intérêt de l'utilisation d'hydrogels comme nouveaux biomatériaux pour l'ingénierie tissulaire. De nombreuses études soulignent désormais l’importance de développer des matériaux ayant une vitesse de dégradation adaptée, et l’importance de la capacité des cellules à interagir et/ou à remodeler ces matériaux pour régénérer des tissus. L'objectif de ce projet est d'étudier la biocompatibilité de nouvelles associations d'hydrogels pour l’ingénierie tissulaire en conditions plus physiologiques que la culture in vitro. Le système inflammatoire et immunitaire joue en effet un rôle majeur dans la réponse de l'hôte dans le cadre des biomatériaux complexes. L'utilisation d'un modèle murin nous permettra de visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Un deuxième objectif est d’étudier la vitesse à laquelle les hydrogels sont dégradés en conditions physiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre l’influence de différentes formulations d’hydrogels sur les processus inflammatoires qui interviennent suite à l’implantation de ces matériaux, mais également sur les processus mis en jeu pour les dégrader. Ainsi, les résultats de cette étude devraient permettre de choisir des formulations d’hydrogels pertinentes pour des applications précises de médecine régénératrice, telles que la régénération de l’os et du cartilage mais également pour les comblements de rides et le remodelage corporel.
Procédures
Sous anesthésie gazeuse, le dos des souris sera tondu, désinfecté, puis les souris recevront chacune 4 injections en sous-cutané au niveau dorsal de nos formulations en conditions d’asepsie. Chaque injection sera très rapide, environ 10 secondes. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil qui aura lieu environ 5 min après le début de l’anesthésie. Elles seront observées quotidiennement les 2 premiers jours suivant l’intervention, puis 2 fois par semaine ensuite par les expérimentateurs en plus de la surveillance quotidienne réalisée par le personnel de l’animalerie, afin de vérifier qu’elles ne présentent pas de signes de douleur ou d’infection au niveau du site d’injection. Les souris seront ensuite euthanasiées 24 h, 72 h, 1 semaine ou 4 semaines après l’intervention. Les hydrogels et leurs tissus environnants seront ensuite explantés pour réaliser des analyses histologiques qui permettront d’évaluer la biocompatibilité et la vitesse de dégradation de ces biomatériaux.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée est un acte mini-invasif qui est déjà pratiqué par notre laboratoire depuis plusieurs années, et qui ne cause habituellement pas de douleur chez les animaux. Si tel était le cas les souris recevraient une dose d’analgésique pour pallier à la douleur. Les souris peuvent également ressentir une gêne dû à l’emplacement des hydrogels au niveau dorsal mais rien qui n’altererait leur alimentation ou leurs déplacements au delà de la simple gêne.
Devenir
Afin d’évaluer la vitesse de dégradation des matériaux et leur biocompatibilité, il est nécessaire de récupérer les matériaux ainsi que les tissus environnants. Pour cette raison, tous les animaux devront être euthanasiés à l’issue de la procédure.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont été réalisées pour simuler une dégradation enzymatique des hydrogels. Ces études ont permis de sélectionner un nombre limité de formulations pertinentes pour nos objectifs de contrôle de la dégradabilité. Pour ce qui est de la biocompatibilité, des études in vitro ont également été réalisées pour vérifier la compatibilité des cellules avec les différentes formulations. Le remplacement de l'animal pour cette expérimentation n’est toutefois pas réalisable car les processus inflammatoires et immunitaires sont complexes et font appel à des systèmes non modélisables in vitro.
Réduction
Quatre injections seront réalisées par animal, ce qui limite le nombre nécessaire de souris pour ces expérimentations. La réalisation de ces 4 injections a montré une très bonne tolérance dans les expérimentations précédentes réalisées au sein du laboratoire. Par ailleurs, plusieurs types d’analyses (analyses d’imagerie, histologie, immunohistochimie) seront réalisées sur un même échantillon pour répondre aux deux questions posées par cette étude en même temps, ce qui diminuera aussi le nombre d’animaux nécessaires. Nous réaliserons 8 injections par condition, ce qui nous permet depuis déjà de nombreuses années de mettre en évidence des résultats statistiquement différents, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour cette étude, nous avons choisi d'injecter les biomatériaux à l'aide d'une aiguille sous anesthésie gazeuse, ce qui permet de limiter le stress qui pourrait être causé par l’injection. De plus, l’injection est un procédé qui permet de limiter l'inflammation du site d'implantation, car c'est un acte mini-invasif. Après l’intervention, Les souris seront observées par les expérimentateurs quotidiennement 48h après l’intervention, puis deux fois par semaine ensuite pour s'assurer de leur bien-être. Si toutefois un signe de mal-être ou de douleur était observé, les animaux recevront une dose d’analgésique. Nous avons en effet mis en place des points limites adaptés, une grille de score et un arbre décisionnel nous permettant d’agir si le moindre signe de douleur venait à apparaître.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin immunocompétent est essentielle pour visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Les études seront réalisées avec des souris adultes, c'est-à-dire, âgées de 12 semaines. Cela correspond à de jeunes adultes avec une croissance terminée, une maturation sexuelle et un potentiel de régénération conservé.