Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Perturbations vasculaires d’origine inflammatoire dans un modèle d’accident vasculaire cérébral thrombo-embolique ou thrombotique : une opportunité thérapeutique ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère du cerveau, après pose d'une prothèse crânienne, avec suivi par imagerie puis exsanguination par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les lésions post-AVC. Le porteur indique des douleurs postopératoires et des déficits fonctionnels, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids ou d'un score de douleur élevé. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, les stratégies d'amélioration de la reperfusion restant à développer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, différents compartiments vont être séquentiellement touchés : le compartiment vasculaire sera immédiatement affecté, suite à la formation d’un thrombus qui induit in situ une diminution du débit sanguin cérébral (DSC). S’ensuit une perte de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et l’apparition de dommages parenchymateux. L'inflammation est connue pour jouer un rôle central dans l’extension de l’atteinte vasculaire au parenchyme. Ainsi, Ddans ce projet, nous allons identifier, dans un premier temps, l’impact d’une inflammation systémique sur le débit sanguin cérébral. Dans un second temps, nous caractériserons l’influence de l’inflammation ischémique sur la modulation de la reperfusion cérébrale post-ischémie dans deux modèles d’AVC (thrombo-embolique et thrombotique). Enfin nous chercherons à limiter les effets de cette inflammation pour améliorer le devenir post-AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie de l’AVC et plus particulièrement sur la modulation de la reperfusion post-ischémie par l’inflammation périphérique, afin de développer des stratégies thérapeutiques d’amélioration de la reperfusion.
Procédures
Procédure 1 : injection intrapéritonéale de Lipopolysaccharide (ou sérum physiologique) + évaluation par Imagerie par Résonance Magnétique (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min) et exsanguination par perfusion intracardiaque. Procédures 2 & 3 : J-10 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 40min). J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes ou 4 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50min). +10min, +1h, J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle et moléculaire (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min). J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5min). J+5 : Exsanguination par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacés par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Durant la pose de prothèse, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas éblouir les animaux et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post-opératoires chauffées puis remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les AVC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles pré-clinique.
Validation de l’efficacité anti tumorale de la combinaison des acides nucléiques délivré par le dendrimère pour les cancers du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
756 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pancréatiques humaines, puis on injecte des molécules par la veine de la queue avant de les mettre à mort pour prélever tumeurs et organes, afin de tester un traitement à base d'ARN transporté par un dendrimère. Le porteur suit la taille des tumeurs et prévoit une mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Il affirme avoir essayé des approches cellulaires en deux et trois dimensions sans pouvoir se passer de l'animal, invoquant l'étude au sein d'un "organisme entier", les retombées contre ce cancer restant conditionnées à l'efficacité du modèle.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer de très mauvais pronostique. A l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement efficace, et l’espérance de vie du patient excède rarement 6 mois. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer le traitement personnalisé à base de l’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents (siARN) et de petits ARN d'activation (saARN) pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précise, offrant une thérapie efficace et personnalisée.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est l’évaluation et la validation d’un nouveau traitement pour le cancer du pancréas, une maladie de très mauvais pronostic sans traitement efficace à ce jour. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ce modèle tumoral, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d’autres cancers résistants à la chimiothérapie classique ou à la radiothérapie, ou sur d’autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.
Procédures
Pour atteindre les objectifs de ce projet, les souris seront étudiées pour la biodistribution et l’efficacité anti tumorale après injection intraveineuse, dans la veine de la queue, de molécules fluorescentes sous anesthésie générale. À terme, les souris seront mises à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes.
Impact sur les animaux
Les souris seront sous anesthésie générale par gaz lors de l'implantation des tumeurs afin de faciliter la manipulation tout en réduisant le stress et la douleur des animaux. Les animaux recevront, si nécessaire, un antidouleur. L’efficacité et la toxicité de des combinaisons seront étudiées en mesurant les tailles des tumeurs, les poids et les comportements des souris. À terme, les souris seront mise à mort afin de prélever le sang, les tumeurs et les organes pour l’analyse biochimique et histologique
Devenir
Les animaux seront mise à mort sous anesthésie générale à la fin de cette étude ou lorsqu’un des points limites suscités sera atteint (voir annexe I). Le sang et les tumeurs seront prélevées, tout comme le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins, le pancréas et le cerveau afin de chercher des lésions éventuelles sur ces organes.
Remplacement
Dans le respect de la règle des 3R et concernant le remplacement, nous avons tenté d'utiliser toutes les méthodes substitutives possibles notamment les approches cellulaires 2D et 3D, mais nous ne pouvons pas nous passer du recours à l’animal pour l’étude de l’efficacité et la bio-distribution de nos traitements. Au vu de la complexité du cancer du pancréas, l’utilisation de souris immunodéficientes, qui sont des modèles bien établis en cancérologie expérimentale et ont fait l’objet de plusieurs milliers de publications, est justifiée et ne peut être remplacée pour plusieurs raisons. Le fait que ces souris ai un système immunitaire diminué facilite la prise de la greffe de cellules tumorales pancréatique humaine, et limite le phénomène de rejet. De plus, l’utilisation de ces modèles de souris immunodéficientes permettent le maintien des caractéristiques moléculaires, histologiques, phénotypiques et génotypiques des tumeurs pancréatiques d’origine, ce qui ne peut pas être obtenu in vitro. Ces souris nous permettront d’étudier au sein d’un organisme entier l’efficacité et la bio-distribution de nos nanomédicine, et obtenir des résultats fiables représentatifs de la tumeur d’origine.
Réduction
Concernant la réduction dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d’animaux grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant d’optimiser la taille des effectifs. Nous n'utiliserons que le nombre d’animaux nécessaires pour l'exploitation statistiques des données. Le nombre de souris de chaque groupe a été calculé avec un test statistique de t de Student. En conséquence, des effectifs de 8 individus par groupe devraient permettre d’obtenir des résultats statistiques fiables pour l’évaluer l’efficacité, et des effectifs de 5 individus par groupe pour étudier la bio-distribution de chaque, soit sur chaque modèle de tumeur, il faut 12 groupes de 8 souris (en total 96 souris) pour l’évaluer l’efficacité de chaque nano-médicine, et 6 groupes de 5 souris (en total 30 souris) pour étudier la bio-distribution de chaque combination. Le nombre total d’animaux pour ce projet est estimé à 756 souris : 576 souris pour évaluer l’efficacité (procédure 1) et 180 souris pour la bio-distribution (procédure 2) sur les ensembles de 6 modèles de cancer pancréas primaire.
Raffinement
Dès réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 10 jours pendant laquelle ils seront familiarisés à la manipulation par les expérimentateurs. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux. Dans chaque cage, nous mettons plusieurs types d’enrichissement (rouleaux de papier, dôme de cellulose, carrés de coton, etc.) ; les litières sont changés toutes les semaines ; de petits groupes sociaux sont constitués afin d'éviter le stress de l’isolement (groupe de 5 souris pour une cage de 530cm²) ; La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum Les souris sont endormies sous anesthésie gazeuse Vetflurane pour tous les actes qui pourraient générer de la douleur (implantation de tumeurs), puis mises sous une lampe chauffante et surveillées jusqu'à leur réveil. Un contrôle quotidien des souris sera effectué en plus d'un contrôle approfondis bihebdomadaire de l'état clinique de nos animaux sera réalisé́, d’avantage si leurs états le nécessitent, Une grille de score a été mise en place pour évaluer les signes de souffrance, identifier les points limites et indiquer la conduite à tenir en fonction de l’état de santé de l’animal.
Choix des espèces
Pour mener à bien notre projet, nous avons besoin d’une espèce de mammifère dépourvu de système immunitaire pour éviter les phénomènes de rejets des greffes de tumeurs humaines. Ces souris qui sont des modèles bien étbalies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et, d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité des agents thérapeutiques. De plus, la souris est facilement manipulable, de par sa petite taille, d’une utilisation simple et peu couteuse, ce qui fait un modèle expérimental de choix pour notre projet.
Le virus de la grippe provoque des altérations distinctes des macrophages alvéolaires humains et murins : une analyse comparative pour une perspective translationnelle
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les infecte par le virus de la grippe puis, au septième jour, par le pneumocoque, une surinfection qui provoque troubles respiratoires, perte de poids et prostration et tue en deux à trois jours si elle n'est pas arrêtée, les instillations se faisant sous anesthésie parfois par incision de la trachée. Le porteur cherche à comprendre pourquoi les macrophages pulmonaires réagissent différemment chez la souris et chez l'humain, et à tester des molécules immunomodulatrices dont un brevet est en cours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la tolérance d'un "organisme entier", tout en décrivant des travaux sur tranches de poumon humain censés réduire le recours aux animaux.
Objectifs
Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d'un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Cependant, lors d’une infection grippale, la morbi-mortalité n’est pas attribuée seulement au virus influenza, mais aussi à des co-infections bactériennes (40% dans notre service de réanimation). Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque) est le principal agent de ces co-infections, responsable de la sévérité de l’infection et de décès potentiels. Les macrophages alvéolaires (MAs) sont essentiels dans la défense contre les infections à pneumocoque. Une déplétion des MAs chez des souris avant une infection par le pneumocoque entraîne une multiplication bactérienne dans les poumons 100 fois plus élevée par rapport au groupe témoin. Pourtant, une infection grippale chez les souris diminue la population des MAs d’environ 80%. Nous avons mené une étude observationnelle chez l’homme pour confirmer et quantifier la déplétion des MAs après une infection grippale (étude multicentrique). Surprenamment, la quantité de MAs reste stable lors d’infections grippales chez l’homme, remettant en question nos connaissances actuelles sur le rôle des MAs. Notre objectif est de comprendre cette différence souris-homme. Nous souhaitons étudier des modèles de souris plus proches de la réalité humaine : dose virale faible, souris plus âgées, souris avec expérience d’infections antérieures. L’exposition à des composés microbiens façonne le développement et la fonctionnalité du système immunitaire, influant sur la réactivité des MAs aux défis ultérieurs par un phénomène appelé immunité entraînée. Nous avons récemment découvert qu'une reprogrammation métabolique des MAs pouvait altérer leurs propriétés immunitaires, et nous souhaitons étudier ce phénomène chez la souris (et chez l’homme) lors d’une surinfection grippale à pneumocoque. Enfin, nous avons démontré que certaines modifications métaboliques induites par le virus influenza pouvaient être inversées, notamment par l’ajout de succinate ou d’autres molécules immunomodulatrices (Demande de brevet en cours). Nous souhaitons évaluer si ces molécules pourraient représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre les surinfections grippales à pneumocoque.
Bénéfices attendus
L’infection grippale est un problème de santé publique majeure ; chaque avancée dans notre compréhension est importante. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle préférentiel pour l’étude des pathologies respiratoires humaines. Nous avons récemment mis en évidence que l’une des faiblesses de ce modèle réside dans la différence entre les macrophages alvéolaires (MAs) murins et humains. Les MAs sont l’une des cellules les plus impliquées dans l’immunité pulmonaire, notamment dans les co-infections bactériennes, responsables de la gravité des présentations cliniques chez l’homme lors d’une infection grippale. Cette différence peut biaiser les recherches effectuées dans ce domaine et limiter la translation souris-homme des thérapies. Ainsi, nous proposons d’améliorer le modèle murin d’infection grippale et de surinfection bactérienne en nous rapprochant de la relevance humaine. Nous espérons que les résultats issus des expériences décrites ici vont faire rapidement progresser nos connaissances et fournir de nouvelles pistes de compréhension sur le rôle des MAs dans cette pathologie. Ce projet permettra d’améliorer la translationalité des recherches dans le contexte des pathologies respiratoires, et notamment des thérapies antigrippales. De plus, nous possédons déjà des molécules immunomodulatrices qui ont démontrées leur intérêt thérapeutique sur un modèle de cellules épithéliales infectées par le virus de la grippe, ainsi que sur un modèle murin d’infection in vivo. Certaines de ces molécules ont notamment un effet protecteur sur les MAs infectés par le virus de la grippe. Ces molécules proviennent d’un nouveau concept de défense immunitaire, l’immunometabolisme ; présentant plusieurs bénéfices attendus : Ces molécules naturelles et endogènes de l’homme (et non des drogues de synthèse), ont des propriétés antivirales à large spectre ainsi qu’un potentiel anti-inflammatoire puissant. Cette double action diminue le risque de résistance ; et permet de conserver un effet thérapeutique protecteur même dans le cas d’une instillation tardive, à l’inverse des molécules antivirales actuellement sur le marché. Pour l’ensemble de ces raisons, l’étude des MAs représente une avancée majeure pour lutter contre la grippe, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement efficace.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées, par injection intrapéritonéale, 3 ou 4 fois selon les groupes, pour une durée quelques minutes à chaque fois, durant lesquelles elles recevront soit une instillation intranasale soit une instillation intra-trachéale. Cette dernière nécessite une petite incision en haut de la trachée. Ces instillations ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale nécessite une contention pour l’injection intrapéritonéale ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Cette anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales et intratrachéales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’instillation intratrachéale nécessite une petite incision en haut de la trachée. Notre modèle d’infection grippale à faible dose virale entraîne des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal à partir du 7ème jour post-infection. La surinfection bactérienne a lieu au 7ème jour chez la souris et provoque une infection qui, si elle n’est pas contrôlée, aboutie à la mort des animaux en 2 à 3 jours. Le cumul de ces infections va induire une altération modérée de longue durée, affectant le bien-être et l'état général des animaux (troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité, température corporelle abaissée, prostration, fermeture totale ou partielle des yeux).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe. Par contre, un effort important est fait pour remplacer certaines explorations in vivo par la mise en place de différents modèles de macrophages alvéolaires in vitro et ex vivo (macrophages alvéolaires), pour étudier les altérations immunométaboliques induites par le virus de la grippe. Enfin, certaines explorations sont directement faites chez l’homme quand cela est possible (culture ex vivo de macrophage alvéolaire humain, coupe de poumon issue de pièce opératoire).
Réduction
Premièrement, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition, nous allons utiliser une technique d’instillation par la trachée. Cette technique permet une instillation dans seulement l’un des deux lobes pulmonaires. De fait, la souris représente son propre contrôle, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. Cette technique a été apprise lors d’un séjour d’étude à l’étranger et nous souhaitons la mettre en place dans notre laboratoire pour limiter le nombre d’animaux et les variations interindividuelles. Secondairement, nous allons récupérer les macrophages alvéolaires issus des souris entraînées ou traitées par des métabolites pour les cultiver en laboratoire. Cela permet de réaliser plusieurs types de tests sur des MAs issue d’une seule souris, limitant ainsi l’utilisation des animaux. Ajouté à cela, nous développons actuellement des modèles de tranches de poumons humains et murins. Cette technique, permet de réaliser un grand nombre de tranches de poumons à partir d’un seul donneur (environ 20 tranches par poumon de souris). Ce modèle permet à la fois de conserver la structure pulmonaire et la diversité cellulaire. Ainsi, cela permet la réalisation d’un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toutes procédures d’instillation intranasale ou intra-trachéale seront précédées d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. L’état de sédation de l’animal suivant ces anesthésies sera de maximum 20 minutes. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d'animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus de la grippe humaine et présentent des symptômes cliniques similaires à l'homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les souris sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Les MAs de ces souris semblent plus résistants à l’infection grippale, se rapprochant de la réponse des MAs humains. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature. Afin d’avoir des souris correspondant à l’âge moyen humain de notre étude (64 ans), des souris agées de 24 mois seront également utilisés.
Amélioration de la greffe d’ilots par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
65 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent un vecteur viral et des immunosuppresseurs, puis subissent une greffe de cellules pancréatiques dans le foie par voie portale, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, pour tester une thérapie génique censée rendre le foie tolérant à la greffe. Le porteur indique un risque de saignement à l'injection dans la veine porte et une baisse d'immunité exposant aux infections. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'organisme receveur, tout en reconnaissant que le passage à l'humain supposerait d'abord un partenariat industriel et des validations chez le primate.
Objectifs
L'objectif du projet est de jeter les bases expérimentales d'une nouvelle approche de la greffe d'îlots de Langerhans en clinique humaine. Celle-ci s'effectue actuellement avec des îlots de donneur ou, dans les essais thérapeutiques en cours, avec des cellules pancréatiques issuées de cellules souches humaines. Dans les 2 cas, une immunosuppression importante est necessaire pour tolérer les cellules greffées. Comme les îlots greffés son transplantés dans le foie du receveur par voie portale, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules issues du donneurou cellules souches le cas échéant. Nous avons conçu une stratégie qui consiste à introduire dans les hépatocytes le gène d'une cytokine anti-inflammatoire (IL 10). Pour effectuer ce transfert, nous utiliserons un vecteur viral adéno-associé (AAV) employé actuelleent dans la grande majorité des thérapies géniques (+ de 200 essais de phase 1 ont utilisé/utilisent ces vecteurs pour véhiculer des gènes thérapeutiques). Le vecteur portant le gène de l'IL10 sera injecté au receveur avant la greffe d'îlots. Les cellules hépatiques capteront le vecteur et exprimeront le gène thérapeutiue dans les 2 semaines qui suivront. L'IL10 produite permettra de réduire, voire d'inhiber la réaction immunologique de rejet du greffon qui sera implanté un mois après l'administration du vecteur.
Bénéfices attendus
Après l’achèvement du projet chez le rat, nous aurons en cas de succès obtenu la preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). Dans la mesure où la thérapie génique par vecteurs AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines, la biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront aucune barrière inattendue dans notre projet clinique. On peut donc en cas de succès chez le rat anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez qui les greffes restent actuellement très restreintes du fait des limites et des complications de l’immunosuppression. Pour réaliser ce transfert, il faudra très probablement aborder un partenariat avec une société biotechnologique disposant des moyens financiers suffisants pour conduire des validations spécifiques chez le primate et aller vers l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirugicale, à savoir la greffe de cellules pancréatiques. De plus, les animaux recevront des administrations de médicaments immunosuppresseurs et d'adénovirus 4 semaine avant la greffe. Enfin, les animaux seront prélevés de sang de façon hebdomadaire (
Impact sur les animaux
La transplantation des ilots de Langerhans se faisant dans le systeme sanguin portal, cela peut engendrer des saignements +/- abondants localement. Ceux-ci seront controler par l'application d'eponge hemostatique au niveau du point d'instillation de la veine porte. Cependant, il est eventuellement possible qu'un leger signement persiste après suture et réveil de l'animal (peu probable). Egalement, du fait des traitements immunosuppresseurs, les animaux traités verront leur immunité diminuée. Ils pourraient être eventuellement plus sensible aux infections. Une vigilance accrue sera prévue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune methode alternative efficace nous permettant de mimer l'organisme receveur. L'emploi d'animaux est essentielle dans un tel projet. Néanmoins, des manipulations in vitro préalables nous permettront de déterminer les meilleures concentrations cellules/virus.
Réduction
en fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative Le choix est donc orienté sur 5 animaux- receveurs par groupe pour pallier toute défaillance technique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Pour la transplantation faite sous anesthésie, un traitement anti-douleur local sera pratiquée, et pour des douleurs plus globales, un traitement systémique est prévu. Afin de suivre le moindre inconfort, nous avons élaborer un arbre décisionnel afin d'adopter les bons gestes et soins suivant les cas (Comportement, Plaie, perte de poids). Si toutefois, ces soins étaient insuffisants pour améliorer la santé de l'animal concerné, nous procéderons à l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le choix s'oriente chez le rat pour plusieurs : - Taille compatible avec un chirurgie (transplantation intra-hépatique aisée et moins dommageable que chez la souris) - Capacité d'hébergement adapté
Potentiel thérapeutique de l’immunoblocage de l’interaction entre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) lors des traumatismes crâniens
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur inflige un traumatisme crânien, suivi d'IRM, d'évaluations neurologiques et d'une perfusion intracardiaque létale au trentième jour, pour tester un anticorps censé bloquer une interaction moléculaire aggravant les lésions. Le porteur indique une perte de poids, une hypothermie, des douleurs et des déficits cognitifs, et prévoit une mise à mort si le poids chute de plus de 15 % ou si le score de douleur dépasse un seuil. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, la stratégie thérapeutique pour les patients restant à proposer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens (TC), qui restent mal pris en charge sur le plan clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons à la fois le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.
Procédures
Traumatisme crânien (J0) (Durée : 15min ; n=80) + traitements (n=40) + IRM (J3, J15, J30 ; Durée : 60min/Session) + évaluation neurologique (J3, J15, J30 Durée : 30min/Session) + perfusion intracardiaque (J30) (n=80) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J30).
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ce modèle.
Optimisation du schéma d’administration de molécules permettant de rentrer dans le cerveau chez le babouin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
3 babouins juvéniles vont être utilisés, maintenus en vie et destinés à d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut être anesthésié jusqu'à dix fois pour recevoir des injections intraveineuses de fragments d'anticorps et subir seize prélèvements sanguins de 8 mL, avec deux périodes d'isolement d'une semaine, afin de mesurer la disponibilité de vecteurs censés faire passer des médicaments dans le cerveau. Le porteur indique un stress de capture, des suites d'anesthésie comme des vomissements et un réveil long, et des hématomes liés aux prélèvements répétés. Il affirme qu'il est "nécessaire" de passer par le primate non-humain avant l'humain, cette étude préparant une future étude d'efficacité dont les retombées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives cérébrales (Alzheimer, Parkinson, Sclérose latérale amyotrophique, etc…) sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe et la plupart des traitements pour ces pathologies ne ciblent pas les mécanismes à l’origine de leur développement. Le cerveau est protégé des pathogènes qui pourraient circuler dans le sang par ce qu’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est imperméable au passage de la plupart des agents thérapeutiques développés par l’industrie pharmaceutique. Nous développons des Vecteurs (V : petits fragments d’anticorps) qui vont se fixer sur des récepteurs présents à l’intérieur des vaisseaux sanguins du cerveau et qui, comme pour les nutriments, vont les faire passer au travers de la membrane des capillaires cérébraux. En couplant nos vecteurs à des molécules thérapeutiques nous sommes capables de délivrer dans le cerveau des médicaments qui autrement ne pourraient pas y aller. Au cours de différentes études réalisées chez la souris, nous avons démontré l’efficacité de nos vecteurs dans ce domaine. L'objectif de la présente étude est de quantifier la disponibilité de deux de nos vecteurs (étude pharmacocinétique simple) une fois injectés dans le sang chez 3 babouins et ceci de façon préalable à une future étude d’efficacité où nous couplerons à nos vecteurs à un agent thérapeutique (étape nécessaire pour valider l’aspect translationnel vers l’Homme en fin d’étude préclinique). En effet les résultats de cette étude nous permettront de définir les modalités optimales du schéma d'administration pour l'étude d'efficacité (la dose, une injection ou plusieurs, en bolus ou en infusion).
Bénéfices attendus
Les enjeux de la réussite d'un tel projet sont assez conséquents. En effet si nos vecteurs sont en capacité d'emmener dans le cerveau des médicaments qui ne pouvaient l'atteindre jusqu'à présent le potentiel est énorme pour le traitement de très nombreuses pathologies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, Sclérose latérale amyotrophique, etc…). A court terme nous comptons grâce à cette étude en planifier une autre qui aura pour but d'emmener dans le cerveau des médicaments qui auront pour but d’empêcher certaines cellules à fabriquer des facteurs responsables de maladies. Ainsi les limites des applications et des cibles de ces médicaments vont bien au-delà des médicaments classiques car ils vont faire synthétiser ou inhiber la synthèse par ces cellules des facteurs absents ou responsables de l'apparition des pathologies. Les bénéfices à long terme de ce projet sont donc de combattre plus efficacement les maladies neurodégénératives cérébrales. A court terme les résultats de cette étude nous permettront d’établir le schéma d’administration de nos composés pour la future étude d’efficacité où sera couplé ce type de molécule thérapeutique.
Procédures
Au cours de la 1e anesthésie, les 3 babouins recevront une injection intraveineuse (
Impact sur les animaux
Stress lors des captures. Anesthésies et conséquences (détresse respiratoire, réveil long, vomissement, dysorexie). Isolement d'une semaine en groupe. Prélèvements sanguins répétés (hématomes). Douleur au site d'injection intramusculaire.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les sujets seront maintenus en vie car les prélèvements et injections ne sont ni invasifs ni douloureux, ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.
Remplacement
Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécanistiques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. Après les phases précliniques menées chez le rongeur pour les récepteurs ciblés, il est nécessaire de passer chez le primate non humain pour évaluer le potentiel translationnel chez l’Homme avant le passage en clinique réglementaire. Le babouin olive représente un de ces modèles qui permet d’étudier ce potentiel. Le développement de nos vecteurs ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des séquences des vecteurs qui vont être testées passe chronologiquement par une phase d'analyses des différents vecteurs sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux. Ces dernières sont ensuite testées in vitro sur lignées cellulaires avant le passage sur modèles souris avant d’envisager le passage sur PNH.
Réduction
La conception de ce projet vise non seulement à réduire au maximum l’utilisation des primates non-humain (PNH), mais aussi de limiter les interventions à des manipulation transitoires, peu invasives et non terminales. L’expérience acquise chez la souris mais aussi les investigations préalables menées chez le PNH en terme immunogénicité et d’endotoxines permet de se contenter de ce petit n. Le fait de tester également 2 versions de nos vecteurs chez les mêmes animaux nous permet de ne pas inclure 3 animaux supplémentaires et donc de réduire le nombre de babouins utilisés.
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). En infirmerie, le programme est renforcé par 2 à 4 enrichissements supplémentaires par jour (manipulatoire, alimentaire, visuel, auditif...) Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. La capture est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Les administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie : les animaux seront sédatés par injection intramusculaire seule ou suivie d'un relais gazeux. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés et des mesures de réchauffement sont mises en place (matelas air chaud pulsé et couverture de survie). Pour compenser les 4 prélèvements sanguins au cours de la 1e anesthésie, un bolus de perfusion sera administré à la fin du 4e prélèvement. Les animaux seront réveillés par arrêt des gaz anesthésiants mais également injection intramusculaire d’antidote ce qui permet un réveil plus rapide. Pour limiter l’apparition des hématomes, une alternance entre côté droit et gauche sera respectée entre chaque prélèvement. A la fin de chaque prélèvement un point de compression sera appliqué à la main pendant 1 à 3 minutes afin de limiter le risque d’hématome. Les individus seront hébergés pendant toute la durée du projet entre eux en groupes sociaux. Ils seront seulement séparés de leurs groupes de façon transitoire au moment des prélèvements (soit pendant 1 semaine) et toujours avec un congénère. Les animaux seront réintroduits dans leurs groupes sociaux dès le réveil de l'anesthésie du dernier prélèvement, après validation de l’état de santé par un vétérinaire, suivant la procédure validée par la Structure chargée du Bien Être Animal (SBEA).
Choix des espèces
Après les phases précliniques menées chez le rongeur wild type et humanisé pour les récepteurs ciblés, il est nécessaire de passer chez le primate non humain pour évaluer le potentiel translationnel chez l’Homme avant le passage en clinique réglementaire. Nous avons choisi des stades de développement précoces (juvéniles) car à ce stade le développement des récepteurs à la transferrine sur la BHE est déjà stable. De plus à ce stade les animaux ne dépassent pas 8kg et il nous est donc possible de produire la quantité de vecteurs nécessaire pour cette étude en interne, ce qui n'aurait pu être le cas pour des individus plus âgés. Par conséquent les animaux seront sélectionnés entre 8 mois et 4 ans afin de garantir un poids inférieur à 8kg.
Inhibition de la cathepsine C dans un modèle murin de la Dysplasie Bronchopulmonaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
120 souris, mères et souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont exposés dès la naissance à 75 % d'oxygène pendant quatorze jours pour reproduire une dysplasie bronchopulmonaire, puis reçoivent deux injections intrapéritonéales par jour, avant d'être mis à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'hyperoxygénation provoque une insuffisance respiratoire et peut léser les intestins, les yeux et le cerveau, et vise à tester l'inhibition d'une enzyme, la cathepsine C. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit une réponse immunitaire complète, les retombées pour les enfants prématurés restant formulées au conditionnel.
Objectifs
Les nouveaux nés atteints de la dysplasie bronchopulmonaire ont une inflammation chronique dans les poumons, liée à la présence d’enzymes qui sont délétères. Leur inhibition pourrait donc être bénéfique d’un point vue thérapeutique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’inhibition indirect de toutes ces enzymes, via l’inhibition de la cathepsine C, dans un modèle murin de la dysplasie bronchopulmonaire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre l'identification d’un nouveau traitement préventif et/ou curatif pour les enfants prématurés sous ventilation mécanique. Un traitement préventif ou qui diminue les conséquences de la pathologie pourrait améliorer l’espérance et la qualité de vie à l’âge adulte de ces patients.
Procédures
Hyperoxygénation pour les mères et leurs souriceaux : 75% d'oxygène pendant 14 jours, ou 75% d'oxygène 1 heure par jour pendant 14 jours. Injection intrapéritonéale 2 fois par jours pendant 14 jours pour les souriceaux.
Impact sur les animaux
La première nuisance est l’exposition à l’oxygène qui entrainera la pathologie pulmonaire, qui chez les humains se traduit par une insuffisance respiratoire. L’exposition à l’O2 peut également entrainer des dommages au niveau des intestins, des yeux et du cerveau. Les autres nuisances seront les douleurs liées aux injections et le stress lié aux manipulations.
Devenir
Les mères et les souriceaux soumis à l'hyper-oxygénation seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses.
Remplacement
La dysplasie bronchopulmonaire est une pathologie inflammatoire qui fait intervenir le système immunitaire et notamment les neutrophiles. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de mettre en place une réponse immunitaire complète et l’effet qu’un traitement pourrait avoir dessus. Cette pathologie atteint la morphologie pulmonaire au niveau des alvéoles, et du système vasculaire notamment ; il n’existe pas de modèle pulmonaire in vitro permettant d’avoir une bonne représentation de la maladie. Ainsi l’efficacité du traitement ne pourra être réalisée que sur un modèle in vivo.
Réduction
D'après des expériences réalisées par d'autres laboratoires avec de la fumée de cigarette ou de l'ozone, les lots devront être constitués d'au moins 8 animaux pour atteindre des différences statistiques.
Raffinement
Pour le confort des souris les dispositions suivantes sont prévues : manipulation des animaux à l'aide d'un tube, présence de dôme, de papier pour nidation, de nourriture et eau ad libitum, de jeux type rouleaux en de carton et de récompense comme des fruits secs ou des graines après chaque manipulation. Les animaux seront observés quotidiennement. Leur poids sera contrôlé. Le comportement de la mère et des souriceaux sera observé, ainsi que leur aspect physique : poil, oreille. En ce qui concerne le raffinement pour les femelles gestantes : massage abdominal, réchauffement de la femelle sur couverture chauffante, tentative de sortie manuelle de l’embryon coincé.
Choix des espèces
Il y a deux raisons à l’utilisation du modèle murin pour ce projet. La première concerne la mise en place du modèle de dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. Cela permet d’utiliser les souriceaux à leur naissance, alors que l’on devrait pratiquer une césarienne sur d’autre modèle. La seconde raison est la disponibilité de souris déficiente en cathepsine C, qui nous permet de faire notre preuve de concept. Les souris adultes (8 semaines) seront utilisées pour la reproduction et pour le sevrage des souriceaux dans le cas de la mère. Les souriceaux seront utilisés dès leur naissance pour la mise en place du modèle de la dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. La mise en place du modèle dure 14 jours, les jeunes souris seront euthanasiées à ce moment-là pour la récupération des échantillons.
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, dont 752 en gravité sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, puis des enregistrements neuronaux pendant l'éveil et le sommeil et des tests comportementaux aversifs, pour étudier des récepteurs du glutamate liés à la mémoire de la peur et à l'anxiété. Le porteur qualifie ces procédures comportementales de "modérément aversives et brèves" sans détailler les tests, et signale des douleurs postchirurgicales, des risques anesthésiques et un isolement. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne préserve un réseau neuronal intact, les retombées contre les troubles anxieux étant renvoyées au long terme.
Objectifs
Le projet se déroulera dans deux EU différents. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet vise à l’étude des récepteurs ionotropiques du glutamate, qui font partie d’une grande famille de récepteurs aux neurotransmetteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le cerveau des vertébrés. Ces récepteurs du glutamate jouent un rôle central dans la communication entre neurones et dans les processus cognitifs tels que l’apprentissage et la mémoire. Les récepteurs du glutamate étant impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’une sous-population de récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pourcent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Les animaux provenant de notre établissement seront impliqués dans 2 transports (aller et retour). Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement 2) injection de virus + comportement 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. Seule l'injection de virus sera réalisée dans notre EU(2). L'ensemble des autres procédures est réalisé dans l'EU1. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes (stress modéré) ; comportement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress) ; identification génétique des animaux réalisés par prélèvement de quelques millimètres à l’extrémité de la queue (douleur légère et stress de courte durée).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, au sein de l'établissement d'origine des animaux, afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ce projet est réalisé sur deux établissements et a déjà été autorisé pour l'établissement n°1. Aucun animal supplémentaire n'a été ajouté.
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux: dont 1920 impliquées sur ce site.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Evaluation des bénéfices des levures sur la robustesse de la truite
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
180 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après six semaines d'une alimentation enrichie ou non en levures, 90 poissons reçoivent sous anesthésie une injection simulant une infection bactérienne et 90 une injection saline, avant d'être tués huit heures plus tard pour prélever sang, foie, intestin et rate. Le projet cherche à renforcer l'immunité innée des truites d'élevage pour une aquaculture présentée comme "nécessaire" face à la demande. Le porteur indique qu'une étape d'alimentation empêche de mener l'étude en culture cellulaire.
Objectifs
Qu'ils proviennent de la pêche ou de l’aquaculture, les poissons jouent un rôle important dans l’alimentation humaine. Selon les prévisions, la production aquacole devrait augmenter de 15 % d'ici 2030. Cette croissance est nécessaire pour fournir à une population croissante des aliments sains et nutritifs. Cependant, cette croissance doit s’appuyer sur une production aquacole durable, c’est-à-dire respectueuse de l'environnement mais aussi capable de s’adapter au changement climatique. Il est donc important que les poissons d’élevage soient plus robustes. Une façon de renforcer la robustesse des animaux est d'augmenter leurs défenses immunitaires. Le système immunitaire des animaux comporte deux parties : l'immunité innée et l'immunité adaptative ou acquise. L’immunité innée est une protection naturelle présente dès la naissance. Elle agit rapidement lors d’une infection mais n’est pas spécifique de l’agent pathogène (bactérie, virus…). L’immunité acquise se développe au cours de la vie. Basée sur la production d’anticorps, elle est spécifique d’un agent pathogène et bénéficie d’un effet mémoire c’est-à-dire que l’animal réagira de manière plus rapide et plus efficace lors d’une autre infection par le même pathogène. Cependant, une idée nouvelle en immunologie suggère que l'immunité innée peut également être entraînée pour lui permettre d’être plus réactive face à de futures infections. Pour entrainer l'immunité innée, il suffirait d’exposer les animaux à des molécules capables de déclencher la réponse immunitaire innée. On trouve certaines de ces molécules en abondance dans la paroi des levures, comme la levure de bière ou de boulangerie. L'objectif de ce projet est donc d’ajouter des levures dans l'alimentation de la truite pour stimuler et entrainer son immunité innée et ainsi augmenter ses défenses immunitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir s’il est possible d’améliorer les défenses immunitaires de la truite arc-en-ciel par le biais de son alimentation. Les levures sont fréquemment utilisées dans l’alimentation des animaux d’élevage pour améliorer la croissance et la santé des animaux. Ainsi cette expérimentation permettra d’évaluer si l'ajout de levure dans l’alimentation de la truite permet d’augmenter les défenses immunitaires de cet animal et le rendre plus robuste face au changement climatique.
Procédures
Dans cette expérimentation, des jeunes truites arc-en-ciel seront nourries pendant 6 semaines avec des aliments contenant ou non des levures. Au bout de ces 6 semaines, 90 poissons recevront sous anesthésie, une piqûre d’un produit simulant une infection bactérienne et 90 autres recevront également sous anesthésie, une piqûre de solution saline (eau salée). Huit heures après l’injection, les poissons seront anesthésiés puis euthanasiés et différents tissus et organes (sang, foie, intestin et rate) seront prélevés sur ces animaux morts. Ce délai de huit heures a été démontré dans des études précédentes, comme nécessaire et suffisant pour induire une réaction inflammatoire.
Impact sur les animaux
Les 6 semaines d’alimentation qui précèdent l'injection du produit destiné à provoquer une réaction immunitaire chez les poissons, ne devraient causer aucune nuisance ni effet indésirable aux poissons car ceux-ci seront élevés de manière traditionnelle et nourris avec des aliments adaptés à leurs besoins. De plus, la levure qui sera introduite dans l’aliment bénéficie d’une autorisation d’utilisation en alimentation des poissons d’élevage. Pour réduire le risque d’infection lié au fait de piquer la peau du poisson avec une aiguille, la seringue et l’aiguille seront stériles et changées entre chaque poisson. L’injection de la solution saline stérile n’a aucun effet sur l’état de santé du poisson et son comportement comme l’ont démontré des études précédentes. L’injection du produit simulant une infection bactérienne devrait déclencher une réaction inflammatoire chez la truite. Des études ont montré que ces injections ne présentent aucun risque pour la vie de l’animal mais entrainent une réaction immunitaire similaire à celle que l’on peut observer après une vaccination.
Devenir
Huit heures après l’injection, la totalité des poissons (180) seront anesthésiés puis euthanasiés afin de procéder à des prélèvements de foie, d’intestin, de rate et de sang.
Remplacement
Le projet requiert une étape prélable d'alimentation des animaux, il ne peut donc pas être réalisé en culture cellulaire.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au strict minimum tout en restant suffisant pour prendre en compte les différences de réaction entre les truites arc-en-ciel lors de l'injection du produit stimulant l'immunité, garantissant ainsi la fiabilité des résultats. Ce nombre de poissons a été établi en utilisant des outils statistiques.
Raffinement
Les mesures de raffinement prévues visent à garantir des conditions idéales pour les poissons, notamment en faisant en sorte qu’il n’y ait pas plus de 9 à 10 kg de poissons par mètre cube d’eau, en renouvelant l'eau en continu pour apporter suffisamment d’oxygène aux poissons, en créant une colonne de bulles pour enrichir l'environnement, en respectant le rythme naturel du jour et de la nuit et en plaçant un nombre suffisant de poissons dans chaque bassin (27 poissons) pour favoriser les interactions sociales. Les bassins seront équipés de couvercles ajourés pour éviter la prédation par des oiseaux et limiter le stress lié aux activités des techniciens. Les poissons seront nourris manuellement deux fois par jour jusqu'à ce qu’ils ne montrent plus de signe de faim, les techniciens surveilleront deux fois par jour, à l’occasion des repas, le comportement et le bien-être des poissons, en complétant une fiche basée sur des critères comportementaux et physiques. Si un point limite est atteint, l'animal sera euthanasié conformément aux réglementations. La manipulation des truites sera effectuée par des personnes expérimentées, les injections seront faites sous anesthésie générale, et tous les prélèvements d’organes et de tissus seront réalisés sur des animaux préalablement euthanasiés.
Choix des espèces
La truite arc en ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale en France. L’expérimentation sera réalisée sur de jeunes truites arc-en-ciel d’environ 150g. Cette taille de poissons permet la collecte d’échantillons de tissus ou d'organes dont les tailles sont compatibles avec la réalisation de plusieurs analyses.
Effets d’une série de composés à visée thérapeutique en développement sur l’athérosclérose chez la souris ApoE -/- nourrie avec une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever cœur et aorte, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris ApoE, prédisposées à l'athérosclérose et nourries au régime gras, reçoivent deux injections intrapéritonéales par semaine pendant douze semaines, des prélèvements sanguins à la queue et une anesthésie terminale. Le projet teste quatre candidats-médicaments sur le développement des plaques d'athérome. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne permet d'étudier cet effet.
Objectifs
L'athérosclérose est un phénomène caractérisé par la formation de plaques d'athérome, constituées de lipides, sur la paroi des artères, induisant un durcissement et une perte d'élasticité de ces dernières. L'athérosclérose constitue un facteur de risque cardiovasculaire majeur. En effet, la rupture des plaques d'athérome peut conduire à une mauvaise oxygénation des organes, notamment le cerveau et le cœur et favoriser la survenue de complications graves telles que l'infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ainsi, du fait de ces complications, et malgré l'existence de traitements ralentissant son évolution, l'athérosclérose demeure l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le développement de médicaments permettant un meilleur contrôle du développement de l'athérosclérose fait ainsi l'objet d'intenses recherches par les laboratoires pharmaceutiques. Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de 4 candidats médicaments sur le développement des plaques d'athérome chez un modèle de souris génétiquement modifié développant spontanément de l'athérosclérose, notamment lorsque ce dernier est soumis à une alimentation enrichie en graisses. Les candidats médicaments seront administrés 2 fois par semaine par voie intrapéritonéale pendant 12 semaines. L'effet de ces traitements sera observé principalement par analyse des plaques au niveau de l'aorte et des vaisseaux sanguins du coeur (coronaires).
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à prévenir et traiter l'athérosclérose. Cette pathologie restant l'une des cause principales de mortalité dans le monde, il existe un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché d'un nouveau médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis : 1) à des pesées régulières (une par semaine, soit 14 pesées; durée : 2 minutes/pesée) _ 2) à deux administrations intrapéritonéales par semaine pendant 13 semaines (1 semaines d'habituation et 12 semaines de traitement; durée : 2 minute par administration) - 3) à trois prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (durée: 5 minute/prélèvement) - 4) à une anesthésie pour administration IV d'une sonde fluorescente (durée : 10 minute) - 5) à une anesthésies terminale avant euthanasie (durée : 10 minute).
Impact sur les animaux
En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleurs aiguës lors des administration intrapéritonéales, et des prélèvements sanguins.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tronc aortique, coeur) sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur la formation et le développement des plaques d'athérome.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris utilisé, soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie intrapéritonéale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3 animaux par cage) afin de satisfaire leurs besoins sociaux. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. L'administration intraveineuse de la sonde fluorescente sera pratiquée en rétro-orbital sur animal anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent notamment une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.
Choix des espèces
La souris ApoE est un modèle génétique présentant une déletion du gène codant pour l'apolipoprotéine E, une protéine constitutive des lipoprotéines, structures chargées du transport des triglycérides et du cholestérol dans le sang. Cette mutation induit chez ces souris une propension à développer spontanément des plaques d'athérome, en faisant un modèle de choix pour les études précliniques. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Production d’anticorps de souris spécifiques de protéines recombinantes et essai de candidats vaccins contre le paludisme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Immunisées avec des protéines du parasite du paludisme mêlées à l'adjuvant de Freund, ou avec des candidats vaccins à ARNm, 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prises de sang et des injections, puis, en fin d'expérience, une ponction cardiaque sous anesthésie qui les vide de leur sang, pour produire des anticorps de laboratoire et trier des candidats vaccins. Le porteur évoque aussi des souris "préalablement infectées par du Plasmodium berghei" pour valider les préparations vaccinales, sans décrire cette infection parmi les actes prévus. Il écrit que les souris au taux d'anticorps insuffisant seront mises à mort à la fin de chaque procédure, puis qu'elles "peuvent être réutilisées dans d'autre projets dans la mesure du possible".
Objectifs
Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, pour Plasmodium falciparum, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du mérozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins contre Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax.
Bénéfices attendus
Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.
Procédures
1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.
Devenir
Toutes les souris ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.
Remplacement
L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium. De plus, l’utilisation de souris préalablement infectées par du Plasmodium berghei permet de valider les préparations vaccinales avant d’envisager de futur développement de ces vaccins.
Réduction
Le nombre de souris pour chaque expérimentation a été calculé au plus juste pour permettre un nombre minimum des animaux. Cette estimation a été réalisée en concertation avec un biostatisticien. Ainsi, nous avons choisi des groupes de 5 souris dont les sérums seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse de nos souris, nous mettrons en œuvre un enrichissement de l’environnement avec par exemple des abris et des bâtons de coton pour la nidification. Si les souris montrent des signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation (injections et prélèvements) seront pratiqués.
Choix des espèces
Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes chez la souris. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris avant de continuer leur développement. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.
Analyse longitudinale de l’effet remyélinisant d’une molécule dans un modèle de souris démyélinisé en utilisant l’imagerie par résonance magnétique – EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues démyélinisées par une alimentation spéciale pendant douze semaines, elles reçoivent des injections intramusculaires d'une molécule puis passent des examens d'imagerie par résonance magnétique de deux à quatre heures sous anesthésie, transportées entre deux établissements. Le projet suit la régénération de la myéline dans un modèle de sclérose en plaques. Le porteur affirme que la remyélinisation ne peut être reproduite in vitro et impose le test dans un "organisme entier".
Objectifs
Dans le système nerveux central, le prolongement majeur des neurones que l’on appelle l’axone est entouré d’une gaine de lipides, ou myéline, qui permet d’optimiser la réponse du neurone et participe au fonctionnement correct des différents tissus et organes du corps humain. Les maladies qui détruisent la myéline dans le système nerveux central sont dites démyélinisantes. La plus commune est la sclérose en plaques (SEP) qui atteint une majorité d'adultes jeunes entre 20 et 40 ans. Les troubles neurologiques associés touchent diverses fonctions comme la motricité, la sensibilité, la vision. Une régénération spontanée de la myéline détruite existe au cours des premières étapes de la maladie, mais le processus finit par s’épuiser conduisant donc à des handicaps irréversibles. Les traitements actuellement disponibles permettent de réduire l'inflammation déclenchée par le système de défense de l’organisme contre les agressions extérieures, mais aucun ne favorise la régénération de la myéline indispensable pour éviter une maladie très invalidante. Nous avons précédemment mis en évidence des propriétés remyélinisantes (régénération de la myéline) intéressantes pour une molécule dans des modèles de démyélinisation (perte de myéline) focale. L’objectif de ce projet est la mise en place d’une étude longitudinale destinée à visualiser par imagerie par résonance magnétique (IRM) la régénération de la myéline induite par cette molécule en utilisant un modèle chronique de démyélinisation chez la souris, classiquement utilisé pour refléter plusieurs caractéristiques des phases tardives de la SEP. La présente demande concerne donc un projet multi-sites (2 établissements utilisateurs). La première partie (établissement utilisateur 1/2) a été préalablement autorisé par le ministère. La deuxième partie est réalisée dans un deuxième établissement utilisateur car elle nécessite une expertise et un équipement spécifiques indisponibles dans le premier établissement utilisateur (l'imagerie par résonance magnétique chez la souris). Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté par rapport au projet initial autorisé dans le premier établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
Du point de vue scientifique, ce projet pourrait permettre d’identifier une molécule remyélinisante qui comblerait le vide thérapeutique actuel dans le domaine de la sclérose en plaques. Cette molécule pourrait permettre d’éviter les handicaps neurologiques irréversibles qui finissent par apparaître au cours du temps chez les malades.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur (EU 1/2) : les souris traitées auront reçu un traitement dans leur nourriture pendant 12 semaines afin de mettre le modèle de la maladie en place. Tous les animaux (traités et contrôles) seront transportés de leur établissement utilisateur d’origine vers un deuxième établissement utilisateur (EU 2/2). Dans le second établissement utilisateur (EU 2/2) : les souris traitées recevront la molécule à tester ou son contrôle, vigiles, tous les 4 jours pendant 21 jours (6 injections au total par animal), par voie intramusculaire après une anesthésie locale (le temps d’une injection dure environ 30 secondes). Trois examens IRM seront réalisées sur une partie de ces souris traitées sous anesthésie gazeuse à 0, 3 et 6 semaines après le début du traitement. Les autres souris traitées seront imagées si besoin pour obtenir nos effectifs statistiques si nous rencontrons un problème. Les souris contrôles seront quant à elles soumises à un unique examen IRM sous anesthésie gazeuse. La procédure IRM dure 4h maximum par animal, 2h30 en moyenne (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal).
Impact sur les animaux
Avant leur arrivée dans notre établissement les animaux (32 souris) auront ingéré une nourriture en poudre supplémentée par une molécule entraînant une perte de myéline (gaine de lipide présente autour des prolongement des neurones) mais cette perte est restreinte au cerveau sans atteinte de la moelle épinière et n’entraîne donc pas de troubles moteurs. A l’issue du transport entre l’établissement d’origine et d’accueil, la période d’acclimatation sera inférieure à 7 jours pour 16 animaux, pouvant causer du stress. La période d’acclimatation est réduite pour ces animaux, car il est nécessaire de pouvoir établir le niveau de démyélinisation basal le plus rapidement possible après la préparation du modèle, avant de commencer le traitement par la molécule ou le véhicule. La molécule à évaluer dans ce projet, tout comme le véhicule contrôle, sera administré par voie intramusculaire (I.M.), car les connaissances pharmacocinétiques actuelles ne permettent pas d’utiliser une autre voie. Il est possible que cela provoque une gêne et une légère douleur au niveau du site d’injection se traduisant par un léger boitillement des animaux à la suite de l’injection. Aucun effet indésirable n’est attendu par la molécule elle-même, car il s’agit d’une molécule déjà testée à la même dose chez d’autres modèles rongeurs, dans le cadre d’autres applications thérapeutiques, sans reporter de toxicité. Les animaux subiront une anesthésie générale unique (8 souris) ou à jusqu’à 3 reprises lors des sessions d’IRM (20 minmum à 32 maximum) pouvant causer un stress thermique (hypothermie), des difficultés cardio-respiratoires et une non récupération de la vigilance suite à l'anesthésie.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux (40 souris) seront euthanasiés au sein du deuxième établissement utilisateur. Ce projet est réalisé sur deux établissements utilisateurs et n'ajoute aucun animal supplémentaire. Pour les animaux ayant effectué au moins un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) (au minimum 28 animaux, au maximum 40 animaux), le cerveau sera prélevé pour réaliser des analyses histologiques dans le cadre de l’évaluation de l’efficacité de notre molécule d’intérêt.
Remplacement
Le processus de remyélinisation (regénération de la myéline) met en jeu plusieurs types cellulaires en dehors des cellules qui synthétisent la myéline, en particulier des cellules inflammatoires. L’évaluation sur culture de ces cellules a permis de déterminer l’effet pro-myélinisant in vitro de la molécule. Mais le processus de remyélinisation qui a lieu dans un organisme à l’issue d’un processus de démyélinisation (perte de myéline) se fait au sein d’un environnement inflammatoire mettant en jeu d’autres types de cellules et des neurones qui sont tous impliqués de manière complexe dans la remyélinisation, ce que l’on ne peut pas reproduire in vitro. Aussi le test de la molécule dans un organisme entier est nécessaire.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés est de 40 souris, dont 8 souris contrôles non traitées (4 mâles et 4 femelles) et 4 groupes de 8 animaux traités avec une molécule permettant d’établir notre modèle pathologique, puis par un véhicule ou la molécule d’intérêt à tester. L’étude longitudinale nous permet de réduire le nombre d’animaux tout en examinant 3 temps successifs. Notre expertise dans le domaine nous permet de dire que 5 animaux par groupe seront suffisants pour visualiser l’effet remyélinisant (regénération de la myéline) si l’on considère les valeurs moyennes dans les conditions 'tests' et 'contrôles' classiquement observées dans nos analyses histologiques. Nous traiterons 8 animaux par groupe pour créer notre modèle, étant donné la durée de l’expérience (18 semaines) et la nécessité de 3 anesthésies générales successives, espacées de 3 semaines, qui pourraient conduire à la perte prématurée de certains animaux. Les 3 animaux supplémentaires viendront en remplacement des éventuels animaux perdus. Nous pourrons ainsi maintenir un effectif suffisant pour notre interprétation statistique. Pour les animaux contrôles, 4 animaux de chaque sexe nous permettent de mesurer un niveau basal de myélinisation pour les comparer par la suite avec les animaux traités.
Raffinement
Dans l'établissement utilisateur 1 sur 2: Les injections intramusculaires (I.M.) sont effectuées par du personnel maîtrisant ce geste, après anesthésie locale avec un système de contention adapté. La molécule injectée a déjà été testée chez des modèles rongeurs à la même dose, sans reporter d’effet toxique. Les 4 dernières semaines de traitement, les animaux seront habitués au système de contention (1 fois par semaine). Dans l'établissement utilisateur 2 sur 2: Le jour du transfert tous les animaux repassent à la nourriture classique avec de la nourriture pulvérisée non supplémentée pour assurer la transition. Le transport est réalisé par un transporteur agréé au calme dans une boîte de transport (trajet inférieur à 30 min) avec leurs congénères, de quoi boire et s’alimenter ainsi que de l’enrichissement. Les animaux seront observés à leur arrivée et transférés en zone d’hébergement avec les mêmes congénères et de l’enrichissement dans des cages ventilées et dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie, éclairage afin de garantir le respect des normes sanitaires. Avant l’imagerie, les souris sont laissées 30 min dans la pièce de préparation puis observés pour vérifier leur état. Lors de l’imagerie (sous anesthésie générale), l’animal est positionné dans un système de contention dédié au système d’imagerie. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui pour éviter toute douleur, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter la déshydratation oculaire. La température de l'animal est maintenue à température physiologique grâce à un tapis chauffant placé sous la cage d’induction puis avec un système de circulation d'eau chaude intégré au berceau IRM. Un contrôle des paramètres physiologiques est réalisé avec une sonde rectale et un capteur de pression respiratoire. De la vaseline sera appliquée avant d’introduire la sonde de température. La profondeur de narcose est contrôlée pendant l’examen (4h maximum) via le rythme cardio-respiratoire. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas d’atteinte de points limites établis (respiration trop lente ou rapide, température corporelle anormale). Pour le réveil l’animal sera placé dans une chambre thermostatée à 37 degrés, sous surveillance et stimulation régulière. La remise en zone d’hébergement sera faite avec des animaux ayant repris une activité normale dans leur cage.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme d’imagerie, leur taille permet de les utiliser dans ce type de scanner par imagerie par résonance magnétique (IRM) pour acquérir des images 2D, 3D ou 4D (dimension temporelle) capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Nous disposons d’un modèle souris de démyélinisation (perte de myéline) classiquement utilisé pour refléter plusieurs caractéristiques des phases tardives de la sclérose en plaques (SEP) chez lequel nous souhaitons tester un traitement via l’injection intramusculaire d’une molécule pour ses capacités remyélinisantes (regénération de la myéline). Les souris (mâles et femelles) seront âgées entre 20-21 semaines (correspondant à l'âge du début du traitement par la molécule et au pic de démyélinisation) à 26-27 semaines (soit à 6,5 mois, 3 semaines après la fin du traitement par la molécule d'intérêt pour étudier les effets à long termes après l'arrêt du traitement).