Recherche appliquée
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Rôle de la coagulation et de l’inflammation dans l’ischémie intestinale chez la souris et évaluation de l’efficacité de différents traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
720 souris femelles vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Leur abdomen est ouvert et l'artère irriguant l'intestin est clampée pendant une heure pour provoquer une ischémie, suivie d'une reperfusion et de prélèvements sanguins, certains animaux recevant un anticoagulant ou un anti-inflammatoire. Le porteur indique que la pathologie provoque des lésions de l'intestin et une contamination du sang par des bactéries, ce qui justifie selon lui l'euthanasie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne simule la circulation complexe en jeu et juge la simulation informatique "peu prédictive".
Objectifs
L’ischémie mésentérique aigue est une affection grave provoquée par une obstruction des vaisseaux irriguant l’intestin, diminuant le flux sanguin et l'apport d'oxygène dans ce dernier et entraînant une détresse intestinale. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes de la formation de caillots et de l’inflammation dans les vaisseaux sanguins irriguant l’intestin dans cette pathologie. En effet, l’intervention chirurgicale permettant la désobstruction des vaisseaux sanguins, induit une réoxygénation trop rapide du tube digestif, et conduit paradoxalement à des lésions des vaisseaux et de l’intestin importantes. Certaines études expérimentales animales ont montré́ que les lésions intestinales étaient initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus de l’intestin qui n’étaient plus irrigués. Cela est appuyé par certaines études, utilisant des modèles expérimentaux animaux, qui suggèrent l’idée qu’une réoxygénation progressive du tissu réduiraient les lésions intestinales. Notre hypothèse de recherche est que les mécanismes associés à la formation des caillots obstruant les vaisseaux et l'inflammation sont impliqués dans les lésions vasculaires et intestinales observées dans la pathologie. Nous avons également émis l'hypothèse que l'inflammation dû à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin pouvait être un facteur aggravant, qui pourrait participer à l'amplification des phénomènes observés. Deux objectifs sont décrits pour ce projet : 1) Caractériser les mécanismes conduisant à la formation d’un caillot et à l’inflammation contribuant à l’obstruction des vaisseaux sanguins irriguant l’intestin. 2) Explorer l’intérêt de différents traitements (Anti-coagulants, anti-inflammatoires) dans la limitation des lésions intestinales en thérapeutique expérimentale chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les vaisseaux irriguant l’intestin après l’élimination de caillots obstruant ces derniers et empêchant l’apport d’oxygène au niveau de l’intestin. Nous étudierons également, l'intérêt d’utiliser des traitements anti-coagulants et anti-inflammatoires dans cette pathologie. En effet, l’évaluation de nouveaux traitements susceptibles de contrôler les phénomènes responsables des lesions des vaisseaux et de l’intestin est primordiale afin d’améliorer le pronostic des patients atteints d’ischémie intestinale. La perfusion d’anti-thrombotiques tels que l'héparine, d’anti-inflammatoire comme l’aspirine ou des agents limitant les phénomènes d’inflammations dus à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin, pourraient diminuer la mortalité des patients atteints d’ischémie intestinale dans toutes ces applications cliniques encore insuffisamment comprises et efficacement traitées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Ils seront opérés sur une table chauffante à 37°C, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, un clamp sera posé sur l'artère principale permettant l’irrigation de l’intestin (artère mésentérique supérieur) induisant l’interruption temporaire de la circulation sanguine au niveau intestinal. Le clamp sera maintenu en place pendant 1 heure avant d’être retiré afin de rétablir la circulation sanguine intestinale. Nos observations commenceront dès la pose du clamp (ischémie) et jusqu’à 1 heure après le retrait du clamp (reperfusion). Un prélèvement sanguin sera effectué en début et en fin de procédure. Afin d'évaluer l'efficacité de différentes molécules thérapeutiques, certains animaux se verront administrer par injection intra-veineuse un traitement anti-coagulant ou anti-inflammatoire au cours de la procédure. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de la pathologie attendus sont des dommages de l’intestin et une contamination du sang par les bactéries provenant de l’intestin, justifiant l'euthanasie sous anesthésie générale en fin de procédure. Les effets indésirables liés à la procédure sont : une douleur liée à l’injection de l’analgésique et une douleur liée à la procédure chirurgicale en cas de réveil de l’animal (évité avec une surveillance continue et un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.
Remplacement
L’ischémie intestinale et les lésions associées à la reperfusion intestinale sont une maladie grave, d'une mortalité extrême (80% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes et encore très mal connue. L'utilisation d'un modèle non animal n'est pas réalisable et pas pertinent pour cette pathologie. En effet, aucun modèle non animal ne permet de simuler le circuit complexe de circulation et les nombreuses interactions impliquées dans le développement de la pathologie. Ces multiples paramètres et l’hétérogénéité de la pathologie en font un modèle difficilement reproductible en milieu artificiel et peu prédictif via l’utilisation de logiciel informatique.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux a été déterminé d’après une analyse statistique. Nous avons estimé qu’il faut inclure 10 animaux par groupe au minimum pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Une revue bibliographique nous a permis de sélectionner les doses pour les traitements ciblés les plus pertinentes afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Avant les procédures expérimentales, les animaux sont dans une cage spacieuse qui permet aux souris de se déplacer librement et d'adopter des comportements naturels, en groupe pour permettre une interaction sociale entre les souris et avec litières (copeaux de bois) et boites pour encourager les comportements de nidification. Les souris seront opérées sur une table chauffante à 37°C sous anesthésie générale. Après une analgésie pour réduire les douleurs durant la procédure, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'un gaz (induction dans une chambre dédiée et maintien à l’aide d’un masque). Les effets de l’anesthésie et l’analgésie seront suivis tout au long de la procédure. En cas de signe de réveil, la quantité d’agent anesthésiant sera augmentée. Si les signes persistent ou d’autres signes indiquant une souffrance de l’animal apparaissent, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de l’ischémie mésentérique aigue chez la souris est déjà décrit dans la littérature et notre équipe est déjà formée à la procédure qui a montré des résultats applicables à ce qui peut être observé chez l’homme. Des souris femelles adultes (7 à 9 semaines) seront utilisées pour que les vaisseaux irriguants l'intestin puissent être facilement visualisés sous loupe. Des souris plus âgées ou un autre modèle animal risqueraient de présenter des zones grasses autour des vaisseaux, compromettant leur observation. De plus, notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie.
Évaluation par imagerie par résonance magnétique d’une stratégie thérapeutique à base d’apeline 13 dans un modèle d’ischémie cérébrale murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivi d'injections, de prélèvements sanguins répétés et de plusieurs IRM sous anesthésie. Le porteur indique que la chirurgie entraîne une perte de mobilité, des troubles de la déglutition pouvant conduire à une fausse route et au décès, et une perte de poids. Il teste des injections répétées d'apeline-13, approche qu'il présente comme jamais rapportée, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la physiopathologie de l'AVC.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Sa forme ischémique est causée par l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot de sang. L’occlusion de l’artère entraine une crise énergétique, par défaut d’apport en glucose et oxygène et provoque la destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements de recanalisations (thrombolyse chimique et thrombectomie mécanique), 50% des patients traités gardent des séquelles. La plasticité vasculaire et neuronale constitue le pivot de la récupération post-AVC. En situation post-ischémique, différents mécanismes compensatoires de néovascularisation sont activés. Ces mécanismes physiologiques compensatoires peuvent s’avérer insuffisants pour assurer une reperfusion efficace lors d’épisodes ischémiques aigus, mais également chroniques. Plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC (thérapies régénératives, agents neuroprotecteurs, entrainement physique + cognitif). L’Apeline et son récepteur APJ sont largement distribués dans différents tissus et organes. La littérature suggère un effet protecteur de l’Apeline sur la neurotoxicité, le stress oxydatif, l’apoptose neuronale et joue un rôle neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant, dans ces études, une seule administration d’Apeline est faite le jour de l’ischémie. Par ailleurs, les bénéfices sont évalués à très court terme et l’expression d’APJ au-delà de J1 post-ischémie demeurent non documentés.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline-13 dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez un modèle murin. Ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature à ce jour. Les troubles cognitifs pouvant être associés à l’AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline-13 est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit en per-opératoire. Dans ce modèle, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Dans ce projet l’objectif est de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée de traitement plus longue et d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des différents troubles moléculaires, moteurs et cognitifs après la survenue d’un AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire l'ischémie cérébrale. Les animaux seront soumis à des injections dans le but de leur administrer le traitement (de 1 à 3 injections selon le groupe). Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin à J-1, à 3 prélèvements sanguins à J1 (ante, per, post tMCAO) ainsi qu'un prélèvement à J3 avant la mise à mort. Ces prélèvements seront réalisés à la queue lorsque les souris seront endormies pour effectuer les IRM. La première IRM aura lieu pendant l'ischémie pour une durée d'environ 30 minutes. Suite à la reperfusion ainsi qu'à J1, J2 et J3, 4 autres IRM seront effectuées et devraient avoisiner 90 minutes chacunes. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J3. Le cerveau sera finalement prélevé au terme du protocole.
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, de petits volumes, qui seront effectués grâce à une unique incision caudale. La chirurgie a pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque d’hypothermie qui sera pris en charge par l’utilisation d’une plaque chauffante pour la chirurgie et d’une couverture chauffante compatible IRM pour l’imagerie in vivo. Plusieurs injections intraveineuses seront réalisées dans les sinus rétro-orbitaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure permettant le prélèvement des tissus cérébraux.
Remplacement
Diverses approches peuvent être utilisées pour étudier la physiopathologie de l’AVC. Parmi elles, l’in vitro, permettant d’étudier les effets de l’hypoxie sur différents types cellulaires, régulièrement indépendamment les uns des autres. Néanmoins, la physiopathologie de l’ischémie cérébrale, bien que de mieux en mieux décrite, reste complexe. En effet, celle-ci se compose de différents mécanismes spontanés s’influençant mutuellement sur la durée. Ces mécanismes mettent en jeu différents types cellulaires et évoluent au cours du temps. Pour caractériser l’évolution temporelle de ces divers processus en réponse à un traitement pharmacologique, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental permettant l’interaction de ces mécanismes complexes, indissociables les uns des autres. Par ailleurs, l’AVC étant à l’origine de troubles moteurs comme cognitifs, notre étude vise également à investiguer les bénéfices neuro-comportementaux de notre traitement, d'autant plus que la souris se présente comme une alternative intéressante du fait des nombreuses similitudes observées entre cette espèce et l’Homme en ce qui concerne les grandes artères cérébrales. De plus, le modèle tMCAO murin est un modèle excessivement bien documenté dans la littérature. Enfin, il pourrait néanmoins être utile d’implémenter notre étude de modèles in vitro pour déterminer précisément les mécanismes d’action et les voies moléculaires impliquées au sein des différentes populations cellulaires indépendamment les unes des autres.
Réduction
En l’absence de données dans la littérature, cette étude nous permettra d’évaluer s’il existe ou non, un effet du traitement répété à l’apeline 13 sur la réduction du volume final de l’infarctus/ réduction des troubles cognitifs dû à la survenue d’un AVC. Nous prévoyons un maximum de 60 souris pour cette procédure. La variabilité importante (environ 20%) de la taille de l’infarctus final généré par l’occlusion artérielle justifie que le critère d’évaluation principal (volume de la lésion) soit normalisé au volume d’hypoperfusion, évalué par IRM durant la phase d’occlusion. Cette normalisation doit permettre de limiter la variabilité interindividuelle des mesures et réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les animaux utilisés dans la partie 1 permettront à la fois d’évaluer la perfusion cérébrale après traitement sans et avec ischémie cérébrale. Pour évaluer le modèle ischémie cérébrale transitoire chez la souris au cours du temps nous utiliserons l’IRM, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Les études déjà publiées chez la souris utilisent des nombres de souris très variables allant de n=6 à n>20. Dans notre étude nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’apeline-13 sur 3 jours. Il n’existe pas d’études chez la souris, nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire. Nous avons donc choisi d'avoir des groupes de 12 animaux pour nous permettre une évaluation statistique fiable à la fin de l'étude (test non paramétrique de wilcoxon pour les comparaisons entre 2 groupes). Ce nombre est suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et permettre de déterminer la meilleure fenêtre d’imagerie pour chaque traceur dans notre modèle.
Raffinement
Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections IV et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress et la douleur et un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale (ropivacaïne) et/ou générale par injection en s.c de morphinique (buprénorphine). Pendant une heure après la chirurgie une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le modèle d’ischémie cérébrale transitoire chez la souris est bien décrit dans la littérature. Cette technique d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO) par un filament de nylon introduit dans l'artère carotide commune via l’artère carotide interne pour occlure l’artère cérébrale moyenne reproduit l’accident vasculaire cérébral ischémique le plus fréquent chez l’humain (par occlusion de l’artère cérébrale moyenne) et il est le plus décrit dans la littérature. Les animaux seront au stade adulte entre 3 et 4 mois conformément au modèle décrit dans la littérature. Après réception, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au minimum 7 jours avant le début du protocole expérimental.
Etude de la plasticité de la myéline dans le cadre d’un hébergement individuel chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est hébergée seule pendant huit semaines, condition dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer anxiété, agressivité et baisse des capacités cognitives, avant des tests d'interaction sociale avec un congénère. L'étude cherche à savoir si l'isolement modifie la myéline chez des souris porteuses d'une mutation, en écho à l'isolement social des personnes âgées. Le porteur affirme que ces questions "intégrées" rendent les études sur l'animal "incontournables".
Objectifs
Notre groupe étudie la physiopathologie de maladies du cerveau, avec un intérêt plus particulier pour certaines maladies dans lesquelles sont observées des anomalies de la myéline, une structure qui entoure les axones des neurones et permet d’optimiser la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Nos travaux ont montré qu’une mutation dans un gène que nous étudions conduit à des anomalies de la myéline chez des souris génétiquement modifiées. L’objectif du projet proposé ici fait suite à ces observations et vise à déterminer si les anomalies de la myéline chez ces souris peuvent être modifiées en fonction des conditions de vie, en particulier dans le cadre d’un hébergement individuel.
Bénéfices attendus
La myéline joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau. Des modifications de la myéline ont été associés à de multiples conditions physiologiques et pathologiques tout au long de la vie, notamment au vieillissement normal du cerveau, et à des troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques (schizophrénie, troubles bipolaires, troubles du spectre autistique), des maladies dégénératives (maladie d'Alzheimer) ou démyélinisantes (sclérose en plaques). L’un des enjeux actuels majeur est d’identifier des éléments qui pourraient améliorer ou défavoriser la condition des patients et/ou personnes âgées. Plusieurs études ont démontré, chez l’homme comme chez la souris, que l’état structurel et fonctionnel de la myéline est influencé par les conditions de vie. Par exemple, des modifications structurelles « favorables » de la myéline ont été observées dans le cadre de l'apprentissage d'une nouvelle langue ou de nouvelles tâches motrices, telles que la pratique du piano et du jonglage. À l'inverse, il a été montré que certaines formes de privation sensori-motrice, comme l'isolement social, entraînent une diminution de la myéline et une réduction de l'interaction sociale. De nombreuses mutations du gène que nous étudions ont été identifiées dans la population générale. Nos études ont montré qu’elles pourraient constituer un facteur de variabilité interindividuelle au niveau de la structure de la myéline. Notre projet va permettre d’évaluer leur impact potentiel chez les patients et les personnes âgées qui souffrent fréquemment d’isolement social (Croix Rouge : 23 pourcents des personnes isolées, sans contact social régulier, sont des personnes âgées de plus de 75 ans).
Procédures
1) Hébergement individuel d’animaux vigiles pendant 8 semaines, puis regroupement 4 par cage pendant 4 semaines pour une partie des animaux. 2) Hébergement en groupes (4 par cage) d’animaux vigiles pendant 8 semaines ou 12 semaines. 3) Test d’interaction sociale d’animaux vigiles avec un congénère de même âge et de même sexe : 3 fois 30 minutes par animal. 4) Chirurgie sans réveil sous anesthésie/analgésie : 1 fois par animal, temps inférieur à 2 minutes
Impact sur les animaux
Les souris hébergées en individuel peuvent présenter des comportements anxieux plus importants, de l’agressivité et une diminution de la cognition. Le test de comportement (interaction sociale) peut également induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’administration des anesthésique et antalgique avant la chirurgie sans réveil peut induire un stress et une légère douleur chez l’animal au point d’injection.
Devenir
L’analyse d’état de la myéline sera réalisée par des techniques qui nécessiteront d’euthanasier les souris par des méthodes réglementaires.
Remplacement
Les questions que nous posons dans ce projet concernent des aspects très intégrés pour lesquels les études sur l’animal sont incontournables. La souris constitue un modèle de choix dans la mesure où : 1) le développement et la structure de la myéline sont très bien conservés entre l’homme et la souris; 2) Des études scientifiques ont montré que les conséquences sur la myéline de l’hébergement individuel chez la souris miment les conséquences observées chez l’homme ; 3) le développement et la structure de la myéline ont été extrêmement bien caractérisés chez la souris, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Nous veillerons à réduire au maximum le nombre de souris utilisées : 1) en combinant plusieurs approches expérimentales ; ainsi, les couples de reproduction seront réalisés de façon à ce que tous les souris soient utilisées et réparties dans les différentes procédures ; 2) en optimisant au maximum les données obtenues à partir d’une expérience donnée. Par ailleurs : 1) La transmission de la mutation pour la lignée transgénique que nous étudions étant mendélienne, nous serons en mesure de comparer les souris sauvages et mutantes issues d’une même portée ; 2) Tous les animaux générés, mâles ou femelles, seront informatifs ; 3) Nos très bonnes connaissances des protocoles, ainsi que la littérature scientifique, nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse et reproductibilité des résultats qui seront analysées avec des tests statistiques. Nous utiliserons pour ce projet 288 souris.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux seront stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Afin de minimiser l’impact de l’hébergement individuel, les souris seront hébergées dans un environnement sécurisant (maisonnettes/nid/bâton à ronger) et des observations du bien-être seront réalisées 1 fois/jour. En cas de comportements anormaux des points limites sont définis : manque de toilettage, prostration, léthargie ou manque d’intérêt pour la nourriture, agitation excessive, stéréotypies et/ou de perte de poids. Si un point limite est détecté, l’état des animaux sera surveillé plusieurs fois par jour. En cas de souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées. L’acte de chirurgie sera réalisé sous anesthésie/analgésie conformément aux bonnes pratiques vétérinaires en vigueur.
Choix des espèces
Choix des souris : 1) Le développement et la structure de la myéline sont très bien caractérisés chez la souris, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. 2) Les conséquences de l’hébergement individuel / réintégration sociale sur la structure de la myéline ont été bien caractérisées chez des souris de type sauvage, constituant une référence pour notre étude et permettant d’optimiser les conditions expérimentales pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées. 3) Nous pouvons également comparer des souris sauvages et mutantes issues d’une même portée dans la mesure où la transmission de la mutation que nous étudions est mendélienne. Stade de développement : Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines, âge auquel la mise en place de la myéline est terminée, la rendant sujette à modification au cours de l’hébergement individuel. Nous suivrons en ce sens un protocole publié, montrant pour la première fois l'impact de l'hébergement individuel sur la myéline chez des souris adultes.
Plasticité fonctionnelle de la voie descendante réticulo-spinale après lésion de la moelle épinière et stimulation régénérative
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une lésion de la moelle épinière leur est infligée sous anesthésie, avec deux heures de chirurgie et des injections de traceurs, ce qui provoque une paralysie des membres postérieurs et des difficultés à se nourrir et boire au réveil. La moitié reçoit ensuite une stimulation magnétique, et tous les animaux sont tués vingt à soixante-cinq jours après la lésion pour prélever la moelle. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'expérimentation in vivo et que le modèle animal reste "nécessaire" pour mesurer la repousse des fibres nerveuses.
Objectifs
Les lésions médullaires traumatiques sont responsables d’une perte des fonctions sensitives, autonomes et motrices liées à une forte inflammation, une démyélinisation ainsi qu’une diminution de la repousse axonale. La thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive a permis notament de réduire l’inflammation, induire une remyélinisation et une repousse axonale après lésions médullaires traumatiques. Toutefois, la plasticité et l’identité précises des voies descendantes qui sont influencées par cette stimulation trans-spinale après lésions médullaires ne sont pas connues. C’est pourquoi ici, nous souhaitons mettre en évidence les effets de la lésion médullaire dans un premier temps ainsi que ceux de la thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive dans un second temps sur la plasticité des fibres réticulospinales.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte lésionnel. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des lésions médullaires chez l’Homme.
Procédures
120 souris (60 males et 60 femelles) seront utilisées sur lesquelles seront réalisées une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Le jour même après la lésion et afin de mettre en évidence les fibres nerveuses ayant survécu, l’injection d’un premier traceur en dessous de la lésion sera également réalisée, la durée de cette intervention sera de 15 minutes. Puis une seconde injection de traceurs, permettant de visualiser les axones des populations neuronales d’intérêt, sera réalisée au niveau du tronc cérébral, cette intervention durera 1 heures et 15 minutes. De ce fait, à J0 l’ensemble des interventions chirurgicales prendra un temps de 2h par souris. Tous les animaux opérés recevront une injection d’antalgique 20 minutes avant la chirurgie et une seconde 6 heures après la chirurgie. De plus, après la chirurgie, à J0, nous procéderons à une injection de sérum physiologique afin de prévenir les animaux d’une déshydratation. Le lendemain et jusqu’au 14 ème jour après la lésion, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 60 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes. Le 15ème ou le 60ème jours après la lésion, une troisième injection de traceurs en dessous de la lésion sera réalisée, permettant ainsi de mesurer la repousse des fibres nerveuses, la durée totale de cette intervention prendra 20 minutes. L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié 5 jours après la seconde injection de traceurs, soit 20 et 65 jours maximum après la lésion afin de récupérer la moelle épinière. Cette chirurgie durera 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs, de type hémiplégie - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (65 jours maximum après la lésion médullaire) afin de procéder au prélévement de la moelle et du tronc cérébral. Les souris ayant subis des lésions médullaires (120 souris), ne peuvent de ce fait pas, même si cela était possible d’un point de vue expérimentale, faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer la plasticité des fibres descendantes après lésion de la moelle épinière et mise en place de thérapie comme la stimulation magnétique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux. Il faut prendre en compte dans ces expérimentations le fait que les injections stéréotaxiques au niveau du tronc cérébral peuvent ne pas être effectuées au bon endroit du fait de variations anatomiques inter-individuelles et donc ne pas marquer les fibres d’intérêt. De ce fait, nous prevoyons d’inclure 15 souris par groupe. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés. Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cela nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. Les animaux utilisés seront agées de 8 semaines, les lésions médullaires chez l’Homme concernent le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Rôle de l’axe IL33/ST2 dans le cross talk pathologique cardio-rénal.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Elles reçoivent cinq injections pour induire une modification génétique, subissent une chirurgie cardiaque d'une heure provoquant un infarctus, puis une mesure de la fonction rénale de deux heures, avant une mise à mort échelonnée à un, sept ou vingt-huit jours. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et présente l'axe IL33/ST2 comme une cible thérapeutique déjà accessible via des anticorps. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le dialogue entre le cœur et le rein et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Le syndrome cardio-rénal est un état de santé où une maladie du cœur ou des reins affecte négativement l'autre organe. C'est un phénomène complexe et nous n'avons pas encore une compréhension complète de comment les deux organes interagissent en cas de maladie. Certains progrès ont été faits pour comprendre cela. Par exemple, des recherches récentes ont mis en lumière certaines voies de communication entre le cœur et les reins en cas de maladie. Une molécule appelée Galectin-3 semble jouer un rôle important lorsqu'il y a une maladie rénale qui affecte le cœur, et cette molécule a été associée à un risque accru de maladie et de décès chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque. Une autre découverte récente concerne une molécule appelée IL33 et son récepteur, ST2. Cette molécule semble jouer un rôle important lorsque les reins sont malades et affectent le cœur, mais de manière surprenante, elle semble avoir un effet néfaste sur le cœur, ce qui est contraire à ce que d'autres études avaient suggéré auparavant. Ces découvertes montrent qu'il existe un lien complexe entre le cœur et les reins lorsqu'une maladie se produit, et que comprendre ce lien pourrait être la clé pour traiter ces maladies plus efficacement. Ainsi, l'objectif de ce travail est d'évaluer l'impact d'une crise cardiaque sur la santé des reins à long terme, et d'étudier plus précisément comment la molécule IL33 et son récepteur ST2 jouent un rôle dans les changements que subissent le cœur et les reins en cas de maladie.
Bénéfices attendus
Dans nos précédents travaux, nous avons mis en évidence que l’axe IL33/ST2 était un axe central dans la survenue de remodelage cardiaque à distance d’une agression rénale aiguë. Ce projet permettra d’une part de caractériser les modifications architecturales qui surviennent au niveau rénal après la maladie coronaire aiguë et de mesure l’impact de cet axe sur ces modifications. Il existe déjà un certain nombre de thérapeutiques déjà disponibles pour la modulation de cet axe (anticorps monoclonaux anti-IL33 ou anti-ST2). L’application clinique et son bénéfice pourront donc rapidement être évalués si les hypothèses de travail sont concluantes. Le pool de patient potentiellement traitables est énorme car il s’agit d’un des problèmes de santé publique le plus important et la cause de morbi-mortalité la plus importante de nos sociétés occidentales.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 injections de substance nécessaire à l'obtention du modèle génétiquement modifié d'une minute 5 jours de suite. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d’une durée d’une heure. Les animaux seront soumis à une mesure du débit de filtration glomérulaire (fonction de filtration du rein) d’une durée de 2 heures. Les souris recevant le tamoxifène auront un intervalle libre entre la dernière injection et la chirurgie d'une semaine. Certains animaux subiront une micro-puncture de l'oreille vers J6 pour déterminer leur génotype.
Impact sur les animaux
Durant l’ischémie reperfusion, les nuisances sont une inflammation au niveau des points d'incision pour la thoracotomie et de la douleur à ces mêmes endroits. Les nuisances liées à l'infarctus du myocarde sont essentiellement marquées par les douleurs post opératoires, le modèle n'étant pas un modèle d'insuffisance cardiaque sévère. Pas de nuisances liées à l'atteinte rénale potentielle. Durant l'injection de la substance pour la recombinaison génétique, on peut avoir une douleur au point d'injection et une irritation abdominale transitoire. La procédure de mesure de la fonction rénale n'est pas source de nuisance en soit sinon une gène pour l'animal de porter le dispositif sur le dos pendant la mesure. Durant la puncture pour le génotypage, la nuisance liée à la puncture est de très courte durée et très peu douloureuse.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'organes et de plasma pour analyse. Le temps de mise à mort varie selon le groupe entre J+1, J+7 et J+28.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro permettant d’évaluer le dialogue entre le cœur et le rein, puisque par essence, il s’agit d’un modèle physiologique intégré. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires plus complexes qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole. Néanmoins, le laboratoire travail en parallèle sur des modèles cellulaires permettant de mimmer ces conditions et à terme remplacer l'utilisation d'animaux, néanmoins ces modèles n'ont à ce jour pas démontré de résultats satisfaisants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans le projet a été calculé pour permette d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ceci, plus notre expérience préalable dans le domaine nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux pour ces expérimentations protocole, l’avantage d’utiliser un processus non invasif de mesure de la fonction rénale permet de limiter le recours extensif à un nombre important d’animaux.
Raffinement
La procédure de raffinement a été établie et discutée avec le responsable du bien-être des animaux au sein de notre unité. Les animaux sont stabulés dix jours après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergées en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). Les animaux sont contrôlés quotidiennement par un animalier formé (afin de s’assurer de leur bien-être), à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Lors de la procédure, les animaux sont anesthésiés et une analgésie avant l’intervention sera réalisée pour limiter un peu plus les risques de douleurs ressenties. La phase de réveil se fait dans un incubateur à 37°C pendant toute la nuit. Des points limites clairs ont été établies afin de soustraitre les animaux à la souffrance.
Choix des espèces
Notre équipe a développé les différents modèles d’ischémie-reperfusion sur la souris afin d’éviter de réaliser des expérimentations sur des gros animaux et pour avoir la possibilité de réaliser le modèle sur des souris transgéniques. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines afin d’obtenir un poids de 20-25 grammes.
Evaluation de l’effet d’un probiotique chez le chien adulte sain
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
16 chiens adultes vont être utilisés, puis réutilisés dans d'autres études, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent quatre prises de sang réparties sur treize semaines et quatre périodes d'isolement individuel d'environ six jours, pour tester une souche bactérienne sur leur digestion et leur microbiote. Le porteur décrit une étude visant l'évaluation d'un additif alimentaire par l'autorité européenne en vue d'une "commercialisation" éventuelle. Il affirme qu'aucun remplacement n'est envisageable puisque le chien est "l'espèce cible" de l'additif.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d'évaluer l'efficacité d'une souche bactérienne sur les paramètres zootechniques chez le chien sain (digestibilité) et l'impact sur le microbiote canin : démontrer le rôle en tant que régulateur de l'immunité et éventuellement en tant qu'agent améliorant la digestibilité.
Bénéfices attendus
A l'instar des études en cours sur le microbiote humain (étude du French Gut ) l'évaluation du microbiote chez les carnivores domestiques présente un intérêt croissant. Pouvoir limiter l'inflammation intestinale en agissant sur la composition du microbiote est une piste d'intérêt. Cette étude permettra d'apporter des connaissances supplémentaires quant à l'efficacité de cette souche bactérienne sur les paramètres zootechniques chez le chien. L'évaluation du dossier d'efficacité par l'autorité européenne de sécurtié des aliments permettra à cette souche d'être éventuellement commerciialisée et de contribuer à l'amélioration du bien-être chez le chien.
Procédures
Les animaux vigiles auront 4 prises de sang (intervention de moins de 10 minutes chacune) réparties sur 13 semaines et ils seront isolés 4 fois une semaine avec un intervalle entre ces périodes de 4 semaines, 2 semaines puis à nouveau 4 semaines en boxes collectifs.
Impact sur les animaux
Les prises de sang constituent une nuisance attendue à cause du stress éventuel de la contention mais les animaux sont habitués à cette procédure ce qui permet la réalisation de celles-ci dans les meilleures conditions de rapidité et de bien-être de l'animal. Le prélèvement sanguin est, lui, considéré comme une procédure légère constituée d’acte (piqûre) non algogène ne justifiant pas l’administration d'analgésiques. Cependant, afin de préserver le bien-être des animaux, tout prélèvement sera interrompu si l’animal montre un quelconque signe de détresse. Les animaux sont individualisés, mais non isolés, 4 fois 6 jours dans des boxes de 4 m2. Les contacts visuels, sonores et olfactifs sont pleinement maintenus avec leurs congénères. Toutefois, leur comportement sera suivi de près afin de mettre en évidence rapidement tout signe éventuel de détresse.
Devenir
Tous les animaux pourront être réutilisés et inclus dans une nouvelle étude après acceptation de la demande.
Remplacement
Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chien est l'espèce cible de cet additif alimentaire.
Réduction
La taille des groupes proposée est celle minimale basée sur notre expérience, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et d’assurer la robustesse des analyses statistiques. L'étude en cross-over et le fait que chaque animal soit son propre témoin permet d'apporter de la puissance à cette étude.
Raffinement
Cette étude ne limite pas les sorties des animaux et leur sociabilisation. Ils peuvent de plus continuer à vivre en groupe (3 à 4 chiens dans un box de 18 m2 avec présence de niches et de jeux type kong ou ballon) en période d'absence de collecte de selles. Ils ont accès à l’eau à volonté. Lors de la prise des repas, les animaux sont attachés dans leur box et ne peuvent ainsi consommer que la ration qui leur est présentée. Ils sont amenés, en laisse, de leur box jusqu’à la salle de prélèvement se trouvant dans le même bâtiment. Un suivi quotidien du comportement des chiens est réalisé afin de mettre en place, si besoin était, des mesures adéquates (changement de place dans le chenil, apport de nouveaux jeux dans les boxes) pour maintenir un bien-être optimal à ces animaux.
Choix des espèces
Le chien est l'espèce cible de la souche testée. Les animaux sont des chiens adultes de 3 ans en bonne santé, n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le microbiote, depuis au moins 3 mois.
Essai pré-clinique d’immunothérapie de la fibrose chez le chien modèle de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Jusqu'à 14 chiens vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance sévère, les chiens malades tués en fin de suivi pour prélèvements et les chiens sains compagnons proposés à l'adoption. Les chiens atteints de myopathie de Duchenne subissent 38 prélèvements sanguins, quatre prélèvements urinaires, trois biopsies musculaires, des IRM et une chimiothérapie préparatoire, avec fièvre, perte d'appétit et risque de cystite hémorragique ou de syndrome de relargage de cytokines. Le porteur teste des cellules CAR-T contre la fibrose musculaire, en visant une "preuve de concept" pré-clinique. Il retient le chien comme le modèle reproduisant le mieux la maladie humaine.
Objectifs
En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T tueurs =sous-population de globule blanc) modifiés artificiellement pour cibler des marqueurs tumoraux spécifiques. Les globules blancs du patient sont isolés par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, puis modifiés ex vivo pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. L'objectif de ce projet est de déterminer si le ciblage de ce marqueur par des cellules CAR-T permet de réduire la fibrose et d'améliorer la fonction musculaire chez des chiens atteints de myopathie de Duchenne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept pré-clinique sur l'efficacité du ciblage d'un marqueur spécifique de la fibrose, pour réduire la celle-ci dans la myopathie de Duchenne. Si cette stratégie s'avère efficace, cette étude ouvrira la voie à la possibilité d'utiliser ce marqueur comme une cible thérapeutique chez les patients atteints par cette maladie.
Procédures
Des prises de sang seront effectuées aux âges de 2, 4 et 5 mois, puis de manière plus rapprochée autour du traitement préparant à l'injection de cellules qui a pour but de faire chuter le nombre de globules blancs circulants, afin de suivre au plus près la formule sanguine des chiens. Puis, des prises de sang seront effectuées lorsque les chiens auront reçu une injection de leurs propres globules blancs, prélevés par une méthode s'apparentant à celle utilisée pour les dons de plaquette, et modifiés ou non. Au total, 38 prélèvements sanguins sont prévus sur les chiens, dont 28 sur chiens vigiles (temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome), et 10 à un cathéter au cours d'une anesthésie générale (temps estimé moins d'une minute). Quatre prélèvements urinaires sont également prévus (prélèvement directement dans la vessie, sous anesthésie générale, durée 1 minute). Des biopsies musculaires seront prélevées chirurgicalement, à 3 reprises (temps d'intervention 30 minutes environ). En outre, les chiens subiront également, sous anesthésie générale : trois examens IRM (durée 2h00), quatre mesures de force (durée 45 minutes). Vigiles, les chiens subiront des examens cliniques et neuf tests de marche (10 minutes), de fonction respiratoire (10 minutes) et d'enregistrement de l'ECG en holter (24 heures, équipement sans fil porté par le chien).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les chiens au cours de ce projet sont de trois ordres : - Celles liées à la maladie qui touche ces animaux : troubles locomoteurs, faiblesse des muscles respiratoires et de la déglutition. Les signes cliniques seront étroitement surveillés, et les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte d'un point limite. - Celles liées au protocole préparatoire qui a pour but de diminuer la quantité de globules blancs circulants pour permettre une meilleure efficacité des cellules CAR-T. Les principales nuisances induites sont une perte d'appétit transitoire en cours de traitement, qui répond à un traitement anti-vomitif et une journée de fièvre avec abattement associée à la baisse des globules blancs dans le sang, environ une semaine après le début du traitement. La formule sanguine et l’état général se normalisent ensuite en quelques jours. Par ailleurs, malgré les mesures préventives recommandées mises en œuvre, il ne peut être exclu qu’un épisode de cystite hémorragique (saignement de la vessie) puisse survenir, s’agissant d’une toxicité connue d’un des agents pharmacologiques utilisés. - Celles liées à la survenue éventuelle d'un syndrome de relargage de cytokines (= état inflammatoire aigu). Il s'agit d'une complication grave connue chez l'Homme des traitements par cellules CAR-T, plus probablement liée à l'action des cellules CAR-T dans un contexte cancéreux donc a priori moins probable dans le contexte présent. Ce syndrome se traduit par une fièvre, une hypotension, une élévation de marqueurs sanguins de l'inflammation et à des stades plus avancés par des troubles respiratoires et/ou neurologiques. Nous serons très vigilants quant à la survenue possible d'un tel syndrome chez les chiens traités, et administrerions un anti-inflammatoire pour traiter ce syndrome s'il survenait.
Devenir
Les animaux inclus dans la procédure 1 (étude pré-clinique proprement dite) seront mis à mort en fin de suivi pour des prélèvements larges de tissus. Les animaux inclus dans la procédure 2 (animaux sains, compagnons de ceux inclus dans la procédure 1) seront mis à l'adoption.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer une stratégie de thérapie anti-fibrose, basée sur une injection de cellules du système immunitaire modifiées pour cibler spécifiquement un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans l'ensemble des muscles striés. Il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" détruisent bien d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Reste à déterminer si dans le contexte d'un organisme entier, le comportement de ces cellules est le même et si ces cellules arrivent bien à atteindre les zones de fibrose et les détruire.
Réduction
Un effectif de 5 chiens traités par des cellules CAR-T sont nécessaires et suffisants pour démontrer une réduction de la fibrose dans les muscles au niveau de celle mesurée chez des chiens malades traités de manière chronique par le traitement de référence actuellement pour la myopathie de Duchenne. Le même effectif de 5 chiens devra être inclus dans le groupe contrôle. Cependant, le projet proprement dit débutant à l'âge de 5 mois, nous envisageons l'éventualité selon laquelle certains chiens engagés sur ce programme à l'âge de 2 mois se seront dégradés sur le plan locomoteur au point d'atteindre un point limite avant l'âge de 5 mois. Nous prévoyons donc deux chiens supplémentaires par groupe afin de nous assurer de pouvoir inclure 5 chiens dans chaque groupe. C'est donc un minimum de 10 chiens et un maximum de 14 chiens qui seront inclus dans le projet.
Raffinement
Les chiens seront évalués à l'aide de nombreuses mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Les chiens seront hébergés en petits groupes d'âges proches et de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Ils seront sortis quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant une quinzaine de jours entourant le protocole de chimiothérapie et l'injection de cellules, les sorties devront être interrompues pour les protéger d'éventuelles infections opportunistes. Du temps supplémentaire sera passé par les soigneurs avec les chiens afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Ils bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur maladie. Des points limites précis, adaptés à cette maladie et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole de chimiothérapie ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.
Choix des espèces
Cette étape préclinique de validation d'une approche thérapeutique anti-fibrose en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit du modèle animal qui reproduit le mieux la maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose et de l'expression du marqueur ciblé par cette thérapie. Par ailleurs, le chien permet la mise en oeuvre des mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T (prélèvement des lymphocytes T par cytaphérèse et injections autologues en particulier). Dans le cadre de ce projet, les chiens seront suivis de l'âge de 2 mois à l'âge de 6.5 mois, et les injections sont prévues sur des chiens âgés de 5.5 mois. Cette tranche d'âge est basée sur le fait que la protéine cible est fortement exprimée à cet âge là chez les chiens malades, et au fait qu'à cet âge là, les chiens ont atteint une taille compatible avec les procédures mises en oeuvre (prélèvement par cytaphérèse notamment).
Etude du mécanisme antidépresseur de la psilocybine/psilocine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
900 souris d'une souche anxieuse vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à des tests comportementaux après administration de psilocybine, de psilocine ou de sérum salé, une autre à une chirurgie stéréotaxique d'implantation d'une sonde de microdialyse dans le cortex préfrontal. Le porteur qualifie cette chirurgie de "mineure" au motif que le cerveau serait dépourvu de fibres nociceptives, et étudie les mécanismes antidépresseurs de la psilocybine. Sur le remplacement, il affirme qu'on ne peut modéliser les troubles de l'humeur ni les effets des molécules in vitro.
Objectifs
Notre projet vise à édudier les effets antidépresseurs rapides de la psilocybine et de son métabolite la psilocine. Ces effets seront aussi étudiés d'un point de vue neurochimique dans le cortex médian préfrontal des souris, une région cérébrale impliquée dans l'effet antidépresseur des molécules déjà commercialisées. Il est donc important de comprendre comment la psilocybine affecte le fonctionnement des différents types de neurones du cortex. Ce travail vise donc à évaluer comment la psilocybine et la psilocine affectent les neurotransmetteurs et si cela participe à la réponse comportementale antidépressive.
Bénéfices attendus
La mise en évidence des mécanismes neurochimiques sous-jacents aux effets antidépresseurs de la psilocybine ou de son principal métabolite seront une avancée supplémentaire dans le développement d'une nouvelle classe d'antidépresseurs non monoaminergiques d'action rapide.
Procédures
En comportement: administration de psilocybine, de psilocine ou de saline pour chaque souris. Chaque souris sera testée en comportement pour évaluer l'effet anxiolytique et antidépresseur de la psiloxybine/psilocine. En neurochimie: anesthésie de la souris, chirurgie stéréotaxique pour implanter la sonde de microdialyse, administration de psilocybine, de psilocine ou de saline pour chaque souris: 24h après, collecte des dialysats du cortex toutes les 30 minutes pendant 4 heures, soit 9 dialysats/souris. Comportement : nombre n=750, durée 5 minutes/souris. Chirurgie : implantation stéréotaxique de sondes de microdialyse: nombre d'interventions: une par souris, durée 24h/souris.
Impact sur les animaux
Les tests comportentaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable. Pour l'implantation intracérébrale de canule qui inclue le positionnement sur le cadre stéréotaxique, la trépanation osseuse et l’incision du scalp, l'animal est sous anesthésie. Le cerveau étant dépourvu de fibres nociceptives, le niveau de douleur pour ces implantations intracérébrales est modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux à l'issue de chaque procédure, pour analyse post-mortem.
Remplacement
Les expériences in vitro et in vivo sont complémentaires et ne s’excluent pas l’une l‘autre. De plus, la psilocybine est une pro-drogue, la psilocine étant son métabolite actif, le métabolisme hépatique de la psilocybine est donc nécessaire à l’obtention des effets antidépresseurs. A ce jour, il n’est possible ni de modéliser les troubles de l’humeur, ni de modéliser les effets de molécules sur de tels troubles in vitro ou in silico. Les mécanismes sousjacents sont trop complexes pour cela. Il est donc nécessaire de recourir à l’expérimentation in vivo dans une telle situation.
Réduction
La technique de microdialyse utilise chaque animal comme son propre témoin, de plus plusieurs, dialysats et donc plusieurs données sont générées pour chaque animal. Pour le comportement le nombre d'animaux est minimisé grâce à l'expertise du laboratoire dans ce type d'observations.
Raffinement
Une anesthésie générale est mise en place pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse et bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Cependant pour prévenir des douleurs induites un traitement antalgique sera entrepris le jour de la chirurgie . Un suivi quotidien des animaux sera assuré et l’état général des animaux sera évalué. Une pesée hebdomadaire sera également effectuée. Les points limites définis dans les différentes procédures expérimentales seront strictement appliquées.
Choix des espèces
L'utilisation de de souris est nécessaire pour ce projet, en particulier la souche Balb/C qui a un phenotype naturellement anxieux. Les animaux entreront dans le protocole expérimental lorsqu'ils seront agés de 8 à 10 semaines, il s'agit d'un stade de développement couramment utilisé dans la littérature pour les tests comportementaux qui seront mis en oeuvre dans ce projet.
Biologie cellulaire et moléculaire du toxoplasme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 25
5884 souris et 25 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, la grande majorité des souris (5784) étant classées en souffrance sévère. Les souris sont infectées par des souches virulentes de toxoplasme, avec douleurs musculaires, fièvre et réduction des mouvements pouvant entraîner faim et soif, certaines étant gavées par sonde gastrique. Le porteur étudie les facteurs de virulence du parasite, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au "long terme". Sur le remplacement, il indique que l'essentiel du travail se fait in vitro mais que l'animal entier reste nécessaire, les rats servant à produire des anticorps.
Objectifs
La toxoplasmose est une maladie humaine et d'interet vétérinaire. Nos recherches sur le parasite qui cause cette maladie pourront servir à long terme à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’étude des mécanismes régulant les interactions entre le parasite et son l’hôte permettra de lutter contre l’établissement de la forme chronique de l’infection. Nos études visent à identifier les facteurs de virulence et ceux qui permettent l’établissement et le maintient de la forme latente du parasite, L’importance de ces facteurs dans le pouvoir de dissémination du parasite et l’établissement de la forme latente ne peut s’examiner que par l’utilisation d’un modèle d’infection de la souris, qui représente un hôte naturel du parasite. Ainsi, l’utilisation de la souris comme modèle d’infection nous permet de valider des cibles potentielles pour le développement de drogues anti-parasitaires.
Bénéfices attendus
La toxoplasmose est une maladie très répandue à l’échelle de la planète, on estime que 30 à 50% de la population mondiale a été infectée par le parasite Toxoplasma gondii. L’infection par T. gondii est une cause importante de morbidité et de mortalité néonatale ainsi que chez les patients immunodéprimés (SIDA, patients greffés). Actuellement, peu de molécules permettent de lutter efficacement contre T. gondii et certaines formes parasitaires échappent encore totalement aux traitements, notamment les formes retrouvées sur des périodes prolongées dans le cerveau et les muscles, notamment cardiaques. Les bénéfices attendus de notre projet sont d’identifier des facteurs important pour la virulence du parasite ou l'etablissement des formes latentes. Il permettra d'identifer de future cibles therapeutiques pour les traitements futurs contre la toxoplasmose.
Procédures
Les administrations sont réalisées sur souris vigiles, les animaux pourront donc montrer des signes de douleurs liées aux piqures. Une seule injection par expérience est prévue lors de l'infection des souris. Toutes les administrations sont réalisées par des personnels maitrisant bien la contention des souris et les gestes d’administration. Les animaux anesthésiés seront aussi manipulés afin de suivre l'infection. Les animaux vigiles pourront être gavés avec une sonde gastrique. Les animaux pourront subir des prélèvements de sang sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Seules les souris infectées par les souches virulentes de T. gondii présenteront une souffrance significative dans ce projet. Nous nous attendons à ce que les animaux montrent des signes de douleurs liés à la maladie de type douleurs musculaires et état fiévreux. Dans les cas avancés de la maladie, la réduction des mouvements des animaux peut entrainer de la faim/soif/malnutrition. Les animaux pourront aussi montrer des signes de douleurs liés aux piqures lors des injections intrapéritonéales. Lors des premiers contacts avec les expérimentateurs, les animaux peuvent ressentir de la peur/détresse avent qu'ils ne soient habitué à ceux-ci. Les animaux gavés par sondes gastriques pourront aussi ressentir de la peur/detresse lors de ces expérimentations.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales. En effet, les animaux ayant subit des infections présentent un risque infectieux et seront donc gérés selon les procédures. Les animaux faisant l'objet de prélèvement d'organe ou de serum doivent être euthanasiés afin de réaliser ces procédures.
Remplacement
La majeure partie des études réalisées au laboratoire utilise des techniques in vitro. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études complémentaires chez l'animal entier car nous ne pouvons par reproduire in vitro la compléxité d'un animal.
Réduction
Le recours à l’utilisation d’animaux est substitué ou minimisé autant que possible. Une étude statistique nous permet d’assurer la fiabilité du résultat tout en limitant à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Ces analyses nous permettront de reduire le nombre d'animaux pour atteindre une puissance statistique minimale.
Raffinement
Outre les conditions d'hebergement (5 animaux par cage et enrichissement dans chaque cage). Nous utilisons des anesthésiques permettant de limiter la souffrance et le stress des animaux. Seules les souris infectées par T. gondii présenteront une souffrance significative dans ce projet. Les points limites que sont les signes traduisant une souffrance significative (voir tableau joint) entraineront une euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent d’étude car il est un hôte naturel de T. gondii. En effet, la souris est sensible à ce parasite et développe la forme aigüe et chronique de la maladie avec la présence de kystes dans le cerveau. De plus, de nombreux outils expérimentaux sont disponibles chez la souris nous permettant de mener à bien nos investigations, en particulier sur la réponse immunitaire lors de l’infection et également sur l’étude de la mise en place de la maladie et des mécanismes parasitaires impliqués dans la virulence. Les anticorps dirigés contre des protéines parasitaires ne sont pas disponibles dans le commerce et doivent être générés au sein du laboratoire pour des études in vitro. Le rat est le modèle idéal pour la production d’anticorps ciblant ces protéines parasitaires étant donné que nous travaillons in vitro avec des cellules immunitaires provenant de souris. Les souris sont utilisées à 8 semaines au stade adulte, ce qui est adapté à nos études de la réponse du système immunitaire. Cet âge suffisamment jeune permet également l’application de protocoles expérimentaux d’une durée totale d’un mois pour l’établissement de la forme chronique de l’infection qui n’entraîne aucune souffrance significative de l’animal. Les rats sont utilisés entre 8 et 10 semaines (150g-250g) lorsqu’ils sont sevrés et présentent un système immunitaire pleinement mature.
Etude de l’effet d’une molécule ciblant le cuivre dans le traitement du mélanome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau, puis des injections de traitement trois fois par semaine sur animal vigile, la tumeur étant laissée croître jusqu'à un volume défini, avec perte de poids, altérations cutanées et nécroses possibles. Le porteur cherche à re-sensibiliser des mélanomes résistants au moyen d'une molécule ciblant le cuivre, ces validations étant présentées comme "indispensables" à un développement clinique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des interactions aussi complexes.
Objectifs
Le mélanome est un cancer très agressif qui risque fortement de développer des métastases, au niveau du foie ou des poumons par exemple. Si il est découvert assez tôt, le mélanome peut se soigner en retirant la partie cancéreuse par chirurgie. En revanche, si des métastases sont déjà présentes lors du diagnostic, le pronostic est souvent mauvais et il est alors nécessaire de traiter de manière systémique, c’est-à-dire sur tout le corps, afin de tuer les cellules de la tumeur d’origine ainsi que les métastases. En termes de traitements, il existe deux familles de médicaments qui sont utilisés aujourd’hui pour traiter le mélanome métastatique, les thérapies ciblées et les immunothérapies. Les thérapies ciblées, dont fait partie le PLX4032, (aussi appelé le Vemurafenib), sont utilisées en première intention et sont efficaces mais seulement chez les 50% de patients qui présentent une mutation spécifique (B-Raf). Cependant, après une période de traitement, le mélanome va se modifier pour devenir résistant au traitement, ce qui va entrainer une rechute. L'autre famille de traitements utilisés est l'immunothérapie, dont font partie les inhibiteurs de point de contrôle ou anti-PD1. Ils sont également utilisés pour traiter les patients atteints de mélanomes métastatiques et fonctionnent en interférant avec le système immunitaire pour induire la mort des cellules cancéreuses mais entrainent cependant une réponse positive dans seulement 10 à 30% des cas. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cellulaires qui entrainent l’apparition de résistance aux traitements actuellement sur le marché. Pour cela nous étudierons une nouvelle molécule qui interfère avec les changements cellulaires induits par la résistance aux traitements dans le but que le traitement redevienne efficace afin d’éviter les rechutes. L’idée de ces expériences est de traiter la combinaison de cette nouvelle molécule avec les traitements utilisés aujourd’hui afin d’observer une resensibilisation des cellules de mélanome envers ces traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une validation in vivo, chez la souris, des observations faites in vitro, sur la capacité d'une molécule ciblant le cuivre ainsi que d’autres inhibiteurs du métabolisme du cuivre, à re-sensibiliser les cellules de mélanomes résistantes aux thérapies ciblées. Il permettra également de vérifier les effets de ces drogues dans le contexte du système immunitaire et d’évaluer leurs rôles dans la résistance aux immunothérapies. Ces validations sont indispensables pour envisager un développement clinique de nos approches thérapeutiques (inhibiteurs en association avec les thérapies ciblées ou les immunothérapies) et permettre d’ajouter une nouvelle ligne de traitement aux patients atteints de mélanomes résistants aux traitements déjà existants.
Procédures
Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome (humaines ou murines). Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini. Ces interventions ne nécessitent pas d’anesthésie et seront effectuées sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Au niveau des expérimentations spécifiquement, les nuisances que subiront les animaux seront des contentions pour injecter les cellules tumorales ou les traitements, ainsi que des injections sous cutanées pour les cellules ou des injections intra-péritonéales (dans l'abdomen) pour les traitements. En ce qui concerne la croissance tumorale, la présence de la tumeur grossissante sur le flanc de la souris pourra être une nuisance. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de procéder à l’analyse des tissus et cellules récupérés de la tumeur formée ou des éventuelles métastases.
Remplacement
Pour ces expériences, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes. Les études in vitro que nous avons réalisées dans un premier temps ont montré l’efficacité de la molécule ciblant le cuivre dans la resensibilisation de cellules de mélanome résistantes aux traitements utilisés aujourd'hui chez des patients.
Réduction
En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique indiquant la quantité minimale d’animaux qui permet d’observer une différence significative. Pour la réalisation de ce projet, il faudra 1584 souris. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs, les métastases et les organes (comme le foie, la rate ou les poumons) pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Raffinement
En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) au sein de l’animalerie et surveillées quotidiennement. L'expérience ne commence qu'après une semaine d'acclimatation à l'animalerie et d'habituation aux expérimentateurs. Les souris seront observées trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est régulier et s'effectue par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). Des points limites précis sont définis dans chaque procédure ainsi que la démarche à effectuer en fonction du point limite observé tels que la désinfection d'une plaie ou le changement des points d'injection en cas de gêne ou signes d'infections par exemple.
Choix des espèces
La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.
Evaluation de l’innocuité d’un vaccin sur des truies en cours de gestation
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
48 truies gestantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour reprendre leur cycle de production dans l'élevage. Elles reçoivent une ou deux prises de sang et une injection de vaccin ou de placebo, avec des effets indésirables possibles au point d'injection et de la fièvre. Le porteur teste l'innocuité chez la truie gestante d'un vaccin déjà autorisé chez le porc en engraissement, en préalable à une étude d'efficacité. Il justifie le recours à l'espèce porcine par le fait que le vaccin lui est destiné.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’innocuité de l’administration d'un vaccin inactivé par voie intramusculaire contre Actinobacillus pleuropneumoniae, chez la truie gestante. C'est un vaccin à destination des porcins visant une immunisation active des porcs à partir de 6 semaines d'âge, afin de réduire les lésions pulmonaires et la colonisation des voies respiratoires par Actinobacillus pleuropneumoniae (App) exprimant des toxines. Ce vaccin est administré chez le porcelet en croissance pour protéger les animaux en engraissement contre la toux, la pleurésie et la mortalité liées à cette bactérie. L'innocuité a donc été évaluée pour ce stade physiologique. En effet, ce vaccin dispose d'une autorisation de mise sur le marché (AMM) pour les porcins et est indiqué pour les porcs en engraissement. La truie infecte les porcelets à partir de l'âge de 2 semaines et ces porcelets infectés propagent l'infection dans le groupe lors de la disparition de l'immunité maternelle, après le sevrage. La transmission se fait par l'intermédiaire des gouttelettes de salive projetées par les animaux porteurs. La sensibilité immunitaire de l'élevage dépend du niveau d'anticorps d'origine maternelle (AOM) pouvant perdurer de 5 à 12 semaines, et de la présence de souches d'App non virulentes à l'origine d'une protection immunitaire croisée. La vaccination des truies, en réduisant la colonisation des voies respiratoires, permettrait de diminuer l'exposition et la contamination des porcelets sous la mère durant la phase d'allaitement. Elle permettrait également de fournir une immunité passive aux porcelets, via des anticorps dans le colostrum, afin de les protéger dans leurs premières semaines de vie, avant l'immunisation active par la vaccination. L'innocuité chez la truie en cas de gestation n'a pas été établie pour ce vaccin. Cette étude sur l'innocuité est préliminaire à une étude d'efficacité, et va permettre de réaliser des tests sérologiques : en effet il n'existe aucune donnée chez la truie concernant la réponse immunitaire en anticorps vis à vis de ce vaccin, et donc le possible transfert d'immunité aux porcelets, via le colostrum.
Bénéfices attendus
Dans le dossier d'AMM, l’innocuité du médicament vétérinaire n’a pas été établie en cas de gestation. En vue d'une utilisation du vaccin sur les truies en cours de gestation, il est nécessaire, avant d'en étudier l'efficacité, d'établir des connaissances sur l'innocuité. C'est l'objet de cette étude.
Procédures
Les prises de sang se feront sur animal vigile. Cette opération sera réalisée une fois, 6 semaines avant mise bas pour le groupe placébo, et deux fois, 6 et 1 semaines avant la mise bas pour le groupe vacciné. La durée maximale d'une prise de sang est d'une vingtaine de seconde. Les injections de vaccin ou de placébo seront faites selon les bonnes pratiques d'injection et durent en moyenne 3 secondes. 48 animaux seront concernés.
Impact sur les animaux
Les prises de sang et la contention sont une source de stress ponctuel pour la truie. Les cas de saignement par le point de ponction sont rares mais pas inexistants. La vaccination qui peut également avoir des effets indésirables sur les truies : rongeur et gonflement au point d'injection, élévation de la température corporelle. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux conformément à la réglementation en vigueur. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.
Devenir
Les animaux sont tous gardés en vie en fin de procédure. Ils continueront leurs cycles de production classiques d'un élevage de porcs.
Remplacement
L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine.
Réduction
L'unité épidémiologique est l'animal. Les écarts attendus entre le groupe témoin et le groupe vacciné nécessitent de mener l'étude sur 48 animaux, soient 24 truies par groupe. Des données qualitatives (état de santé des animaux, évaluation du site d'injection) et quantitatives (température rectale, taux d'anticorps) seront comparées entre groupes par des tests statistiques. Le nombre d'animaux pour lequel une prise de sang sera réalisée a été fixé pour représenter l'unité épidémiologique, soient 48 truies.
Raffinement
Les prises de sang seront réalisées par une personne aguerie à ce geste afin que les périodes de contention soient réduites autant que faire se peut. Pour les vaccinations, il est recommandé d'utiliser une contention afin que les injections soient réalisées correctement. Cette contention consistera loger les truies temporairement dans des stalles individuelles, les unes à côté des autres, pour la durée des injections. Les truies seront ensuite libérées. C'est une procédure réalisée classiquement à chaque séance de vaccination dans l'élevage expérimental de Romillé. Parmi les effets indésirables du vaccin chez le porc en croissance sont rapportés une induration, une rougeur ou un gonflement au site d'injection qui se résorbent spontanément, ainsi qu'une augmentation de la température pendant 1 à 2 jours après l'injection. Ce sont des effets indésirables qui arrivent fréquemment lors de la vaccination des animaux et qui feront l'objet d'investigations lors de cette étude. Tout autre symptôme sera également noté. Des soins seront apportés aux animaux dès que nécessaire (antipyrétiques, anti inflammatoires, isolement en infirmerie). En cas d'effets indésirables cumulés ou impactant l'état général de l'animal, la/les truie(s) concernée(s) sera/ont isolée(s) en infirmerie, soignée(s) et sortie(s) de l'étude. Par ailleurs, les animaux seront élevés dans des conditions d'élevage classiques, en groupe pour la gestation puis en cases individuelles pour la maternité, avec des conditions d'ambiance contrôlées par ventilation dynamique et alimentation et abreuvement selon les recommandations en vigueur en élevage de porcs. Chaque case est enrichie en matériaux d'enrichissement, conformément à la réglementation. Les cases sont également équipées de distributeurs automatiques de concentrés adaptés aux truies et leur distribuant une ration alimentaire adaptée à leur poids et stade physiologique. Des abreuvoirs en nombre suffisant permettent un accès à l'eau en continu et ad libitum.
Choix des espèces
L'évaluation de l'innocuité d'un vaccin à destination de l'espèce porcine nécessite d'être réalisée sur l'espèce porcine. Les truies seront suivies de 6 semaines avant la mise bas jusqu'à la mise bas. Les vaccinations seront réalisées sur cette période (6 et 3 semaines avant mise bas). La comparaison des effets indésirables et de la réaction immunitaire liés à la vaccination se feront sur cette période. Leurs porcelets à la naissance seront également inclus dans l'étude.
ONCO-Disséminé. Evaluation de composés thérapeutiques sur les animaux porteurs de tumeurs disséminées
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 200
2000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales, des traitements répétés par voies orale, intraveineuse ou intracardiaque, des prélèvements de sang et de moelle osseuse, et pour certains une mesure de mécanique pulmonaire par trachéotomie sous anesthésie profonde avant euthanasie. Le porteur prévoit une cinquantaine d'études sur cinq ans pour évaluer des médicaments anticancéreux sur des cancers disséminés, en admettant que les modèles alternatifs in vitro restent "marginaux" et difficilement transposables. Le développement tumoral peut provoquer perte de poids, difficultés locomotrices et respiratoires, la mise à mort étant déclenchée à des points limites définis.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, - l’impact du développement de métastases pulmonaires sur les paramètres ventilatoires fonctionnels (pléthismographie) Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Induction tumorale sous anesthésie (moins de 10 minute s, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 5 heures aller, 5 heures retour). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 heure). Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 10 minutes) . Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 10 minutes). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 10 minutes) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Transport vers le site où est réalisée l’éventuelle irradiation ou l’éventuelle imagerie ou l’éventuelle radiothérapie -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale par IV -Traitements -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique -Induction en intraartérielle et intracardiaque. Si nécessité d’incision Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : -Prélèvements de sang par ponction dans une veine. -Prélèvements de sang sous contention. -Prélèvement de moelle osseuse Les prélèvements de moelle osseuse pourraient générer des fractures dans de rares cas (point limite). Le développement tumoral induira une perte de poids, des difficultés locomotrices. En cas de développement de métastases pulmonaires, des difficultés respiratoires pourraient éventuellement apparaître. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde et suivies d’une euthanasie sans réveil.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort afin de collecter de grands volumes de sang et les organes pertinents.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Nous prévoyons environ 50 études sur 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 10 études sont réalisées chaque année , mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum d’animaux surnuméraires La taille des groupes nécessaires pour obtenir des modifications statistiquement significatives de paramètres mécaniques pulmonaires ou de saturation en oxygène sera optimisée suite à des études pilotes utilisant ces technologies. En première approximation, 10 animaux par groupe seront utilisés, s’agissant du nombre qui a été déterminé pour les mesures similaires dans d’autres modèles. S’agissant d’une mesure terminale, s’il est nécessaire d’évaluer la mécanique pulmonaire à plusieurs points de temps, un groupe d’animaux par point de temps sera constitué.
Raffinement
Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par la SBEA. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis et des antalgiques pourront être prescrits. Dans la mesure du possible, les animaux seront achetés déjà irradiés. Cependant, dans ce cas, la période d’acclimatation devra être réduite à 24h minimum, avec implantation dans les 24-72h suivant l’irradiation. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse (Intradermique, intramusculaire), les animaux recevront une antalgie adaptée. L’induction en intraartérielle et intracardiaque se fera sous anesthésie En cas d’ouverture chirurgicale, une administration de buprénorphine (30 minutes avant minimum) sera prévue. Les injections intracardiaques seront accompagnées d’une analgésie (alpha2 agoniste et un opiacé).. Des soins opératoires (maintien de la température) seront apportés, et feront l’objet d’une surveillance et de soins post opératoires adaptés. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations de la SBEA en termes de volume, fréquence et antalgie. Ces prélèvements seront réalisés sous anesthésie avec l’analgésie appropriée (administration d’anti-inflammatoires non-stéroïdiens et/ou d’antalgiques opiacés/alpha-2 agoniste). Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux et un scoring sera mis en place. Dans toutes les cages, un gel nutritif sera rajouté, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires (cf procédure). Les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront un point limite. Des points limites adaptés et prédictifs permettant de limiter la souffrance des animaux sont indiqués dans les procédures.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.