Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Validation de l’efficacité in vivo de molécules anti-tumorales dans des modèles syngéniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
252 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans le pancréas, puis des injections trois fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester des molécules contre le cancer du pancréas. Le porteur décrit des signes possibles comme la cyphose, la prostration, la perte de poids ou l'automutilation, les souris atteignant un score de souffrance élevé étant mises à mort. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour prouver un effet antitumoral dans un modèle "proche de l'être humain".
Objectifs
Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Actuellement, il n'existe aucun traitement efficace, et cela constitue une urgence pour la recherche. Dans nos efforts pour lutter contre cette maladie, notre équipe de recherche a réussi à identifier une voie de signalisation qui conduit à l'expression de gènes pro-inflammatoires. En conséquence, nous avons développé des molécules qui interviennent dans cette voie de signalisation et qui se sont révélées très efficaces sur plusieurs organoïdes dérivés de patients. Les résultats prometteurs obtenus in vitro montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous avons l'objectif d'évaluer si les molecules, sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal. Notre objectif final est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre des essais précliniques.
Procédures
Après une semaine de l'injection initiale de cellules tumorales par voie intrapancréatique, l'intervention durera environ 5minutes. Aprés, les animaux seront traités 3 fois par semaine par une injection intrapéritonéale d'une solution à l'aide d'une seringue pendant 4 semaines. L'intervention durera environ 20 à 30 secondes. Deux fois par semaine, la taille des tumeurs sera mesurée à l'aide d'un échographe. Cette intervention de mesure prendra environ 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Nous pourrions observer un certain inconfort ou des lésions après l'injection des cellules tumorales. Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées pourraient générer des lésions cutanées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que les composés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 126 individus par modele celullaire (2 modeles: 4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris contrôle pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne développeraient pas de tumeur) conformément à la règle de réduction. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection des cellules intrapancréatiques pour le modèle d'allogreffes, celles-ci seront réalisées sous anesthésie et analgésie, et le gel échographique ainsi que la solution seront chauffés avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux. Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie de tumeur cancéreuse (utilisation de souris développant un adénocarcinome pancréatique). Le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules puis encore 1 à 2 semaines d’attente pour obtenir une tumeur visible par échographie. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 8 semaines.
role du controle qualité des proteines mitochondriales dans le métabolisme hépatique et cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
208 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection dans la veine de la queue, suivie de séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être mis à mort pour prélever le foie et le cœur. Le projet étudie une voie de contrôle des protéines mitochondriales sur des souris génétiquement modifiées. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas de méthode alternative" et que la souris est le seul modèle porteur d'une déficience pour sa protéine d'intérêt.
Objectifs
La mitochondrie est un organite intracellulaire semi-autonome qui est impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques essentielles comprenant entre autres, la production d'énergie, la régulation du stress oxydatif et la mort cellulaire programmée. Les dysfonctions mitochondriales sont responsables de plus de 120 syndromes. Ces pathologies sévères sont classées dans les maladies rares. Les fonctions mitochondriales reposent sur un protéome de 1500 protéines environ. Chez les mammifères, plus de 99 % des protéines mitochondriales sont synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseurs qui sont ensuite importés dans l'organite. La qualité de ces protéines néosynthétisées représente un enjeu crucial permettant d’éviter l'accumulation de protéines défectueuses dans l'organite et ainsi prévenir les dysfonctions mitochondriale. A ce jour, on ignore encore comment le contrôle qualité de ces précurseurs protéiques mitochondriaux est assuré avant leur import dans l'organite. Récemment, en utilisant des modèles cellulaires nous avons mis en évidence qu'une E3 ubiquitin ligase, FBXL6, est indispensable pour ce processus de contrôle qualité des protéines nouvellement synthétisées ou naissantes. L'objectif de notre projet est d'étudier les conséquences physiopathologiques de l’invalidation de cette voie sur contrôle qualité des protéines mitochondriales dans deux tissues, le foie et le coeur. Pour cela nous utiliserons un modèle de souris KO pour la E3 ubiquitine ligase.
Bénéfices attendus
La mitochondrie est une organelle intracellulaire jouant un rôle central dans plusieurs fonctions cellulaires et tissulaires. Entre autres, ces organelles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares sévères caractérisés par des perturbations généralisées du métabolisme (acidose lactique, obésité, déficits énergétique ...), encéphalopathie, cardiomyopathie etc... A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Notre projet vise à améliorer les connaissances concernant ces pathologies et réveler des nouvelles cibles therapeutiques pour ces pathologies.
Procédures
Pour chaque animal, une injection sera réalisée dans la veine de la queue grâce à une seringue. Cette étape durera moins d’une minute. Un premier groupe d’animaux sera analysé en imagerie à 1, 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Ces animaux seront anesthésiés par voies respiratoires, puis soumis à une injection par voie intrapéritonéale et enfin placé dans une chambre d’imagerie. La durée totale de cette approche est d’environ 15 min par animal et répétée, donc, à 1, 4 et 8 semaines post injection. En parallèle, deux groupes seront sacrifiés successivement, à 4 et 8 semaines après l’injection intraveineuse. Nous prélèverons les tissus d’intérêt et cette étape durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Notre procédure nécessite une l’injection intraveineuse dans la veine de la queue susceptible d’entrainer une douleur transitoire. Cette procédure est très rapide (
Devenir
Tous les animaux, incluant les animaux atteignant les points limites seront mis à mort, à des fins d’ analyses, conformément à l'annexe IV de la directive 2010/63/CE.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologie observée chez l'homme. Nos recherches préalables menées sur des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo, ont permis d’obtenir un certain nombre de résultats et nous permettent de cibler/restreindre précisément les recherches à mener sur l’animal. En revanche, ces modèles ne peuvent pas reconstituer la complexité de la régulation des fonctions mitochondriales et de leurs conséquences physiopathologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter-lots avec 40% d’écart type intra lot est de 10 et les expériences seront répétées à deux reprises. Les tests statistiques afin de comparer les groupes d’animaux seront non paramétriques. Dans un premier temps, un test statistique nous permettra de vérifier les différences significatives entre les groupes d’animaux. Il sera ensuite suivi d’un test post-hoc de comparaisons multiples. Nous utilisons les souris males et femelles pour notre projet. De plus, nos études préliminaires réalisées sur des modèles complémentaires ont permis de réduire notre étude in vivo à une partie congrue.
Raffinement
1-Hebergement : Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Nos animaux sont hébergés en présence de raffinement spécifique: - coton dentaire, que les souris dépiautent pour se faire un nid. -des tunnels en carton, qui leur servent à se cacher et à jouer. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les injections intraveineuses sont réalisées sur des animaux par un personnel dument formé. Un suivi quotidien des animaux est réalisés post injection afin d’anticiper des éventuels inconforts et douleurs. En cas d’inflammation lors des 24h après la procédure, nous injecterons une dose d’anti-inflammatoire non-steroidien en sous-cutanée. 5. Les points limites : Nous avons également établi des points limites objectifs et précoces permettant de mettre fin à toute procédure le cas échéant. Les animaux présentant des signes moteurs anormaux après les injections, au réveil après l’anesthésie et l’imagerie seront observés de près et si aucune amélioration observée après 24h, ils seront euthanasiés. Les animaux ayant une perte de poids de plus de 20 % ou présentant des signes tels que piloérection, déshydratation, dos voûté, prostration, isolement pendant plus de 24h jour, seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utiliserons les souris adultes pour cette expérimentation. L’âge adulte correspond au stade durant lequel les effets biologiques que nous analysons sont modifiés. Par ailleurs, nous utilisons la souris car il s’agit de l’unique modèle animal existant présentant une déficience pour notre protéine d’intérêt.
Modèle de cancer pancréatique par greffe orthotopique : mise au point et études d’efficacité
- Recherche appliquée
- Cancers
1 200 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur met au point une greffe de cellules de cancer du pancréas directement dans le pancréas, par chirurgie abdominale ou par injection échoguidée, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins répétés. Les souris sont euthanasiées lorsque la tumeur approche 1 500 mm3 ou en fin d'étude, pour prélever sang, tumeur et organes. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reconstituer in vitro les interactions de la tumeur avec son microenvironnement.
Objectifs
Le pancréas est un organe localisé à l’arrière de l’estomac. Il contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. Parmi les différents types de cancer du pancréas, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP), qui se développe dans le compartiment exocrine, représente 90-95% des cancers pancréatiques. L’ACP est un cancer très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (et seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les traitements classiques de l’ACP sont la chirurgie qui permet de retirer la partie tumorale tout en conservant la partie saine du pancréas, la chimiothérapie et l’irradiation, mais ces traitements ne permettent pas d’améliorer significativement les résultats cliniques. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs pour déterminer leur efficacité anti-tumorale. Les modèles les plus couramment utilisés sont des modèles de greffes de cellules tumorales sous la peau des souris. Mais ils ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral qui peut constituer une barrière physique aux traitements. La greffe de cellules tumorales pancréatiques directement dans le pancréas, (greffe orthotopique pancréatique), permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée d’intérêt pour la recherche de nouveaux traitements. Ce projet vise à mettre au point des techniques de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique chez la souris via une méthode dite classique de chirurgie ainsi que par une méthode d’échoguidage non invasive – les deux techniques seront réalisées en différents sites du pancréas pour déterminer quelle approche permet de générer un modèle le plus ressemblant à la tumeur humaine. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée.
Bénéfices attendus
Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre de l’ACP sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris immunocompétentes permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Bien que l’approche de la greffe orthotopique au niveau de la queue du pancréas soit la plus décrite, nous allons mettre au point l’injection orthotopique dans la tête du pancréas. En effet, ce site d’injection, bien que moins simple d’un point de vue de l’approche chirurgicale, est plus relevant scientifiquement vis-à-vis de la pathologie humaine. De plus, la greffe orthotopique dans le pancréas nécessite un acte de chirurgie dont nous allons essayer de nous affranchir par la mise en place d’une approche d’implantation per cutanée échoguidée. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la progression tumorale au cours des études permet de raffiner l’utilisation des animaux en les incluant progressivement dans l’étude. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme. Ce projet vise également à développer si possible ce modèle avec une méthode non chirurgicale moins invasive afin de favoriser le bien-être animal.
Procédures
- Puçage : afin d’identifier chaque animal, un dispositif sous cutané est implanté en vigile par trocart quelques jours avant l’étude (environ 10 secondes/souris) - Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Echoguidage sous anesthésie gazeuse pour l’implantation de cellules tumorales dans le pancréas : cette procédure sera réalisée une seule fois sur l’animal et durera 10-15minutes. - Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite de la chirurgie (7 à 10 jours), à raison de 1 mesure échographique par semaine. La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris et la mesure se fera sur une durée maximale de 8 semaines - « Microsampling » : prélèvements de sang, en cinétique, à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de marqueurs caractéristiques de la cachexie) (environ 20 secondes/souris) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction cardiaque.
Impact sur les animaux
-Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de de la mesure de la composition corporelle -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de l’administration des traitements en quotidien ou biquotidien ou triquotidien, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration) -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors des prélèvements sanguins par microsampling d’environ 20 secondes /souris -Douleur très légère lié à la piqûre lors des prélèvements sanguins par microsampling -Douleur légère due à la pathologie et possiblement associée à une perte de poids et/ou formation d’ascite et/ou cachexie -Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen
Devenir
Lorsque le volume tumoral total est proche de 1500 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.
Remplacement
Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, fournissant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.
Réduction
- Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la capacité des designs de ces études à l’aide d’un test statistique. Un modèle statistique longitudinal sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. - Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. - Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris mortes issues d’autres projets afin de maitriser les voies d’abords et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur afin de réduire le nombre d’animaux - Afin d’inclure toutes les souris greffées dans les études, nous utiliserons l’échographie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure avec un volume tumoral similaire ainsi le taux d’inclusion sera maximisé. - Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés maximum 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.
Raffinement
- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. - La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie - L’analgésie post-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. - Une seconde méthode de greffe orthotopique « non chirurgicale » par échoguidage percutané sera évaluée, ceci en vue de s’affranchir de douleurs opératoires et réduire les risques de pertes lors de la chirurgie. L’implantation cellulaire s’effectuera sous échographie par injection échoguidée en percutanée ne nécessitant pas de pré ou post médication. Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sur des souris anesthésiées à l’isoflurane. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 1500 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. - La cachexie, signe clinique associé à la progression tumorale du cancer du pancréas, sera suivie via l’établissement d’une grille de scoring. La prise alimentaire, l’activité générale, la mesure de la composition corporelle par scanner non invasif EchoMRI (pourcentage de masse grasse, masse maigre et eau totale), de paramètres métaboliques (albumine, triglycérides) et hématologiques seront monitorés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.
Etude de la procalcitonine, un possible biomarqueur lors de bronchopneumonies par fausse déglutition chez le chien.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
20 chiens vont être utilisé·es, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces chiens, déjà inclus dans des recherches sur la myopathie de Duchenne, subissent trois prélèvements sanguins lors d'épisodes de bronchopneumonie survenant au cours de leur vie, pour évaluer un marqueur sanguin, la procalcitonine. Le porteur décrit un stress modéré lié aux prises de sang et ne rapporte pas de mise à mort au titre de ce projet. Il affirme qu'il "n'est pas envisageable" d'étudier ce marqueur autrement que dans un "organisme entier" et que l'espèce canine s'impose puisque l'application vise le chien.
Objectifs
Chez le chien, le diagnostic d’une bronchopneumonie par fausse déglutition (BPFD) repose sur le contexte, les signes cliniques, des images radiographiques évocatrices et une augmentation marquée de la protéine C réactive (CRP), un marqueur d'inflammation, dans le sang. Néanmoins, les lésions radiographiques peuvent être discrètes et masquées par des lésions pulmonaires pré-existantes, notamment lors d’épisodes récidivants. De même, la CRP reste peu spécifique : la sévérité de son augmentation lors de BPFD est très variable selon les cas et les valeurs de CRP peuvent se chevaucher entre plusieurs affections respiratoires. Ces limites soulignent la nécessité d’évaluer d’autres biomarqueurs. Ces problématiques sont particulièrement vraies chez les chiens atteints de myopathie de Duchenne et utilisés pour la recherche sur cette maladie, qui conduit à des difficultés de déglutition, prédispose à des épisodes récurrents de BPFD et où la chronicité des signes conduit le plus souvent à des augmentations plus modérées de la CRP. Par ailleurs, l’état inflammatoire inhérent à la myopathie peut être à l’origine d’une augmentation de la CRP sans lien avec une bronchopneumonie. La procalcitonine est un marqueur utilisé chez l’Homme et qui semble plus spécifique des infections bactériennes. Récemment, sa mesure par un kit ELISA a été validée chez le chien L’objectif de ce projet est de déterminer si la procalcitonine pourrait constituer un marqueur de BPFD qui répondrait aux problématiques soulevées par l’état actuel de l’arsenal diagnostique chez le chien. Ce projet exploitera les épisodes de BPFD survenant spontanément chez les chiens myopathes au cours de leur vie, sans interférence avec les projets dans lesquels ils seront inclus ni changement dans la gestion médicale habituelle de ces épisodes. A terme, si ce nouveau biomarqueur s'avère pertinent, il pourra constituer un outil pour mieux gérer ces affections non seulement chez les chiens atteints de myopathie de Duchenne, mais aussi chez tous les chiens de compagnie qui présentent des BPFD.
Bénéfices attendus
Nous éméttons l’hypothèse que la procalcitonine sera un meilleur marqueur de BPFD que la CRP et donc que son augmentation sera plus marquée que celle de la CRP lors du diagnostic. Le bénéfice serait la validation d’un biomarqueur plus spécifique d’une infection bactérienne aiguë et/ou plus sensible dans les cas de bronchite bactérienne (sans pneumonie) afin de mieux diagnostiquer les BPFD, de mieux cibler les patients nécessitant une antibiothérapie, de mieux adapter la durée de l’antibiothérapie et ainsi de limiter l’antibiorésistance.
Procédures
Trois prélèvements sanguins de 3 mL sur chiens vigiles. Durée estimée : 1 minute pour le prélèvement, 5 minutes de manipulation incluant le temps de rassurer le chien, de prélever, d'effectuer un point de compression et de récompenser le chien.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables et nuisances sont modérés et essentiellement liés au stress lié à la réalisation de 3 prises de sang durant le suivi d’étude.
Devenir
Ce projet sera mené sur des animaux déjà inclus en procédures expérimentales et qui présenteraient des complications médicales de BPFD. Les BPFD, si elles n'induisent pas de difficulté respiratoire significative sur les chiens ne constituent pas en elles-mêmes un point limite et la procédure expérimentale initiale pourra donc être poursuivie normalement.
Remplacement
Cette étude visant à déterminer l'intérêt du dosage d'un biomarqueur d'inflammation systémique, il n'est pas envisageable de la réaliser autrement que dans un organisme entier. Par ailleurs, l'application de cette étude étant le diagnostic des bronchopneumonies par fausse déglutition chez le chien, il apparaît nécessaire de réaliser cette étude dans cette espèce. Enfin, les chiens atteints de myopathie de Duchenne développant spontanément ce type d'affection respiratoire et bénéficiant d'un suivi très rapproché dans des conditions standardisées, ils présentent un intérêt évident pour valider ou non ce biomarqueur qui pourra ensuite être appliqué aux chiens de compagnie.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'études antérieures sur ce biomarqueur ayant montré des résultats significatifs avec un tel effectif.
Raffinement
Une attention sera portée à la minimisation du stress lié à la procédure de prélèvement. Les chiens seront manipulés avec douceur par des personnes de leur entourage habituel. Le temps sera pris avant le prélèvement pour rassurer le chien. A la fin du prélèvement, une friandise sera donnée au chien, qui sera également félicité par la voix et des caresses. Habituellement les chiens GRMD présentent assez peu de signes d'inconfort respiratoire durant un épisode de bronchopneumonie, mais si tel éait le cas et que le prélèvement n'était pas indispensable au suivi clinique de l'animal, celui-ci ne serait pas effectué. Sur le plan de l'hébergement, les chiens seront hébergés en petits groupes compatibles, sur litière végétale. Ils auront à leur disposition un lieu de couchage (corbeille + tapis), une plateforme, des jouets. Ils bénéficieront d'intéractions quotidiennes avec leurs soigneurs (caresses, jeux), et d'une sortie quotidienne 7j/7 dans des espaces de jeux intérieur et extérieur.
Choix des espèces
Ce projet ayant pour objectif de valider un biomarqueur chez le chien, il sera mené dans l'espèce canine. Les chiens GRMD recrutés pourront l'être à tout moment de leur vie. Les BPFD peuvent survenir à partir de l'âge de 4-5 mois (à ce stade les chiens GRMD pèsent entre 10 et 15 kg).
AMENDEMENT : Rôle des lymphocytes T non conventionnels dans des modèles murins de diabète de type 1
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- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
6 194 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection virale intra-péritonéale, un transfert de flore intestinale par gavage d'eau fécale et un suivi de glycémie, pour étudier le rôle de certains lymphocytes dans le diabète de type 1. Les souris devenues diabétiques développent une hyperglycémie et sont mises à mort dans les huit jours suivant sa détection, puis disséquées pour l'analyse du pancréas, du foie et de l'intestin. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" parce que ces cellules immunitaires ne s'étudient pas in vitro.
Objectifs
Notre projet porte sur le rôle des lymphocytes T non conventionnels dans le diabète de type 1. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune qui se caractérise par la destruction des cellules productrices d’insuline par le système immunitaire. Les cellules immunitaires infiltrent les îlots pancréatiques en déclenchant une inflammation qui aboutit à la destruction des cellules productrices d’insuline principalement par des lymphocytes T auto-réactifs. Cependant, les mécanismes de recrutement et d’activation de ces cellules par les îlots ne sont pas encore connus. Certaines infections virales et le microbiote sont impliqués dans la destruction des cellules productrices d’insuline mais aussi dans les altérations intestinales dont souffrent les malades atteints d’un diabète de type 1. Les lymphocytes T invariants associés aux muqueuses sont fortement perturbés chez les enfants et les modèles murins à l’apparition du diabète. De manière intéressante, ces cellules répondent à la fois face au microbiote, mais également aux infections virales.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes d'action par lesquels les cellules MAIT participent à l'apparition du diabète de type 1 et des complications associées aux infections virales.
Procédures
L'infection virale est induite par une injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Les différents traitements de molécules inhibitrices sont réalisés par injection intra-peritonéale (durée 30 secondes). Le transfert de flore intestinale est réalisé par gavage d'eau fécale (durée 1 minute). Certains animaux subirons une anesthésie de 5 minutes pour permettre une injection intraveineuse pour limiter le stress. Pour le suivi de la glycémie, une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent développer une hyperglycémie, mais cette hyperglycémie reste modérée car les animaux sont suivis quotidiennement et sacrifiés dans les huit jours après la détection d'une hyperglycémie. L'infection virale peut induire un état fébril modéré et transitoire. Les injections intra-péritonéales ainsi que la mesure de la glycémie sont une nuisance pour l'animal.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses des tissus implliqués dans le diabète (pancréas, foie, intestins) : histologie, cellules immunes présentes dans les tissus, cytokines.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées sont localisées essentiellement dans les muqueuses et le pancréas et l'analyse de leurs interactions dans l’organisme au cours du développement de la maladie ne peut être faite in vitro. Néanmoins ce projet est associé à de multiples manipulations in vitro visant à remplacer le maximum d'expérimentation animale possible.
Réduction
Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisés in vivo pour valider ces donnés est calculé sur la base d'un plan expérimentale stéréotypé permettant d'obtenir la puissance statistique nécéssaire à l'obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Notre stratégie vise à obtenir le maximum de résultats significatifs en utilisant des tests staistiques appropriés à chaque procédure expérimentale, de manière à utiliser le moins d’animaux possibles. De plus, en amont des procédures expérimentales, des expériences in vitro seront réalisées afin de mieux sélectionner les échantillons à tester in vivo. Chaque procédure fait l'objet d'analyses complètes qui permettent d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants et un panel large d’informations.
Raffinement
Pour chacune de ces procédures, le bien-être des animaux est surveillé par le personnel compétent ainsi que les responsables du projet. De l’enrichissement (maison et coton) est ajouté dans leurs cages de façon systématique. L’expertise des responsables de projet avec les procédures permet également de limiter le stress et l’inconfort des animaux. Pour les procédures necessitant une injection par intraveineuse, les souris subirons une anesthésie isoflurane d'une durée de 5 minutes. Toute souris diagnostiquée diabétique aura une attention plus poussée ainsi qu’un change de biberon d’eau et de litière plus fréquent. Une échelle avec les points limites adaptés est mise en place pendant les procédures expérimentales. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Le modèle murin du diabète de type 1 est adapté à l’étude immunitaire de cette pathologie : -Sa physiopathologie est très proche de la maladie humaine avec notamment une destruction auto-immune progressive des cellules productrices d’insuline de manière spontanée; -Ce modèle est une souris, ce qui permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour pouvoir isoler des paramètres biologiques importants dans le développement de la pathologie ; -Le système immunitaire de la souris est très proche de l’homme, ce qui est important pour l’étude d’une pathologie auto-immune, et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines d’âge (jeunes adultes), stade auquel on observe les premières anomalies du système immunitaire chez ce modèle de souris. AMENDEMENT : Les souris sous fond B6 permettent de déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections virales au delà du diabète.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur associés à différents tests chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3770 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 800 d'entre elles étant réutilisées pour de la formation et les autres tuées. Différents modèles de douleur inflammatoire, post-opératoire et neuropathique leur sont induits, avec stimulations douloureuses thermiques ou mécaniques des pattes, mise à jeun et prélèvements de sang, pour tester environ 80 candidats-médicaments analgésiques. Le porteur indique que les animaux des procédures sévères ne peuvent être réutilisés à cause de la douleur persistante et sont mis à mort. Il affirme que l'efficacité d'un analgésique ne peut être démontrée que chez l'animal vigile, la douleur associant une composante sensorielle et émotionnelle.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur (inflammatoire, post-opératoire, neuropathique) chez la souris et pour différent type de douleurs (mécanique, aigue, chronique). L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus (80 composés estimés). Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. De plus selon les tests, les animaux sont soumis à la contention, isolés dans des compartiments (durée de 3minutes à maximum 2h30 selon le test) et une stimulation douloureuse thermique ou mécanique des pattes arrière est réalisée (durée de 1minute à 1.5 minutes selon le test). Les tests peuvent être réalisés sur plusieurs jours et peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans limite de 6 points de mesures. Les animaux pourront subir des nuisances liées à l’administrations de composés (durée de quelques secondes à 3 minutes maximum). Ils pourront être réalisés une seule fois ou plusieurs fois par jour. Les administrations répétées peuvent causer des lésions superficielles. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé. Les prélèvements durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne l’apparition de symptômes douloureux. Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. Ces nuisances sont modérées à sévères. Pour une procédure , les animaux subissent une mise à jeun d’une durée maximale de 20h (nuisance modérée). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisances légères < 1minute). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère
Devenir
Les animaux des procédures sévères sont mis à morts, ils ne peuvent être ni replacés ni réutilisés à cause de la douleur persistante liée à leur pathologie. De plus, certains tests peuvent induire des douleurs intenses a posteriori. Enfin bien que les animaux ne présentent plus d’effets post-test, nous ne connaissons pas les impacts potentiels que les administrations de composés en systémique ou non ont pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. C’est pourquoi, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité. Dans le cas de certaines procédures les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein de notre structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en plastique rouge, briquettes en bois, sizzle nest) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux de 3 à 8 ou 10 souris (selon le poids final attendu) dans des cages de dimensions appropriées selon la directive 2010-63. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines au début de toutes les procédures. Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Production d’ascite de souris en vue de l’obtention d’anticorps monoclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
12 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce sont des femelles âgées réformées de l'élevage, qui reçoivent une injection de pristane provoquant une inflammation douloureuse du péritoine, puis un hybridome, pour produire un liquide d'ascite riche en anticorps destinés à des tests de diagnostic du D-Dimère. Le porteur indique que les animaux ne restent que 24 heures en état ascitique avant mise à mort et prélèvement. Il affirme que 83 pour cent des anticorps ont été transposés in vitro mais qu'un clone doit encore être produit sur souris, en invoquant aussi la "souveraineté nationale".
Objectifs
Le D-Dimère est un marqueur biologique de la formation et de la dégradation de la Fibrine, qui peut être mesuré sur sang total ou dans le plasma. Le D-Dimère a été largement étudié pour le diagnostic de la maladie thromboembolique veineuse (VTE), et est utilisé en routine pour cette indication. Il a également été évalué pour déterminer la durée optimale du traitement anticoagulant chez les patients souffrant de VTE, pour le diagnostic et le suivi de la CIVD (Coagulation lntraVasculaire Disséminée), ainsi que pour l'identification des patients à haut risque de VTE. Donc, la quantification du taux en D-Dimères joue un rôle important dans les décisions thérapeutiques. En France grâce à ces tests, ce sont près de 50000 à 100000 cas de phlébite qui peuvent être dépistés et traités par an. Plus récemment, il a été démontré que les patients infectés par la COVID-19, et présentant une forme grave de la maladie, présentaient un état de profonde inflammation conduisant à des taux élevés de complications thrombotiques comme la Thrombose Veineuse Profonde (DVT), l'Embolie Pulmonaire (PE), et la thrombose microvasculaire. Le marqueur le plus typique chez les patients avec COVID-19 et coagulopathie est une élévation de la concentration en D-Dimères. Ces trousses de diagnostics sont des kits I.V.D (In Vitro Diagnostic) enregistrés officiellement et marqués CE sous la réglementation « ISO 9001-2008 » et « 13485 ». Certains sont également FDA Approved. Les clones ont été développés et sélectionnés pour leurs spécificités et leurs rendements il y a plus de 25 ans. Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production d’une quantité suffisante d’ascite à une concentration importante d’anticorps monoclonaux, de qualité, afin de pourvoir les quantités nécessaires à la confection des kits de dépistage des pathologies recherchées, et ce afin de limiter le nombre de souris utilisées. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages de D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines.
Procédures
2 inoculation sous cutanée de buprénorphine sur animal vigile : 5 sec/animal Inoculation intrapéritonéale de pristane sur animal vigile : 2.5 sec/animal Inoculation hybridome sur animal vigile : 2.5 sec/animal Aucun prélèvement sur animal vigile
Impact sur les animaux
Aujourd’hui la production de ces anticorps sur ascite de souris, est réalisé ans des établissements européens et français selon le protocole préconisé par la CNREEA. L’injection d’adjuvant de type pristane (huile) provoque une inflammation du péritoine et active le système immunitaire. Cette inflammation est douloureuse dans les premières heures après l’injection. Afin de diminuer cette douleur et pour que l’animal récupère plus rapidement, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) préalable à celle du pristane est réalisée. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Les animaux sont donc observés et reçoivent une seconde injection de buprénorphine 4 heures après la première. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avant le prélèvement.
Remplacement
Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Malheureusement, la production en bioréacteur pour les différents clones, dont cette DAP fait objet, a modifié certaines caractéristiques de l'anticorps pour un clone et ne permet pas, à ce jour, de valider l'équivalence entre l'anticorps monoclonal "in vitro" et l'anticorps monoclonal "in vivo". Cette perte de qualité n’est pas acceptable ni autorisée par les autorités compétentes en raison du marquage CE et de la finalité diagnostic des produits. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies. Ces productions sont également réalisées dans des pays hors Union européenne, capables de produire la totalité des volumes nécessaires qui pourraient ainsi faire perdre en partie la souveraineté nationale et européenne ainsi que le contrôle du bien-être animal propre à la CNREEA.
Réduction
Le clone de cellules est sélectionné afin d’obtenir un volume d’ascite important à une concentration importante en anticorps dans le but de limiter le nombre de souris. La quantité d’ascite produite est en moyenne de 2.8mL/souris. Les animaux utilisés sont des souris anciennes qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Raffinement
Les souris sont hébergées sur un lit de sciure avec des enrichissements de type lanières de cartons et tunnels afin qu’elles puissent se cacher, créer un nid afin de répondre à leurs besoins physiologiques. Elles sont soignées quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation A tout moment l’opérateur peut décider de l’arrêt du protocole s’il juge que l’animal est en détresse. Pour diminuer la douleur liée à l’inflammation provoquer par l’adjuvant, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) est effectuée avant et après l’adjuvant. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité. La raison de l’utilisation de la buprénorphine est bibliographique. En effet il s’agit de l’anti-douleur préconisé dans cette production. Plusieurs essais d’optimisations ont été apportées : - Essais avec des AINS (Anti-inflammatoire Non Stéroïdien) n’ont pas été concluants et n’ont pas montrés une amélioration significative de l’état de l’animal car ce qui est recherché par l’injection de l’adjuvant, est une inflammation du péritoine et une activation du système immunitaire de manière à obtenir une grande quantité d’anticorps. - Essais menés pour éviter la manipulation et l’injection de buprénorphine aux souris : des gels aromatisés contenant un morphinique ont été placés dans la cage des souris ou dans l’eau des biberons. Ces deux essais n’ont pas été concluants car ils ne garantissaient pas que toutes les souris étaient correctement traitées avec l’anti-douleur : certaines étant sous-dosées et d’autres à l’inverse sur-dosées. Les souris sont mirées quotidiennement. Dès lors qu’une réaction est détectée par mirage de l’abdomen l’ascite de la souris est prélevée sur animal mort. Cette façon d’opérer permet aux animaux de ne rester que 24 heures en état ascitique et limiter la mortalité du fait d’une production exponentielle d’ascite. Des points limites prédictifs sont mis en place suivant une grille de scoring.
Choix des espèces
La souris est l’animal idéal pour la production d'anticorps monoclonaux et est, de ce fait, l'animal le plus utilisé. La souche utilisée est la lignée de souris consanguine BALBc, sur laquelle ont été développés tous les essais liés aux techniques d’obtention d’anticorps monoclonaux . Cette lignée permet d’obtenir un volume plus important d’ascite avec une concentration en anticorps supérieurs aux autres souches de souris. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes. Elle produit des volumes satisfaisants d’antisérum présentant un titre élevé et une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines. Les animaux utilisés sont des souris BALBc femelles, anciennes reproductrices réformées chez l’éleveur. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure( multiplié par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Rôle de FGF21 hépatique dans le comportement alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 384 d'entre elles étant ensuite replacées en élevage et les autres tuées. Elles subissent un jeûne pouvant durer 24 heures, un hébergement isolé lors des tests de comportement alimentaire et des prélèvements de sang à la queue et à la joue, pour étudier le rôle de l'hormone hépatique FGF21 dans l'appétence au sucre et à l'alcool. Le porteur indique que le jeûne peut abaisser la glycémie et la température corporelle et que l'isolement peut stresser les animaux. Il affirme que ces mécanismes, faisant intervenir plusieurs organes, ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives.
Objectifs
Le foie est un régulateur central du métabolisme et du dialogue avec les autres organes, notamment avec le cerveau pour assurer le contrôle de différents types de comportements alimentaires. Dans ce dialogue entre le foie et le cerveau, la protéine FGF21 (pour Fibroblast Growth Factor 21), une hormone produite de manière prédominante par le foie (hepatokine), exerce divers effets métaboliques parmi lesquels le contrôle de l’appétence pour le sucre et l’alcool. FGF21 est aussi une hormone dont l’expression est fortement induite lors du jeûne. La majorité des recherches sur cette hormone a été réalisée grâce à l’utilisation de souris déficientes pour FGF21 dans tout l’organisme et avec des souris transgéniques surexprimant FGF21. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’implication de FGF21 spécifiquement du foie lors du jeûne et dans le comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider notre modèle de délétion spécifiquement hépatique de FGF21. De plus, ce projet permettra de démontrer ou réfuter que FGF21 d’origine hépatique contrôle la préférence au sucre et à l’alcool. En effet, les résultats décrits jusqu’alors dans la littérature ont été obtenus à partir de souris délétées pour FGF21 dans tout l’organisme ou surexprimant FGF21 dans tout l’organisme. Ces modèles sont peu physiologiques et ne permettent pas de définir l’origine tissulaire de FGF21 dans ces effets.
Procédures
Dans la procédure 1, les animaux seront mis à jeun pendant 24h maximum. Pour la mesure de la glycémie, un prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Le jeûne peut induire une baisse du taux de glucose circulant et une baisse de la température corporelle. La consommation d’eau sucrée et d’alcool peut entraîner une augmentation de la glycémie. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des tests de comportement alimentaire et des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. La piqûre pour mesure la glycémie ainsi que le prélèvement de sang peuvent entraîner une douleur.
Devenir
A la fin de la procédure 1 de jeûne, les animaux seront euthanasiés. A la fin de la procédure 2, les animaux seront replacés en élevage après examination par la vétérinaire référente.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car les phénomènes biologiques étudiés (jeûne et comportement alimentaire) sont complexes et font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible d’étudier la protéine d’intérêt (FGF21) grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux pour ce projet est défini pour permettre d’une part de répondre aux questions scientifiques et d’autre part de respecter la réduction du nombre d’animaux au maximum. Ainsi, nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance et est basé sur des données provenant d’expériences antérieures du laboratoire. Ce nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire mais suffisant afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance (inactivité, somnolence, respiration lente, déshydratation) avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, le critère d’arrêt sera atteint. L’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (hébergement collectif, régime standard et aucune procédure réalisée).
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement des organes métaboliques est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Evaluation comportementale des effets de nouvelles entités pharmacologiques dans trois modèles de mémoire chez le rongeur: le test du labyrinthe de Barnes, le test du labyrinthe en Y et le test de reconnaissance de nouvel objet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1440
6 240 rongeurs, 4 800 souris et 1 440 rats, vont être utilisés, et la déclaration en compte 3 520 en souffrance légère et 2 720 en souffrance modérée. Selon les groupes, ils passent sous candidats médicaments un labyrinthe de Barnes, un labyrinthe en Y, dont une version impose huit jours de restriction alimentaire, ou un test de reconnaissance d'objet nouveau, et l'un des protocoles les expose à une lumière et un bruit forts pour les pousser à chercher un refuge. Les souris des lignées présentées comme reproduisant la trisomie 21 et le syndrome de l'X fragile passent les trois tests. Ces molécules viennent du centre de recherche du porteur, qui les trie selon leur effet sur la mémoire et renvoie les retombées pour les patients à "plus long terme", où le projet "pourrait permettre" de fournir des données qu'il dit "indispensables". Les souris de ces lignées et les rongeurs traités par des composés qui risqueraient d'interférer avec d'autres expériences sont tués, et les témoins pourront être réutilisés dans d'autres projets, 960 souris et 360 rats selon la déclaration.
Objectifs
Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.
Bénéfices attendus
A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouveaux candidats médicaments, ce projet permettra de caractériser leur effet sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale, mémoire à court ou long terme). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des candidats médicaments présentant des effets promnésiques (c'est à dire favorisant la mémoire) intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits de mémoire (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Ou à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus deux modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile), qui permettront de tester l’effet de nos nouveaux candidats médicaments sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique chez l’humain, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments pour traiter des déficits de mémoire dans différentes pathologies.
Procédures
Ce projet comporte 3 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, des groupes distincts seront soumis à ces 3 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 2 modèles souris de la trisomie 21 et du syndrome de l’X Fragile, les mêmes souris seront soumises aux 3 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déoulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes; la seconde version impliquera une restricton alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Pour chacun des 3 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitive et d’attention fonctionnelles.
Etude des mécanismes de l’atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un prélèvement de queue, des injections intraveineuses, deux chirurgies sous anesthésie et des séjours en cage métabolique, une atteinte rénale leur étant induite pour en étudier les mécanismes avant prélèvement des reins. Le porteur affirme que "seule l'expérimentation animale" permet d'étudier ces maladies rénales rares dans un organisme vivant. Les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort après le seul génotypage.
Objectifs
Les maladies rénales rares et sévères sont à mauvais pronostic et sont associées à des risques élevés d'insuffisance rénale terminale. Ces maladies représentent 11% des causes d'insuffisance rénale terminale en France. Ces maladies sont des maladies complexes et seule l'expérimentation animale, résumant l'ensemble des interactions cellulaires au sein du rein, dans un organisme vivant, permettra d'étudier les mécanismes impliqués dans la destruction rénale au cours de ses maladies. Nous avons identifié une protéine potentiellement impliquée dans ces maladies et nous allons tester le rôle de cette protéine chez des souris où cette protéine aura été inactivée et chez qui nous aurons induit les maladies rénales que nous étudions. Nous réaliserons des prélèvements d'urine pour évaluer la fonction des reins et les animaux serons mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les reins et analyser les lésions.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies rénales rares et sévères. Ce projet permettra d'établir si le mécanisme identifié pourrait faire l'objet d'un ciblage pharmacologique à visée thérapeutique.
Procédures
Baguage à l'oreille et prélèvement d'un morceau de queue de 1 mm sur animal vigile (1 fois 2 min), injection intra veineuses sous anesthésie générale (1 à 3 selon la procédure, 5 minutes), chirurgies sous anesthésie générale (2 chirurgies pour une procédure, 20 minutes). recueil d'urine en cage métabolique (3 à 7 selon les procédures, 8H)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, stress lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleur post-opératoire. Effet lié aux modèles: insuffisance rénale pouvant induire une perte de poids modérée ou une fatigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Soit ils n'auront pas un génotype d'intérêt et sont mis à mort sans expérimentation autre que le génotypage, soit ils sont d'intérêt et sont mis à mort pour prélèvement des tissus.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères incluant les cultures cellulaires (in vitro). Les cibles identifiées sont d'abord testés sur des cellules en culture. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales comme les interactions entre les glomérules et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous avons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un logiciel dédié. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les cages sont enrichies en coton et bâton de bois. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, les modèles utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Stade de développemnt: de la naissance à l'age adulte car nous avons un élevage. Seuls les animaux adultes agés de 2 à 6 mois sont utilisés pour les modèles expérimentaux. Les pathologies étudiées touchent essentiellement les adultes donc nous réaliserons les modèles expérimentaux chez des souris adultes.
Cibler le microbiote des tiques pour perturber leur alimentation/survie et bloquer leur compétence vectorielle vis-à-vis de bactéries (rickettsies)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Lapins : 12
100 souris et 12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des injections, portent une capsule fixée sur le dos et sont infestées par des tiques, les lapins étant utilisés pour produire du sérum, avant mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que l'alimentation des tiques provoque un inconfort modéré et que la pose des capsules a été optimisée pour le limiter. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de la souris à une vaccination anti-microbiote de tique.
Objectifs
L'implication du microbiote (bactéries symbiotique de la tique) de la tique dans la survie des tiques et dans la transmission des agents pathogènes transmis par ces dernières a déjà été signalée pour différentes espèces de tiques. Ces preuves renforcent le fort potentiel du microbiote des tiques en tant que cible pour le développement de stratégies de contrôle. Il est prouvé que la présence de certaines espèces de ces bactéries (symbiotes) favorise l'établissement d’agents pathogènes chez les tiques, alors que la présence d'autres espèces de bactéries a été associée à l'absence d’agents pathogènes chez la tique. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de recherche est de cibler deux types de bactéries symbiotiques pour évaluer les effets de la vaccination de souris par ces bactéries sur la composition du microbiote de la tique, sur l'limentation et la survie de tique et enfin sur l'acquisition d'un agent pathogène par la tique.
Bénéfices attendus
Les tiques transmettent des maladies graves à l'homme et aux animaux. Cependant, la lutte contre les tiques repose uniquement sur les acaricides, qui peuvent contaminer l'environnement et les produits d'origine animale (par exemple, le lait et la viande) consommés par l'homme. En outre, les acaricides peuvent sélectionner des populations de tiques résistantes. Malgré la gravité des maladies transmises par les tiques, la prévention repose uniquement sur l'évitement des piqûres de tiques. Les tiques abritent une communauté de microbes (microbiote) comme les autres animaux. Chez les tiques, le microbiote joue un rôle dans la survie et le développement des tiques ainsi que dans leur capacité à transmettre des agents pathogènes. Ce projet vise à développer une stratégie plus sûre de lutte contre les tiques, basée sur des vaccins anti-microbiote de tique utilisés chez la souris.
Procédures
Souris animaux vigiles : 2 injections et 3 prélèvements. Pose de capsule sur le dos des souris. Infestation avec tiques Lapins = Animaux vigiles : 2 injections et 2 prélèvements.
Impact sur les animaux
Chez les souris, l’alimentation des tiques induit un inconfort modéré. De plus, les souris peuvent simplement se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pas de symptômes attendus suite à l'inoculation des agents pathogènes mais surveillance quotidienne des animaux (souris et lapins).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.
Remplacement
Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec des bactéries non pathogènes afin d'évaluer les effets sur la composition du microbiote de la tique, l'alimentation/survie de la tique et l'acquisition d'une bactérie pathogène (Rickettsia) par la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne afin d'analyser les effets sur le microbiote des tiques et la colonisation des pathogènes. Afin de disposer d'un plus grand volume de sérums pour des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation de souris supplémentaires. Dans le cadre de ce projet nous ne cherchons pas à simplement infecter des tiques par des bactéries, nous avons besoin d’évaluer l’efficacité d’une vaccination chez la souris avec deux bactéries sur le gorgement/survie et capacité à s’infecter des tiques. Il existe des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire des souris suite à une vaccination. La production/cultures des bactéries est par ailleurs réalisée par culture cellulaire in vitro.
Réduction
Chaque souris peut nourrir au maximum 30 tiques. Mais par souris entre 20-25 tiques vont se détacher sans faire un repas complet ou mourir donc nous obtiendrons 5-10 tiques gorgées par souris donc il faut prévoir 5 souris pour groupe pour obtenir 25-50 tiques gorgées par groupe au total, nombre nécessaire à nos analyses. Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir le nombre de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Nous avons comptabilisé le nombre minimal de lapin nécessaire à l’obtention du volume necessaire de serum pour nos futures experimentations in vitro. Pour nos expérimentations futures in vitro, nous avons besoin durant les 5 années du projet d’un volume total de 60ml de sérums de lapins immunisé pour chaque bactérie (deux bactéries) et le même volume pour chaque lapin contrôle (deux contrôles). Nous avons donc estimé avoir besoin de 3 lapins par groupe (environ 20ml de sérum pouvant être récupéré par Lapin) soit un total de 12 lapins sur les 5 ans du projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées par lot de 3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Il n’y a aucune souffrance attendue suite à l’infection par les bactéries lors des immunisations, les infections sont asymptomatiques chez les souris et les lapins. Pas de points limites dans ces conditions. Cependant, après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux (état général) sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de déshydratation ou signes neurologiques (début de paralysie notamment). Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels. Lorsque les souris auront des capsules sur le dos avec des tiques, elles devront être hébergées en cage individuelle, en effet les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Mais ces souris seront hébergées dans les conditions classiques avec l'enrichissement nécessaire à leur bien être en augmentant le nombre de carré de coton et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages d'à côté. Pour les lapins, à leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins seront observés quotidiennement pendant toute l'expérimentation. Comme les lapins sont des animaux très sensibles à la manipulation, ils seront quotidiennement contrôlés et manipulés par les animaliers et l’expérimentateur pour les habituer à leur présence et aux manipulations.
Choix des espèces
Les 3 lignées de souris ont été sélectionnées car elles sont les plus sensibles aux agents pathogènes (bactéries notamment) transmis par les tiques. Lapin blanc de Nouvelle-Zélande car ce sont les animaux les plus appropriés pour obtenir un grand volume de sérum vacciné en une seule expérience et permettra d'obtenir suffisamment d'anticorps spécifiques contre les bacteries à l'étude. De plus ils ne peuvent pas être utilisés pour infecter des souris car ils ne développement pas de bactériemie suffisante. Souris 7-8 semaines. Lapins = 4-5 semaines. Adaptation des animaux durant une semaine avant l'expérimentation. Souris gardées au plus 39 jours (entre 20 et 39 jours selon procédure). Lapins seront gardés au maximum 30 jours. Mise à mort de tous les animaux au maximum à J39.
Les neurones inhibiteurs longue distance de l’hippocampe: des tours de contrôle dysfonctionnelles ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié classée en souffrance sévère et l'autre en souffrance légère. Les animaux subissent des chirurgies d'induction d'une épilepsie chronique, des injections de virus, l'implantation de dispositifs d'enregistrement, puis de l'imagerie calcique, des enregistrements EEG et des tests comportementaux cognitifs et émotionnels, avant prélèvement de l'encéphale. Le porteur décrit les crises d'épilepsie, le maintien en cage individuelle pendant huit à douze semaines et les chirurgies répétées du crâne comme des atteintes sévères au bien-être des animaux non-humains. Les souris au génotype non souhaité, classées en léger, ne subissent que le génotypage avant mise à mort.
Objectifs
L’épilepsie du lobe temporal, type le plus fréquent d’épilepsie incurable, se caractérise par des crises d’épilepsie souvent générées dans l’hippocampe. Toutefois, l’ampleur des altérations cognitives, anatomiques et fonctionnelles chez les patients suggère que la maladie implique le dysfonctionnement d’un large réseau de régions cérébrales, bien au-delà de l’hippocampe seul. Il est crucial d’étudier les mécanismes qui contrôlent les interactions entre l'hippocampe et les autres régions du cerveau pour mieux comprendre les échecs fréquents des thérapies actuelles, dont celles ciblant l’hippocampe. Nous nous intéressons à un type de neurones qui jouerait dans des conditions normales un rôle de « tour de contrôle » entre différentes régions du cerveau : les neurones inhibiteurs à projection longue. Nous pensons qu’un dysfonctionnement de ces neurones pourrait jouer un rôle primordial dans le réseau épileptique. Pour le vérifier, nous combinerons imagerie calcique et enregistrements électrophysiologiques in vivo sur des souris épileptiques en comportement avec des virus rétrogrades ciblant les neurones inhibiteurs à projection longue-distance. Ainsi, nous examinerons le rôle pathologique de ces neurones dans les altérations à grande échelle liées à l’épilepsie du lobe temporal et déterminerons les potentiels bénéfices de leur manipulation au niveau thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance de neurones inhibiteurs particuliers, qui connectent l'hippocampe avec d'autres régions cérébrales, dans les altérations à grande échelle associées à l'épilepsie du lobe temporal. En cas de succès, ces neurones pourraient être la cible de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de formes incurables d'épilepsie.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) un génotypage (optionnel), b) des chirurgies d'induction d'un état chronique d'épilepsie (1-4h), c) des chirurgies (30-90minutes) d'injection de virus chez l'adulte ou à P0 (optionnel), d) des chirurgies d'implantation de dispositifs d'enregistrements par électrophysiologie ou par imagerie calcique, e) des mesures de leur activité neuronale (maximum 1h en imagerie, 24/7 en EEG télémétrique, une technique permettant d'enregistrer les crises d'épilepsies sur des animaux libres de leurs mouvements), f) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions cognitives ou émotionnelles, réputées altérées en condition d'épilepsie (1/2 journée). A la dernière étape du protocole expérimental, l'encéphale sera prélevé sous anesthésie profonde pour analyser les tissus
Impact sur les animaux
Dans le cas d’animaux subissant l’ensemble d’une procédure, l’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus sont de classe sévère et peuvent être résumés selon les points suivants: - Le stress lié au maintien des souris adultes en cages individuelles après induction de l'épilepsie et pendant la majeure partie de la procédure (soit généralement 8-12 semaines) afin de limiter les bagarres et faciliter le suivi, - l'inconfort et le stress généré par les interventions (optionnelles) sur des souriceaux nouveau-nés et leur maintien transitoire hors de la cage maternelle pour observation pendant 2h30 à 3h30 - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - L'inconfort associé au réveil post-chirurgical et le risque infectieux lié aux anesthésies et interventions chirurgicales répétées (craniotomie, implantation) afin de réaliser des injections intracérébrale et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale – Les démangaïsons pouvant être provoquées par les sutures de la peau du crâne. Dans le cas de l'utilisation de lignées transgéniques, les animaux au génotype non-souhaité sont classés en léger puisqu’ils ne subissent qu'une intervention (génotypage).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux subissent une anesthésie profonde terminale afin de prélever l'encéphale et d'effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Notre but est de comprendre le rôle d'un type de neurones particuliers de l'hippocampe dans des désordres cognitifs et électrophysiologiques à large-échelle associée à l'épilepsie du lobe temporal. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro (que nous utilisons régulièrement par ailleurs) n'est pas applicable pour ce projet-ci. En termes de modèle animal, les souris sont un excellent modèle animal par rapport à d'autres existants parce qu'elles reproduisent fidèlement les altérations cardinales observées chez les patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal, sont capables de réaliser des tests de comportement transposables chez l'homme (à la différence d'autres animaux tels les poissons zèbres) et comptent d'autres avantages (vitesse de reproduction, capacité de transgenèse).
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés : Nous utilisons une procédure raffinée d'induction de l'épilepsie qui augmente considérablement le taux de réussite de la procédure, et limite par conséquent le nombre d'animaux nécessaires pour générer des cohortes d'animaux épileptiques chroniques. De plus, nous privilégions chaque fois que cela sera possible l’utilisation d’animaux sauvages (appelés aussi wildtype ou WT) combinée à des constructions AAV spécifiques des neurones inhibiteurs afin de limiter quand cela est possible le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des souris du génotype voulu. Le cas échéant, nous utiliserons des lignées transgéniques telles que GAD-Cre, PV-Cre ou SOM-Cre disponibles dans le laboratoire.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement afin de limiter l'impact de nos expérimentations sur le bien-être des animaux: - Les animaux sont hébergés dans des cages avec un environnement enrichi (composé d'igloos cartonnés, de tunnels en carton et de papier foisonnant), en présence d'eau et de nourriture ad libitum - Notre procédure raffinée d'induction de l'épilepsie, basée une échelle des symptômes et sur l'injection de caféine, permet de prévenir la survenue des stades les plus sévères du status épilepticus (associés à de la souffrance et la mort). - Chaque intervention invasive (e.g., chirurgie) est effectuée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie optimales. - Nous mettons un soin particulier à constamment surveiller les constantes biologiques et la souffrance des animaux , particulièrement dans les heures et jours suivant les interventions invasives (e.g., induction de l'épilepsie, chirurgie) jusqu'à la mort des animaux. Des grilles de suivis ont été mises en place, et le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction.
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux dont souffrent les patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeurs, altérations histologiques). Ils sont donc un excellent modèle pour cette maladie humaine, et sont utilisés de manière routinière dans le laboratoire. L'induction de l'épilepsie est effectuée sur des souris agées de 2 mois environ, un stade favorisant la survie des animaux, ainsi que le taux d'induction de l'épilepsie. Les enregistrements (imagerie calcique, électrophysiologie) et les tests comportementaux s'effectuent 6-12 semaines plus tard, à un stade où les animaux ayant subi le protocole d'induction ont subi des altérations histologiques conduisant à une épilepsie chronique (se manifestant par des crises spontanées récurrentes, des désordres cognitifs ainsi que que des altérations histologiques).