Recherche appliquée

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un impact crânien est infligé à des souriceaux de 17 jours, suivi de l'implantation d'un mini-microscope par une fenêtre crânienne, puis de tests comportementaux (exploration, coordination motrice, sensibilité tactile, état anxieux) et d'imagerie du cerveau. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme qu'aucun signe de douleur n'apparaît au réveil. Toutes les souris sont tuées pour des analyses en immunohistochimie et par IRM.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place à la suite d'un traumatisme crânien (TC) au sein du cerveau et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Nous allons nous focaliser dans ce projet sur les atteintes des vaisseaux sanguins ainsi que sur les processus inflammatoires qui se mettent en place après un TC. Le caractère unique de ce projet est assuré par l’utilisation d’une technique innovante permettant d’imager les cerveaux de souris se comportant grâce à un mini-microscope qui sera implanté sur leur tête.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu).

Procédures

1. trauma crânien léger juvénile (TC): 17 jours après leur naissance, les animaux seront anesthésiés pendant 5 min et subiront un impact léger calibré de 200 µs. Animaux contrôles soumis au même geste, sauf impact. Réalisé une seule fois. 2. Implantation des lentilles de miniscope. Réalisé un mois après TC sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Réalisation d’une fenêtre crânienne. Le cas échéant injection stéréotaxique de virus. Insertion et fixation du prisme, scellement de la base d’ancrage. Durée de 1h à 1h30, plus 30 min en cas d’injection virale. Réalisé une seule fois. 3. Tests comportementaux et imagerie calcique sur animal vigile. Tous les 3 mois (2 fois pour la moitié des animaux, 4 fois pour l’autre moitié). A. mise en place du miniscope. Contention à la main et positionnement du miniscope à l’aide d’une plateforme aimantée sur la lentille. B. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration, 3 tests de coordination motrice, 2 tests de sensibilité tactile, et 1 test d’évaluation de l’état anxieux. Tests de 5 minutes réalisés à raison d’1 test/jour. C. Injection intrapéritonéale unique (environ 3 secondes) lors de la dernière session comportementale (6 mois post TC pour la moitié des animaux, 12 mois pour l’autre moitié), une demi-heure avant le test d’évaluation de l’état anxieux.

Impact sur les animaux

Ce projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile anesthésié. Une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur et reprend immédiatement un comportement normal. Les conséquences incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Il n’y a pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des modèles de souris permettant une exploration longitudinale par imagerie calcique parfaitement décrits qui sont très utilisés dans le domaine et très bien décrits dans la littérature. Aucun phénotype dommageable n’a été décrit. La chirurgie envisagée peut entraîner à faible niveau hypothermie, déshydratation, douleur postopératoire et stress. La pose d’un implant tel que la lentille de miniscope s’accompagne de la possibilité de perte de l’implant. Lors de l’imagerie calcique sur animal vigile couplée au comportement, la pose du miniscope sur la lentille entrainera une contention très courte d’environ 20s. Le poids (< 2g) et le câble reliant le miniscope peuvent occasioner une gêne. Chaque série comportementale peut représenter une source de stress pour les animaux. L’injection IP du composé peut entraîner une douleur ou une gêne locales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 224 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été spécialement conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés par l’obtention d’un suivi longitudinal non invasif. En effet, l’utilisation de l’imagerie in vivo permet d’enregistrer sur un même animal l’évolution de l’unité neurovasculaire au cours du temps, limitant significativement le nombre d’individus nécessaires à cette étude (par exemple, pour 4 temps d’intérêt un seul groupe d’animaux ne sera nécessaire contre 4 groupes avec des techniques classiques). De même cette technique permet de diviser par 2 le nombre d’individus nécessaires pour une approche pharmacologique, les animaux représentant leurs propres contrôles, et augmentant de fait la significativité des résultats. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra d’augmenter l’efficacité des techniques d’imagerie et donc réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en conservant une puissance statitistique satisfaisante, nous avons réalisé une étude de la robustesse de notre nombre d’animaux pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser.

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme. Il s’appuie sur la mise en place des méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. Pour permettre la réalisation des enregistrements d’imagerie, l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype non-dommageable sera privilégié dans la mesure du possible à l’utilisation d’injection virale. Ceci permettra de réduire le temps de chirugie d’environ 30 min et donc favoriser la récupération post-opératoire des animaux. Le projet sera mis en oeuvre par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera mise en place.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un traumatisme crânien en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 12 mois après le traumatisme crânien afin d’évaluer les conséquences à long-terme.

75 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit par voie rectale un produit destiné à provoquer une inflammation du côlon, subit des coloscopies et des IRM sous anesthésie, puis l'administration orale ou rectale d'un anticorps. Le porteur indique que l'induction de l'inflammation peut entraîner saignements, douleurs, diarrhées et déshydratation, et que les animaux sont tués par injection intracardiaque en fin de protocole. Il décrit le mini-porc comme le "modèle le plus adapté" pour tester une nouvelle forme orale d'un médicament déjà commercialisé en perfusion.

Objectifs

L’inflammation chronique de l’intestin et du côlon (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Selon l'Association François Aupetit (AFA), 8000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année en France. Les traitements conventionnels des MICI sont à base d’antiinflammatoires (acide 5-amino-salicylique, Pentasa®), de corticoïdes ou d’immunosuppresseurs (Azathioprine). Dans cet arsenal thérapeutique, l'utilisation des anticorps monoclonaux anti-TNF en monothérapie s’avère être efficace, notamment sur les cas compliqués. Ce sont les molécules les plus puissantes disponibles actuellement en clinique. En 2014, 3 formes de ce médicament à base d’anti-TNF ont obtenu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en France pour le traitement des MICI administré par perfusion. Leurs indications ciblent le traitement de la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique modérée à sévère chez les patients réfractaires aux traitements conventionnels cités ci-dessus. Cependant, les effets secondaires de ces nouveaux médicaments sont parfois importants pour les patients, notamment l’apparition des saignements liées à l’injection répétée par voie intraveineuse de ce médicament. De façon intéressante, nous avons développé une autre forme de ce médicament de manière à l’administrer par voie orale. Cette voie permettra ainsi d’éviter ces effets secondaires. Cependant, l’efficacité de ce médicament administré par voie orale reste à démontrer. Cette recherche préclinique chez le mini-porc permettra de valider d’une part la faisabilité et la tolérance de la voie orale pour l’administration de ce médicament et d’autre part, l'efficacité thérapeutique de son activité anti-inflammatoire dans un contexte pathologique. Cette étude comportera deux grands objectifs : (1) Valider un modèle animal (mini-porc) qui développe la maladie de l’inflammation chronique de l’intestin et du colon, (2) confirmer la sécurité et l’efficacité du traitement administré par voie orale par rapport à la voie parentérale (perfusion) et rectale.

Bénéfices attendus

Notre étude apportera la validation préclinique d’une formulation pharmacologique innovante permettant d’administrer un traitement anti-TNF par voie orale. De manière générale, cette étude apportera un intérêt clinique majeur chez les patients souffrant de pathologies chroniques et déjà sous traitement parentérale (perfusion). L’utilisation d’une nouvelle forme galénique innovante s’accompagnera d’une meilleure tolérance et d’une action d’installation plus rapide que les traitements actuellement mises sur le marché. Les bénéfices attendus par l’utilisation d’un bio-médicament avec une nouvelle forme galénique administrée par voie orale sont nombreux : 1. Une libération locale ciblée de la substance active au site d'action. 2. Réduction des infections à répétitions. 3. Une meilleure observance du traitement liée à un mode d’administration plus simple, sans les contraintes de stockage et de stérilisation retrouvées avec les formes injectables. 4. diminution importante de la charge hospitalière (soulagement du système économique de la santé) 5. La fabrication d'une forme galénique sèche (comprimé) est simple et moins couteuse.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection par voie intra-rectale (induction de l’inflammation par 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) et le Dextran Sulfate Sodium (DSS) + injection du traitement en solution ou dispersion), un gavage (administration des comprimés) et deux examens d'imagerie pour l’évaluation et le suivi du traitement (coloscopie + IRM avec injection de produit de contraste sous anesthésie générale). L’administration du médicament par voie orale à travers la sonde nasogastrique et par voie rectale à l’aide d’une canule rectale (dispositif médical) après fixation d’une seringue va durer approximativement 10-15 min. Une surveillance rapprochée des animaux sera effectuée afin de s’assurer de la tolérance des interventions.

Impact sur les animaux

La plupart des animaux notamment ceux inclus dans les phases 1 (sauf lot 1.1 : contrôle négatif), 2 et 3 (modèle de MICI), seront soumis à une injection d'un produit pouvant être irritant par voie rectale, afin de déclencher une inflammation colique. Cette intervention nécessite une anesthésie générale et l'utilisation d'une procédure de coloscopie. Cette intervention peut entrainer un saignement du colon, les animaux peuvent ressentir des douleurs, rarement une modification du poids (+/- 10%), des diarrhées pouvant entrainer une déshydratation. Par ailleurs, un stress lié à l'administration du traitement orale sera remédié avec une prémédication. Le traitement peut nécessiter une courte sédation de l'animal car le comprimé de 5 mm de diamètre ne doit pas être croqué (comprimé enrobé). Les animaux seront euthanasiés par l'injection létale intracardiaque du T61 à la fin du protocole expérimental ou lorsqu’un des points limites sera atteint.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à chaque date (Mois 3 : Phase 1 et 2, Mois 12 : Phase 3), puis une autopsie (évaluation macroscopique des tissus) et des prélèvements de tissus biologiques pour une analyse moléculaire et histologique seront effectués. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas d’apparition d’un point de limite.

Remplacement

Pour réaliser cette étude préclinique, nous utiliserons un modèle de maladie inflammatoire chronique intestinale (MICI) chez le mini-porc pour mimer la pathologie chez l’homme. Il s’agit d’un modèle animal le plus adapté d’une part par les ressemblances anatomiques et processus physiopathologiques du tube digestif avec l’homme, et d’autre part par sa corpulence proche de la taille humaine. Cette étude comporte la sécurité et l’efficacité de la forme galénique du traitement antiinflammatoire des MICI ciblant la partie distale de l’intestin. De ce fait, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation du modèle animal par une évaluation in vitro ou ex vivo ou un modèle d’intestin artificiel « in silico ». Une administration des comprimés à taille humaine chez la souris ou le rat n’est pas réalisable, elle ne reflèterait pas les conditions physiopathologiques observées chez l’Homme. De plus, ce mammifère est le plus couramment utilisé dans les évaluations pharmacologiques des MICI. A notre connaissance, aucune étude expérimentale n’a évalué à ce jour l’efficacité d’un bio-médicament sous une forme galénique par voie orale. L’utilisation chez le mini-porc d’un bio-médicament sous une nouvelle forme galénique (développé en collaboration avec un industriel) permettra de démontrer la preuve de concept in vivo (efficacité, tolérance et sécurité) dans le traitement des MICI avant la réalisation des premiers essais cliniques sur l'homme.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. De surcroît, le nombre des animaux choisis permet de réaliser une étude comparative entre les groupes d’animaux sains et avec un MICI induite. Ce qui permet de valider le modèle pathologique. Ensuite, une étude d’efficacité du traitement selon le mode d’administration « orale versus intra-rectal » sera réalisée pour comparer les groupes traités avec les non-traités « placebo ». Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une évaluation efficace de l'induction ciblée de l'inflammation au niveau du colon. Il est prévu d’évaluer l'efficacité des formes galéniques innovantes pour une période de 5 ans sur 75 mini-porcs, soit 15 mini-porcs par an en moyenne. Nous envisageons de faire des groupes de 6 à 7 mini-porcs. Ce nombre est le minimum possible, puisqu’il tient compte des analyses statistiques et des éventuelles pertes de mini-porcs pendant l'anesthésie ou des procédures liées à l’induction de l'inflammation. Nous allons réaliser des tests statistiques de comparaison entre les différents groupes de type « Mann-Whitney » non paramétrique. Les différences entre les groupes seront jugées statistiquement significatives lorsque la valeur P est inférieure à 0.05.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les mini-porcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE. La douleur liée aux interventions chirurgicales est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'induction de l'inflammation pour visualiser tout signe de complications post-opératoires imprévues qui nécessiteraient l’euthanasie de l’animal. Ainsi, les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo chez l'animal, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins, chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux (analgésiques en pré- et post-opératoire et médication spécifique pour limiter les éventuelles douleurs induites par l'inflammation). Les membres de l'équipe possèdent la formation "concevant et réalisant" et la formation de chirurgie chez l'animal (AUEC).

Choix des espèces

Le modèle d'induction de l'inflammation chronique de l'intestin (MICI) chez le mini-porc sera utilisé pour évaluer et caractériser l’efficacité in vivo de nouvelles formes galéniques. C’est l’un des meilleurs modèles d’étude des MICI puisqu’il permet de s'approcher aux conditions physiopathologiques observées chez l'homme (similitudes de l’anatomie de l'appareil digestif, de la composition de la flore intestinale et du temps de transit). De surcroît, ce modèle permettra d’utiliser des technologies perfectionnées utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme (IRM, coloscopie) dans le diagnostic, le contrôle, le traitement et le suivi de la maladie. Cette étude préclinique permettra ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des MICI et leur traitement. L’objectif est de confirmer la preuve de concept in vivo avant de passer aux études cliniques chez l'Homme. - Dans un premier temps, les mini-porcs seront utilisés pour valider l’induction de l’inflammation chronique intestinale chez le groupe non-traité et le groupe traité par voie intra-rectale avec le bio-médicament. Ce dernier est administré soit en solution ou en dispersion d’un comprimé broyé contenant la dose thérapeutique de l’anticorps monoclonal afin de montrer d’abord son efficacité locale. L’induction de la maladie et l’efficacité locale du bio-médicament seront évaluées par le calcul des scores Wallace (étude macroscopique : extension des lésions) et Ameho (étude microscopique : immuno-histologie) et par le dosage des marqueurs biologiques (réponses inflammatoires, dosage des cytokines, MPO, TNFα, numération formule sanguine, …). -Dans un deuxième temps, les mini-porcs seront utilisés dans le cadre d'efficacité de la thérapie par voie orale. - Puis, afin de se rapprocher de la clinique en termes de taille et de structure anatomique de l'appareil digestif humain, le modèle du grand mammifère mini-porcs de type Gottingen adultes (40 à 60 kg) sera utilisé pour évaluer l’efficacité, la sécurité et la répétabilité de la thérapie à long terme (6-12 mois).

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections sous-cutanées deux fois par semaine pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire et des tests de force et de respiration, pour évaluer une protéine médicament combinée à une thérapie génique. Le porteur décrit des gestes réalisés sur des rats habitués et une perte de poids limitée, et prévoit une sédation systématique pour l'injection intraveineuse. Il qualifie d'"indispensable" le recours à ce modèle de rat, présenté comme plus fidèle à la maladie humaine que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l'absence d'une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardio-respiratoire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique visant à la restauration de dystrophine sont prometteuses et en cours d’évaluation. Nous posons l'hypothèse qu’une thérapie préalable induisant un maintien de l’intégrité et de la croissance musculaire amplifierait le bénéfice de ces thérapies géniques, limitées lorsque les fibres musculaires dégénèrent et laissent place à du tissu conjonctif et graisseux, tous deux non contractiles. La protéine médicament testée dans ce projet est un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Cette étude a pour objectif d’évaluer le bénéfice de la combinaison protéine médicament / thérapie génique dans un modèle de rat DMD. En cas de validation chez le rat d'un effet synergique des deux approches combinées, la pertinence d’un essai clinique chez les enfants atteints de DMD, encouragée par des résultats précliniques robustes, serait augmentée et le processus sans doute accéléré.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés à base de protéine médicament et de thérapie génique pour optimiser la restauration de la fonction perdue dans les muscles dystrophiques. La protéine médicament joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire par une potentialisation du processus de nécrose-régénération des fibres musculaires. Nous attendons donc à court terme une synergie protéine médicament/thérapie génique qui optimisera l'efficacité chez le rat DMD de la première génération de médicaments de thérapie génique. À plus long terme et en cas de succès, nous soutiendrons le développement clinique de cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique (seconde génération de médicaments).

Procédures

Procédure 1 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous-cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. En fin de procédure, un unique test d’agrippement et une quantification non-invasive du patron ventilatoire seront réalisés (durée totale de 45 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). Procédure 2 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous- cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. Au cours de la procédure, trois séries d'évaluation non-invasive sur animal vigile seront réalisées à 4 semaines d'intervalle : évaluation de la force d’agrippement, du patron ventilatoire et du rythme cardiaque par ECG (durée totale d’une heure). Une semaine avant la fin de la procédure, ils seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et soumis à une échocardiographie (20 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). À l'issue du prélèvement, les animaux toujours anesthésiés sont évalués pour la force musculaire de leur muscle tibial antérieur (30 minutes).

Impact sur les animaux

A 5 mois, les conséquences de la maladie impactent très peu la qualité de vie des animaux. Afin de privilégier une méthode la moins invasive possible pour les animaux, nous avons optimisé notre produit et réussi à obtenir des données fiables de pharmacocinétique et d'efficacité en l'administrant par voie sous-cutanée, réalisée avec une aiguille très fine. Le geste réalisé sur des rats habitués est réalisé sans contention ferme, au cours d'un moment d'interaction positive. Les injections répétées en sous-cutané sur un même site d’injection pouvant entrainer l’apparition de granulomes (jamais observés sur nos précédentes cohortes), nous alternerons néanmoins les sites d’injection. L’unique injection intraveineuse sera effectuée dans la veine de la queue chez les rats âgés de 12 semaines (4 semaines au démarrage plus 8 semaines de prétraitement). Pour prévenir une réponse de stress éventuelle des rats en raison de la nécessité de réaliser cette injection sur des rats maintenus quelques minutes dans un tunel de contention, ils seront de façon systématique préalablement sédatés. Si besoin, les plus agités (anxieux) seront en plus légèrement anesthésiés pendant 5 minutes. Tous ces traitements sont parfaitement tolérés par les animaux et maîtrisés. Nous avons montré qu'ils évitent les conséquences perverses d'une réponse de stress exagérée, en particulier les arythmies cardiaques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et améliorent la croissance et la survie des fibres musculaires. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Nous avons préalablement contrôlé que les protéines médicaments étaient bien actives dans des cellules musculaires, et avons réalisé les premières expériences chez la souris modèle (peu sévère) de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui tester l’efficacité de ce traitement combiné dans un modèle dystrophique plus sévère et plus proche de la physiopathologie humaine, le modèle du rat DMD. L’utilisation de ce modèle nous parait indispensable pour évaluer le bénéfice du traitement sur des processus tels que le maintien précoce de la masse musculaire mais aussi la régénération du muscle déjà atteint.

Réduction

Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur le modèle de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons de plus optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. Nous utilisons 8 rats par groupe, ce qui permet d'obtenir des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Additionnellement, les analyses prévues ont toutes été optimisées afin de minimiser le nombre d’anesthésie/injection/stress et dérangement subis par les animaux. Tous les tests pouvant être réalisés lors de la même anesthésie ont été regroupés et les tests réalisés sur animaux réveillés sont également rassemblés afin de limiter le stress et la fatigue induite par le dérangement des animaux pendant leur période de repos.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).