Recherche appliquée

52 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux à quatre interventions chirurgicales sous anesthésie, la dernière sans réveil, avec des effets attendus comme douleur, perte de poids et troubles neurologiques. L'objet est d'optimiser la greffe de cellules endocriniennes encapsulées pour le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Le porteur présente le porc comme un modèle proche de l'homme, après des essais déjà menés sur des rongeurs.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples. De manière générale, il s’agit d’optimiser les techniques de transplantation de cellules endocriniennes, ici îlots de Langerhans pour le traitement du diabète de type 1, et cellules parathyroïdiennes pour le traitement de l’hypoparathyroïdie. Cette optimisation se fera en étudiant les performances apportées par l’encapsulation des cellules et par le choix de sites alternatifs. De manière plus précise : - Développement d’un dispositif d’encapsulation de cellules endocriniennes pour la greffe : choix du biomatériau selon sa biocompatibilité et choix de son meilleur site d’implantation - Evaluation de l’apport bénéfique apporté par l’encapsulation sur la greffe d’îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes, en matière de survie et de fonction du greffon, dans un cadre d’autogreffe. - Evaluation l’intérêt de site alternatifs accessibles par voie endoscopique mini-invasive tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale (sans encapsulation au sein de dispositifs).

Bénéfices attendus

A court et moyen terme, ce projet donnera lieu à plusieurs publications scientifiques ainsi que des communications orales lors de congrès nationaux et internationaux. A long terme, les résultats de cette étude permettront : - de pouvoir transplanter des îlots de Langerhans chez des patients diabétiques au sein de sites alternatifs moins invasifs que celui actuel (intrahépatique via un accès par la veine porte, nécessitant une laparotomie) - de développer une thérapie innovante, efficace et durable de l'hypoparathyroïdie - de limiter la perte de fonction du greffon au cours du temps - de diminuer les traitements immunosuppresseurs, très contraignants et à haut risque d'effets secondaires chez les patients

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront répartis en 4 différents groupes. La nature et le nombre d’interventions auxquelles les animaux seront soumis dépendra des groupes formés. Les animaux du groupe 1 seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la deuxième sera sans réveil. Ces interventions dureront au maximum 2 heures. Les animaux du groupe 2 seront soumis à 3 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Les animaux de la procédure 3 seront soumis à 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire). Enfin, les animaux de la procédure 4 seront soumis à 6 procédures chirurgicales effectuées sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Deux de ces interventions n’impliqueront pas d’incision chirurgicale. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, troubles neurologiques et métaboliques, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole (jusqu'à 3 mois) mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Aucun animal n'est gardé en vie à l'issue de chaque procédure. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier estomac et rectum, n'est pas compatible avec la survie de l'animale.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de développer de nouveaux dispositifs d'encapsulation améliorant la survie et la fonctionnalité d'îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes greffés au sein d'un organisme, dans une optique thérapeutique contre le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Au sein de ce projet, nous souhaitons évaluer la tolérance de ces dispositifs par l'organisme, la survie des cellules greffées et leur fonctionnalité in vivo, ainsi que le potentiel intérêt de sites alternatifs pour la greffe tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale. Il s'agit donc d'une approche d'ordre physiologique et intégrée à un organisme, d'où la nécessité d'utiliser des animaux pour ce projet. Nous ne pouvons donc pas remplacer l'utilisation d'animaux car nous souhaitons évaluer le comportement du greffon in vivo.

Réduction

Nous utiliserons un minimum d’animaux pour notre étude qui correspond à une étude préclinique en vue d’une étude clinique future. Il est à ce jour impossible de calculer le nombre nécessaire d’individu dans chaque groupe car nous ne pouvons pas encore quantifier l’effet attendu de chaque technique en cours d’évaluation sur le phénotype. Cependant, par rapport aux études antérieurement réalisées sur le miniporc dans notre laboratoire, un nombre minimal standardisé de miniporc nécessaire par groupe a été établi. Les estimations déclarées ici sont maximales et nous pourrons réduire le nombre d’animaux en cours de protocole si l’effet attendu a pu être constaté.

Raffinement

Les procédures de raffinement suivantes seront appliquées : -Condition standard d'hébergement conformément à la réglementation : hébergement individuel, 12 heures d'éclairage par jour, enrichissement du milieu : jouets. - Prélèvements et expérimentations menés dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d’hébergement. -Administration d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés : anesthésie gazeuse et opioïdes et/ou anti-inflammatoires -Soins apportés au besoin après avis vétérinaire (infection cathéters, ...). -Les animaux présentant au moins un point limite sont retirés de l’étude et mis à mort (prostration, immobilité, appétence, perte de poids) si nécessaire. -Une période de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal entrant.

Choix des espèces

Le modèle pré-clinique porcin est un modèle à haute valeur translationnelle : sa proximité avec l'Homme est très grande, d'un point de vue métabolique, physiologique, ou encore anatomique. Par ailleurs, il permet une bonne transposition des techniques chirurgicales et présente un métabolisme glucidique semblable. La tolérance du dispositif et son effet sur la survie et la fonctionnalité des cellules greffées ayant déjà été étudié sur modèle rongeur, l'objectif serait de reproduire ces études mais sur un modèle à plus grande valeur translationnelle, afin de pouvoir transposer cette innovation thérapeutique directement sur l'Homme. Des miniporcs seront alors utilisés : ils présentent une taille et un poids adulte raisonnables permettant une stabulation moins compliquée que des porcs charcutiers (300 kg à l'âge adulte), plus lourds chez lesquels il aurait fallu utiliser des individus juvéniles au métabolisme quelque peu différent des individus adultes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (d'au moins 1 an). Leur taille et leur poids permettra de faciliter les techniques chirurgicales et les prélèvements sanguins. Par ailleurs, leur métabolisme glucidique sera d'autant plus proche des patients adultes, cible de cette innovation thérapeutique.

4 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections intramusculaires d'un candidat vaccin, cinq prélèvements sanguins à l'oreille, puis une ponction intracardiaque de 30 mL de sang sous anesthésie qui sert de mise à mort. L'objet est de produire des anticorps contre la bactérie Klebsiella pneumoniae résistante aux antibiotiques. Le porteur affirme qu'il n'est "pas encore possible" de se passer de l'animal pour produire des anticorps polyclonaux et justifie la mise à mort par le volume de sang à récupérer.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale. Ce projet en particulier, vient compléter les différents groupes déjà testés en étudiant cette fois l’administration des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées, sans modification génétique associées à l’adjuvant (ces cellules sont appelées « cellules porteuses »). Ajouter ce groupe à l’étude a pour but de déterminer si les cellules porteuses sont capables d’entrainer une production d’anticorps spécifique ou non et d’évaluer l’importance de la réponse immunitaire associée à leur administration (via la quantité d’anticorps retrouvé en fin d’expérience).

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer si les cellules porteuses ont un rôle dans l’efficacités du vaccin (activation de l’immunité, production d’anticorps). Les informations récoltées permettront d’en apprendre d’avantage sur le fonctionnement du vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - 3 injections de cellules porteuses + adjuvant (200µL) par voie intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - 3 injections intramusculaires à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) - Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. Nous n’attendons donc aucune toxicité lors de l’administration des cellules porteuses. - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire directement suivi d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 4 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seul 1 groupe de 4 lapins sera administré par les cellules porteuses + adjuvant (protocole de 3 immunisations) afin de compléter des données précédemment obtenus (pas de groupe control). Comme ce projet ne comporte qu’un groupe, aucun test statistique de comparaison ne sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations des cellules porteuses et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. L’administration des cellules porteuses n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.

24 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale des oocystes du parasite Eimeria pour reproduire une coccidiose, une partie subissant aussi un prélèvement sanguin, avec pour signes attendus perte de poids, apathie et plumes ébouriffées. L'objet n'est pas de soigner ces animaux mais de produire du parasite pour des études in vitro, faute de pouvoir le cultiver au laboratoire. Le porteur met en avant l'ampleur économique de la coccidiose en filière avicole et conclut que l'usage d'animaux vivants comme réservoir est nécessaire.

Objectifs

Les coccidioses sont les affections parasitaires les plus dommageables en filière avicole, du point de vue économique et du bien-être et de la santé des animaux (coût mondial annuel estimé à plus de 12 millards d’euros selon ANSES, août 2022). Cette pathologie est causée par Eimeria, un parasite qui infecte l’intestin et y crée des lésions. Les conséquences de la coccidiose sont importantes : diminution de l’ingestion, inflammations, diarrhées hémorragiques, développement d’autres maladies intestinales, et dans le cas de certaines espèces du parasite, peut même causer une mortalité. Les Eimeria forment des oocystes selon un cycle de vie défini en « utilisant » les cellules épithéliales de l’intestin. Ces oocystes sont ensuite excrétés via les fientes qui sont le principal moyen de transmission entre les animaux. Il existe différentes formes de coccidiose, la forme chronique et la forme aigüe qui se caractérisent par des signes cliniques spécifiques des espèces Eimeria. Actuellement, les méthodes destinées à contrer la coccidiose reposent principalement sur l’utilisation de produits chimiques anticoccidiens et sur le développement d’une immunité contrôlée par addition d’antibiotiques ionophores dans l’aliments. Mais des résistances peuvent survenir très rapidement avec l’apparition de coccidioses subcliniques voire cliniques. Ces stratégies sont restées efficaces tant que de nouveaux médicaments étaient régulièrement introduits. Mais aucun nouveau produit n’ayant été proposé depuis l’an 2000, la sensibilité à tous les médicaments existants a diminué, favorisant l’apparition de souches plus virulentes du parasite. De plus, la demande de la société en faveur d’animaux élevés sans antimicrobiens, d’aliments exempts de résidus et l’utilisation prophylactique de produits chimiques anticoccidiens étant en croissance constante, il est nécessaire d’identifier de nouvelles molécules anticoccidiennes. Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’additifs alimentaires montrant des propriétés anticoccidiennes potentielles et agissant sur de nouvelles cibles moléculaires. Ces nouvelles approches de lutte contre la coccidiose devront être aussi efficace que les médicaments ou les combinaisons de médicaments actuellement utilisés et aboutir au développement d'un additif alimentaire anticoccidien. L’identification de nouvelles molécules anticoccidiennes repose sur des tests de criblage in vitro permettant de mesurer l’activité anticoccidienne avec différentes approches.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier, à partir de test in vitro objectifs, des nouvelles molécules d’anticoccidien à destination des volailles pour faire face aux résistances des solutions actuellement disponibles, et répondre à une attente sociétale en développant une solution pouvant être classée en tant qu’additif alimentaire. L’impossibilité technique de cultiver in vitro Eimeria tenella nécessite d’utiliser des animaux comme réservoir naturel du parasite. Le nombre d’animaux est réduit à la stricte nécessité numérique du nombre de parasite nécessaire à la réalisation des tests in vitro et non à la recherche d’une production en masse du parasite, [[Modification du 15/11/2023: à la constitution d’ une banque de cellules d’animaux infestés par Eimeria sp. et à la détection de cytokines pro-inflammatoires dans les fèces pour valider une méthode d’analyse de la réponse immunitaire non invasive chez le poulet]]. Sur la base de résultats in vitro probants, un autre projet pourra être menée afin de valider in vivo l’efficacité des molécules candidates.

Procédures

Les animaux seront élevés avec un aliment répondant à leur besoins nutritionels pendant 26 jours. A 21 jours d'age, une seule administration par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille de 1 ml de substance sera réalisée sur chaque animal de la cage. Pour chaque administration, le temps de contrainte pour maintenir chaque animal ne dépassera pas 30 secondes et se fera progessivement en fonction de la déglutition de l'animal. [[Modification du 15/11/2023: Une partie des animaux (8 sur 24) sera soumise à un prélèvement sanguin, un volume de sang de 4 ml necessaire et suffisant à l'analyse des différents paramètres sanguins sera prélevé sur chaque animal. Pour chaque prise de sang, le temps de contention ne dépassera pas 1 min]].

Impact sur les animaux

Signes cliniques pouvant apparaitre dès 4 jours après l'administration d’oocystes infectieux sporulés : baisse de consommation d’aliments, perte de poids, frilosité, apathie, plumes ébouriffées, position en boule. [[Modification du 15/11/2023: Inconfrot et stress dû aux prises de sang]].

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux infestés seront mis à mort , ils ne peuvent pas être réutilisés.

Remplacement

L’étude in vitro des parasites unicellulaires est un challenge scientifique et Eimeria n’y fait pas exception. Si des tests in vitro mimant le comportement infectieux existent comme l’invasion cellulaire avec des lignées de rein, il est n’est pas possible d’aboutir à un cycle complet du parasite et par conséquence à sa multiplication in vitro. La culture in vitro d’Eimeria tenella reste encore à l’heure actuelle impossible. Cette impossibilité technique de cultiver in vitro Eimeria tenella nécessite d’utiliser des animaux vivants comme réservoir naturel du parasite. Lorsqu’une méthode in vitro de multiplication du parasite sera disponible l’utilisation des animaux vivants ne sera plus nécessaire.

Réduction

Dans ce projet, la procédure expérimentale mise en œuvre peut être considérée comme une étude exploratoire où l’on cherche uniquement à produire des oocystes. Seize animaux au total seront nécessaires lors des deux campagnes de production d’oocystes. Le nombre d’animaux est réduit à la stricte nécessité numérique du nombre de parasite nécessaire à la réalisation des tests in vitro dans un laps de temps évitant le développement de manifestations intestinales sévères chez l’animal (diarrhées sanglantes). Le but de ce projet n’est pas de rechercher une production en masse du parasite étant délétère pour l’animal. Le nombre de huit animaux par campagne de production d'oocystes permettra également d’améliorer les conditions d’élevage. En effet, le poulet de chair est une espèce qui a besoin d’un nombre minimum d’individu pour pouvoir mettre en place une hiérarchie sociale participant à son bien-être. Le nombre de huit animaux vivants par campagne de production d’oocystes ne semble pas pouvoir être encore réduit

Raffinement

L’inconfort, le stress de la contrainte lors du maintien des animaux dû au gavage, sont réduits par une manipulation empathique des animaux par les applicateurs de la procédure, une administration unitaire de la substance par voie orale à l’aide d’une seringue sans aiguille à un volume approprié à la taille de l’animal soit 1 mL et par une surveillance minutieuse quotidienne des animaux à l’aide de la grille d’observation. [[Modification du 15/11/2023: L’inconfort et le stress dus à la contention de courte durée et la douleur légère liée à l’introduction de l’aiguille lors des prises de sang sont réduits par une manipulation délicate des animaux maintenus en décubitus latérale, un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie, en piquant le plus haut possible dans la veine jugulaire (proche de la tête pour réduire la formation des hématomes) et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires Pas d'utilisation d'anesthésique local en vue du prélèvement de sang car cela nécessiterait de capturer deux fois les animaux (application du produit et réalisation du geste) entrainant un stress et un inconfort supplémentaire]]. Le raffinement des conditions d’hébergement consiste en la mise en place de papier filtre à l’intérieur de la cage pour éviter que les animaux ne se coincent pas les pattes dans les mailles de la grille tout au long de l’étude et en favorisant l’accès facile à l’eau et à la nourriture surtout en période de démarrage (J0-J8). L’accès à l’eau est facilité par la mise en place de coupelle d’eau en plus des pipettes et des godets récupérateurs d’eau. L’accès à la nourriture est affiné en mettant directement dans la cage sur le papier filtre un tas d’aliment. En plus, ajustement régulier de la hauteur des lignes d’eau ainsi que les ouvertures d’accès aux mangeoires en fonction de l’âge des animaux.

Choix des espèces

Les anticoccidiens recherchés constituent une solution contre la coccidiose aviaire des poulets de chairs (Gallus gallus domesticus) en élevage et sont destinés à être incorporés dans les aliments distribués aux volailles (poulet de chair). Notre modèle d’étude sera donc le poulet de chair (Gallus gallus domesticus) Les animaux livrés seront des poussins de 1 jour (poids moyen 40 g). Ils seront mis en stabulation en cages en batterie et seront élevés jusqu’à l’âge de 28 jours

640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur pratique une implantation sous-cutanée puis une ouverture du crâne, avec des injections dont une en rétro-orbitaire et des séances de scanner, pour étudier la vascularisation dans la réparation d'os de la face. Il décrit des douleurs postopératoires modérées pendant 72 heures, avant la mise à mort pour l'imagerie et l'histologie. Il affirme utiliser des souris immunodéprimées porteuses de cellules humaines et qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" in vitro ou in silico.

Objectifs

L'os est un tissu dur vascularisé qui se renouvelle continuellement pour s'adapter aux exigences mécaniques et métaboliques du corps. Les maladies inflammatoires, infectieuses ou les traumatismes entraînent d'importants défauts osseux craniofaciaux, aux conséquences esthétiques et fonctionnelles. Des substituts osseux synthétiques ou biologiques ont été développés et sont actuellement utilisés pour traiter ces défauts avec des résultats encore inconstants et perfectibles. La vascularisation joue un rôle important dans la réparation osseuse. L’objectif de ce travail est d'arriver à caractériser et comprendre le rôle de la vascularisation puis d'en déterminer son rôle dans la réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux et mieux comprendre le comportement des vaisseaux implantés essentiel à toute survie d'un tissu greffé. Il s’attaque à un problème de santé majeur par le biais d’une stratégie d’ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble.

Procédures

Procédure 1 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale d'implantation sous-cutanée (5min), des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (2 acquisitions, 10min) Procédure 2 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale de craniotomie (10min) et des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (5 acquisitions, 25min)

Impact sur les animaux

A l'anesthésie, une dépression respiratoire peut très rarement être observées. Lors de la chirurgie, une complication hémorragique peut survenir. En post opératoires des douleurs modérées pendant 72h, hématomes, oedèmes et réouverture de la plaie par désunions des sutures peuvent être rarement observées. Concernant l'injection en rétro-orbitaire, un léger gonflement de l'oeil est rarement observé durant quelques minutes.

Devenir

Mise à mort pour permettre les analyses d'imagerie et d'histologie.

Remplacement

Ce projet s'intérêsse à la prévascularisation de greffon pour améliorer leur intégration in vivo et leur survie. Cela nécessite donc un modèle in vivo capable de supporter l’implantation de cellules humaines, comme la souris athymique nude. De plus, nous visons à transposer ce modèle de pré-vascularisation à la régéneration osseuse, qui présente une biologie complexe que l’on ne sait pas reproduire par ingénierie actuellement et dont la complexité ne peut être mimée in vitro ou in silico. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été limité grâce à une approche statistique de manière à déterminer la taille des groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par quatre par cage et disposeront d’un espace suffisamment complexe pour leur permettre d’exprimer leur comportement normal (enrichissement). Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pendant 7 jours après la chirurgie puis 2 fois par semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un score de points limites de 3 dans une sous-catégorie ou si un indice total de 6 est atteint, l’animal sera alors mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce de laboratoire appropriée, dont la biologie (vasculaire et osseuse) est proche de celle de l’homme. De nombreux outils d’analyses d’imagerie et d’histologie sont donc disponibles et adaptés à ce modèle. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéprimées du fait de l’implantation de cellules humaines. Des souris de 8 semaines à 5 mois seront utilisées, les animaux étant alors de jeunes adultes et sont alors les plus à même de pouvoir procéder à une régénération tissulaire.

3 porcs vont être utilisé·es, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont maintenus en contention dans un hamac et subissent jusqu'à quatorze prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, pour mettre au point une technique de micro-échantillonnage de sang. Le porteur indique que la contention peut être source de stress et que les prélèvements peuvent provoquer douleur et hématomes. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à "l'animal entier" faute de méthode reproduisant la diffusion d'un produit dans le sang.

Objectifs

L'objectif de ce projet est la mise au point de méthodologie de micro échantillonnage de sang (maximum 200µL de sang prélevé) pour réduire l'invasivité des prélèvements sanguins lors d'études pharmacocinétiques à venir.

Bénéfices attendus

Les techniques de micro-échantillonnage permettent de réduire au minimum le volume de sang prélevé sur les animaux. Cela présente des avantages par rapport à la diminution du nombre d'animaux utilisé et l'amélioration des aspects liés au bien-être animal.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention pour réaliser les prélèvements sanguins. Contention manuelle via l'utilisation d'un hamac. La durée de la contention sera d'environ 1 minute. Il y aura 14 prélèvements de sang au maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement de sang est inférieure à la minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins uniquement. Les animaux seront contentionnés via un hamac. La contention via le hamac peut être génératrice de stress. Les prélèvements sanguins se feront au niveau des veines auriculaires, veines mammaires, veines caudale et veines saphènes. Les prélèvements peuvent engendrer de la douleur, des hématomes au niveau des sites de prélèvements. Si tel est le cas des analgésiques pourront être appliqués si nécessaire sur décision du vétérinaire responsable.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test chez le mini-porc. Les tests in vitro, ou les tests sur organe isolé ne peuvent pas traduire de la réponse d'un organisme entier. Il n'existe pas de modèle animal synthétique qui permette de mettre au point cette méthode.

Réduction

Trois animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal de replicats pour definir une bonne reproductibilité technique. Aucune approche statistique n'a été réalisé, mais les réplicats constituent d'importants contrôles de la qualité de la conduite des expériences et les test statistiques non paramétriques de type Mann-Whitney peuvent être utilisé dès n=3.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 3. De l'enrichissement (exemple: balle, jouet suspendus) seront présents autant que possible dans les boxes. Un suivi bi quotidien (voir plus) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Les animaux seront préalablement habitués à la contention dans un hamac et à la manipulation des zones d'intérêt. Un analgésique local ou du froid pourra être utilisé pour limiter la douleur de la piqûre de la zone d'intérêt. Les effets secondaires peuvent être de la douleur ou un hematome au site de prélèvement qui ne sera alors plus utilisé.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type de projet. Necessité de développer cette technique pour cette espèce. Jeune Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.