Recherche appliquée
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- Troubles urogénitaux
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une communication bucco-sinusienne est créée chirurgicalement au palais sous anesthésie, puis comblée par un biomatériau à base de collagène, avec un suivi par scanner pendant trois semaines avant mise à mort au 21e jour pour analyse histologique. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des difficultés d'alimentation, des infections et un risque de mortalité estimé inférieur à 5 pour cent. Il affirme qu'il n'est "pas possible de se passer d'animaux" pour vérifier l'efficacité du biomatériau avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales. Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorisent la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...). Le but de ces travaux est d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs situés dans un même bâtiment (un établissement pour l'expérimentation y compris la chirurgie et l'hébergement, le second pour l'imagerie).
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rongeur
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes (EU1/2). Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle (EU 2/2). Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes, pour être disséqués et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons (EU 1/2).
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur post-opératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composée de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées sera réalisée par un personnel qualifié composé de concepteurs de projet et d’applicateurs de procédures expérimentales ainsi de chirurgiens ORL. Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages utilisées et le nombre d’animaux par cage sont conformes à la règlementation en vigueur. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et la structure possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie. Le transfert des cages se fera sur chariot (moins de 20 minutes de transfert entre deux services situés dans un même bâtiment, au même étage). Le biberon est retiré des cages pour la durée du transfert pour éviter tout déversement de liquide dans la litière. Les animaux gardent accès à la nourriture.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
Détermination des conditions de greffe et de croissance de tumeurs implantées par voie sous-cutanée ou intraveineuse, chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente
- Recherche appliquée
- Cancers
5 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales sous la peau ou en intraveineuse, des injections répétées et jusqu'à seize prélèvements sanguins, le porteur reconnaissant des ulcérations, des nécroses tumorales et des paralysies possibles. Ce projet ne vise pas encore une thérapie mais seulement à caler les conditions de greffe et de croissance des tumeurs, en amont d'études d'efficacité, avec jusqu'à cent séries sur cinq ans. Le porteur juge l'usage de la souris "indispensable" et invoque un "besoin médical" considérable.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’efficacité anti-tumorale de composés thérapeutiques, consiste à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études. Ces études seront menées chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès dans le monde en 2020. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de composés thérapeutiques.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 16 semaines, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (16 fois/maximum, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse. Stress et douleur légère lors de l’administration de la molécule déplétante/neutralisante en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intraveineux. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 15 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, dans les modèles de greffe en sous-cutanée et 10 souris maximum par groupe pour ceux en intraveineuse, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées avec des analyses statistiques basées sur les tests ANOVA, Mann Whitney, test T de Student, test de Log-rank et/ou de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 100 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permettra de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un prélèvement terminal, sous anesthésie générale pourra également être réalisé. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Les cellules tumorales greffées en intraveineuse pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et l’activation du système immunitaire. Enfin, le modèle murin est un modèle de choix du fait de l’existence de souris immunodéprimées et de souris génétiquement altérées qui permettent d’évaluer le rôle de nos composés thérapeutiques sur le système immunitaire. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Effets des polluants sur les poissons hôtes et leurs parasites : une étude expérimentale sur le modèle chevesne-acanthocéphales
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
320 chevesnes sauvages vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés par pêche électrique et maintenus jusqu'à dix mois, ils subissent des endoscopies, une infestation contrôlée par des parasites intestinaux et une exposition à des polluants par ingestion, avant dissection. Le porteur reconnaît un stress de captivité, des lésions du tube digestif et des pathologies liées aux polluants. Il affirme que l'étude des interactions hôte-parasite ne peut se faire in vitro ou in silico.
Objectifs
La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalus cephalus infestés par des acanthocéphales. Ce projet vise à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les relations hôtes-parasites. Tout d'abord il s'agira de tester les méthodes d'endoscopie pour surveiller la présence de parasites intestinaux dans le tractus digestif des poissons. Des manipulations expérimentales de la charge parasitaire et de l'exposition aux polluants seront menéeschez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques. La règle des 3R a été prise en compte de la manière suivante : 1. remplacement : les questions de recherche portent sur les interactions biotiques, entre un poisson hôte et les parasites intestinaux en réponse à la pollution environnementale, il n'est pas possible de conduire des études in vitro, ex vivo, in silico pour y répondre. 2. réduction : les effectifs ont été réduits à 20 individus par groupe, effectif minimum suffisant pour tester avec robustesse les hypothèses, 3. raffinement : les conditions d'hébergement en mésocosmes ont été optimisées, plusieurs points limites ont été retenus, et les manipulations expérimentales se font dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, que ce soit pour la prévalence en parasites, ou pour l'exposition aux polluants.
Bénéfices attendus
Le projet développera une méthode pour un examen interne des parasites intestinaux. L’endoscopie est une technique maitrisée et courante en médecine humaine et vétérinaire, mais très peu utilisée en écologie. Le développement de la micro-endoscopie permettra d’améliorer les connaissances sur l’état de santé des animaux sauvages, à l’échelle des individus et des populations, sans recourir à des euthanasies. Cette technique permet d’acquérir de multiples donnéeset le suivi à moyen et long terme l’évolution de l’infestation et du développement des parasites. L'étude expérimentale répond également à des questions de recherche fondamentale en écotoxicologie à l'échelle des interactions biotiques, qui sont encore très peu étudiées, les effets étant principalement étudiés à l'échelle des organismes ou des populations.
Procédures
Les individus seront capturés en milieu naturel par pêche électrique, hébergés pour une durée de 10 mois maximum, dans des très grands mésocosmes avec enrichissement du milieu (radeaux flottants végétalisés). Chaque acte durera moins de 5 minutes, sur des poissons anesthésiés. Les interventions consisteront à 1) réaliser un examen par endoscopie (2 examens par individu), 2) manipuler expérimentalement la charge en parasites, via l'utilisation d'un anthelminthique suivie d'une infestation expérimentale par ingestion de cystacanthes (stade juvénile des acanthocéphales à raison de 0, 5 ou 10 parasites par individu, qui seront déposés dans le tractus digestif des chevesnes anesthésiés). Le développement des acanthocéphales nécessite 5 mois d'attente, les chevesnes ne seront pas manipulés pendant ce temps. 3) manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion, à raison d'une fois par semaine pendant 4 semaines. Une prise de sang (sera réalisée sous anesthésie par ponction de la veine caudale afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés et disséqués pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont : le stress de captivité, stress thermique (les mésocosmes sont à l’extérieur et sont influencés par les températures atmosphériques). L'endoscopie peut provoquer des lésions et irritation du tractus digestif après la phase de réveil post-anesthésie. L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. Lors de l'infestation expérimentale, la fixation des parasites peut provoquer des irritations et lésions de la muqueuse du tractus digestif et limiter les apports nutritifs. L'exposition expérimentale aux polluants peut engendrer des pathologies.
Devenir
L'euthanasie se justifie par la nécessité de comparer le nombre réel de parasites intestinaux par dissection, par rapport au nombre estimé par endoscopie afin de valider la méthode et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.
Remplacement
Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.
Réduction
320 animaux seront utilisés, soit 20 animaux par lot pour 16 lots au total. Cet effectif correspond au nombre minimum d'animaux calculé à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes. Les données obtenues feront l'objet de traitement statistique des données a posteriori
Raffinement
Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de grande taille, équipés de radeaux végétalisés flottants permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Avant chaque manipulation, les poissons seront anesthésiés. Chaque acte durera moins de cinq minutes. Il seront ensuite surveillés pendant la phase de réveil. Un suivi journalier des poissons et des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement, altération du rythme operculaire, hypersécrétion de mucus, lésions, pathogènes) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance. Un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie.
Choix des espèces
L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, au point que les chevesnes sont devenus une espèce modèle, 2. cette espèce est ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. de précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm. Cette taille est nécessaire pour l'utilisation de l'endoscope.
Mesure de biomarqueurs d’imagerie cérébrale en IRM haut champ dans des modèles murins de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie intracrânienne pour détruire localement la myéline, ou une immunisation induisant une encéphalomyélite avec parésie et paralysie progressive des membres, suivies de séances d'IRM sous anesthésie. Le porteur met au point des biomarqueurs d'imagerie de la sclérose en plaques et affirme que la paralysie "n'entraîne pas de douleur en soi". Il conclut que l'étude de la pathologie ne peut être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d’évaluer et de mettre au point des mesures par imagerie de résonance magnétique, technique non invasive, à très haut champ magnétique pour le suivi des atteintes de la gaine protectrice des neurones, la myéline, telles celles que l’on observe chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie neurologique. Deux modèles de souris présentant des lésions dans la gaine de myéline seront utilisés: le modèle LPC, Lysophosphatidycholines, pour lequel la lésion est localiséeet le modèle EAE, Experimmental Autoimmune Encephalomyelits, pour lequel les lésions sont plus petites et réparties dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à établir de nouvelles méthodes de mesure par imagerie pour le suivi de la dynamique de la détérioration/reconstitution de la gaine de myéline –protectrice des neurones- chez les sujets atteints de sclérose en plaques au cours de la maladie. Ces phénomènes doivent être davantage explorée, à un moment où des thérapies innovantes pour aider à la reconstitution de la gaine de myéline doivent être évaluées cliniquement. De plus, la mise au point de biomarqueurs d’imagerie non invasive réalisée dans ce projet représente un bénéfice pour les futures études thérapeutiques sur le petit animal puisque l’imagerie permettra le suivi du même animal et donc de réduire le nombre d’animaux.
Procédures
Modèle LPC, Lysophosphatidylcholines, une chirurgie intracranienne pour détériorer localement la gaine de myéline des neurones pour mimer la sclérose en plaque. Une seule chirurgie sur l'animale. 4 sessions d'IRM de 2h sur 3 mois. Modèle EAE, Experimental autoimmune encephalomyelitis, obtenu par immunisation sous cutanée et injection par voie intraveineuse rétro-orbitale faites sous anesthesie gazeuse. 4 sessions d'IRM sous anesthesie de 2h sur 3 mois.
Impact sur les animaux
La démyélinisation focale au LPC nécessite une chirurgie, injection stéréotaxique, durée inférieure à 1h, et n’engendre pas de signes cliniques persistents. Seule la cicatrisation post-chirugie est à surveiller et seuls les animaux ayant complètement récupéré et cicatrisé seront éligibles au suivi par IRM haut-champ, réalisé sous anesthésie générale, 4 sessions de 2 h maximum réalisées sur 3 mois. Pour le modèle EAE, un altération de l’état général de l’animal est attendu avec un score clinique maximal généralement entre 15 et 25 jours après l’induction de l’EAE, suivi d’unerémission partielle. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, injections i.v. à moyenne, symptômes cliniques de l’EAE et il existe une gradation des symptômes allant de la queue molle; au réflexe de redressement avec facultés affaiblies et parésie d'un membre à la paralysie des membres postérieurs et ou antérieurs. La procédure complète est de classe de gravité moyenne. Il est nécessaire de préciser que la faiblesse ou la paralysie des membres n’entraîne pas de douleur en soi, mais plutôt une gêne pour l’animal dans ses déplacements, à l’instar de la pathologie humaine.
Devenir
Ils seront mis à mort à différents temps en vue de réaliser des mesures histologiques post-mortem.
Remplacement
À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables. Nous utiliserons des modèles de pathologies très bien décrits dans la littérature, ce qui permettra un suivi précis de la sévérité de la maladie. L’animal vivant est nécessaire pour valider un biomarqueur d’imagerie avant som implémentation en clinique, dans une démarche de recherche translationnelle
Réduction
Pour chacune des procédures expérimentales, le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et interprétables, en tenant compte de la variabilité biologiques des modèles animaux. Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet est de 40. Le suivi longitudinal effectué en imagerie permet d’obtenir jusqu’à 4 points de mesure par animal pour suivre les phases de démyénisation et remyélinisation sans mise à mort intermédiaire des groupes supplémentaires d’animaux.
Raffinement
Les points limites qui permettront d'arrêter le protocole sont les suivants: cicatrisation de la plaie crânienne, changement de poids corporel , apparence physique i.e. pelage, posture et comportement (vocalisations non sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile). L'arret des souffrances si elles sont constatées se fera par traitement antalgique ou par euthanasie des animaux concernés.
Choix des espèces
L’IRM haut champ ne peut accueillir que des petits animaux de type rongeur. Nous avons réalisé une première étude sur rat du fait d’un cerveau plus grand que la souris ce qui a facilité la mise en œuvre des techniques IRM avec des volumes à explorer plus gros. L’objectif étant d’étudier les pathologies cérébrales, les procédures de cette demande se feront chez la souris afin d’étudier notamment le modèle de sclérose en plaques EAE modèle pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes de la sclérose en plaques. Animaux adultes ayant un développement cérébral achevé (7-10 semaines).
Etude chez la souris de la pharmacocinétique et de la biodistribution d’un nouveau traitement, pour le traitement de maladies dégénératives telles que la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de tauopathie, elles reçoivent une molécule radiomarquée puis sont mises à mort par exsanguination pour prélever leurs organes et mesurer la distribution du composé dans l'organisme. Le porteur situe ce travail en amont d'une future étude d'efficacité et d'un dossier clinique, présentés au conditionnel. Il affirme que la souris est la seule espèce mammifère modifiable pour exprimer la maladie d'Alzheimer et juge son usage "indispensable".
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale en vue d’une application en santé humaine. Les objectifs du projet sont de compléter un programme initial de développement de nouvelles thérapies pour le traitement des tauopathies telles que la maladie d’Alzheimer. Un nouvel agent a en effet permis de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle de souris malades. En utilisant maintenant une version de la molécule associée à un traceur radioactif (molécule radiomarquée), nous souhaitons évaluer les paramètres pharmacocinétiques de cette molécule et déterminer sa biodistribution dans l’organisme de la souris par imagerie. L’ensemble de ses informations sont nécessaires afin de sélectionner la dose et la voie d’administration pour mener par la suite une étude d’efficacité thérapeutique de la molécule.
Bénéfices attendus
Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies, ensemble de maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans les neurones d’agrégats toxiques de la protéine Tau, et dont la plus connue est la maladie d'Alzheimer. Cette étude intervient dans le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de définir l’action d’une nouvelle classe de composés à visée thérapeutique sur les tauopathies en étudiant leurs paramètres pharmacocinétiques et de biodistribution dans un organisme entier afin de pouvoir initier la mise en place d’un premier dossier clinique pour démarrer des essais cliniques chez l’humain.
Procédures
Un opérateur spécialisé réalisera une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse ou une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sera réalisé par animal sous analgésie et anesthésie chimique générale puis les animaux seront mis à mort par exsanguination afin de prélever les différents organes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure car l’étude de la biodistribution de la molécule nécessite de prélever les organes.
Remplacement
De premières manipulations réalisées en laboratoire sur des cellules de neurones ont permis de diminuer les taux des protéines impliquées dans le développement la maladie d’Alzheirmer. Cependant, la maladie d’Alzheirmer est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qu’il est possible de modifier génétiquement pour qu’elle exprime cette maladie, il est donc indispensable d’utiliser ces animaux pour développer des médicaments utilisables chez l’homme par la suite.
Réduction
Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse. Pour l’étude des tissus par imagerie, nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux par groupe (n=10 : 5 mâles et 5 femellesDe plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, seule la dose de la molécule et la voie d’administration optimales sélectionnées à l’issu des expériences sur les souris saines seront testées sur les souris développant la maladie d’alzheimer.
Raffinement
La douleur engendrée lors des administrations est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Les prélèvements présentent une douleur potentiellement plus importante, ils seront donc réalisés sous analgésie et anesthésie chimique générale. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H de la manipulation et donc au moment même de l’apparition du moindre problème.
Choix des espèces
La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qui peut être modifiée génétiquement pour modéliser la maladie d’alzheimer. (Ce modèle est disponible chez les éleveurs agréset est reconnu par la communauté scientifique, il a déjà été utilisé dans de nombreux projets scientifiques et est bien caractérisé. Les études de pharmacocinétique seront réalisées chez la souris, portant un fond génétique proche des souris porteuses de la maladie. Nous utiliserons des souris adultes car dans ce modèle la phase précoce de la tauopathie, apparaît entre 2,5 à 4 mois. Le projet prévoit l'utilisation des 2 sexes (même nombre d'animaux dans les deux sexes), la tauopathie étant décrite pour se développer de manière légèrement différente chez les mâles et les femelles dans le modèle.
Développement d’un traitement pour la déficience en acide lipase lysosomale par thérapie génique avec des virus adéno associés (AAV)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la déficience en lipase acide lysosomale, elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans la veine caudale et des prélèvements sanguins répétés, avant que leur foie, leur rate et leur intestin soient prélevés. Le porteur teste vingt-quatre vecteurs de thérapie génique puis les plus prometteurs, en vue d'un "traitement curatif" présenté au conditionnel. Il affirme que l'effet et l'innocuité de la stratégie ne peuvent être vérifiés que sur un animal vivant.
Objectifs
Dans le cadre du développement d’une thérapie génique pour la déficience en acide lipase lysosomale, le projet consiste à tester l’addition d'un gène médicament encodant la protéine manquante chez les patients : l'acide lipase lysosomale (LAL) en utilisant des vecteurs viraux. Plusieurs types de vecteurs et différentes constructions du gène médicament sont disponibles, il s’agit donc dans un premier temps de sélectionner la meilleure combinaison entre vecteur viral et gène médicament. Puis la meilleure construction sera évaluée a différentes doses et temps sur notre modèle de souris afin d’aboutir à la sélection d’un « médicament » efficace.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi montrer au terme du projet une efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique ce qui permetrait d’initier un développement clinique de ce produit et d'offrir un traitement curatif aux malades.
Procédures
Les animaux subiront une injection dans la veine caudale (animaux vigiles) et des prélèvements de sang (animaux anesthésiés) au niveau du sinus retro-orbitale.
Impact sur les animaux
Dans les procédures expérimentaux : les injections dans la veine caudale et des prélèvements de sang régulièrement pourront entrainer une perte des poids, des plaies au le site de prélèvement ou d'injection. Ces paramètres seront suivie toutes les semaines et pris en compte afin de diminuer la souffrance des animaux.
Devenir
Les souris de la procédure expérimentale 1 seront utilisées dans les procédures 2, 3, 4 et 5. Les souris des procédures 2, 3, 4 et 5 seront euthanasiées afin de récupérer différents organes: foie, rate, intestin pour étudier la correction de l'accumulation de lipides dans nos souris traitées par rapport à des souris saines et malades non traités ai et donc s'assurer de l'effet thérapeutique de notre stratégie et de son inocuité.
Remplacement
Nous développons une stratégie curative de la déficience en LAL par thérapie génique. Bien que cette stratégie ait été testés in vitro sur des cellules de foie et de peau de patient, cela ne permet pas d’étudier la distribution de nos vecteurs ni leur effet thérapeutique sur tous les organes ou encore de confirmer leurs innocuités. Pour cela, nous devons avoir recours à l’utilisation d’animaux sur un modèle de souris représentatif de la déficience en LAL. De plus, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étranger à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le gène de l’enzyme LAL jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux malade à élever et à utiliser, nous allons procéder par étape : sélection des meilleurs vecteurs AAV-LAL in vivo sur souris saines (24 vecteurs), puis études de ces vecteurs sur souris LAL -/- (15 vecteurs) et enfin étude de la dose thérapeutique à injecter pour aboutir à la sélection du meilleur AAV-LAL « médicament » capable de réduire l’accumulation de lipides. Afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser, un premier criblage des vecteurs a été réalisé in vitro.
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures, nous avons mis en place un suivi adapté des souris LAL -/- (pesés des animaux, au besoin aliment placé au sol et maintien du lien social) et des points limites les plus précoces possibles afin de soulager ou supprimer toutes souffrances. De plus, les procédures expérimentales potentiellement douloureuses (prélèvement sanguin) seront effectuées sous anesthésie gazeuse (Isoflurane)
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle de souris LAL -/- car ce modèle reproduit les symptômes induit par de la déficience en LAL humaine : accumulation de lipide dans le foie et permet d’étudier l’effet corrective de notre approche de thérapie génique. De plus, seul des modèles de souris LAL déficient sont disponible et ont été décrit dans la littératures jusqu’à présent. Aussi, la souris est facile à manipuler, à nourrir et à se procurer. L’injection de l’AAV dans la veine caudale de souris est parfaitement maitrisée au sein de Généthon et l’étude de l’effet thérapeutique est bien décrit dans la littérature dans les souris. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront injectées à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte. Pour la procédure expérimentale P4, les souris seront injectées à 8 semaines. L’étude sur les souris saines durera 1 mois tandis que l’efficacité du traitement sur les souris LAL-/- nécessitera un suivie de 12 semaines pour les procédures 2-3 et de 8 mois pour la procédure 4.
AMENDEMENT : Identification du rôle d’une hormone dans l’absorption de nutriments chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
826 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du sans réveil au modéré. Modèles génétiques de l'hémochromatose, elles reçoivent des injections et des prélèvements sanguins répétés, certaines subissant une chirurgie abdominale sous anesthésie. Le porteur cherche à comprendre le rôle d'une hormone intestinale dans l'absorption du fer et à tester des composés mimant cette hormone, en renvoyant les retombées thérapeutiques au long terme. Il justifie l'usage de la souris par le fait qu'elle constitue le "modèle pathologique" de la maladie.
Objectifs
L’hémochromatose est une maladie de surcharge en fer fréquente. La surcharge induit une défaillance des organes vitaux au cours du vieillissement. Cette surcharge en fer est notamment due à une hyper absorption du fer par le duodénum (partie supérieure de l’intestin). Cependant il existe très peu de traitement, la diminution du fer par des médicaments et/ou les saignées sont les principales lignes de traitement. Ces traitements ne visent pas à réduire l’absorption du fer (intestin) mais seulement à diminuer le contenu en fer de l’organisme. L’hormone du fer est produite majoritairement par le foie et est le stabilisateur du taux de fer dans l’organisme. Une production de l’hormone du fer a été décrite également au niveau intestinal. Le premier objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette hormone produite par l’intestin dans la régulation de l’absorption du fer. En parallèle, de nouveaux outils thérapeutiques mimant l’hormone du fer ont été développés. Ces outils thérapeutiques pourraient diminuer l’absorption du fer. Le deuxième objectif de ce projet est donc de montrer l’efficacité de ces nouveaux outils thérapeutiques dans des modèles murins de surcharge en fer (hémochromatose).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont, à court terme, la découverte du nouveau rôle de l'hormone intestinale dans l'absorption du fer et à plus long terme au développement de nouveaux outils thérapeutiques pour diminuer l'absorption du fer dans l'hémochromatose.
Procédures
Sur animaux vigiles : -Contention pour injection en intrapéritonéal (15 secondes par souris (contention + injection)) -Contention pour injection en sous cutanée (15 secondes par souris (contention + injection)) - Prélèvement sanguin (30secondes). Sur animaux anesthésiés -Chirurgie abdominale ( 5 minutes par souris) -Tonte de l’abdomen (30 secondes par souris). -Prélèvement sanguin (30 secondes par souris)
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress lors de l’anesthésie, de la contention, des injections et du gavage.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.
Remplacement
Nous utilisons un modèle murin car c'est le modèle murin pathologique de l'hémochromatose. Nous avons besoin de l'utilisation de l'animal pour que l'effet thérapeutique des lactocoques soit relevant.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et vivent en groupes sociaux. Le milieu est enrichi. Les animaux seront quotidiennement surveillés. De plus, toutes les procédures se font avec des anesthésiques et des analgésiques si nécessaire. Dans chaque procédure, des grilles de points limites ont été établie et que des mesures seront prises en fonction de ces évaluations.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle murin car nous utilisons des souris transgéniques, modèles de la pathologie étudiée. Les souris seront âgées de 3-4 semaines juqu'à 7-8semaines car ce modèle de souris présente une surcharge en fer dès 2 mois. Un autre lot de souris sera utilisé à l'âge de 8-10 semaines. AMENDEMENT : La lignée murine Hbb th1/th1 représente un autre modèle de surcharge en fer qui est secondaire. L'utilisation de ce modèle murin permet d'élargir les domaines d'application de ces probiotiques.
Effet d’une immunothérapie cellulaire sur des modèles murins de différentes tumeurs humaines (cancer du sang, cancer des poumons, du foie et du sein).
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant quatre mois au plus, et une prise de sang chaque semaine à la joue : 675 souris dépourvues de système immunitaire et irradiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La déclaration en compte 600 en souffrance modérée et 75 en souffrance sévère. Greffées de cellules cancéreuses humaines par la veine de la queue ou, sous chirurgie, dans la rate, elles reçoivent ensuite des lymphocytes T dits "non conventionnels", issus de donneurs sains, dont l'équipe veut faire un traitement "universel" contre leucémies, lymphomes et cancers du poumon, du sein et du foie. Le porteur choisit la souris pour son comportement "bien connu et proche de l'humain", qui rendrait la douleur facile à évaluer, et prévoit chez ces souris irradiées et greffées infections, diarrhée, paralysie ou insuffisance respiratoire.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.
Procédures
Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).
Impact sur les animaux
Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant un légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.
Devenir
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Remplacement
Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.
Elevage de lignées de souris (animaux génétiquement altérés : AGA) immunodéprimées ou exprimant une cécité précoce, en condition exempt de pathogènes spécifiques et opportunistes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
15 600 souris génétiquement modifiées vont être élevées, immunodéprimées ou frappées d'une cécité précoce, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur décrit lui-même des lignées au phénotype "dommageable", avec dégénérescence rétinienne sévère et susceptibilité accrue aux infections, destinées à des protocoles sur la cryptosporidiose et la tuberculose. Une partie des souris part vers d'autres protocoles ou renouvelle les reproducteurs, le reste étant tué en surnombre ou en fin de "carrière" de reproduction. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Ce projet consiste à élever différentes lignées de souris, génétiquement modifiées/altérées (= AGA : animaux génétiquement altérés), dont le phénotype est dommageable pour l’animal élevé au sein de la a plateforme expérimentale et qui serviront pour des protocoles réalisés également au sein de la plateforme expérimentale. Les souris sont élevées pour répondre aux besoins scientifiques des chercheurs de l'unité de recherche qui étudient (i) à mieux comprendre les mécanismes protecteurs ou pathologiques mis en jeu lors de la cryptosporidiose et la tuberculose et à (ii) plus particulièrement dans le cadre de la cryptosporidiose, à évaluer l’effet d’immunostimulants et de molécules anti-parasitaires dans des modèles murins expérimentaux sensibles à ces agents pathogènes telles que les souris immunodéprimées par délétions génétiques de gènes de l’immunité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l'obtention de souris génétiquement altérée pour l'expérimentation correspondant aux besoins des projets correspondants. Comme précisé plus haut cryptosporidiose est une maladie zoonotique qui a une forte incidence dans les élevages de ruminants et qui est encore mal contrôlée par la chimiothérapie ou un vaccin. La compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la protection est donc déterminante pour pouvoir indentifier des stratégies d’immunostimulation du système immunitaire notamment des jeunes individus afin de les rendre plus résistants ou plus résilients à l’infection. La compréhension des mécansimes immunitaires est donc essentielle pour la mise en place de stratégies efficaces. La recherche de nouveaux antiparasitaires plus efficaces que le produit possédant une autorisation de mise sur le marché (antiparasitaires) est une priorité de recherche et il convient d’évaluer les antiparasitaires sur les modèles sensibles à l’infection (souriceaux, veaux, agneaux, chevreaux, souris immunodéficiente : individus immunodéprimés). Les bénéfices attendus sont donc à la fois forts pour l’élevage de ruminants et l’humain qui sont tous deux infectés par le même parasite sur lequel nous travaillons. La contamination se fait par contact direct (animal-animal ; animal-humain ; humain-humain) ou indirect via l’environnement (eau de boisson insuffisamment traitée ou de piscine, aliment souillés…). Le contrôle de la maladie chez les animaux d’élevage bénéficie donc directement à l’environnement et à l’humain. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections mycobactériennes est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Dans le cadre de la tuberculose, nous pourront ainsi définir les signes précoces de la maladie en analyse leur comportement grâce à la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur. Cette lignée permettra aussi de caractériser le rôle des gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés.
Procédures
Les souris seront élevées de façon conventionnelle (identification, surveillance quotidienne, mise en reproduction, change des cages) dans l’attente d’être intégrées dans nos protocoles de recherche
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent certains degrés d’immunosupression par altération d’une cytokine, de son récepteur ou de cellules immunitaires. On peut donc s’attendre à une susceptibilité accrue aux infections (agents pathogènes intracellulaires par exemple). Pour les souris C3H, Elles sont homozygotes pour l'allèle donné et présentent une dégénérescence rétinienne sévère précoce.
Devenir
Tous les animaux produits sont en majorité utilisés pour des protocoles expérimentaux ou pour renouveller les animaux reproducteurs. Les animaux non utilisés dans des protocoles expérimentaux (sous autorisation éthique validée) seront mis à mort à l’issue d'une "carrière" de reproducteur ou s'ils sont surnumérraires (nombre très réduits d'animaux).
Remplacement
Pour étudier les réponses immunitaires de l’hôte ou des stratégies d’immunostimulation qui ciblent le système immunitaire, il n’est pas possible d’utiliser de système in vitro ou des méthodes alternatives suffisament élaborées pour reproduire un environnement tissulaire complexe tel que l’intestin (pour étudier la cryptosporidiose) ou le poumon (pour étudier la tuberculose). Cas de la cryptosporidiose : Pour étudier, l’effet de molécules anti-parasitaires (anti Cryptosporidium), il est possible dans un premier temps de faire un criblage de molécules in vitro sur des lignées de cellules épithéliales intestinales. La phase in vivo intervient pour avoir un environnement cellulaire plus complexe impossible à reproduire in vitro ou lorque l’on doit évaluer l’efficacité de métabolisation d’une molécule ou sa biodisponibilité dans l’organisme. La culture partielle des parasites est possible sur des lignées de cellules épithéliales intestinales et toutes les interactions que nous pouvons étudier dans cet environnement sont toujours réalisées en amont des expérimentations in vivo. Par exemple, si on veut étudier l’effet d’une cytokine sur les cellules épithéliales, on peut commencer à l’évaluer in vitro comme tous les essais d’antiparasitaires qui sont sélectionnés in vitro. La phase in vivo intervient pour avoir un environnement cellulaire plus complexe impossible à reproduire in vitro ou lorque l’on doit évaluer l’efficacité de métabolisation d’une molécule ou sa biodisponibilité dans l’organisme. Cas de la tuberculose : A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum, mais en nombre suffisant afin d’éviter toute risque de perte d’une lignée. Le nombre est défini en fonction de la prolificité de la lignée et de l’expérience acquise dans l'élevage de ses lignées. Le maintien de ces derniers en statut SOPF (Specific and Opportunistic Pathogen Free) permet également de diminuer le nombre de reproducteurs nécessaires. Comme indiqué précédemment, la reproduction en plus grand nombre des animaux est fonction de la demande des chercheurs et des projets pour lesquels les protocoles et le nombre d’animaux ont été validés par le comité d’éthique local et le ministère. Pour le maintien des lignées (conservation d'un "noyau") : A raison de 10 animaux par lignée (mâles et femelles confondus) et par génération, avec un renouvellement trimestriel, nous estimons le nombre à (10x4) x 5ans, soit 200 animaux par lignée gardé en vie. Donc 1600 animaux pour les 8 lignées sur les 5 ans. En se basant sur la formule de calcul de probabilité : F= (P/PP)/R, nous comptons 5,55 femelles qui’il faut mettre en reproduction pour obtenir 10 petits par génération (5 mâles et 5 femelles), 10 = (10/6)/30%. F = nb de femelles à mettre en accouplement P = nb d'animaux demandé PP = nb de petits par portée R = nb de femelles gestantes sur 1 accouplement (lié au cycle oestrien) = 30% Toutefois, la portée moyenne est de 6 petits par femelle, ce qui ferait si toutes les femelles mettaient bas, 30 petits par génération et par lignée. Mais afin d’éviter les surprises, nous allons compter la totalité des animaux si toutes les femelles mettaient bas. Ce qui nous ferait au final, un nombre théorique de 30 petits par générations x 4 renouvellements annuel x 8 lignées = 960 animaux par an, soit 960 X 5 ans= 4800 animaux juste pour le maintien du "noyau". Ce qui nous fait : 45 (reproducteurs) x 3 (reproductions par an) x 5 ans x 8 lignées = 5400 animaux servant la multiplication des lignées. Puis en suivant le même raisonnement que le maintien de lignée si toutes les femelles mettaient bas, 30 (femelles mis en repro) x 6 (petits par portée) x 3 (fois par) x 5 ans x 8 lignées = 21600 animaux. Autre paramètre, toutes les lignées ne sont pas utilisées en même temps, ainsi pour se projeter par rapport à notre expérience des années précédentes, nous estimons une multiplication de la moitié des lignées annuellement, ce qui ferait 21600/2 = 10800 animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en conditions particulière de type exempt de pathogènes spécifiques et opportunistes. Le change est effectué dans des conditions d'hygiènes strictes. Un suivi sanitaire trimestriel est mis en place afin de surveiller leur statut sanitaire et des modes opératoires sont rédigés, validés, respectés et révisés régulièrement pour permettre de maintenir ce statut. Leur milieu de vie est enrichi et diversifié afin que les animaux puissent exprimer un comportement normal, propre à l’espèce. Parmi les différents types d’enrichissement utilisés, citons : la maison igloo. Ces enrichissements sont adaptés en fonction des lignées, de l'âge des animaux… en fonction de l'évaluation faite par les zootechniciens. Les cages sont pourvues au minimum de 2 enrichissements différents. D’autres enrichissements pourront être testés / utilisés au fil du temps, pour améliorer / diversifier l’environnement des animaux et leurs possibilités d'activité..., en fonction des propositions des fournisseurs en particulier. Les lignées sont identifiées par poinçon à l’oreille ; l’échantillon prélevé à cette occasion sert pour le génotypage des animaux d’intérêt, à garder pour le maintien et le suivi de la lignée. Concernant plus particulièrement les souris, modèle de la tuberculose, nous gardons un environnement enrichi unique sans diversification pour ne pas perturber les animaux à l’apparition du phénotype dommageable = leur cécité.
Choix des espèces
Le modèle murin est très largement utilisé par toute la communauté internationale travaillant sur la cryptosporidiose. L’infection mime bien celle que nous observons chez l’humain et les ruminants (même site d’infection : ileum), même suceptibilité liée au statut immunitaire, même souche parasitaire capable d’infecter l’humain, la souris et les ruminants). Le modèle murin permet l’utilisation de nombreux animaux trangéniques, leur génétique bien définie permet d’avoir des réponses homogènes. Leur reproduction rapide permet l’obtention régulière d’animaux, leur cycle court de reproduction permet des mises-bas synchronisées très utiles pour les expériences sur les nouveau-nés. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. Le modèle murin permet une manipulation en animalerie de confinement de niveau 3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce : kits, anticorps. Les animaux seront utilisés pour la reproduction : il y aura donc les deux sexes à l’âge adulte, des femelles gestantes et allaitantes, ainsi que leurs nouveau-nés qui suivront leur croissance jusqu’au sevrage puis jusqu’à leur maturité pour ensuite être mis en accouplement. à leur tour. Pour les projets en lien avec la cryptosporidiose, les animaux âgés entre 3 et 7 jours en début d’expérimentation seront fournis (encore accompagnés de leur mère) ainsi que des souris adultes de sexe indéterminé généralement âgés de 8 à 20 semaines. Pour les projets en lien avec la tuberculose, les souris adultes seront âgées de 6 semaines. Il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus, nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.les souris adultes seront âgées de 6 semaines. Il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus, nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.
Développement d’une immunothérapie combinatoire dans les cancers pulmonaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pulmonaires sous la peau ou en suspension, puis on leur administre de une à quatre injections d'un vaccin et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie combinée contre le cancer du poumon. Le porteur décrit une douleur légère, une perte de poids modérée et une gêne à la mobilité liée aux tumeurs sur le flanc. Il affirme que l'effet d'un vaccin combiné à des anticorps ne peut être vérifié que sur un "organisme vivant entier".
Objectifs
L'objectif du projet est de développer et d'optimiser un vaccin thérapeutique contre le cancer du poumon puis de le combiner avec les immunothérapies anti-PD-1 existantes dans les cancers pulmonaires.
Bénéfices attendus
Le vaccin thérapeutique seul a demontré un effet bénefique, in vitro et in vivo, sur certains lymphocytes en les activant. La combinaison que nous proposons est d'ajouter des anticorps de type anti points de blcage immunitaire qui viseront à maintenir l'état d'activation des de ces lymphocytes, specifiquement induits par le vaccin, plus longtemps. Cette combinaison thérapeutique dévrait demontrer un bénéfice anti-tumoral et à terme pourrait améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
En fonction de la procédure expérimentale appliquée, les souris seront soumises à des greffes de lignées cellulaires en suspension: durée 5 minutes, sous anesthésie locale ou des greffes sous-cutanées de tumeurs solides: durée 10 minutes sous anesthésie locale et générale - Chaque souris sera greffée qu'une seule fois durant toute la procédure expérimentale - Selon les porcédures, les animaux auront entre 1 et 4 injections de vaccin, sous aensthésie locale, durée 3 minutes. Certains animaux pourront avoir 1 prélèvement sanguin par semaine durant 3 semaines: durée 3 minutes, sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les animaux qui seront utilisés subiront des injections (dont des greffes de tumeurs sous la peau), ainsi que des prélèvements de sang. Parmi les nuisances possibles : stress léger et douleur légère et transitoire lors des administrations et des prélèvements, perte de poids modérée posible, gêne légère à la mobilité des souris à cause des tumeurs pouvant pousser sur le flanc.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de conduire des analyses post-mortem sur les tumeurs et les rates.
Remplacement
L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique en combinaison avec les inhibiteurs de checkpoints immunitaires relève d’une grande complexité où les modéles in vitro seuls n’apporteraient que des réponses partielles et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs pulmonaires. L'utilisation d'un organisme vivant entier est donc incontournable.
Réduction
Afin de calculer le nombre d’animaux minimum pour répondre à nos hypothèses,, un logiciel de statistique a été utilisé. Les calculs de puissance ont pris en compte la réalisation d'expériences uniques, l'effet attendu, et le taux de prise de greffe. Les résultats seront étudiés par analyse de variance à une voie. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses de vaccins seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. Des procédures pourront être annulées en cas d'hypothèse non vérifiée.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux. Chaque cage contiendra en plus de l’eau et de la nourriture, des éléments d’enrichissements : Une maison par cage ou 2 tunnels en cartons, avec du sizzlenest pour leur nid. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. Des examens cliniques seront faits quotidiennement par l'équipe de recherche. En cas de perte de poids, un aliment plus riche, plus appétent et plus facile à consommer sera donné. Toutes les interventions lors des procédures seront faites avec anesthésie locale ou générale (ou en combinaison). Des antalgiques seront utilisés.Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour tester des vaccins sur animaux à système immunitaire normal (greffes de tumeurs murines) ou déficient (greffes de tumeurs humaines). Les souris seront greffées jeune adultes (6 semaines) et seront traitées à 8-9 semaines. Ce choix d’âge est justifié par une réponse immunitaire robuste et une prise de greffe plus efficace.
Mesures de dégradation « in sacco » d’échantillons d’aliments entrant dans la ration des ruminants
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
4 vaches vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées vivantes tant qu'elles sont en bonne santé et réutilisées d'un essai à l'autre. Munies d'une canule permanente ouverte sur le rumen, elles subissent jusqu'à cent cinquante ouvertures de cette canule par an pour poser et retirer des sachets, afin de mesurer la dégradation d'aliments du bétail dans l'estomac. Le porteur ne décrit guère d'effet indésirable au-delà du stress de contention. Il indique lui-même que des méthodes de laboratoire sans animaux sont attendues à l'horizon 2025-2026 pour remplacer les vaches canulées.
Objectifs
L’objectif du projet est de mesurer la valeur nutritive des aliments (fourrages et concentrés) utilisés dans l’alimentation des ruminants. Ces mesures servent à fournir des valeurs nutritionnelles de référence pour de nouveaux aliments ou des aliments produits avec de nouvelles techniques (récolte/conservation pour les fourrages, traitements technologiques pour les concentrés) et ainsi bâtir des équations de prévision de la valeur nutritive à partir de paramètres dosés en laboratoire. La connaissance fine des valeurs nutritives des aliments (fourrages et concentrés) permet d’ajuster les rations des ruminants au plus près de leurs besoins. Bien caractériser les aliments et leur dynamique de dégradation dans le rumen permet de limiter les risques pour la santé des animaux en contrôlant les fermentations ruminales et les excès potentiels en éléments nutritifs qui peuvent entrainer des pertes per les fèces (azote notamment) ou des disfonctionnements digestifs (acidose). La connaissance des valeurs nutritives est également utilisée à des fins de sélection et d’évaluation variétale afin de proposer aux éleveurs des variétés d’espèces fourragères performantes sur le critère de la valeur nutritive.
Bénéfices attendus
La connaissance des valeurs nutritives des aliments (fourrages et concentrés) est utile pour les domaines de la nutrition animale et de la sélection variétale. Ce projet va permettre d’acquérir des références nutritionnelles sur de nouveaux fourrages utilisés récemment dans les élevages de ruminants, notamment pour adapter la production fourragère au changement climatique ou améliorer l’autonomie et la valorisation des protéines produites sur les exploitations. D’autres travaux vont permettrent de mieux caractériser la cinétique de dégradation d’aliments déjà utilisés en élevage de ruminants. Ces travaux permettent de limiter les risques pour la santé des animaux en contrôlant les fermentations ruminales et les excès potentiels en éléments nutritifs qui peuvent entrainer des pertes per les fèces (azote notamment) ou des disfonctionnements métaboliques. La connaissance des valeurs nutritives est également utilisée à des fins de sélection et d’évaluation variétale afin de proposer aux éleveurs des variétés d’espèces fourragères performantes sur le critère de la valeur nutritive.
Procédures
Ouverture et fermeture de la canule ruminale pour la pose et le retrait de sachets nylon. Cette intervention est réalisée 30 fois par essai au maximum, et chaque intervention dure 3 à 5 minutes (temps d’ouverture et de fermeture de la canule plus le temps de pose et retrait des sachets nylons). A raison de 5 essais par an, cela donne un total de 150 interventions maximum par vache et par an.
Impact sur les animaux
Peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux. L'éventuel stress lié à la contention et à la manipulation des animaux est la principale nuisance attendue. La manipulation (pose et retrait de sachets) a lieu 30 fois au cours d'un essai, pour une durée de 3 à 5 minutes par manipulation, soit environ 2h30 par essai (12h30 maximum par an si réalisation de 5 essais).
Devenir
Les anmaux sont conservés tant qu'ils sont en bonne santé.
Remplacement
L’évaluation des nouveaux aliments (non référencés) uniquement à partir d’analyses chimiques reste problématique et les techniques in vitro utilisant des préparations enzymatiques ne permettent pas encore une caractérisation approfondie de la dégradabilité des différents nutriments dans le rumen. Néanmoins, des acteurs publics et privés de la recherche en nutrition animale sont fortement mobilisés depuis 2021 dans le cadre d’un projet commun afin de développer des méthodes alternatives à l’utilisation des animaux canulés. Les résultats acquis dans ce projet serviront notamment à bâtir des méthodes de laboratoire subsituant le modèle animal. Des méthodes alternatives robustes sont espérées à horizon 2025-2026.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire pour assurer la conduite d’essais in situ permettant de capter la variabilité animale des conditions du rumen : 4 vaches par essai. A la fin d’un essai, chaque vache peut directement être affectée sur un autre essai car la méthode n’est pas invasive pour les animaux. Une nouvelle vache ne rentre dans le protocole que lorsqu’une des 4 vaches meurt. Aucun test statistique n'a té utilisé.
Raffinement
Les 4 animaux sont logés ensemble dans une stabulation avec une aire d’exercice commune raclée (2 fois par jour) du même type qu’une installation laitière en ferme commerciale. Les vaches disposent d’une logette individuelle pour le couchage (tapis en caoutchouc nettoyé chaque jour et ajout de sciure, protection lisse sur le côté gauche pour éviter le risque d’arrachement de la canule) et pour s’alimenter de manière individuelle sans compétition à l’auge. Les animaux sont alimentés quotidiennement 2 fois par jour avec une ration d’entretien permettant d’assurer leur longévité sans engraissement excessif. A chaque repas et chaque jour de l’année, le technicien effectue un contrôle visuel des animaux (appétit, locomotion, bonne tenue de la canule). En dehors des périodes d’essai (3 mois/an minimum sur la période estivale), les animaux sont placés au pâturage dans une parcelle spécifique pour permettre un bon suivi au quotidien des animaux. Ils sont pesés chaque année à la sortie au pâturage et à l’entrée en bâtiment, et une note d’état corporelle est réalisée ponctuellement. Afin d’asurer une longévité maximum, au moins un parage et une séance d’ostéopathie sont réalisés chaque année sur chacune des 4 vaches. Des applications anti-parasitaires sont appliquées pour limiter la gêne occasionnée par les mouches. Quelques enrichissements sont proposés aux animaux : une brosse dorsale a été installée pour permettre aux animaux de se gratter, et des pierres de sel à lécher sont à disposition. La mise en place de points limites a été réalisée.
Choix des espèces
Vaches de réforme issues du troupeau de la station. Les femelles laitières sont taries pour permettre une bonne longévité de l’animal en limitant les besoins de production et les risques sanitaires. Il s’agit du modèle animal de référence pour l’étude de la valeur nutritive des aliments. Les vaches utilisées sont des vaches taries nourries avec une ration correspondant à leurs besoins d’entretien. L’utilisation de vaches taries permet d’évaluer la dégradabilité ruminale des aliments sans biais liés aux effets de la lactation. Des modèles mathématiques sont ensuite appliqués aux données pour calculer la dégradabilité des aliments en prenant en compte le taux de transit des animaux en production.
Etude de la tolérance locale et générale du dispositif médical (ballon intragastrique) implanté dans l’estomac de porc selon la norme ISO 10993 -6 (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
70 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 10 d'entre eux et modéré pour 60, la plupart tués à l'issue et une dizaine réutilisés pour d'autres projets internes ou des formations. On leur implante par voie endoscopique un ballon gastrique sous anesthésie, avec imagerie et prélèvements sanguins, puis un transport vers un autre établissement pour un suivi de longue durée, pour une étude réglementaire de tolérance d'un dispositif contre l'obésité. Le porteur décrit un inconfort digestif, des vomissements et un stress lié au transport et aux contentions. Il présente cette étude sur animaux comme exigée par la réglementation et sans méthode substitutive.
Objectifs
L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de graisse, représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes qui décèdent de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après la World Health Organization, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1,9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Plusieurs études comparant ballon intragastrique (BIG) versus sham (traitement fictif) ont montré que les BIG entraînaient une perte de poids plus importante qu'un régime seul, amélioraient les comorbidités et la qualité de vie des patients obèses. L’objectif du dispositif médical est de proposer un traitement non chirurgical pour les patients non éligibles à la chirurgie bariatrique et pour aider à la perte de poids en favorisant le sentiment de satiété. Le ballon intra-gastrique testé est indiqué de façon temporaire pour : 1) La perte de poids, chez les patients adultes obèses, n’ayant pas réussi à atteindre et à maintenir l’objectif d’un programme de perte de poids sous surveillance médicale 2) Avant chirurgie, chez les patients gravement obèses (IMC supérieur à 35 kg/m2) dans le but de réduire le risque chirurgical. L’objectif de ce projet est de réaliser une étude réglementaire in vivo (sur les porcs) pour la commercialisation sur le marché, laquelle permettra d’évaluer la tolérance locale (effets locaux) au niveau de l’estomac et générale (effets secondaires) en comparant le dispositif testé avec un dispositif de référence. Pour atteindre les objectifs, ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs : l'établissement 1/2 assurera l'implantation des dispositifs et le suivi post-opératoire à court terme et l'établissement utilisateur 2/2 assurera l'hébergement post-opératoire de longue durée avec le suivi associé.
Bénéfices attendus
Obtenir l’autorisation de mise sur le marché des dispositifs médicaux testés. En effet, ce projet va permettre d’évaluer la tolérance locale (effets locaux) au niveau de l’estomac et générale (effets secondaires) en comparant le dispositif testé avec un dispositif de référence.
Procédures
Etablissement utilisateur 1 : L’introduction du ballon dans l’estomac ainsi que l’examen d'imagerie seront réalisés sur des animaux anesthésiés. Les interventions seront de longue durée et seront réalisées par voie endoscopique. Les animaux utilisés seront brièvement anesthésiés avant chaque prélèvement sanguin L’anesthésie va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Les interventions seront de courte durée, quelques secondes pour le prélèvement et l’anesthésie dure environ 20 minutes (si anesthésie spécialement pour la ponction). Elles ne seront réalisées qu’une seule fois par animal pendant le jour de l’introduction de ballon dans l'estomac et le J+2 semaines. Etablissement utilisateur 2 : Les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés à 3 différents temps. La pesée est un acte de courte durée (quelques minutes). Des prélèvements sanguins sur animaux non anesthésiés seront également réalisés à 3 différents temps et ces prélèvements sont aussi des actes de courte durée (quelques minutes). Le temps de récupération entre 2 prélèvements sanguins sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.
Impact sur les animaux
Etablissement utilisateur 1 : Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation, inconfort digestif transitoire, vomissement les premiers jours de post-implantation ainsi qu’une possible réaction inflammatoire locale des tissus. Etablissement utilisateur 2 : Au bout de 2 semaines environ après la mise en place du ballon, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. Un stress peut être généré par l’arrivée des animaux dans un nouvel environnement. A différents temps post-opératoires, l’animal sera pesé et des prélèvements sanguins seront réalisés. Les différentes contentions pour réaliser ces pesées, ces prélèvements sanguins et l’anesthésie précédant la mise à mort peuvent également générer un stress.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser les sites d’implantation étudiés (l’estomac et les ganglions lymphatiques autour). Ces prélèvements sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet. Le porc de réserve ne recevra pas de ballon gastrique le jour de l'implantation mais pourra être implanté en cours d'étude si pour l'un des 6 autres porcs du groupe il y'a une complication le jour de mise en place du ballon ou les jours suivants sa pose. S'il n'est pas utilisé pour ce projet, il sera réutilisé pour des projets internes à la structure (autres études, formations).
Remplacement
L’étude de tolérance locale conformément à la norme ISO 10993 -6 est une étude réglementaire demandée par les autorités, dans le cadre de la commercialisation sur le marché de dispositifs médicaux. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer une bonne tolérance générale et locale au niveau de l’estomac. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la norme ISO 10993-6, selon laquelle il est nécessaire d’évaluer minimum 10 prélèvements d'estomac étant en contact avec le dispositif par groupe, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre d’études sur la durée du projet). Nous considérons qu’un porc a deux demi-estomacs, donc 2 sites de prélèvements, afin de réduire le nombre d’animaux. Nous pouvons considérer que l’estomac du porc étant symétrique par rapport à son axe cardiapylorique, la biocompatibilité du dispositif implanté est testée sur chaque côté des parois stomacales. Les sites de prélèvement incluront toutes les parties morphologiques de l’estomac, c’est à dire le fundus, le corps et l’antre pylorique ainsi que la chaine ganglionnaire associée. Trois prélèvements seront ainsi réalisés de chaque côté, afin d’augmenter les sites d’évaluations et d’analyses en contact avec le dispositif, d’inclure toutes les parties morphologiques et physiologiques et de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les études seront réalisées sur minimum 2 groupes avec un groupe test versus un groupe avec un dispositif de référence avec 6 porcs + 1 de réserve inclus par groupe, Par conséquent, sur cinq ans et a raison d'une étude par an, il a été estimé 70 porcs au total. Ce nombre d'animaux permettra de répondre aux exigences de la norme ISO 10993-6 et d'obtenir des données statistiques robustes.
Raffinement
1) Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant l’implantation des dispositifs médicaux. Avant l’inclusion des animaux, une évaluation de l’acclimatation sera réalisée. Les critères suivants seront observés : - Harmonie du groupe - Bon état de santé - Bonne consommation alimentaire et hydrique. 2) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales (hébergement, environnement, alimentation, apport en eau, soins), Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement et disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon, chaîne associée à une balle en plastique etc, permettant à l'animal de jouer). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils seront hébergés dans des box attenants avecun contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et auront à disposition plus d'enrichissements (enrichissement compensatoire). De plus, la température de la salle sera augmentée (Etablissement utilisateur 1). 3) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des porcs. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l'animal. L'administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 4) Surveillance accrue de l'animal durant les manipulations. Comme les animaux sont conservés longtemps, nous privilégierons des techniques de renforcement positif pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. 5) Les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique voire remplacées par cette solution : 1- en période post-opératoire immédiate (afin de ne pas solliciter l'estomac avec des éléments solides) 2- en cas de perte de poids prononcée 3- en cas de troubles digestifs chroniques.
Choix des espèces
Pour cette étude, le modèle porcin sera utilisé, car le porc est considéré comme le modèle animal le plus représentatif de l’être humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie digestive, avec un régime omnivore et un estomac de taille très comparable à celle de l’humain. Conformément à l’anatomie du porc et des dimensions des dispositifs médicaux (longueur de cathéter est 64,5 cm), les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 40 et 50 kg environ le jour de l’implantation des dispositifs médicaux. Lors des implémentations (phase critique), il convient de pouvoir déposer le ballon en intra-gastrique tout en manipulant le cathéter à l’extérieur de la gueule des animaux anesthésiés. Les poids cibles des animaux utilisés correspondent à une longueur d’oesophage environ 40 cm, contre déjà environ 60 cm chez l’animal adulte. L’utilisation d’animaux plus âgés et plus lourds diminuerait fortement l’adéquation de la longueur du cathéter de pose du dispositif et celle de l’endoscope (les deux étant adaptés à la longueur de l’oesophage humain). De plus, l’objectif principal de cette étude est centré sur la biocompatibilité tissulaire et des organes et non sur l’efficacité du dispositif qui est testé par ailleurs lors d’essais cliniques chez l’homme.