Recherche appliquée

4 truies et 27 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les truies sont infectées deux fois par un streptocoque puis vaccinées, les porcelets infectés à leur tour, avec des écouvillonnages amygdaliens et vaginaux et des ponctions sanguines répétés tout au long de la reproduction. Le porteur indique que l'infection reste quasi asymptomatique chez les truies mais peut rendre les porcelets malades, ceux qui atteignent les points limites étant alors mis à mort. Il justifie le projet par les pertes économiques en élevage porcin et le "potentiel zoonotique" de la bactérie, et affirme qu'aucun remplacement in vitro n'est possible.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un autovaccin visant un streptocoque administré à des truies en gestation. De précédentes investigations ont mis en évidence une excellente protection des porcelets issus de truies infectées par une bactérie de type streptocoque avant leur mise à la reproduction puis vaccinées contre cette bactérie en cours de gestation. Ces connaissances inédites doivent absolument être consolidées avant d’être diffusées auprès des professionnels de la filière porcine qui sont fréquemment confrontés à cette bactérie responsable de troubles méningés chez le porcelet. L’objet de cette saisine est donc d’apprécier l’efficacité, sur des porcelets, d’un autovaccin administré en gestation à leur mère préalablement infectées par ce streptocoque. Elle comporte une seule procédure expérimentale impliquant un total de 4 truies et de 27 porcelets.

Bénéfices attendus

Les bactéries de type streptoccoque étudiées ici, sont répandues dans les élevages porcins et transmissibles de l’animal à l’homme. Elles sont responsables de graves affections (méningite, septicémie et polysérites) pouvant entraîner des pertes économiques importantes (réduction des performances zootechniques des animaux affectés, détérioration de la qualité des carcasses, élévation du taux de pertes et de saisies à l’abattoir, etc.). Le contrôle de l’infection des animaux par cette bactérie est généralement difficile et les mesures de prévention aléatoires. En élevage, l’antibiothérapie constitue un des éléments de l’arsenal thérapeutique. Cependant, son utilisation doit être limitée en raison de résistances développées par les bactéries vis-à-vis de certains antibiotiques. Une des méthodes alternatives pour lutter contre ce streptocoque repose sur la vaccination et plus précisément, dans la mesure où aucun vaccin commercial n’est disponible, sur l’utilisation d’autovaccins. Ces derniers sont préparés à partir de germes pathogènes isolés d’un sujet malade dans un élevage donné et sont administrés aux animaux de ce même élevage. Les autovaccins sont utilisés pour prévenir les infections à ces streptocoques chez les truies ou les porcelets sans que leurs efficacités ne soient clairement démontrées. Acquérir des connaissances sur les autovaccins visant les infections à ce type de streptocoque apportera des éléments pour aider à mieux gérer ces maladies désastreuses en élevages et à potentiel zoonotique.

Procédures

Prélèvements sur truies vigiles : Des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés chez les 4 truies avant le jour de l’infection soit 5 semaines avant les inséminations artificielles, puis 8 fois au cours du cycle de reproduction (soit 9 interventions). Des ponctions sanguines seront réalisées pour suivre la réponse immunitaire (soit 11 interventions). Des écouvillonnages vaginaux seront également réalisés avant le jour de l’infection puis 4 fois au cours du cycle de reproduction (soit 5 interventions). Les truies seront infectées deux fois par voie veineuse et seront vaccinées deux fois par voie musculaire. Prélèvements sur porcelets vigiles : Des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés sur chacun des porcelets avant le jour de l’infection puis 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 5 interventions). A chaque jour de prélèvement, un écouvillonnage amygdalien sera effectué sur les porcelets infectés, les porcelets contacts et les porcelets témoins (n=27 animaux). Des ponctions sanguines seront réalisées 24h après la naissance puis une fois par semaine à compter du sevrage jusqu’à la fin de l’expérimentation pour suivre des paramètres immunologiques et deux fois au cours de la première semaine suivant l’infection (suivi de la bactériémie), soit 9 interventions au total. Les porcelets seront infectés une fois par voie veineuse. Afin de limiter la contention des animaux, les écouvillonnages amygdaliens seront réalisés en même temps que les ponctions sanguines. Les durées des interventions sont estimées chez les truies à 30 secondes pour l’infection par voie veineuse, 20 secondes pour la vaccination par voie musculaire, 1 minute et 30 secondes pour l’ écouvillonnage amygdalien et la ponction sanguine et 10 secondes pour l’écouvillonnage vaginal (sans contention). Pour les porcelets, les durées des interventions sont estimées à 30 secondes pour l'infection par voie veineuse et entre 30 secondes et 1 minute pour l’ écouvillonnage amygdalien et la ponction sanguine.

Impact sur les animaux

L’infection expérimentale avec le streptocoque étudié est quasiment asymptomatique chez les truies et est généralement symptomatique chez les porcelets de 6 semaines. Cependant, la sévérité clinique peut être limitée lorsque la dose bactérienne injectée est ajustée à la dose minimale infectante. C’est la dose que nous utiliserons dans cette procédure expérimentale. Toutefois, une attention de tous les instants sera apportée au suivi clinique quotidien de chaque porcelet. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’infection. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction des symptômes cliniques relevés. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour, y compris le week-end. Dans les cas où l’infection conduirait à une altération importante de l’état de santé, à une atteinte des points limites préalablement définis, les porcelets seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Cet acte est nécessaire afin d'obtenir des prélèvements de bonne qualité impactant directement les résultats des analyses.

Remplacement

L’expérimentation consistant à évaluer l’efficacité d’un vaccin et étudier les réponses immunologiques induites, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcelets utilisés tout en menant une étude suffisamment puissante pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Nos études antérieures montrent qu’il est indispensable d’avoir au minimum trois porcelets infectés par truie et des groupes de 6 porcelets pour (i) considérer la variabilité inter-individuelle des animaux et (ii) obtenir une pression d’infection suffisante permettant de reproduire une colonisation des amygdales et/ou la maladie. Ce projet impliquera au total 4 truies et 27 porcelets.

Raffinement

Les truies et les porcelets seront élevés en groupe stable, bénéficieront d’un enrichissement social et auront à leur disposition des objets manipulables. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique rapproché. Les truies, abreuvées à volonté, seront examinées a minima une fois par jour pendant les deux semaines suivant l’infection. Les porcelets seront nourris et abreuvés à volonté. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’infection (y compris le week-end). Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction de l’évolution leur état de santé . Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour, y compris les week-ends. En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcelets seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas. Une récompense sous la forme de friandise sera proposée aux truies et aux porcelets une fois l’ensemble des prélèvements réalisés afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible de la bactérie de type streptococoque étudiée dans cette saisine. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Les truies et les porcelets impliqués dans l’expérimentation auront, au moment de l’infection, respectivement ente 28 et 34 semaines de vie et entre 6 et 7 semaines de vie . Le modèle expérimental a été précédemment validé à ces âges ce qui permet de s’affranchir d’une étape de validation.

14 rats et 7 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats reçoivent une plaie cutanée au bistouri sur le dos et une injection intradermique, les souris une injection de médicament anticancéreux destinée à provoquer une nécrose de la peau, pour tester un nouvel appareil de mesure de l'élasticité des tissus comparé à deux dispositifs du commerce. Le porteur annonce des douleurs localisées, une perte de poids modérée et un stress lors des manipulations. Il présente l'outil comme plus simple et moins coûteux et renvoie au conditionnel son application clinique chez l'humain.

Objectifs

La caractérisation des propriétés mécaniques des tissus mous, à l’instar de l’élasticité cutanée, présente un intérêt majeur pour de nombreuses spécialités médicales et chirurgicales. Sur une peau cicatricielle (séquelles de brûlures, cicatrices post-opératoires ou post-traumatiques, cicatrices chéloïdes, greffes de peau, etc.) sa mesure répétée au cours du suivi objective l’efficacité d’un traitement et conforte l’examen clinique. Les technologies actuelles sont cependant imprécises, coûteuses et complexes à manipuler et il n’y a pas de protocole fiable utilisé en pratique clinique pour effectuer cette mesure. L’objectif du projet est de valider un nouveau dispositif de mesure de l’élasticité des tissus mous, indolore et non invasif. Une étude mécanique préalable a été réalisée sur des échantillons inertes mimant des tissus biologiques (Agar Agar de différentes concentrations). Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur tous les échantillons, et de meilleures performances qu'avec les technologiques utilisées actuellement. L'objectif de ce nouveau protocole est de valider ce dispositif sur des tissus biologiques in vivo (modèles murins : la souris et le rat) en le comparant au Cutomètre® et au Myoton®, deux outils permettant la mesure de l’élasticité cutanée et des tissus mous. L’ensemble de ces expérimentations animales permettra d’assurer la cohérence en vue d’un futur essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus après analyses statistiques seront en premier lieu de confirmer l’applicabilité de notre dispositif à l’étude de l’élasticité des tissus mous in vivo sur un modèle murin, ainsi que la simplicité de cette mesure. Nous souhaitons démontrer la précision et la fiabilité de cet outil par comparaison au Cutomètre® et au Myoton®, pour un coût et une complexité de mise en oeuvre moindres. Ces résultats positifs permettront à court terme de développer une étude chez l’homme en pratique clinique usuelle. Notre outil pourrait permettre d’évaluer instantanément et in vivo l’élasticité d’un tissu mou biologique. Il pourra aisément s’intégrer au diagnostic et au suivi thérapeutique de l’ensemble des pathologies nécessitant une évaluation objective de ces propriétés mécaniques, et permettre un gain majeur en qualité de vie pour les patients cibles. Il s’agit d’un dispositif très simple puisqu’il se compose d’une masse équipée d’un ou plusieurs capteurs de force, et est ainsi peu coûteux en comparaison aux technologies déjà présentes sur le marché. A terme, son utilisation pourra s’étendre à d’autres domaines tels que la médecine régénérative, la cosmétologie ou la chirurgie carcinologique, par exemple via la délimitation en temps réel des marges tumorales lorsque celles-ci sont incertaines à l’inspection et à la palpation.

Procédures

Dans le premier protocole, il est effectué sur le dos des rats une perte de substance cutanée rectangulaire (plaie mécanique au bistouri). Elle est réalisée sous sédation chimique, après rasage à la crème dépilatoire et désinfection cutanée. Elle est ensuite recouverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation. Il est également réalisé une injection intradermique ventrale d'un produit volumateur. Dans le second protocole, il est effectué sur le dos des souris une injection intradermique d'un médicament anticancéreux afin d'induire une zone de nécrose cutanée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus et prévisibles, et cibles des stratégies de raffinement sont : - Douleurs localisées au niveau des zones étudiées (perte de substance cervico-thoracique droite et point d'injection ventral droit chez le rat, zone de nécrose dorsale droite chez la souris) - Perte de poids modérée - Stress majoré lors des manipulations initiales et lors des mesures régulières en cours d'étude.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'étude : 14 rats et 7 souris, au terme des 2 mois de l'étude.

Remplacement

Les alternatives non animales pour notre étude ont été exploitées lors de la phase initiale du projet, lors de l'étude mécanique préliminaire in vitro réalisée sur des échantillons d'Agar Agar de différentes concentrations mimant des tissus biologiques. Les résultats ont montré une très bonne reproductibilité avec une erreur inférieure à 5% sur toutes les concentrations en Agar et de meilleures performances qu'avec les méthodes élastométriques. L'objectif est désormais de valider notre outil sur le modèle animal, afin de le valider in vivo au cours d'un processus de cicatrisation complet. Ces résultats, s'ils sont positifs, permettront à terme de développer une étude chez l'homme en pratique clinique usuelle.

Réduction

Le nombre d'animaux requis pour notre étude a été calculé afin d'obtenir des analyses statistiques significatives en ce qui concerne la précision de nos mesures. Il est cohérent avec les protocoles suivis dans les études animales comparables. La durée totale d'étude de 2 mois a été retenue pour permettre un recul suffisant après cicatrisation, et ne pas prolonger inutilement le protocole. Elle est cohérente avec les délais des études comparables compris entre 1 mois 1/2 et 3 mois.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation des animaux avec des conditions de lumière et de température standardisées sera respectée en début d'étude, afin de limiter le stress animal. Une sédation sera réalisée avant chaque geste invasif, adaptée à la douleur. Concernant la perte de substance réalisée pour le protocole n°1, elle sera couverte de vaseline et bandée pour faciliter la cicatrisation à la phase initiale. Passé le délai de 14 jours, et puisque les mesures seront alors plus espacées, un pansement hydrocolloïde transparent sera appliqué entre chaque mesure. En cas de douleur postopératoire, un antalgique sera administré à l'animal selon les bonnes pratiques usuelles. La réaction locale aux points d'injection sera étudiée à chaque temps et des photographies seront réalisées. Le choix d'une perte de substance dorsale a été fait pour éviter le risque de grattage de la lésion par le rongeur. Les cages comporteront des tiges de coton pour nidifier et des maisonnettes en carton.

Choix des espèces

Les modèles murins (souris et rats) sont très adaptés au suivi cicatriciel et permettent des manipulations aisées. Il s'agit des modèles principalement utilisés dans les études comparables de la littérature. Les rats et les souris seront à l'âge adulte. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des animaux plus jeunes, et leur surface corporelle ainsi que leurs capacités de cicatrisation seront optimales à ce stade de développement.

Une chirurgie du cerveau de 20 minutes avec pose d'électrodes pendant une heure, quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré jour et nuit, et des tests de comportement chaque mois pendant une semaine au plus : 918 souris, issues notamment de deux lignées présentées comme reproduisant la maladie d'Alzheimer, vont passer par ces étapes. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue par une dose létale d'anesthésique. L'équipe veut corriger par thérapie génique l'hyperexcitabilité du cerveau associée à la maladie, en faisant exprimer aux souris une protéine altérée chez les patients, et émet l'hypothèse que ce traitement pourra s'appliquer un jour à des personnes à risque, avant les premiers symptômes. Le texte ne nomme ni cette protéine, ni les deux lignées, ni les tests de mémoire, décrits seulement comme des séances d'une dizaine de minutes répétées trois fois, à côté d'une heure de déplacement libre dans une arène.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles ont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

20 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur colorectale humaine greffée sous la peau, elles reçoivent un peptide radiomarqué au fluor-18 puis passent en imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque terminale. L'objectif est d'évaluer la distribution de ce traceur pour le diagnostic du cancer du côlon. Le porteur affirme que les résultats in vitro sont insuffisants et qu'un modèle animal porteur de tumeur est "indispensable".

Objectifs

On estime, en 2018, à plus de 43 000 le nombre de nouveaux cas de cancer colorectal en France. Il s'agit du troisième cancer le plus fréquent et du deuxième cancer en termes de mortalité, avec plus de 17 000 décès par an en 2018. Le cancer du côlon est guérissable dans plus de 90% des cas lorsqu'il est diagnostiqué tôt. Ainsi, le diagnostic précoce de ces cancers est un enjeu majeur afin d'établir un traitement le plus tôt possible et par conséquent avoir un impact direct sur la survie du patient. Même s'il existe des tests biologiques de plus en plus performants, l'imagerie médicale, si elle est optimisée, reste un outil performant et quasi non invasif pour la détection précoce de ces cancers. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au récepteur de la neurotensine qui est exprimé au niveau du cancer du côlon (lignée HT 29). Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament radiopharmaceutique ciblant le récepteur de la neurotensine utilisé en routine. Dans ce projet préclinique, 1 peptide radiomarqué au fluor-18 sera étudié sur 20 souris porteuses de tumeurs du colon (lignée HT-29).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si cet analogue de la neurotensine donne de bons résultats in vivo en imagerie PET, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique tel que le Lutétium-177.

Procédures

Les différentes interventions sur les 20 souris Balb/c nude sont les suivantes : - 1 xénogreffe sous-cutanée de cellules tumorales (cancer colorectal) sur le flanc droit (5 min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse pour les 20 souris (5 min) - 2 imageries de 20 min sous anesthésie gazeuse - 1 ponction cardiaque terminale sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau du flanc droit pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies pour les imageries ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 20 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue de la neurotensine radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur à la neurotensine est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique par le peptide radiomarqué.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude de l'analogue de la neurotensine radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic PET, il est nécessaire de visualiser la biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs à ce neuropeptide. Pour cette étude, un modèle murin présentant une xénogreffe sous-cutanée d'une lignée de cancer humain du colon sera utilisé. La présence du récepteur à la neurotensine sur cette lignée a été validée in vitro. La saturation de tous les récepteurs cibles par la neurotensine froide injectée en large excès (groupe dit de "blocking") permet une non fixation du peptide radioactif. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 10 souris xénogreffées par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et un groupe dit "blocking" incluant 10 souris injectées avec le radiopeptide + un large excès de neurotensine "froide".

Raffinement

Les souris étant immunodéprimées, celles-ci sont logées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes à l’intérieur des salles de stabulation de l’animalerie de recherche agréée où l’ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus les cages sont équipées d’enrichissement pour limiter le stress. Les souris immunodéprimées sont hébergées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes (SOPF). Une limitation du nombre de souris par cage est également requise. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur. Si un des points limites est atteint l'animal sera sorti de l'étude et la décision sera prise par le vétérinaire soit de soigner l'animal soit de l'euthanasier par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la xénogreffe sous-cutanée de tumeur humaine. Des souris femelles seront utilisées pour cette étude car moins agressives que les mâles (moins de risques de blessures au niveau de la tumeur). Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. A ce stade de développement, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, l'étude de biodistribution pourra être initiée.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à deux injections intra-péritonéales par jour pendant dix jours sur animal vigile, puis un prélèvement de sang intra-cardiaque avant l'euthanasie pour récupérer organes, rate et ganglions. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'une protéine, qui font l'objet d'un dépôt de brevet, pour la greffe de poumon. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et "le seul modèle préclinique adapté".

Objectifs

BOB1 est un facteur de transcription exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associée au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. Notre hypothèse est que BOB1 est un déterminant transcriptionnel qui contrôle les réponses immunes allogéniques après greffe de poumons. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de modifier le programme transcriptionnel des lymphocytes activés et fournir un bénéfice thérapeutique pour la prévention et le traitement des dysfonctions chroniques du greffon. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune spécifique d’un alloantigène, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Ces souris développent une réponse immune complète (humorale et cellulaire) spécifique d’un alloantigène que nous pouvons quantifier. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique et innocuité in vivo chez la souris. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une allogreffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 2 minutes, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intrapéritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, des tests statistiques adequats sont utilisés et le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

160 agneaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infestés par gavage avec des parasites intestinaux, ils peuvent développer une inflammation de l'intestin, des diarrhées et une chute de l'hématocrite, portent un harnais de collecte des excréments et subissent un jeûne avant d'être tués. Le projet entretient des souches de parasites, que le porteur nomme "matériel biologique", pour tester des antiparasitaires. Il retient des mâles, plus sensibles à l'infestation, pour "produire plus de parasites avec moins d'animaux", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit le cycle complet du parasite.

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes et adultes de parasites intestinaux d'intérêt vétérinaire) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique, criblage de molécules). Pour cela, il est nécessaire de conduire des infestations expérimentales pour i) produire le matériel de façon régulière, ii) disposer d'isolat parasitaire et caractériser leurs propriétés de résistance et de virulence, iii) contrôler les doses infestantes et cibler l'espèce d'intérêt (à la différence d'infestation naturelle non contrôlées), iv) maintenir les isolats parasitaires multi-résistants en confinement. Toutes ces contraintes ne rendent pas possible l'utilisation d'animaux en infestation naturelle ou d'animaux d'élevage commerciaux.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en comprenant i) les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques. Ces bénéfices couvrent des enjeux à court et moyen terme.

Procédures

1) Le déparasitage consiste à traiter les animaux avec un anticoccidien et un anthelminthique. Les deux sont par voie orale ( 1 fois et entre 5 et 10 min). 2) Des prises de sang sur animal vigile pour suivre l'hématocrite (entre 3 et 5 fois et 5 min). 3) Infestation par gavage de parasite en fonction du niveau de résistance de l'isolat (1 fois et entre 5 et 10 min). 4) Transfert des animaux infestés par des isolats résistants dans les parc sur grille et mise en place des harnais (1 fois et environ 30 min). 5) En fonction de la pression sélection, application d'un traitement antiparasitaire (1 fois et en entre 5 et 10 min) 6 ) Récolte des fécès grâce au pot rattaché au harnais (en fonction de besoin scientifique et en continu). 7) Prélèvement rectal pour collecter de petites quantités de parasites (ponctuelle selon les besoins et environ 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de quatre ordres : 1. l'effet de l'infestation : les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en parc avec plateau de récolte des fècés par deux des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux. 3. Les harnais de collecte et le prélèvement rectal peuvent provoquer un léger inconfort. 4. Une mise à jeûn une nuit (< 16h) avant l'euthanasie constitue un stress important pour l'animal. 5) La prise de sang : la contention peut générer du stress ainsi qu’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminés dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro car aucune méthode alternative n'est disponible à l'heure actuelle.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe soit 160 agneaux sur les cinq années à venir au maximum. Aucun test statistique n'est prévu dans le cadre des projets car il s'agit d'assurer une production continue de matériel biologique. Un minimum de deux animaux est considéré pour prévenir un isolement social.

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par deux minimum. Chaque parc avec grille pour la collecte des fèces dispose d’un tapis pour le confort pour le couchage. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte : elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux. Enfin, des granulés sont donnés après chaque prise de sang. Les animaux sont observés quotidiennement. Dans le cas où l'animal présenterait un état clinique détérioré (apathie, anorexie, diarrhée), une coproscopie de contrôle sera réalisée. Pour l'infestation par H. contortus (parasite hématophage), tout animal présentant une perte d'hématocrite supérieure à 30% de son hématocrite initial sera vermifugé (isolat sensible ou mono-résistant) ou euthanasié (isolat multi-résistant). L'hématocrite sera établi avant puis 30j et 45j après infestation, ainsi qu'après toute coproscopie supérieure à 15000 oeufs/g lors du suivi hebdomadaire. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

Les vers gastro-intestinaux, parasites d'intérêt, sont inféodés à cette espèce. Les agneaux auront entre 2.5 à 6 mois. A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.