Recherche appliquée

Une lignée de souris du syndrome de Wolfram, qui perd la vue et l'audition vers un mois et développe un trouble vestibulaire source d'hyperactivité, est exploitée pour tester cinq composés chimiques fournis par des chimistes. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Après un marquage à l'oreille, elles reçoivent des injections quotidiennes dans le péritoine pendant quinze jours, un test de vision éveillées à un mois et deux anesthésies à trois jours d'intervalle pour un test d'audition d'une heure et un test de vision de 30 minutes, des tests que le porteur dit tous "indolores". Le texte justifie des lots de 10 souris par groupe par plus de vingt ans de mesures, sans détailler comment ces groupes aboutissent à 800 souris pour cinq composés.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par gavage, des mesures répétées de la tumeur et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester un composé inhibiteur associé à une immunothérapie. Les bénéfices annoncés pour les patients ne répondant pas à l'immunothérapie restent formulés au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit encore les interactions de l'environnement tumoral et que ce modèle est "nécessaire".

Objectifs

Dans le microenvironnement tumoral, les fibroblastes associés à la tumeur favorisent la malignité en sécrétant des facteurs empêchant le système immunitaire de s'attaquer aux tumeurs fibreuses et favorisant ainsi les métastases. Des immunochemothérapies ont été testées, lors d'un précédent projet collaboratif, pour améliorer la réponse immunitaire naturelle qui reconnaît le cancer comme étranger. Cela n'a produit que peu d'effet dans ces cancers riches en fibroblastes. L'inhibition (par un de nos composés en développement clinique) d'une enzyme spécifique a permis de stopper la migration et invasion de cellules tumorales (métastases) et de cibler l’activation des fibroblastes pour aider le système immunitaire. Inhiber cette enzyme pour des cancers fibreux est alors devenu une voie de traitement envisagée. Le cancer du côlon est connu pour présenter des tumeurs solides présentant une enveloppe fibreuse exprimant fortement cette enzyme. Pour tester l’effet des composés inhibiteurs de cette enzyme spécifique sur les fibroblastes et la réponse de la tumeur à l’immunothérapie dans ce cancer précisément, nous allons utiliser le modèle murin sous-cutané de cancer du colon, qui développe des tumeurs immunogènes répondant à des anticorps inhibiteurs d’un contrôle immunitaire.

Bénéfices attendus

Un composé inhibant cette enzyme spécifique est important à tester dans le contexte de cancers fibreux, dans un objectif de ciblage des fibroblastes associés à la tumeur. Ceci pourra affecter les caractéristiques de la malignité, y compris la prolifération des cellules cancéreuses, l'invasion et les métastases, mais aussi l'effet sur le phénotype du myofibroblaste dans la tumeur et la réponse immunitaire anti-tumorale. Cela peut atténuer la réaction tissulaire stromale entourant les tumeurs solides, permettant la pénétration accrue des molécules de chimiothérapie dans le noyau tumoral pour faciliter la destruction des cellules cancéreuses. Le composé peut également permettre de rompre cette barrière fibreuse construite par les fibroblastes et de permettre à nouveau un environnement immunocompétent, conduisant le système immunitaire à voir les cellules cancéreuses comme étrangères pour augmenter la mortalité de ces cellules chez les patients qui n'ont pas répondu à l'immunothérapie.

Procédures

induction après rasage : une injection sous cutanée dans le bas du dos (moins de 30 secondes), pesées et traitements par gavage (voie orale, 2 maximum par jour, moins de 10 secondes chacun), mesure de la tumeur 2 fois par semaine - 30 secondes / prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse profonde (à J7 pour 4 animaux par groupe et en final pour tous) 3 minutes - et de la tumeur après la mort.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à plusieurs types de contraintes engendrant du stress et douleur légère : injection de cellules tumorales en sous-cutané sous anesthesie gazeuse, traitements par voie orale grâce une sonde oesophagienne, injections intraperitonéales, contention pour la mesure de la tumeur et la pesée des souris.

Devenir

mise à mort pour prélevement de sang et de la tumeur.

Remplacement

Les progrès technologiques permettent de plus en plus le remplacement des animaux par des méthodes alternatives. Ces changements sont une bonne chose et dès que cela est possible nous réalisons des expériences in vitro dans le but d’identifier les composés les plus prometteurs, pour les tester par la suite in vivo. Dans le cadre de nos recherches, nous étudions l’effet des molécules sur le développement tumoral afin de traiter in fine des tumeurs humaines. L'environnement tumoral qui va se développer va interagir avec plusieurs éléments de l'organisme. Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo, et ce modèle en particulier, est nécessaire.

Réduction

Ce modèle a déjà été utilisé pour tester des inhibiteurs de Nox au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données ADME des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Différents tests statistiques nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou un potentiel effet-dose.

Raffinement

Les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois dur par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les animaux seront monitorés quotidiennement (à chaque traitement) pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont une espèce de choix pour l’étude de modèles cancéreux de par les nombreuses études déjà réalisées. Ce modèle de xénogreffe est très bien décrit dans la littérature. Les souris femelles seront utilisées car nous avons une expérience antérieure d’études in vivo sur ce modèle avec des souris femelles. Nous utiliserons des animaux de 8 à 10 semaines. Il est maintenant prouvé que les processus de fibrose sont réversibles dans le jeune âge et les biomarqueurs associés à la fibrose ont un turnover plus faible en vieillissant. Il n’y a pas nécessité d’ajuster des doses ou de prendre des dispositions particulières liées au jeune âge ou au contraire à l’âge avancé.

360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par amputation de phalanges, subissent des prélèvements de sang à la veine temporale, des injections et des mesures de force musculaire, pour tester une thérapie génique et une thérapie pharmacologique contre une myopathie rare. Les souris des procédures thérapeutiques sont tuées pour l'analyse histologique des muscles, tandis que la lignée d'élevage est gardée vivante pour des projets ultérieurs. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "essentiel" et la souris "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui un tissu vivant.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont des maladies rares avec un fort impact sur la qualité et la durée de vie. Les CNM se caractérisent par une faiblesse des muscles volontaires (= muscles squelettiques). Les patients montrent des retards moteurs ou n’apprennent jamais à marcher, et ils ont des restrictions respiratoires. Notre projet vise à : -Comprendre les étapes du développement de la maladie afin d’identifier des biomarqueurs qui serviront à diagnostiquer cette maladie à un stade précoce à partir d’une simple prise de sang, et à évaluer l’efficacité d’un traitement en comparant la valeur de ces marqueurs avec des sujets sains. -Tester une approche thérapeutique génique en injectant des petites molécules qui seront injectées avant et après l’apparition des premiers signes afin de pouvoir évaluer l’efficacité du traitement d’anticiper (= empêcher le début de la maladie) et d’invertir la maladie (= guérir les souris déjà malades). -Tester une approche thérapeutique pharmacologique en injectant des composés chimiques avant et après l’apparition des signes de la maladie pour évaluer leur potentiel d’anticiper et d’invertir la maladie. Suite aux injections des molécules et composés chimiques, nous évaluerons la force et la structure musculaire des souris afin de pouvoir quantifier l’efficacité des traitements.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir de nouvelles connaissances sur les voies cellulaires impliquées dans le développement des CNM, et ainsi permettre de valider des biomarqueurs circulants (= dans le sang) permettant l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. En outre, nous allons tester deux nouvelles approches thérapeutiques sur un modèle souris de CNM : une approche de thérapie génique et une approche de thérapie pharmacologique. Les résultats sont d’un grand intérêt médical et pourraient conduire à des essais cliniques dans l’objectif de traiter les patients CNM.

Procédures

Nous prévoyons les interventions suivantes : 1) Identification de souris par amputation de phalanges - une fois entre 7 et 10 jours - durée 2 minutes. 2) Prélèvement sanguin à partir de la veine temporale - durée 2 minutes. 3) Injection de petites molécules - durée 2 minutes. 4) Injection de composés pharmacologiques - durée 2 minutes. 5) Mesures de force musculaire - durée 20 minutes

Impact sur les animaux

Les souris CNM présentent une faiblesse musculaire modérée sans impact majeur sur la qualité et la durée de vie. Les approches thérapeutiques par molécules ou composés pharmacologiques visent à augmenter la force musculaire des animaux. Il est néanmoins possible que les traitements aient des effets secondaires indésirables. L'identification, de même que les injections a visées thérapeutiques ou d'anesthésiants pour la mesure de force musculaire peuvent engendrer un stress ou une douleur temporaire chez l'animal.

Devenir

Procédure maintien de la lignée : les souris seront gardées pour des projets ultérieurs. Procédure thérapie génique et pharmacologique : les souris seront soumises à des test de force musculaire puis mis à mort pour des analyses histologiques des muscles.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les voies cellulaires impliquées dans le développement de la myopathie centronucléaire (CNM) et à évaluer l’effet d’approches thérapeutiques sur la fonction musculaire. Pour ces raisons, un modèle animal est essentiel et nous ne pouvons avoir recours à des modèles cellulaires (qui ne reflètent pas un tissu vivant). Les connaissances du système musculaire sont très développées chez la souris, qui représente de ce fait un modèle approprié et indispensable pour étudier la CNM et établir des approches thérapeutiques qui pourraient être transférées aux patients dans l’avenir.

Réduction

Pour l’étude transcriptomique (étude des voies cellulaires), nous prévoyons d’utiliser 6 souris par groupe (souris malades et souris saines), et pour les approches thérapeutiques un nombre de 8 par groupe pour la thérapie génique et la thérapie pharmacologique. Ces nombres ont été calculés pour s’assurer que l’étude soit statistiquement et scientifiquement valable, et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées chez les mêmes souris lors des traitements par approche génique ou pharmacologie, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, dans des cages ventilées et enrichies (barreaux à ronger, matériel de nidification), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera vérifié quotidiennement afin de détecter des signes des souffrance à l’aide d’une grille de suivi adaptée. Cette grille de score prend en compte les points des catégories suivants : 1) L'aspect général de l'animal (hérissement des poils, yeux clos, flancs creusés, perte de poids …) : 2) Le comportement / la mobilité́ de l'animal (mobilité́, prostration, dos voûté, isolement par rapport aux autres animaux). Ce suivi sera réalisé de manière journalière sur toute souris traitée par approche thérapeutique et sur les souris CNM non traitées à partir du sevrage et jusqu’à la mise à mort pour expérimentation.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et courant dans le domaine des myopathies. Son système musculaire est bien étudié et de nombreuses techniques d’analyse sont établies afin de mener à bien les analyses. La dissection des muscles pour les études transcriptomiques se fera à l’âge de 7 semaines afin de pouvoir analyser la régulation des gènes musculaires et de comparer les données avec d’autres résultats obtenus préalablement sur d’autres modèles souris de la maladie au même âge. Pour évaluer l’efficacité des approches thérapeutiques géniques (molécules) et pharmacologiques (composés chimiques), nous allons traiter les souris avant et après l’apparition des signes de la maladie, soit à 4 et à 8 semaines.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent 29 gavages sur 22 semaines, un régime riche en graisse, un produit irritant ajouté à l'eau de boisson pour accentuer une colite et plusieurs prélèvements sanguins, pour tester une association de bactéries, d'extraits de plante et d'activité physique censée réduire l'inflammation intestinale. Les retombées annoncées pour les patients atteints de la maladie de Crohn, une thérapie personnalisée modulant le microbiote, sont renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de valider le cocktail à l'échelle d'un "organisme entier" et que l'ajout de l'activité physique impose de recourir à la souris.

Objectifs

Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin. En effet, dans de nombreuses pathologies, certaines populations de bactéries ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Dans la maladie de Crohn, il a été observé une quantité anormale de bactéries aux propriétés adhérentes et invasives au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients. Une fois attachées à la muqueuse iléale, ces bactéries adhérentes et invasives peuvent traverser la muqueuse et déclencher ou aggraver l’inflammation intestinale. Chez l’animal, ces bactéries adhérentes et invasives sont capables d’aggraver une inflammation intestinale déjà existante et elles sont également capables de coloniser l’intestin et d’induire une inflammation intestinale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour guérir définitivement la maladie de Crohn, les traitements actuels visent à contrôler les poussées inflammatoires sans cibler les causes de l’inflammation. Ce projet a pour but de tester l’efficacité d’une stratégie ciblant le microbiote, et plus précisément les bactéries adhérentes et invasives, afin de limiter leur présence et ainsi, diminuer une des origines de l’inflammation intestinale. Lors du projet, une combinaison de bactéries dites « bénéfiques » et d’extraits de plante, préalablement sélectionnée in vitro pour leurs propriétés à lutter contre les bactéries adhérentes et invasives, sera administrée à des souris, en plus d’une activité physique. L’efficacité de ce traitement à éliminer les bactéries agressives présentes dans le microbiote digestif des animaux et à restaurer un microbiote « sain » dans le but de diminuer les symptômes inflammatoires sera évaluée.

Bénéfices attendus

Les investigations chez l’animal permettront de compléter les résultats des analyses in vitro obtenus avec la combinaison bactéries/extraits de plante à l’échelle d’un organisme entier, en prenant en considération l’environnement du tractus digestif, le microbiote intestinal et le système immunitaire. A court terme, les bénéfices attendus de ce projet sont d'éliminer spécifiquement les bactéries adhérentes et invasives de l’intestin afin de diminuer les symptômes inflammatoires. Plus largement, le bénéfice attendu est de restaurer un microbiote intestinal global « sain » et ainsi, de protéger et renforcer la muqueuse intestinale. A moyen terme, ce projet permettra de comprendre l’importance de combiner ou non un traitement de type « probiotique » avec une activité physique. A plus long terme, cette investigation permettra de mieux prendre charge les patients atteints de maladie de Crohn en fonction de la composition de leur microbiote intestinal en leur proposant une thérapie personnalisée modulant le microbiote qui inclura une alimentation adaptée, une activité physique, et une prise de probiotiques et d’extraits de plante.

Procédures

-Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront par voie orale (gavage) 1/le cocktail de bactéries-extraits de plante (26 administrations réparties sur 6 semaines), les bactéries adhérentes et invasives (1 administration) et le traceur fluorescent pour suivre la perméabilité intestinale (2 administrations), soit 29 gavages/animal sur la totalité du protocole de 22 semaines. -Les animaux auront 2 prélèvements sanguins en cours de protocole (en semaines 18 et 21). Ce prélèvement sera réalisé sur animal endormi sous anesthésie gazeuse. Un dernier prélèvement sera réalisé sur animal anesthésié sans réveil. - Les propriétés contractiles (force maximale isométrique et puissance maximale concentrique) des muscles fléchisseurs plantaires seront évaluées une fois sous anesthésie à l’isoflurane. Les contractions musculaires seront évoquées électriquement à l’aide d’électrodes de surface (technique non invasive).

Impact sur les animaux

L’administration d’un régime alimentaire riche en graisse va induire une prise de poids accompagnée d’une légère inflammation intestinale. En fin de protocole, les animaux vont recevoir dans l’eau de boisson une faible dose d’un produit irritant qui peut accentuer les symptômes de colite. L'activité physique va permettre de diminuer la prise de poids des animaux placés sous régime riche en graisse. Le projet impose que les animaux soient placés un par cage, de réaliser des gestes de gavage et des prélèvements de fèces et de sang, ce qui peut induire un stress chez l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés lors de la procédures (72 animaux) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il est nécessaire de prélever un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques (signes de colite), des analyses de microbiote fécal, ou des paramètres inflammatoires déterminés suite à des dosages dans les fèces des animaux.

Remplacement

Avant de réaliser l’essai chez l’animal, le cocktail de bactéries/extraits de plante a été finement analysé in vitro, sur des modèles de cellules en culture (cellules épithéliales intestinales humaines et cellules immunitaires) afin de sélectionner la meilleure combinaison pour lutter contre les bactéries adhérentes et invasives retrouvées chez les patients atteints de maladie de Crohn. Cependant, il est nécessaire de valider l’efficacité de ce cocktail à l’échelle d’un organisme entier, afin de prendre en compte l’effet du passage digestif (pH acide de l’estomac, sels biliaires…) et la présence du système immunitaire et du microbiote intestinal. Mais surtout dans ce protocole, nous voulons savoir si l’activité physique peut augmenter l’effet bénéfique du cocktail, ce qui impose de passer chez l’animal.

Réduction

-Le nombre d'animaux a été réduit dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Le nombre de 8 animaux/lot devrait permettre de réaliser des tests statistiques adaptés d’après l’ensemble des données animales antérieures. -Le fait de réaliser la procédure en 2 temps permet d’intégrer un ‘go/no go’ dans la procédure : le protocole sera mené sur 24 des 72 animaux avec des lots justement pensés, permettant de juger si le modèle reflète suffisamment les symptômes de la maladie de Crohn (inflammation intestinale de bas grade et déséquilibre du microbiote intestinale). Si celui-ci est le reflet de la maladie, alors l’étude sera poursuivie sur le second groupe d’animaux. -Les études antérieures ont montré que le nombre de bactéries adhérentes et invasives dans les fèces des animaux était le reflet du nombre de bactéries associées à la muqueuse. Cette mesure permet de réaliser un suivi de colonisation en fonction du temps de façon non invasive et sans douleur pour l’animal. La quantification des bactéries dans les fèces en fonction du temps permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début de la procédure (une semaine). Les animaux auront libre accès à l'eau et la nourriture. Les animaux seront disposés dans des cages de 1500 cm² en IVC (individually ventilated cages) afin de pouvoir y placer une roue d’activité connectée. L’environnement sera donc enrichi avec plusieurs types d’enrichissements : lamelles de cartons compressées et maisonnettes ou tremplins avec abris. Lors de la phase 2 du projet, les lots sédentaires seront placés sur un portoir à distance des groupes avec activité physique afin de diminuer les potentiels effets délétères du bruit que peuvent produire les roues. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement à base de buprénorphine (0,05mg/kg en sous-cutanée) pour réduire leur douleur. Des critères d’arrêt ont été déterminés. Si un animal rempli ces 3 critères lors du protocole (points limites) : 1/perte de poids corporel > à 15% par rapport au début de l’étude 2/modification de l’activité (hypoactivité importante ou prostration ou spasmes abdominaux ou réticence à se déplacer) ou de la posture (dos vouté, décubitus ventral ou latéral) ou de la respiration (pénible ou rapide avec effort) 3/signes cliniques d’inflammation intestinale (arrière train ou anus souillés avec diarrhée et/ou présence de sang dans les fèces ou au niveau de l’anus) -->il sera immédiatement sorti du protocole, anesthésié à l’isoflurane (2,5%) et mis à mort par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris C57BL/6 qui est un modèle employé régulièrement pour étudier l’activité physique spontanée sur roue. C’est également un modèle de choix pour la réalisation d’un modèle de colite induite par un produit chimique placé dans l’eau de boisson. L’ensemble des souris utilisées lors de ce projet seront utilisées au stade de jeune adulte, (6-8 semaines) reflétant le pic d’incidence de la maladie de Crohn (15-30 ans).

1 140 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis données à des familles pour poursuivre leur vie en basse-cour. L'expérimentation consiste à les peser, à peser leurs aliments et à récupérer leurs fientes pour mesurer la digestibilité des rations, le porteur jugeant "peu probable" tout effet indésirable au-delà d'une moindre consommation ou d'une baisse de ponte. L'objectif affiché sert la filière de production d'œufs, cadré autour des "performances technico-économiques". Le porteur indique tester d'abord les aliments par simulation informatique et in vitro, ne retenant in vivo que les formulations jugées intéressantes.

Objectifs

La production mondiale œuf dans le monde est en constante augmentation. La France en est le 1er pays producteur d’œufs, avec 15,7 milliards (Md) d’œufs produits en 2020, soit +4,9% par rapport à 2019. Ainsi, la filière est toujours à la recherche d’une amélioration des performances technico-économiques en élevage de production. Ceci va principalement passer par l’alimentation des poules. En effet, pour leur métabolisme, les cellules de l’organisme utilisent des nutriments apportés par l’alimentation et des métabolites issus de la mobilisation des réserves corporelles. La digestion des aliments et l’absorption des produits de la digestion sont indispensables pour transformer les aliments ingérés en nutriments assimilables par les volailles. Dans ce contexte, il est indispensable de connaitre de façon précise la digestibilité de chaque aliment apporté à la poule. Celle-ci se caractérise par la formule suivante : (Quantité ingérée – Quantité excrétée dans les fécès) / Quantité ingérée. Elle permet de calculer le coefficient d’utilisation digestive (exprimé en pourcentage de la digestibilité apparente). Pour obtenir ses valeurs il faut donc 1) peser les quantités mangées par l’animal et 2) récupérer les fientes des animaux. Le but de ce projet est de mesurer à une échelle imitant les conditions et la durée d’élevage la digestibilité des aliments donnés aux poules afin d’optimiser les recommandations alimentaires, de chercher de nouvelles matières premières et vérifier l’impact de ces aliments sur la qualité physique et organoleptique de l’œuf. En pratique 1 140 poules de race Dekalb White seront utilisées pour ce projet (1 essai par an pendant les 5 années du projet).

Bénéfices attendus

A l’issue de ce projet, nous souhaitons mettre à jour les valeurs nutritionnelles des aliments pour poules pondeuses (en terme de valeurs énergétiques, protéiques, lipidiques, cellulosiques, vitaminiques et minérales principalement) pour améliorer leur bien-être (digestif notamment), et leurs performances.

Procédures

Les mesures prévues sont les suivantes : 1/ Pesée des animaux par case (n=19 animaux) le jour de leur arrivée, puis tous les 15 jours, jusqu’à la fin de l'essai. 2/ Pesée des aliments consommés chaque semaine par case (n=12). 3/ Ces données permettront d’établir pour chaque case le poids moyen des poules, le gain moyen quotidien et l’indice de consommation. Les éventuelles mortes seront ramassées chaque jour et pesées individuellement. Elles seront prises en compte dans le calcul des indices. 4/ Les fécès seront récupérés chaque semaine par parc (plaque sous les grillages) et analysés en laboratoire pour composition chimique.

Impact sur les animaux

Compte-tenu des aliments testés (le but étant d’optimiser les performances et maximiser le bien-être), il est peu probable que des nuisances ou effets indésirables soient observés. Les seuls critères imaginés pourraient être une moindre consommation d’aliment, une moindre prise de poids et un moindre taux de ponte. Il faut souligner que la surveillance des animaux se déroulera de manière très rapprochée puisque des prélèvements sont prévus toutes les semaines et une surveillance quotidienne sera faite par l’animalier.

Devenir

Tous les animaux seront adoptés par des familles pour continuer leur vie de poule pondeuse de basse cour à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Avant de tester un aliment sur poule, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poules nous travaillons avec des modèles in vitro (analyses en laboratoire) permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés in vivo, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux.

Réduction

Nous utilisons au total 1140 poules pour ce projet (1 essai par an pendant les 5 années du projet). L'utilisation d'animaux homogènes sur les plans biologiques et sanitaire, nous permet de réduire la variabilité d'un individu à l'autre et donc d’obtenir un nombre minimum d’individus par lot. Le nombre d’animaux a été validé par un test de puissance statistique (réalisé sur le logiciel R) et permettra une interprétation statistique des résultats.

Raffinement

Chaque parc dispose d’enrichissements pour les poules (perchoirs, jouets, miroirs) afin de répondre à leurs besoins naturels et de les stimuler. De plus, les poules ne sont pas isolées dans les parcs et sont plusieurs par parc afin de combler leur instinct grégaire.

Choix des espèces

La poule pondeuse (Gallus gallus) est l’espèce utilisée pour produire des œufs de consommation alimentaire. Les poules utilisées auront de 18 à 70 semaines d’âge, soit la durée classique d’élevage d’une poule pondeuse standard.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie d'implantation d'électrodes sous anesthésie, puis des stimulations cérébrales répétées sur animal éveillé et jusqu'à dix injections de molécules sur cinq à dix semaines, avec des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de mettre au point des marqueurs de l'activité électrique du cerveau transposables entre la souris et l'humain pour l'optimisation de médicaments. Le porteur justifie le recours à l'animal par des "mécanismes physiopathologiques complexes" que des modèles cellulaires ou informatiques ne représenteraient pas.

Objectifs

L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des marqueurs biologiques des pathologies et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel translationnel de cette méthode et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales spontanées et évoquées chez des animaux contrôles.

Bénéfices attendus

L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite de développer des marqueurs et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ces marqueurs doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris. Nous cherchons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur ces animaux. Ces marqueurs biologiques applicables chez l’humain et le rongeur nous permettrons également de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des stimulations cérébrales répétées de faible intensité qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Chaque session de stimulation durera entre 3 et 20 minutes au maximum. Au préalable de chacune de ces stimulations, une molécule pharmacologique pourra être administrée à l'ensemble des animaux. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés, tous les animaux du projet sont susceptibles d'étre soumis à ces prélèvements. Pour ces tests pharmacologiques, un maximum de 10 injections sur une période de 5 à 10 semaines par plan d’étude sera réalisé.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagères pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l’intensité faible utilisée, une réaction comportementale (immobilité, sursaut, clignement des yeux) pourra être induite dans de rares cas, notamment si l’implantation des électrodes est défectueuse. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel).

Réduction

Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal est son propre contrôle et sera utilisé pour tester différents candidats médicaments, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.

Raffinement

Les souris qui entrent dans cette procédure ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d'analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement (coton, maison en carton) pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques spontanées et évoquées. Ces similarités peuvent être utilisées pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de minimum 9 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures.

170 rats et 6 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les uns et les autres reçoivent une injection de vecteurs de thérapie génique sous la rétine des deux yeux, puis subissent des séries d'imageries et de tests rétiniens sous anesthésie, répétés jusqu'à quinze fois chez les macaques, ainsi que des prélèvements sanguins. L'objectif déclaré est de tester l'efficacité d'un traitement de la maladie de Stargardt chez les rats et sa toxicité chez les macaques, que le porteur juge indétectable chez les rongeurs. Il présente la rétine comme non reconstituable in vitro et retient le macaque pour son œil proche de celui de l'humain.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Injection intramusculaire d'un traitement immunosuppresseur: Geste réalisé sur animaux vigiles (sous contention dans leur cage), pour les macaques une fois avant l'injection du vecteur, puis une fois par semaine pendant les 5 semaines suivant l'injection du vecteur. (v) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 10 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide après les chirurgies car les animaux seront sous anesthésie gazeuse.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Ce nombre basé sur celui de nos précédentes études, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 2 animaux par groupe, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voire de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

2 476 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée par injection, puis elles reçoivent jusqu'à quatre vaccins ARN administrés dans le poumon sous anesthésie et subissent des séances répétées de tomographie et des prélèvements sanguins. Le porteur affirme sortir les animaux de l'expérimentation avant que les tumeurs n'atteignent leur physiologie, si bien qu'aucune modification du comportement ne serait détectable. Il présente comme espoir de "soigner un nombre important de patients" et revendique l'impossibilité de tester cette preuve de concept ailleurs que sur un système vivant complet.

Objectifs

Les vaccins à ARN messager ont permis de juguler la mortalité liée au SARS-COV2 dans les pays développés. Ces technologies basées sur les ARN ont permis pour la première fois de produire un vaccin efficace en un temps extrêmement court. Cette adaptabilité des technologies ARN les rend très attractives pour la lutte contre le cancer. Ce projet a pour objectif à court terme de prouver qu’il est possible d’induire une réponse immunitaire anti-tumorale spécifique dans le cancer du poumon en utilisant une nouvelle approche vaccinale. Notre stratégie expérimentale doit donc permettre de : 1) Fournir la preuve de concept qu’il est possible de soigner le cancer du poumon en utilisant une stratégie de vaccin ARN. 2) Caractériser précisément les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cette nouvelle stratégie vaccinale pourrait fonctionner de façon optimale.

Bénéfices attendus

Par le développement de cette nouvelle technologie vaccinale, nous pensons être en mesure de soigner un nombre important de patients pour lesquels il n’existe pas de traitement efficaces sur le long terme à ce jour. Ces investigations réalisées chez la souris seront une pierre angulaire dans l’implémentation d’un vaste projet impliquant 7 équipes en Europe et visant à aboutir sur la validation d’une nouvelle stratégie vaccinale. En somme, si comme nous l’espérons, nous fournissons par ce projet la preuve que notre nouvelle formulation vaccinale peut permettre de lutter plus efficacement contre le cancer du poumon, nous serons en mesure de proposer cette technologie aux patients dans un temps très court.

Procédures

La transplantation des lignées tumorales sera effectuée par injection intraveineuses (une fois sur chaque animaux) ou sous-cutanée (une fois par animal). Cette injection nécessite une contention des souris de deux minutes maximum. Une petite proportion des animaux subira un prélèvement de sang par incision de la veine caudale. Ce geste ne sera répété qu’une fois avec un intervalle de deux semaines. Cela nécessite de placer les animaux sous une lampe chauffante durant 5 minute puis une contention de deux minute. La majorité des animaux subiront des tomographies (technique d’imagerie non invasive) permettant de suivre l’évolution de la croissance tumorale nécessitant une anesthésie gazeuse qui aura lieu à une fréquence d’une fois toutes les deux semaines et sera répétée 6 fois maximum. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement. L’administration dans le poumon de notre vaccin sera réalisée sans chirurgie mais demande une anesthésie des animaux. Pour réduire le nombre de d’anesthésies, nous combinerons la vaccination avec la tomographie. Il y aura un maximum de 4 vaccinations par animal espacées de deux semaines. Les animaux seront anesthésiés par le gaz durant 15minutes maximum puis placés dans une cage de réveil pendant au moins une heure avant de retourner dans leur cage d’hébergement.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables pour les animaux sont : - L’initiation et le développement du cancer du poumon. Nous avons adapté nos protocoles et mis en place des techniques de suivi des animaux de sorte que nous considèrerons les animaux seront sortis de l’expérimentation avant que la croissance des tumeurs ne cause une atteinte significative à leur physiologie. Suivant nos procédures, aucune modification du comportement des animaux ni de leur performance physique n’est détectable en lien avec le développement de la maladie car nous arrêtons les protocoles à un stade suffisamment précoce du développement de la maladie. - Une infection au site d’injection ou de prélèvement de sang - Les anesthésies répétées

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour les besoins expérimentaux nécessitant l’accès aux sang, rates, ganglions et au poumons.

Remplacement

Nous développons une approche vaccinale qui a pour objectif de changer les interactions en le l’hôte et la tumeur par le développement d’une réponse immunitaire anti-tumorale. La preuve de concept de notre stratégie ne pourrait donc être réalisée en système in vitro ou par simulation informatique car elle doit être intégrée dans un système physiopathologique complet. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les différentes formulations de vaccins ont été ou sont en cours d’évaluation in vitro. A ce jour nous avons validé 13 formulations et continuons d’en identifier d’autres. Pour des raisons de éthiques et de faisabilité, nous ne dépasserons pas ce nombre de formulation différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 2476 souris sur 5 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos vaccins. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer des tests statistiques relevant pour définir la significativité de nos résultats. Pour réduire le nombre d’animaux, notre projet est conçu de sorte à ce que les premières étapes de validation permettent de réduire le nombre de conditions possibles par l’optimisation des modèles et la sélection d’une seule formulation de vaccin à partir de 13 candidats validés in vitro. Enfin ce projet a pour but de fournir une preuve de concept dans un modèle préclinique justifiant le transfert de notre technologie chez les patients. Hors comme l’utilisation de ce modèle nécessite un parcours expérimental de 6 mois avec les animaux génétiquement modifiés, nous avons défini une construction de notre projet qui repose sur des étapes de validation de nos candidats vaccin sur des temps cours en privilégiant des procédures ne nécessitant pas d’intervention lourde sur les animaux. Ainsi, même si réduit au maximum le nombre d’animaux reste élevé, nous travaillerons à l’optimisation de l’utilisation de chaque animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage) en milieux enrichis, la durée d’hébergement des animaux est réduite au minimum. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress et d’agressivité. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique, mise en place par la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être envisagée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation. Néanmoins, un arbre décisionnel basé sur le poids, la prostration, la détection de difficulté respiratoire, l’agressivité et l’isolement décidera de l’arrêt de toute expérimentation de l’utilisation d’analgésique voir de la mise à mort des animaux. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé dans notre étude est le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets vaccinaux sur le long-terme. Ces souris immunocompétentes sont greffées avec des tumeurs murines de même fond génétique. Les souris que nous utilisons offrent à ce jour le meilleur modèle de cancer du poumon autochtone pour adresser les questions biologiques que nous développons ainsi que pour fournir la preuve de concept de l'efficacité de notre nouvelle thérapie. En effet, dans ce modèle, le développement tumoral à lieux dans des individus présentant un système immunitaire intacte mimant parfaitement la maladie humane, non seulement d’un point de vue immunitaire mais aussi au regard des mutations conduisant à l’apparition des tumeurs.