Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Immunothérapie par combinaison d’anticorps pour le traitement des cancers du foie par modèle cellulaire orthotopique
- Recherche appliquée
- Cancers
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie pour induire une tumeur du foie, des injections d'un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des mesures de tumeur par imagerie, la tumeur pouvant provoquer gêne et douleurs. Le projet cherche à confirmer qu'un anticorps déjà développé freine le cancer du foie et l'associe à des immunothérapies existantes. Le porteur affirme qu'une "validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier" reste nécessaire avant tout passage chez l'humain.
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 20 minutes. Une fois par semaine, les animaux recevront une injection d’un composé permettant de mesurer la taille des tumeurs sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Puis les animaux seront anesthésiés afin de réaliser la mesure, qui dure au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer de l’inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps par le biais d'une étude pilote sur une petite cohorte d'animaux afin de choisir la dose la plus éfficace. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton et de la frisure de kraft pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte à partir de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur des myosines rapides dans la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme sévère de dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent par voie orale un inhibiteur des myosines rapides, subissent des prises de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie et des tests d'agrippement, avant d'être tués pour analyses des muscles. Le porteur affirme tester un modèle qui "mime fidèlement" la maladie de l'enfant et renvoie le bénéfice thérapeutique au "long terme". Il conclut que la question ne peut être obtenue que chez "l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. En l'absence de la protéine dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité de réparation du muscle. L'objectif de notre étude est de stopper la progression de la maladie à l'aide de nouvelles molécules qui réduisent la mort des fibres musculaires. L'efficacité d’un composé similaire a déjà été démontrée sur un modèle de souris DMD, cependant moins sévères que notre modèle de rat. Ce projet permettra de valider chez le rat l'efficacité de trois nouveaux composés dans une situation qui ressemble beaucoup à celles des enfants atteints de DMD.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de tester des composés innovants qui via un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, améliore la survie de l'ensemble des muscles et réduisent la douleur de l'inflammation causée par la disparition massive des fibres. Ces composés permettront sur le long terme d'accélérer la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Le traitement sera administré une seule fois par voie orale afin de maîtriser la dose administrée. Le geste dure 15 secondes. Le sang des animaux (1,7 ml au total) sera prélevé en deux fois au sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie générale légère et locale. Le prélèvement dure 30 secondes, l'anesthésie complète environ 20 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Il a été montré que les produits administrés ne sont pas toxiques jusqu’à une inhibition de 50% de l’activité des fibres musculaires rapides (qui confère leur protection contre la mort). Le dosage utilisé, inférieur, sera limité à 15% d’inhibition, ce qui garantit l‘absence de toxicité. La procédure de ce projet inclut des animaux de 4-5 semaines chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne gênent l'exécution d'aucune de leurs tâches quotidiennes. Ils se déplacent, mangent, boivent, se toilettent et jouent comme leurs frères de portée non atteints par la maladie. L'administration du traitement par gavage utilisera une sonde plastique souple à bout arrondi qui supprime les perforations possibles de l'oesophage avec l'usage d'anciennes sondes métalliques. La contention pour ce geste, les prises de sang et le test d'agrippement est réalisée délicatement, ce qui élimine la réponse de stress de l'animal. Un effet indésirable du test d'agrippement est la cassure d'une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions avant le test leur longueur et les raccourcissons si besoin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et réduisent la contraction des fibres musculaires rapides. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle dans le modèle sévère de la maladie (le rat que nous utiliserons) de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable des lésions musculaires délétère à l’échelle histologique.
Réduction
Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur ce modèle de rats DMD. Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence. Les molécules ont par ailleurs déjà été testées sur des rats sauvages.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle de chien DMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge de 4 à 5 semaines. Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 4-5 semaines permettra d’évaluer la capacité des composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée.
Toxicité d’aérosols de type « mélanges gaz/particules » d’intérêt défense : cas des résidus de combustions issus de propergols solides composites
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
782 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils sont exposés par inhalation "nez seul" pendant quatre heures à du chlorure d'hydrogène et des particules d'alumine, subissent aspirations oropharyngées, instillations intratrachéales, gavages, jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang, des tests d'anxiété et de mémoire, une trachéotomie puis une perfusion intracardiaque. Le projet vise à définir des valeurs limites d'exposition pour les personnels du Ministère des Armées et du secteur aérospatial soumis aux résidus de combustion des missiles. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" et que les études in vivo sont "indispensables", ne retenant que des mâles au motif qu'aucune donnée féminine n'est disponible.
Objectifs
Avec l’émergence de nouveaux systèmes d’armes, le cumul des expositions des personnels du Ministère des Armées devient de plus en plus complexe, et ces derniers peuvent de fait être exposés à des mélanges de polluants au cours de leur carrière. C’est notamment le cas lors de l’utilisation de propulseurs tels que les propergols solides composites nécessaires à la mise à feu rapide de missiles où les personnels peuvent être exposés simultanément à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines par inhalation. Seule une étude sur les effets de ce type d’exposition a montré des phénomènes d’inflammation pulmonaires et systémiques précoces. L’objectif de ce projet est de poursuivre cette évaluation, en déterminant notamment si l’inflammation observée à court terme est persistante et si ces expositions impliquent d’autres types d’effets. Les résultats de ce projet devraient permettre de contribuer à définir des valeurs seuils chez les travailleurs du Ministère des Armées et du secteur aérospatial (valeurs limites d’exposition professionnelles) susceptibles d’être exposés à ce type de substances dans leur environnement professionnel, d’établir de nouvelles recommandations et d’identifier des biomarqueurs à analyser pour un meilleur suivi médical (examens pulmonaires, prises de sang, tests cognitifs, etc.).
Bénéfices attendus
Les études réalisées dans le cadre de ce projet permettront : - De déterminer les effets à long terme de l’exposition aiguë et subaiguë à des mélanges de chlorure d’hydrogène et de particules d’alumine (fibrose pulmonaire, atteintes cognitives, pathologies neurodégénératives, génotoxicité, etc.) ; - D’obtenir des informations sur les mécanismes d’action toxiques induits par ce type d’exposition ; - De comparer les données in et ex vivo obtenues à des données d’études in vitro réalisées en parallèle, et de définir si les modèles in vitro testés permettent une bonne prédictivité de la toxicité de ces substances/mélanges ; - De fournir des données contribuant à l’établissement de valeurs limites d’exposition professionnelles et de préconisations pour le suivi des personnels du Ministère des Armées par la médecine de prévention.
Procédures
Identification (moins de 5 min) : 1 fois ; anesthésie, perçage d’une oreille à l’aide d’une pince et tatouage en utilisant une encre dédiée (animaux stabulés plus d’un 1 mois). Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Aspiration oropharyngée (moins de 10 min/exposition) : 5 aspirations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par aspiration oropharyngée. Instillation intratrachéale (moins de 10 min/exposition) : 5 instillations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par instillation intratrachéale. Exposition par inhalation en mode "nez seul" : 1, 4 (1 exposition/jour/4 jours consécutifs) ou entre 16 et 24 expositions (1 exposition/semaine/4 à 6 mois) ; habituation à la contention des tubes d’exposition (stabulation dans les tubes jusqu’à 30 min/jour/3 jours consécutifs), exposition aux substances/mélanges d’essai (4h/exposition). Gavage (moins de 3 min/administration) : 1 à 3 gavages (jour 1, jour 1+24h et jour 1+45h) ; contention manuelle des animaux vigiles, gavage avec la solution d’essai. Prélèvements de sang (moins de 5 min/prélèvement) : 1 à 25 prélèvements (2 prélèvements/semaine/12 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations et prélèvement d’une goutte de sang. Comportement (15 min à 1h15/évaluation suivant les tests) : 3 ou 4 fois (1, 3, 6 et pour certains animaux 12 mois après la dernière exposition) ; placement des animaux vigiles dans des dispositifs de mesure de l’activité, de l’anxiété et des capacités de mémorisation, et enregistrement de leurs déplacements. Pléthysmographie (moins de 1h15/évaluation) : 2 à 48 fois (1 évaluation/semaine ou par mois/2 semaines à 12 mois) ; placement des animaux vigiles dans des enceintes de pléthysmographie corps entier et enregistrement de paramètres respiratoires. Mécanique pulmonaire (moins de 45 min) : 1 fois préalablement à la fin de l’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, acte chirurgical (trachéotomie), administration d’un myorelaxant et mesure de la mécanique pulmonaire. Perfusion intracardiaque/exsanguination (moins de 45 min) : 1 fois en fin d’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, actes chirurgicaux (laparotomie et thoracotomie) et perfusion avec du tampon phosphate salin.
Impact sur les animaux
Tatouage : stress lié à l’anesthésie ; Aspiration o.p. : stress lié à l’anesthésie ; Instillation i.t. : stress lié à l’anesthésie ; Exposition par inhalation en mode "nez seul" : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Gavage : stress lié au gavage et à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Prélèvements de sang : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Analyse comportementale/pléthysmographie : Stress lié à la manipulation et au placement dans les dispositifs de test, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront notamment les expositions/administrations des substances/mélanges d’essai. Les expositions/administrations de substances/mélanges d’essai pourront également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps de fin d'étude définis en fonction des analyses ex vivo prévues selon une méthode autorisée chez le rat.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité aiguë et subaiguë de l’exposition par inhalation à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines, seuls et en mélange, notamment des effets cliniques, pulmonaires, cognitifs et systémiques immédiats, et à court et à long terme. Les études in vivo sont pour cette évaluation indispensables. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires d’utilisation du rat, de souche couramment utilisée en laboratoire, au stade jeune adulte au moment de l’exposition aux substances/mélanges d’essai et de mâles. L’âge et le sexe des animaux utilisé a été défini comme étant représentatifs de la population humaine cible de ce projet. Seuls des mâles seront utilisés car il n’est pas attendu de variations significatives entre les deux sexes concernant les paramètres qui seront analysés, que le sexe n’est pas un facteur d’intérêt dans ce projet et que des données étant actuellement uniquement disponibles chez des mâles, seule l’étude de ce sexe sera pertinente pour la confrontation des données.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point et valider un protocole de développement de fibrose pulmonaire, un protocole d’induction de génotoxicité et évaluer la toxicité de l’exposition aux substances/mélanges d’essai chez le rat. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur l’induction de ces modèles pathologiques et par rapport aux paramètres in vivo (fonctions respiratoires, mécanique pulmonaire, fonctions cognitives) et ex vivo (biodistribution de l’alumine, marqueurs histologiques et biochimiques de toxicité et de génotoxicité) qui seront étudiés pour permettre une analyse statistique robuste et une extrapolation inter-espèces pertinente des résultats. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux substances/mélanges d’essai. De plus, plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront adaptées aux rats et enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par groupe expérimental (2 ou 3 animaux par cage) pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Pour les animaux exposés par inhalation « nez seul », des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec ces objets et de se cacher. Préalablement à la 1ère exposition, ces animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque phase d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués (manipulation précautionneuse, surveillance continue, posologie adaptée, etc.), des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur (perte de poids, lésion, comportement anormal, etc.) et des actions correctives visant à soulager les animaux (surveillance accrue, traitements médicamenteux, etc.) ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires, d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire. Des animaux jeunes adultes (âgés de 6 semaines au moment de la 1ère exposition) seront utilisés. L’âge des animaux au cours de l’étude (jeunes adultes/adultes étudiés durant au maximum 12 mois) sera ainsi représentatif des scénarios d’exposition réalistes étudiés.
Recherche du dopage génétique, administration de transgènes dans le cadre du contrôle antidopage des chevaux
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
6 chevaux vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection sous-cutanée ou intramusculaire de plasmides porteurs de transgènes "de la performance", puis subissent des prélèvements de sang à la jugulaire jusqu'à trente fois par mois et des prélèvements d'urine, pour vérifier qu'une méthode de détection du dopage génétique fonctionne. Le porteur indique que les chevaux sont gardés jusqu'à quinze ans sauf retraite anticipée décidée par le vétérinaire. Il affirme que l'étude ne peut se faire que sur l'espèce cible, le cheval, et qu'il n'existe "pas d'alternatives non animales" pour ce contrôle antidopage.
Objectifs
Ce projet est justifié par la mise en œuvre de nouveaux contrôles réglementaires recommandés par l'International Federation of Horseracing Authorities pour répondre à la menace du dopage génétique. Le dopage génétique est défini comme « l’utilisation d’acides nucléiques, d’analogues d’acides nucléiques ou de toutes substances qui pourraient modifier les séquences génomiques et/ou altérer l’expression génique par tout mécanisme. Ceci inclut le transfert de gènes, mais également l’utilisation de cellules normales ou génétiquement modifiées » dont l’utilisation pourrait permettre l’amélioration des performances athlétiques des chevaux en ciblant des gènes dit « de la performance ». Au regard du code des courses ou des articles 6A ou 6B de la Fédération Internationale des Courses hippiques, la détection de l’administration des gènes de la performance est toujours une priorité absolue. L’amplification PCR est l’une des techniques de choix de détection appliquée à la détection de transgènes circulants potentiellement utilisés à des fins de dopage. L’objectif de ce projet est de vérifier que la méthode de détection développée par le laboratoire est satisfaisante pour détecter, dans les fluides biologiques, l’administration de vecteurs plasmidiques contenant des transgènes liés à la performance physique chez le cheval à la suite d’un protocole d’administration (voie parentérale : Intramusculaire ou sous-cutanée.
Bénéfices attendus
Ce projet doit contribuer à répondre à la menace du dopage génétique par la mise en place d’une technique de contrôle adapté.
Procédures
La procédure consiste en une administration unique par voie sous cutanée ou intra-musculaire et des prélèvements sanguins et urinaires avant et après l’administration. Nombre de prélèvements sanguins et urinairesde 30/mois au maximum pour le sang et de 15 /mois pour les urines. En ce qui concerne les prélèvements, le prélèvement sanguin se déroule en 3 étapes : - la désinfection de la zone de prélèvement par application d'une solution alcool modifiée à l'aide d'une compresse stérile imbibée pendant 10sec puis 2min d'attente. - introduction de l'aiguille 20G et prélèvement du sang 10 sec / tube - retrait de l'aiguille 20G et compression de la jugulaire 30 sec à l'aide d'une compresse. Le prélèvement urinaire se déroule en une seule étape, lorsque le cheval se met en position l'opérateur rentre dans le box, se place sur un des côtés et positionne un pot de récupération sous le jet d'urine. La durée du prélèvement d'urine dépend de la durée de la miction (d'environ 30 sec en moyenne). La durée d'administration dans le cas de ce projet (administration en sc ou en IM) est de quelques secondes après désinfection au niveau de l’encolure.
Impact sur les animaux
Les chevaux subissent des prises de sang par ponction de la veine jugulaire. Il est très rarement rencontré un risque d’infection au point de ponction.
Devenir
Tous les chevaux sont gardés généralement jusqu’à 15 ans en bonne santé sauf avis contraire du vétérinaire recommandant un départ en retraite anticipé. Décision prise par le vétérinaire
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée que chez l’animal vivant et sur l’espèce cible, le cheval pour obtenir des prélèvements comparables à des situations de dopage réelles. Il n’existe pas d’alternatives non animales utilisables pour ce projet. Il est nécessaire de disposer d’échantillons comparables à ceux prélevés dans le cadre du contrôle antidopage pour démontrer que la méthode développée correspond bien aux besoins et est applicable au contrôle antidopage et sera efficace.
Réduction
Le nombre d’animaux impliqués est réduit au minimum. Ces essais sont généralement conduits sur un cheval pour les études pilotes et trois chevaux pour les études destinées à suivre l’effet du transgène.
Raffinement
Les chevaux sont hébergés dans un établissement confortable. Ils sont quotidiennement surveillés et observés. Tout éventuel signe d’inconfort est noté et corrigé et est pris en compte afin d’optimiser les tests ultérieurs. Le bien-être de chaque cheval est une priorité quotidienne du personnel. Les chevaux subissent des prises de sang par ponction de la veine jugulaire. Les injections sont réalisées par un vétérinaire. Les prélèvements sont réalisés par un vétérinaire ou du personnel expérimenté soucieux d’éviter absolument tout risque d’infection lié aux injections et aux prélèvements.
Choix des espèces
Répondre aux exigences du contrôle anti-dopage des chevaux. Le cheval est l’unique espèce concernée. Les animaux utilisés sont des jeunes chevaux (à partir de 2 ou 3 ans) ou des chevaux adultes d’âges comparables à ceux des chevaux de compétitions.
Validation d’un modèle de leucémie évalué par bioluminescence chez la souris NSG, en vue de traitement par CAR-T cells innovants – EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à sévère. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent en intraveineuse des cellules leucémiques humaines et développent une leucémie suivie par imagerie, jusqu'à des signes tels que poils hérissés, perte de poids et début de paralysie des pattes. L'étude ne fait que valider un modèle de leucémie et déterminer la dose de cellules cancéreuses, avant de tester dans un autre projet des cellules CAR-VST issues de donneurs sains. Le porteur revendique un modèle murin "indispensable" pour toute étude préclinique de thérapie cellulaire des hémopathies malignes.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse par CAR-T cells permet de traiter la leucémie. Ces cellules sont conçues à partir des cellules du patient et sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité reste à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de cellules CAR-T à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST). L’une des particularités des VST est qu’elles persistent à long terme chez les patients, ce qui permettrait d’apporter un bénéfice majeur à la production de CAR-T. Après modification génétique, ces nouvelles cellules (CAR-VST) possèdent une double fonction : elles s'attaquent à la leucémie et ciblent également d'autres virus demeurant dans l'organisme après une infection. Ces cellules anti-virales spécialisées ont déjà montré des résultats prometteurs chez les patients, avec une capacité de persistance prolongée, offrant ainsi une alternative potentiellement plus efficace pour lutter contre la leucémie. Le modèle de souris que nous souhaitons utiliser pour prouver notre hypothèse est très bien décrit dans littérature. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette étude préliminaire aidera à déterminer la quantité de cellules cancéreuses nécessaires pour créer une leucémie chez les souris. Cela nous aidera à savoir quand injecter les traitements futurs contre le cancer, qu'ils soient classiques (CAR-T cells) ou nouveaux (CAR-VST). Dans le traitement des cancers du sang, les CAR-T cells ont montré leur efficacité à court terme chez les humains. Cependant, elles disparaissent rapidement, ce qui peut causer des rechutes chez les patients. En utilisant nos cellules anti-virales comme matière première pour créer les CAR-VST, nous pourrions améliorer leur capacité à rester actives plus longtemps et offrir une protection supplémentaire contre les virus chez les patients dont le système immunitaire est affaibli. Les résultats de cette étude préliminaire sont essentiels pour continuer à développer ce traitement innovant en vue de réaliser des tests sur des patients.
Procédures
- Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue (souris vigiles) - développement d’une leucémie sur quelques semaines - injections abdominales d’un produit d’imagerie et suivi régulier (sous anesthésie, durée 30 minutes) de la progression tumorale 1 fois par semaine pendant quatre semaines par imagerie Etablissement utilisateur 1 : -Une injection intraveineuse sur animal vigile des cellules leucémiques au jour 0 (1min) Etablissement utilisateur 2 : - Imagerie des souris par bioluminescence : contention et injection intrapéritonéale (IP) d’une substance permettant de tracer les cellules leucémiques (1min). - retour en cage hébergement pendant le temps où la substance agit (10min) - au bout de 5 min, induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (1min) - acquisition par bioluminescence (3min) avec possibilité de placer 5 souris dans l'appareil en même temps - arrêt de l’expérimentation au dernier jour (28e jour) ou lorsqu’un point limite est atteint et sacrifice des souris
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse n’est pas douloureuse – au pire elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront des signes cliniques tels des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des jambes. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie, suivi des anesthésiques. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur .
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider la fonctionnalité des cellules humaines anti-leucémiques, de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et le microenvironnement tumoral développé in vivo. Cette saisine permet de valider un modèle de leucémie chez la souris, ce qui nous permettra dans une deuxième saisine de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence. Ces informations sont cruciales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. La détermination des doses de cellules leucémiques à injecter chez la souris permettra de valider un modèle développant une tumeur identifiable sur plusieurs semaines.
Réduction
Nous utilisons le moins de souris possible pour obtenir des résultats statistiquement valables. Nous arrêterons les tests dès que nous verrons une grande différence entre les groupes, avec au moins 3 souris par groupe et au maximum 6.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec seulement 3 à 6 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, quelqu'un vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, un guide permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper la souffrance.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires et l’effet anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 10 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
DETERMINATION DES CONDITIONS DE CROISSANCE DE CELLULES CANCEREUSES IMPLANTEES PAR VOIE INTRAVEINEUSE CHEZ LA SOURIS IMMUNODEPRIMEE OU IMMUNOCOMPETENTE
- Recherche appliquée
- Cancers
2 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des cellules tumorales humaines ou murines pour reproduire des leucémies, des lymphomes ou des métastases sanguines, puis subissent des injections répétées, des prélèvements de sang à la veine saphène et des séances d'imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le projet ne teste aucun traitement, il cale les conditions de greffe comme la densité cellulaire et la souche en amont d'études pharmacologiques menées ailleurs. Le porteur affirme que la recherche d'efficacité chez l'animal reste "indispensable" et présente cette mise au point comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études futures.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste en la mise en place d’un modèle tumoral « orthotopique » ou « métastatique » chez la souris par injection de cellules tumorales (humaines ou murines) par voie intraveineuse (IV) dans le but de mimer des tumeurs hématologiques (leucémies, lymphomes,…) ou des métastases expérimentales en « court-circuitant » les premières étapes du phénomène métastatique pouvant provenir de tumeurs solides (migration dans la matrice extracellulaire, intravasation dans le vaisseau sanguin) pour ne mimer que la dissémination dans la circulation sanguine. La mise au point et la caractérisation de ce modèle se situe en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale, afin de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris, …), ainsi que la durée limite de l’étude sur laquelle nous pourrons réaliser les études pharmacologiques ultérieures. Ces études de mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Des cellules cancéreuses humaines ou murines vont être greffées par injection intraveineuse, chez des souris soit immunodéprimées (c’est-à-dire avec un système immunitaire déficient voire absent) pour permettre la greffe de tumeurs humaines, soit immunocompétentes (c’est-à-dire avec un système immunitaire parfaitement fonctionnel) pour permettre la greffe de tumeurs murines. Ce second modèle permettra l’évaluation de produits anti-cancéreux ayant recours au système immunitaire pour être actif et efficace (comme l’immunothérapie ou les thérapies ciblées). Ce projet décrit deux modalités de suivi de la dissémination tumorale au cours du temps ; la première, qui sera privilégiée, utilise l’imagerie optique, mais ne peut être mise en œuvre que selon la disponibilité de lignées tumorales génétiquement modifiées pour être bioluminescentes. La seconde se basera sur des analyses ex-vivo après prélèvement des tissus et organes des souris
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont la détermination des conditions optimales de greffe en intraveineuse (limitation de la variabilité inter individuelle et temps d’expérimentation correct pour pouvoir ensuite faire une étude pharmacologique) pour ensuite évaluer et sélectionner sur ces modèles, le meilleur candidat médicament (études réalisées dans le cadre d’un autre projet autorisé) . Ces modèles permettront de déterminer l’indication thérapeutique du candidat médicament, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique futur.
Procédures
Injection intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (1 fois, moins de 30 secondes)) Injection intra-péritonéale de l'agent réactif pour les mesures en bioluminescence , 2 à 3 fois par semaine (moins de 10 secondes) ; 1 à 2 prélèvements de sang par microsampling par semaine à la veine saphène (moins de 30s) suivant les recommandations de la structure de bien-être animale ; anesthésie générale pour l'imagerie par bioluminescence, quelques minutes, 2-3 fois/sem.
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress/douleur peut provenir : De l’envahissement tumoral/ mestastases lié au modèle pathologique recherché. De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress et l’injection (moins de 30s) de la douleur. De l’injection en intra-péritonéale du substrat réactif (luciférine) pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrières de l’animal. La contention ainsi que la tonte de la patte d’une durée maximale de 30s peuvent générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur. De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress.
Devenir
Toutes les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives.
Remplacement
La recherche d’efficacité de candidats chez l’animal reste aujourd’hui indispensable, c’est pourquoi les conditions expérimentales doivent être le plus possible fiabilisées afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux pour les études pharmacologiques ultérieures. Ce projet permet de déterminer ces conditions.
Réduction
Le système d’imagerie optique est non invasif et permet de suivre un même animal au cours du temps, réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Concernant les procédures pour lesquelles nous utiliserons des lignées tumorales non génétiquement modifiéesne permettant donc pas des mesures par imagerie bioluminescence, si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling (prélèvement de petits volume de sang, répétés au cours du temps sur un même animal) sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer le suivi de l’évolution sur un même animal et réduira donc considérablement le nombre d’animaux utilisés. Ce projet sert à définir les conditions expérimentales optimales de greffe et leurs caractéristiques de progression tumorale en amont des projets de recherche de traitements efficaces. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ces futures études en permettant une bonne connaissance des caractéristiques expérimentales comme la variabilité et de définir ainsi les designs et effectifs adaptés afin de garantir la réussite de ces études. Un accompagnement par le service bio-statistiques permettra de déterminer les meilleures conditions de expérimentales.
Raffinement
L’évaluation de la dissémination tumorale par bioluminescence est une technique non invasive pour l’animal et qui ne requiert qu’une simple anesthésie de courte durée. Le suivi du développement tumoral en imagerie sera effectué 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse, sur une surface plane et thermostatée. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. La mesure du poids corporel sera effectuée 2 à 3 fois/semaine ainsi que le suivi des signes cliniques. Cette surveillance accrue vise à suivre et anticiper l’application des points limites si nécessaire. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de les protéger de tout risque d’infection et/ou contamination. Des prélèvements de sang « en microsampling » peuvent être mis en œuvre afin de réaliser le suivi de la dissémination cellulaires dans le cas où l’utilisation de l’imagerie n’est pas possible et que la détection des cellules dans le sang est possible. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive, rapide, et pour de très petits volumes, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal. Dans le cas de greffes de cellules sans possibilité d’imagerie, les organes et tissus d’intérêt doivent etre prélevés en fin d’étude. Ces prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie complétée d’une analgésie et sans réveil des souris. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu (éléments de nidification) adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage étudiés et donc déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle animal est dicté par la tolérance des cellules à proliférer dans l’organisme de l’animal (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous n’excéderons pas 10 mois d’âge à la fin des études.
Etude de l’effet de la longueur de la chaine carbonée des acides gras sur la lipémie postprandiale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
24 hamsters dorés vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des gavages de matières grasses laitières une fois par semaine pendant trois semaines et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour comparer l'effet de différents acides gras sur le taux de lipides après un repas. Le porteur indique réutiliser les mêmes individus sur deux cycles avec une semaine de repos, ce qui ramène l'effectif de 54 à 24. Les hamsters sont tués pour prélever le sang et les organes du métabolisme des lipides, les surnuméraires étant "recyclés" vers d'autres protocoles.
Objectifs
L’ingestion d’un repas riche en graisse provoque une augmentation excessive des lipides dans le sang. Cette augmentation est connue comme étant un facteur de risque de développer des maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous allons vérifier si le remplacement d’une partie des lipides alimentaires par des acides gras qui ont une structure particulière (dits acides gras à chaînes courte et moyenne) entraînerait une moindre augmentation du taux de lipides après un repas et serait donc favorable à une meilleurs santé cardiovasculaire. Nous prévoyons donc d’administrer ces lipides laitiers par voie orale à des hamsters, d’analyser les différents taux de lipides dans le sang pendant les 6h qui suivent l’administration et de comparer les résultats avec ceux obtenus après l’administration chez ce même groupe de hamsters de lipides laitiers standards ou de l’huile de palme (acides gras connus pour leur effet délétère). Ces expériences seront réalisées sur deux lots d'animaux et les expérimentations sur chaque lot sont appelées par la suite cycle 1 d'expérimentation et cycle 2 d'expérimentation.
Bénéfices attendus
il est attendu une diminution des taux de lipides dans le sang après l’ingestion des lipides laitiers riches en acides gras à chaînes moyennes et courtes comparé aux lipides laitiers standard ou encore à l’huile de palme. Trois paramètres seront étudiés : l’évolution du taux de lipides pendant 6 heures après l’administration, taux cholestérol estérifié dans les HDL (bon cholestérol) et les LDL (mauvais cholestérol) et la mesure d’activité d’un transporteur de lipide (CETP). Les produits laitiers sont une source importante de protéines et de calcium, et leur consommation fait partie intégrante des habitudes alimentaires en France. La modification de leurs lipides pour les rendre moins susceptibles d’induire des maladies cardiovasculaires constituerait une amélioration significative de leur qualité nutritionnelle, et encouragerait davantage leur consommation.
Procédures
- Gavages une fois par semaine pendant 3 semaines. - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse :
Impact sur les animaux
Gavage => nuisances en lien = stress de courte durée lié à la contention. Prélèvements sanguins sur animaux amnésiés => nuisances en lien = stress lié à l'anesthésie
Devenir
Juste après la dernière cinétique, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes impliqués dans le métabolisme des lipides et en particulier dans la régulation de la lipémie postprandiale (foie, intestin, muscle, tissus adipeux). Si les animaux surnuméraires ne sont pas utilisés, ils seront recyclés dans la mesure du possible, vers les autres protocoles de l’animalerie .
Remplacement
La lipémie postprandiale est le résultat de plusieurs processus physiologiques impliquant la digestion, l'absorption, l'hydrolyse et la captation tissulaire. Il n'existe aucune méthode alternative (in silico ou in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques impliqués dans la réponse postprandiale. Son évaluation exige donc une expérimentation in vivo.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude, nous avons prévu la réutilisation des animaux avec des périodes de Wash-out de minimum une semaine. En effet dans notre étude nous avons trois groupes correspondant chacun à une fraction lipidique. En théorie, il aurait fallu 54 animaux, au total, pour avoir 9 animaux/groupe/cycle d'expérience, alors que nous prévoyons seulement 24 hamsters pour la totalité de l'étude, soit une réduction de plus de 50%.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux pour chaque procédure sont optimisés afin d’obtenir le maximum d’informations et des résultats fiables. Les procédures utilisées étant de sévérité légère, nous utilisons des points limites adaptés qui consistent essentiellement à surveiller le poids des animaux, un animal ayant perdu du poids ne sera pas utilisé après la période de wash- out.
Choix des espèces
Le hamster syrien doré (Mesocricetus auratus) est un rongeur qui exprime la CETP (Cholesterol Ester Transfer Protein), ce qui en fait un modèle adapté à l'étude du métabolisme des lipides. En effet grâce à cette protéine de transfert, le hamster se caractérise par un profil lipoprotéique proche de l'Homme avec une répartition du cholestérol dans les LDL (Low Density Lipoprotein) et les HDL, contrairement à la souris ou au rat où l'essentiel du cholestérol est porté par les HDL. De manière similaire à l'homme, chez le hamster la production d'apolipoprotéine B est tissus-spécifique (intestinale pour la B48 et hépatique pour la l'apoB100) contrairement au rat et à la souris caractérisés par l'absence de cette spécificité. Ces caractéristiques seront tout à fait avantageuses pour l'étude de la lipémie postprandiale compte tenu du rôle de ces lipoprotéines dans la formation des chylomicrons et des VLDL. Les animaux commandés seront âgés de 8 semaines, soit à l'âge adulte. Pour une étude pilote sur la lipémie postprandiale, nous avons choisi de faire nos tests sur des mâles. En effet des études cliniques montrent que les hommes présentent une lipémie postprandiale plus élevée que les femmes en réponse aux mêmes repas. Si les résultats montrent une réponse postprandiale différente en fonction des fractions lipidiques ingérées, il serait intéressant d’envisager l'expérience sur des femelles.
Evaluation in vivo de polymères à visée thérapeutique dans la prévention et le traitement de névrome chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
746 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit la section puis la réparation d'un nerf sous anesthésie et des mesures de conduction nerveuse par stimulation électrique, pour tester des colles et implants censés prévenir les névromes après amputation. Le porteur indique que la section nerveuse affecte la mobilité de la patte opérée et provoque léthargie, douleur et perte de poids. Il affirme qu'un modèle mammifère est "essentiel" et que ces études ne peuvent se faire ni ex vivo ni in vitro, faute de reproduire un "organe entier".
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation des tissus et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. Notre objectif est de développer des systèmes de réparation atraumatiques sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales ont été développés pour différentes applications dont la réparation des nerfs périphériques et ont démontré une nette efficacité lors de précédentes études. Le but de ce présent projet est d’élargir l’indication de ces systèmes de réparation à des scénarios cliniques très spécifiques comme le traitement et la prévention de névrome notamment dans le cadre d’amputations. L’amputation concerne plus d’un million de patient par an à l’échelle mondiale, qu’elle soit liée à des traumatismes ou à des maladies chroniques comme le diabète ou le cancer. Après une amputation, il est fréquent que les nerfs sectionnés soient à l’origine : 1) du phénomène de douleur du membre fantôme qui correspond à des douleurs ressenties dans la partie du corps amputée. Ce phénomène affecte 95 pour cent des patients en postopératoire immédiat avec une persistance au long cours chez la moitié d’entre eux. 2) de la formation d’un névrome (48,7 pour cent des patients). Il s’agit d’une tumeur bégnine formée par des fibres nerveuses qui se sont développées de façon anarchique. Un névrome s’accompagne de douleurs fulgurantes et peut nécessiter une nouvelle intervention chirurgicale pour le retirer. En clinique, les chirurgiens utilisent la réinnervation musculaire ciblée pour traiter les nerfs lors d’une amputation pour prévenir l’apparition de névromes. Le but de ce projet est de valider in vivo l’efficacité de nos systèmes de réparation sur les nerfs dans un modèle de réinnervation musculaire ciblée chez le rat.
Bénéfices attendus
Si la régénération nerveuse est confirmée avec nos systèmes de réparation, une solution atraumatique pourra être proposée aux chirurgiens pour éviter l’apparition de névromes post-amputation sans créer de traumatismes supplémentaires aux tissus.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie unique d’une durée de 30 minutes environ de transection puis réparation du nerf, effectuée sous anesthésie générale gazeuse et locale associée à une prise en charge de la douleur pré et postopératoire. Nous évaluerons à trois reprises (avant, pendant et après la chirurgie) la conduction nerveuse par électrophysiologie (stimulation électrique des nerfs) sous anesthésie générale pour une durée de 20 à 40 minutes. A la fin de la période de maintien prévu, ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire. Au cours de la chirurgie, des nerfs vont être sectionnés ce qui va impacter la mobilité de l’animal au niveau de la patte opérée. Le muscle n’étant que partiellement dénervé au cours de la chirurgie, l’impact sur la mobilité sera limité.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer l’efficacité de nos systèmes de réparation sur la régénération nerveuse.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères et les designs les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet doit nous permettre d’évaluer une régénération nerveuse ce qui ne peut être fait que dans un individu intégré et autonome.
Réduction
Au maximum, 746 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres designs ou des temps de suivi tardifs. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=10 animaux par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée avant la chirurgie puis 1 fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie pour évaluer la récupération de l’animal puis 1 fois/semaine. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifiées seront déposés directement dans le fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront également ajoutées à l’alimentation usuelle pour diversifier l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Une grille de score va nous permettre d’évaluer de façon objective l’état de l’animal et de prendre les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance par la mise en place de points limites. Le scoring sera effectué 1 fois par semaine et servira de support au suivi quotidien des animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin, d’autant plus que nous travaillerons sur des nerfs. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est très important pour les temps de suivi tardifs de notre étude.
Etude des polyphénols alimentaires sur l’hémostase et le risque hémorragique sous anti-coagulants chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tués sous anesthésie, sans réveil, après des prélèvements et des mesures d'hémostase, 80 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Pendant cinq semaines, ils reçoivent chaque jour sous contention un anticoagulant par la bouche et subissent une prise de sang, pour mesurer l'effet d'une supplémentation alimentaire en polyphénols sur leur coagulation et leur risque de saignement. Le porteur les héberge seuls, pour éviter que des comportements agressifs ne provoquent blessures et saignements sous anticoagulant et pour recueillir leurs urines de 24 heures, avec pour enrichissement un tunnel et des balles en acier. Il annonce aussi que le projet contribuera à la "mise en place d'un modèle animal" destiné à tester d'autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant "un bénéfice ou un risque hémorragique".
Objectifs
Le saignement sous anti-coagulants représente une des premières causes iatrogènes d’hospitalisation d’urgence en France. Une marge thérapeutique étroite et des effets indésirables potentiellement graves des anti-coagulants conduisent les praticiens à prendre en considération les interactions possibles entre anti-coagulants et alimentation du patient. L’objectif du projet est l’évaluation des effets d’une supplémentation nutritionnelle en polyphénols sur les paramètres de l’hémostase et le risque d’hémorragie chez le rat sous anti-coagulant. En effet, de nombreuses études montrent que les polyphénols agiraient favorablement sur certains facteurs de risque cardiovasculaires dont l’amélioration de la fonction endothéliale . Bien qu’encore peu documenté au niveau clinique, les flavonoïdes, une famille de polyphénols, auraient également un impact direct sur l’hémostase (ensemble des phénomènes qui permettent l’arrêt d’une hémorragie). Elle est divisée en deux temps successifs : l’hémostase primaire correspondant à la formation du « clou plaquettaire » et l’hémostase secondaire, dite « cascade de coagulation ». Murphy et al. ont mis en évidence un impact des flavonoïdes sur l’hémostase primaire en exerçant une action antiplaquettaire. Plus récemment, des études ont mis en évidence une réduction de la coagulation plasmatique par les flavonoïdes qui exercent des activités anti-facteur IIa ou anti- facteur Xa. De plus, notre équipe a montré un impact des flavonoïdes sur la structure du caillot de fibrine formé lors de l’hémostase secondaire, résultant en un caillot moins dense et plus perméable. L’ensemble de ces résultats sont en faveur d’une diminution des évènements thrombotiques et d’un allongement de l’hémostase primaire , qui pourrait constituer un facteur de risque de saignement, notamment chez les sujets sous anti-coagulants. Ainsi, il apparaît pertinent de porter une attention particulière au risque hémorragique en cas de supplémentation nutritionnelle riche en polyphénols.
Bénéfices attendus
Les bénéfices qui découleront de ce projet sont la contribution à la compréhension de l’impact des polyphénols de notre alimentation sur l’hémostase, le risque hémorragique, et la réactivité vasculaire. Le projet contribuera également à la mise en place d’un modèle animal permettant de tester d’autres facteurs nutritionnels ou agents pharmacologiques présentant un bénéfice ou un risque hémorragique (anticoagulants ou anti-agrégants plaquettaires…).
Procédures
Les animaux, sous contention (d'une durée d'environ 30s) recevront une administration quotidienne d'anticoagulant par voie orale pendant 5 semaines. Une prise de sang unique sera réalisée pour s'assurer du taux plasmatique d'anticoagulant au cours du traitement (durée du geste = moins de 2 minutes). En fin d'études, les animaux seront anesthésiés (5 minutes) pour la réalisation de prélèvements et des mesures d'hémostase avant sacrifice sans réveil préalable pour la collecte des tissus.
Impact sur les animaux
La mise sous anti-coagulants ainsi que la supplémentation nutritionnelle en polyphénols (à des doses équivalentes à celles des aliments sources) ne sont pas suspectées d’induire d’effets indésirables. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés lors de l’administration par voie oral des traitements anti-coagulants afin de s’assurer de l’absence d’effet secondaire (hémorragie spontanée, …). Par ailleurs, l''hébergement en cage individuelle transparente n'est connu pour induire de baisse de l'ingéré. Par précaution, la masse corporelle ainsi que leur consommation alimentaire seront contrôlées de façon bi-hebdomadaire dans le cadre de se projet.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de collecter le plasma et les tissus vasculaires nécessaires à l'exploration des fonctions tissulaires impliquées dans l'hémostase et la réactivité vasculaire.
Remplacement
Les méthodes d’étude de l’hémostase in vitro, sur des restes de tubes de plasma humain par exemple, ne permettent pas la prise en compte du métabolisme des flavonoïdes. En effet, les flavonoïdes de notre alimentation sont soumis à différentes modifications de structure par les enzymes digestives et métaboliques, résultant en la génération de formes nommées métabolites dans la circulation sanguine. De plus, les approches in vitro ne prennent pas en compte les effets des métabolites des flavonoïdes sur les paramètres cellulaires régulant l’hémostase (ex : facteurs endothéliaux …). De plus ces méthodes permettent d’estimer de façon indirecte le risque d’hémorragie. Par conséquent, à ce jour, aucune méthode de remplacement n’est envisageable pour répondre aux objectifs scientifiques de notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux dans l’étude proposée a été déterminé sur la base des données de la littérature ayant mis en évidence une modification significative du temps de saignement chez le rat anti-coagulé à l’aide d’une procédure similaire. Par ailleurs, des critères secondaires d’analyses tels que l’évaluation de l’hémostase primaire et secondaire ainsi que l’évaluation de la réactivité vasculaire ont été inclus dans l’étude afin de ne pas répéter cette expérimentation à ces fins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés individuellement afin d’éviter tout comportement agressif pouvant engendrer des blessures et saignement notamment lors des traitements sous anti-coagulants. De plus, l’individualisation des animaux est nécessaire pour le suivi de la prise alimentaire et le recueil des urines 24h. Cet hébergement se fera dans les conditions standards et réglementaires. Toutefois, ces animaux bénéficieront d’attention particulière notamment en termes d’offre d’objets d’enrichissement (tunnel et balles en acier) avec des alternances hebdomadaires. Un suivi quotidien des animaux, imposé par ailleurs par le déroulé du protocole, permettra de compléter la surveillance de leur bien-être.
Choix des espèces
Les rats « Sprague-Dawley » ont été largement étudiés avec des similitudes physiologiques avec l’homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Ces animaux sont également utilisés dans les études publiées sur le temps de saignement ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux agés de 8 semaines (poids < 200gr) de façon similaire aux études précédentes publiées.
Etude chez la souris de l’activité anti-inflammatoire des cellules Immunomodulatrices dans un modèle d’infection pulmonaire avec la bactérie Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.
Bénéfices attendus
Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.
Procédures
Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.
Devenir
Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.
Evaluation de la pathogénicité de souches de virus de la fièvre de la vallée du Rift
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
2304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec des souches du virus de la fièvre de la vallée du Rift, par injection ou par voie nasale sous anesthésie, puis subissent jusqu'à quatre prélèvements de sang, pour comparer la pathogénicité de souches isolées sur le terrain. Le porteur indique que l'infection est "le plus souvent mortelle" et provoque perte de poids, prostration, signes d'encéphalite et convulsions, les souris étant mises à mort dès les premiers signes cliniques. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" du fait de sa sensibilité au virus.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer la pathogénicité de nouvelles souches de virus de la fièvre de la Vallée du Rift isolées sur le terrain (pays africains) lors de foyers infectieux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'obtenir des indications pertinentes et importantes (différences de sévérité clinique et de virémie - niveau et cinétique) sur le niveau de pathogénicité des nouvelles souches virales isolées, dans un contexte expérimental parfaitement contrôlé, par comparaison avec une ou deux souches de référence. Ces données pourront être confrontées avec des observations de terrain lorsqu'elles seront disponibles.
Procédures
Les souris seront soumises : - à l'inoculation d'une suspension virale soit par injection (une fois, 2 secondes), soit par voie intranasale après anesthésie par injection (une fois, 2 secondes, durée d'anesthésie 20 minutes); - au maximum à 4 prélèvements de sang de faible volume (durée 15 secondes) espacées de 3 jours.
Impact sur les animaux
L'infection par inoculation intrapéritonéale n'engendre qu'une sensation légèrement douloureuse très brève. L'inoculation par voie intranasale est réalisée sous anesthésie générale et n'a aucun impact au réveil de la souris. Les prélèvements de sang entraînent une douleur de piqûre au point de prélèvement qui dure moins de 10 secondes. Les volumes prélevés ont été réduits pour n'entraîner aucun risque d'anémie. La réalisation de ces gestes par un opérateur expérimenté contribue à réduire l'effet indésirable ressenti par les souris. L'inoculation du virus de la fièvre de la Vallée du Rift à des souris de laboratoire induit une infection le plus souvent mortelle. Cliniquement, une perte de poids apparaît au bout de 3-4 jours avant que les souris développent des symptômes sévères (prostration, signes d'encéphalite, convulsions) qui précèdent la mort de quelques heures. Néanmoins, les animaux n'attendront jamais ce stade et seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes cliniques.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort car elles seront infectées par un agent infectieux dangereux pour la santé humaine.
Remplacement
La caractérisation des nouvelles souches virales impose d'établir leur niveau de pathogénicité par comparaison avec des souches de référence. Ce sera fait in vitro sur des cultures de cellules, qui ne permettent toutefois pas de prédire la pathogénicité in vivo (en particulier la répartition du virus entre les organes, qui peut varier d'une souche à l'autre). Le recours à un modèle animal est indispensable et la souris est le plus adapté en raison de sa sensibilité au virus et de la somme de connaissances accumulées sur ce modèle d'infection.
Réduction
Les nombreuses données que nous avons déjà produites au laboratoire nous permettent d'estimer que des groupes de 7 à 10 souris seront nécessaires et suffisants pour obtenir des informations fiables dans des expériences de suivi clinique. L'effectif sera ajusté en fonction des résultats (sévérité clinique et charge virale). Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser, les expériences seront d'abord réalisées sur des femelles, chez qui l'infection est moins rapide. Seules les doses et souches intéressantes seront ensuite répliquées chez les mâles. De même, une première voie et première dose sera testée en priorité, d'autres doses et voie d'administration ne seront pas systématiquement réalisées
Raffinement
Les souris seront entretenues dans des conditions d'hébergement normales (isolateurs, cages de 5 souris pour les femelles et autant que possible en petits groupes de 2-3 pour les mâles). Les gestes techniques seront réalisés par un opérateur très expérimenté les maîtrisant parfaitement. Les sourisseront suivies chaque jour, puis deux fois par jour après l'apparition des premiers symptômes pour mettre en œuvre des points limites précoces mais qui ne perturbent pas les conclusions des expériences. De l'aliment gélifié sera mis à disposition des souris sur la litière pour les aider à s'alimenter dès observation de difficultés locomotrices.
Choix des espèces
La souris est une espèce adaptée à l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift en raison de sa sensibilité spontanée et des nombreuses connaissances produites sur ce modèle d'infection. Elle est compatible avec un hébergement en isolateur indispensable compte tenu du niveau de risque associé à ce virus. Nous utiliserons des jeunes adultes (9-12 semaines), âge auquel le modèle d'infection a été validé dans les études antérieures.
Evaluation d’une immunothérapie pour traiter la fibrose dans la Dystrophie Musculaire de Duchenne dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes d'une forme de myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections d'un traitement, des prélèvements de sang, une échographie cardiaque sous anesthésie et des tests de force, pour évaluer une immunothérapie censée réduire la fibrose musculaire et cardiaque. Le porteur indique que la maladie induit un affaiblissement musculaire et un décès prématuré des souris. Il affirme que les modèles murins restent une "source unique et indispensable" pour évaluer le traitement, les modèles cellulaires servant au préalable.
Objectifs
La myopathie de Duchenne est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations d’un gène qui assure la stabilité structurelle des muscles. Chez les patients, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. Si la recherche d’un traitement curatif pour cette maladie est plus forte que jamais, le besoin médical reste à ce jour non satisfait. En effet, l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement est la difficulté d’accès à leurs cibles en raison d’une fibrose excessive. C’est pour cette raison qu’il est cliniquement pertinent d'explorer une réduction de la fibrose comme une nouvelle piste. L’une de ces pistes consiste à cibler une protéine exprimée spécifiquement à la surface des fibroblastes activés, à l’aide de cellules immunitaires ou particules génétiquement modifiés qui ciblent spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept a préalablement montré que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin d’hypertension. Cette pathologie diffère toutefois de la myopathie, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de traitements innovants dans un modèle murin de myopathie. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la myopathie.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes T spécifiques dans des modèles murins de la myopathie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. Le terme ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la maladie à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permettra également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront 1- l’Injection du traitement (5 min) 2- les Prélèvements sanguins espacés d'une semaine pour les deux premiers et 1 mois plus tard pour le dernier (1 min chacun) 3- Echographie cardiaque réalisé sous anesthésie (5 min) 4- Test de force (10 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues causées par la maladie consistent en un affaiblissement musculaire (respiration haletante, démarche incertaine, fatigue) et une réduction modérée de la fonction cardiaque. Il est à noter que cette maladie induit un décès prématuré (11 mois par rapport à une espérance de vie d’environ 2 ans chez les souris saines). Le pré-traitement peut induire un état transitoire de fragilité (4-7 jours) chez la souris avec notamment une perte de poids. Les prélèvements sanguins et injections peuvent générer du stress chez l'animal et une douleur minime. Les prélèvements et injections n’induisent qu’une très faible douleur. L’échocardiographie nécessite une anesthésie pour garantir l’immobilité de l’animal pendant la mesure (5 min) et occasionne un stress chez l’animal.
Devenir
A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera mise à mort par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (cœur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les données indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.
Remplacement
En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité est mise en place sur des modèles cellulaires. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur la sécurité de ce traitement.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est calculé grâce à des tests statistiques qui seront réalisés pour analyser les résultats et l’utilisation de calcul de puissance statistique pour évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Ces calculs se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe, en prenant en compte des sorties des animaux de protocoles (atteinte de points limites ou décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception de l’injection intra-veineuse et du prélèvement de sang, sont des tests indolores, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse étant donné qu’elle est non invasive. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et de manière hebdomadaire par les expérimentateurs. Une grille d’évaluation des points limites est établie afin de prévenir et limiter la survenue de la souffrance animale. L’animal sera mis sous surveillance accrue et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité.
Choix des espèces
La souris est l’espèce permettant de reproduire la complexité de la myopathie puisqu’aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la myopathie. En outre, les modèles pré-cliniques de la myopathie ont été développés chez la souris et récapitulent la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. L’âge choisi de la souris constituant le modèle sera au stade adulte, plus précisément entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant atteint la fin de leur croissance musculaire et cardiaque. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ce modèle à partir de 4 mois.