Recherche appliquée

570 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral modifié est injecté directement sous la rétine des deux yeux sous anesthésie, suivi d'imageries et d'électrorétinogrammes répétés, puis les yeux, le foie et le sang sont prélevés après mise à mort. L'objectif est de tester si une modification chimique de l'enveloppe du vecteur le dirige mieux vers la rétine. Le porteur affirme que la rétine ne peut être reconstituée "parfaitement in vitro" et retient le rat pour la taille de son œil, plus commode à injecter.

Objectifs

Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les outils les plus performants pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. L’AAV de serotype 2 (AAV2) est capable d’infecter une large gamme de cellules in vivo chez le mammifère comme les cellules musculaires, les hépatocytes ou les neurones ce qui explique en partie sa popularité. Ce sérotype a d’ailleurs été utilisé en clinique pour le transfert de gène dans le foie notamment dans le premier essai clinique sur hémophilie B. Ces propos optimistes sont néanmoins pondérés par des limites : •Le tropisme très large des AAV qui peut être à l’origine d’une expression du transgène dans d’autres tissus que celui ou ceux où l’expression du transgène est souhaitée. •Il reste nécessaire d’injecter des doses importantes qui peuvent entrainer une immuno-toxicité au détriment de l’effet thérapeutique Ces principaux inconvénients sont à l’origine de ce projet de recherche car nous pensons qu’une modification chimique ciblée, pourrait changer l’adressage des vecteurs vers l’organe d’intérêt, ici la rétine. Ce projet consiste à modifier chimiquement la capside (l’enveloppe) des vecteurs dérivés du Virus Adéno-Associé de type 2 et 8 (AAV2 et AAV8). Il repose sur le couplage à la surface des vecteurs de molécules chimiques ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine ce qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées. Des premiers tests seront effectués sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo. Il est également impossible de vérifier la bio-distribution et l’index thérapeutique de ces particules modifiées sur des cellules en culture. L'utilisation du rat est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres in vivo.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de déterminer l’infectiosité des AAV (virus adéno-associé) modifiés en les injectant chez des rats sains par voie sous-rétinienne. Il repose sur le couplage de molécules chimiques à la surface de la capside d’AAV ayant théoriquement des propriétés de ciblage de cellules rétiniennes. Ces modifications pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées pourraient favoriser la transduction spécifique de la rétine qui ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrée et donc le risque de réaction immunitaire.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne, des vecteurs chimiquement modifiés dans les 2 yeux ou en intra-veineuse : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et de quelques minutes pour l’intra-veineuse. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, le jour de l’injection et le jour de l’euthanasie. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats. Durée du geste, 5min environ.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne ou intra-veineuse. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie…) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. L’œil du rat étant 5 fois plus gros que l’œil de souris, l’injection sous-rétinienne est plus facile à réaliser chez le rat, avec une distribution du produit plus homogène entre les individus. La taille de l’œil de rat permet également d’avoir suffisamment de matériel pour réaliser les analyses post-mortem.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses post-mortem et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec une solution saline, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes : marquages immunohistochimiques), des analyses de biologie moléculaire et biochimiques. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression de la GFP, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre le vecteur et une analyse statistique sur les amplitudes en ERG (électrorétinogramme).

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés et une régulation de leur température, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats. L’enrichissement sera renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le rat est un bon modèle pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large permettant une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats non albinos, ayant une acuité visuelle moins impactée par l’âge ce qui nous semble cohérent pour l’analyse de l’impact de vecteur sur l’intégrité et la structure de la rétine. Les rats seront utilisés à l’âge d’un mois pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.

50 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un vecteur de thérapie génique, parfois par une chirurgie cérébrale de cinq heures, puis subit des séances répétées d'imagerie sous anesthésie avant l'euthanasie pour analyse des tissus. L'objectif est d'obtenir une "preuve de concept" avant un essai clinique contre la maladie de Parkinson. Le porteur justifie le recours au macaque par la taille de son cerveau et sa proximité immunitaire avec l'humain, et affirme que ni les cultures ni le rongeur ne sont "prédictifs".

Objectifs

La maladie de Parkinson, fait partie d’un groupe de maladies du cerveau dont la signature est l’accumulation anormale d’une protéine l’alpha-synucléine (α-syn). A l’état normal, α-syn régule le trafic et la libération des neurotransmetteurs qui sont essentiels pour la communication entre neurones. Son accumulation excessive et en forme insoluble, contribue à l’apparition d’agrégats multi-protéiques qui encombrent les neurones et empêchent leur bon fonctionnement. Une stratégie thérapeutique contre cette accumulation et agrégation d’α-syn est de réduire sa quantité dans les tissus ou des molécules intermédiaires (ARN messager, ou ARNm) nécessaires à sa production. Des essais cliniques sont déjà en cours sur des patients atteints de la maladie de Parkinson pour évaluer l’efficacité de cette stratégie. Cependant, ces approches laissent la protéine et/ou ARNm s’accumuler jusqu’à qu’ils rencontrent une molécule qui les élimine. Ce processus engorge à terme la machinerie cellulaire et il serait plus efficace de réduire l’expression du gène directement, c’est-à-dire d’agir en amont de la production d’ARNm et de protéines. Grâce à une technologie d’édition du génome qui est inductible et réversible, nous proposons de tester une nouvelle approche pour réduire partiellement la quantité d’α-syn produite de novo. Des résultats obtenus chez le rongeur montrent que l’approche est efficace et bien tolérée. Il s’agit maintenant d’étoffer ces données et de mettre à l’échelle le traitement dans une espèce plus proche de l’humain en termes de taille et organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau, et par rapport au système immunitaire. Les expériences proposées dans un modèle primate non-humain permettront ainsi d’établir si la réduction partielle de l’expression du gène est efficace et bien tolérée. Pour ceci, il faut réaliser la mise à l’échelle du traitement chez le gros animal et étudier différentes voies d’administration, en comparant l’effet de la thérapie génique après injection du vecteur thérapeutique directement dans le cerveau, dans le compartiment de liquide céphalorachidien, ou dans le compartiment sanguin. Toutes les voies d’administration citées sont utilisées chez l’humain et sont donc pertinentes pour le traitement des patients atteints de la maladie de Parkinson. Dans un souci de raffinement, la voie moins invasive donnant une efficacité satisfaisante chez le primate non humain sera privilégiée pour la translation de cette thérapie en clinique.

Bénéfices attendus

Les données déjà obtenues dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson montrent bien que la réduction de la quantité de protéines ou d’ARNm de l’α-syn a un effet bénéfique. Ce projet vise à établir pour la première fois chez le primate non-humain l’effet d’une thérapie qui réduit partiellement l’expression du gène de l’α-syn en vue de son utilisation chez le patient atteint de la maladie de Parkinson. Notre approche devrait éviter d’encombrer et perturber la machinerie cellulaire, et limiter le risque d’engorgement empêchant l’élimination des produits accumulés et causant une inflammation chronique autour des neurones, où ils s’accumulent. Les données acquises pendant le projet permettront d’établir les meilleurs paramètres d’administration chez le patient, ce qui constitue une preuve de concept essentielle avant de démarrer un essai clinique.

Procédures

Le protocole expérimental comporte 4-5 séances de prélèvements sous anesthésie (~30 min) avant et après administration de la thérapie. L’imagerie IRM non-invasive, sera utilisée pour observer l’anatomie du cerveau et la présence d’inflammation (4-5 fois 1-2H). De même, 4-5 séances d’imagerie TEP (4H max) seront délivrées en respectant 3 semaines d’écart entre les examens. Une seule délivrance de thérapie est prévue par animal et sa durée sera de 1H à 6H selon la voie. L’euthanasie en fin de protocole sera nécessaire pour prélever les organes et tissus et les analyser, afin de comparer les résultats aux mesures fonctionnelles et anatomiques acquises par imagerie IRM et TEP, et ainsi valider les résultats d’innocuité et efficacité. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale en prenant en compte l’inconfort, la douleur lors des chirurgies et le suivi de l’état général des animaux comme le poids, la mobilité et la sociabilité avec les congénères.

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles suite à la délivrance du traitement par chirurgie sont une infection au niveau de l’incision de la peau (5-7 jours maximum avec prise en charge par un traitement antibiotique), une douleur au niveau de l’incision (2-3 jours post-incision avec prise en charge par un traitement analgésique), perte de poids (2 jours post-chirurgie avec prise en charge par un soutien alimentaire). Toute modification du comportement moteur ou social des animaux hébergés en groupe social sera noté et notifié au vétérinaire.

Devenir

Suite à des données prometteuses obtenues chez le rongeur, et dans l’optique d’obtenir une preuve de concept de l’efficacité et la sureté d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Parkinson chez une espèce fonctionnellement et immunitairement proche de l’Homme, il est nécessaire d’analyser les tissus après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, le cadre règlementaire pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain impose une vérification directe de la distribution dans l’organisme du vecteur viral et une évaluation de sa capacité à induire une réponse immunitaire. Ces données sont inaccessibles chez le patient humain et le recours à l’animal reste nécessaire. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques ou histopathologiques.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire, aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permettant aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale du cerveau au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique, ou de comparer cette distribution en fonction des voies d’administration utilisées. Le rongeur, vu la petite taille de son cerveau, n’est pas pertinent pour informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire le nombre d’injections et la concentration de l’agent thérapeutique à utiliser pour couvrir une région du cerveau. La taille et la structure du cerveau du primate non-humain – en rapport avec la résolution intrinsèque des équipements d’imagerie existants – permettent aussi des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients et impossibles chez le rongeur par exemple. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets grâce à des examens d’imagerie et de confirmer ces résultats par analyse immunohistochimique des marqueurs d’inflammation post-mortem. Le protocole expérimental pourra être révisé pour éviter une réaction immunitaire, en modulant des paramètres d’administration comme la concentration et le volume de l’agent thérapeutique, sa répartition par site d’injection et l’administration d’un traitement anti-inflammatoire. Tous ces éléments pourront être utilisés pour mettre au point les protocoles de délivrance et de suivi chez le patient.

Réduction

Une veille de la littérature démontre que ces expériences n’ont pas été déjà réalisées et que le nombre d’animaux choisi, en tenant compte de l’espèce, est pertinent puisqu’il a déjà permis de mettre en évidence des effets thérapeutiques dans d’autres études. De plus, le laboratoire dispose d’une solide expérience dans le design d’expériences d’évaluation thérapeutique chez le primate non-humain et du nombre d’individus nécessaires par groupe expérimental pour conclure sur des effets pertinents et prédictifs chez l’humain. Un suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives comme l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer un effet thérapeutique significatif, en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps.

Raffinement

Une seule séance par individu est prévue pour délivrer les vecteurs viraux. La durée et le caractère invasif de la procédure de délivrance seront variables entre les groupes expérimentaux, selon qu’il s’agira d’une simple injection (~1h) ou une chirurgie pour délivrance dans le cerveau (~5h). Un suivi d’observation journalière sera mis en place les deux premières semaines après administration pour vérifier l’absence de réaction aigue (réaction cutanée locale, gonflement, rougeur, infection). Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie locale et systémique le jour de l’intervention et, dans le cas de la chirurgie, dans les deux jours qui suivront. D’après l’expérience du laboratoire, grâce à ces protocoles, les chirurgies ne modifient pas le comportement de l’animal ni sa prise de nourriture, même dans les 48 heures post-intervention. De plus, un suivi du poids sera réalisé toutes les semaines durant toute la durée de l’expérience. Le comportement sera évalué une fois par semaine pendant toute la durée du protocole à l’aide d’une grille prenant en compte différents critères, dont la présence ou absence d’un penchement de la tête, la difficulté de déplacement à cause d’un membre inférieur ou supérieur, les rotations, la prostration, l’apparence du pelage, la prise de nourriture fournie par l’expérimentateur (motricité fine et apathie).

Choix des espèces

Des études préalables chez le rongeur montrent que la réduction de l’expression de la protéine aSyn est suffisante pour modifier ou empêcher le développement de la maladie de Parkinson. Notre projet vise à réduire partiellement l’α-syn au niveau de l’ADN. Le développement clinique de l’approche demande d’étudier la biodistribution et la sureté de cette thérapie dans un modèle bien connu et proche de l’homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie. Ni les modèles in vitro ni les modèles rongeurs ne sont prédictifs du fait de la petite taille du cerveau et des différences au niveau du système immunitaire, et c’est pourquoi nous avons fait appel au modèle macaque. En effet, des études comparatives entre rats, primates et humains montrent que le nombre de cellules dopaminergiques dans la substance noire est de 12.7x10e3, 203x10e3 et 382x10e3 respectivement ce qui illustre la pertinence de l’espèce de choix. Animaux adultes dans la perspective de l’application clinique chez des patients atteints de la maladie de Parkinson et dans le but de s'éloigner d'une plasticité trop importante observée chez l'enfant et le jeune adulte et qui pourrait entrainer la mise en jeu de mécanismes adaptatifs de compensation.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, une injection intraveineuse d'un immunostimulant dérivé d'une molécule bactérienne, puis des prélèvements sanguins, sur des lignées immunocompétentes et immunodéficientes. L'étude, exploratoire, vise à décrire la réponse immunitaire innée dite mémoire face à la tumeur. Le porteur affirme que tester ce composé exige un "organisme entier" que les cultures ne reproduisent pas, et renvoie les retombées contre les cancers et les maladies infectieuses au long terme.

Objectifs

Le système immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement des cancers. Récemment, de nouvelles immunothérapies permettant la modulation du système immunitaire ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule contenue dans les bactéries a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire, mais sa toxicité ne permet pas son utilisation en clinique. La détoxification de ce composé et son encapsulation a permis d’améliorer sa pharmacocinétique et réduire sa toxicité pour permettre son injection intraveineuse. La réponse mémoire innée n’a été décrite que récemment, mais pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la progression et de la rechute tumorale. Mais les mécanismes impliqués ainsi que les acteurs de ce contrôle sont en revanche encore peu connus à ce jour. Ce projet aura pour objectif : 1) de décrire le type de réponse immunitaire innée et adaptative induite par cette molécule détoxifiée sur des souris immunocompétentes, préalablement implantées avec des cellules tumorales. Cette évaluation nous permettra d’appréhender les variations des populations immunitaires totales au cours du temps. 2) nous évaluerons ces mêmes critères sur des souris immunodéficientes ne présentant pas tous les aspects de la réponse immunitaire, afin d’estimer l’implication de la seule réponse innée. Cela permettra par la suite d’évaluer si la réponse innée seule permet la mise en place d’une réponse efficace contre la prolifération des cellules cancéreuses, mais également de conclure sur l’efficacité de ce composé détoxifié en tant qu’immunothérapie anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les populations immunitaires impliquées dans la mémoire innée, et promues par ce composé détoxifié prometteur pour la santé humaine. Cette caractérisation aura plusieurs retombées : 1) Suivre la cinétique du système immunitaire complet chez des souris immunocompétentes, 2) Renforcer l’affirmation que le système immunitaire adaptatif n’est pas le seul menant à une réponse mémoire, 3) Mettre en évidence les populations cellulaires responsables de cette mémoire innée, permettant par la suite de comprendre comment favoriser leur induction. A plus long terme, cette réponse mémoire innée pourrait être mise à profit non seulement pour soigner différents types de cancers, mais également dans le cas de maladies infectieuses.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) - durée < 1 minute. - 1 contention + 1 injection intraveineuse (animal vigile) du composé testé - durée < 5 minutes. - 1 prélèvement sanguin sous vapeurs d’isoflurane (3,5%) - durée < 5 minutes.

Impact sur les animaux

- douleur lors d’injection de cellules tumorales en sous-cutané (durée de quelques minutes, une fois), - gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite. Il n’y a pas de métastases attendues avec les modèles tumoraux utilisés. - stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (durée de quelques minutes) - douleur lors d’injection dans la veine caudale (durée de quelques minutes, une fois)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude, dû à la nécessité de prélever les échantillons biologiques

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité de ce composé et sa formulation ont été préalablement validées in vitro au laboratoire. Des tests plus poussés doivent être réalisés sur modèle animal pour évaluer l’effet de ce composé sur un organisme entier et plus complexe. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du microenvironnement, et également du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion du composé dans le système sanguin et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire et d’une réponse mémoire, sa migration, son recrutement et son effet sur la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Cette expérience est exploratoire, et a pour but de décrire les populations immunitaires recrutées après traitement ainsi que leur activation dans les différents compartiments testés. Nous avons choisi d’utiliser 12 animaux par groupes afin d’obtenir un nombre suffisant de cellules dans les organes prélevés pour mener à bien toutes les analyses et obtenir des résultats suffisamment représentatifs. Dans ce cas, nous ne pouvons pas déterminer de tests statistiques appropriés, mais nous nous sommes basés sur le nombre de cellules vivantes à enregistrer, en comparaison avec le nombre de cellules obtenu par prélèvement sanguin, retranché des biais de manipulation connus (mortalité cellulaire, perte des cellules lors des différentes étapes de lavages et de traitement de l’échantillon). Ce nombre permet également de palier au fait que l’implantation de tumeur ne prenne que dans 80% des cas. Nous avons donc dû prévoir une augmentation de l’effectif de souris prévu initialement de 20%. A des fins de réduction, nous avons choisi d’utiliser le groupe de souris contrôle comme point de référence T0.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…) critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels seront annotés sur une fiche de suivi, et comparées à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si score 1, observation quotidienne des animaux par l’expérimentateur, pas d’action particulière. Si score 1 deux jours de suite : action similaire à score 2. Si score 2, animaux suivi matin et soir. Si score 3 ou 4, traitement palliatif mis en place le jour même sur une durée de 24h. Si score 5, animaux mis à morts = Point Limite. Des points limites adaptés seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs et permettent de constituer des groupes d’effectifs compatibles avec des résultats statistiquement significatif. Des souris femelles âgées entre 12-20 semaines seront choisies car elles sont moins agressives entre elles que le sont les mâles, et ont un système immunitaire compétent et mature. Le modèle immunocompétent est particulièrement utilisé pour l’étude de l’immunité cellulaire. Pour évaluer la réponse immunitaire innée, un modèle animal fortement immunodéprimé ne comportant pas de système immunitaire adaptatif est nécessaire, celui-ci pouvant fausser nos résultats dû aux interactions entre ces deux versants de l’immunité. La souris immunodéficiente est connue pour présenter ces caractéristiques en ne développant pas certaines cellules immunitaires. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins.

6 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, trois injections intramusculaires d'un candidat vaccin et cinq prélèvements sanguins à l'oreille en cage de contention, avant une ponction cardiaque terminale de 30 mL de sang sous anesthésie. Le porteur indique que leur mise à mort est justifiée par la "nécessité" de récupérer une grande quantité de sang pour analyser les anticorps. Il affirme qu'il n'est "pas encore possible" de se passer de l'animal pour la production d'anticorps polyclonaux et prévoit un seul groupe de six lapines, sans témoin.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont également résistantes à ces antibiotiques de dernière ligne. Des alternative aux antibiotiques, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées (bactéries inoffensives dont tous les facteurs de virulence ont été retirés) et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae, a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à différente fréquences d’administration de ce candidat vaccin associé à un adjuvant (produit utilisé pour améliorer l’efficacité des vaccins). L’objectif est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale et ainsi obtenir une quantité suffisante d’anticorps avec la fréquence d’administration choisie. Ce projet en particulier, vient compléter les différents groupes déjà testés en étudiant cette fois l’administration du vaccin seul, sans aucun adjuvant. La quantité d’anticorps produite par les animaux et collectée en fin d’expérience reflètera l’efficacité de la vaccination.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer à évaluer la variabilité de réponse à son administration et à compléter les données obtenues avec le bon protocole d’administration. Les anticorps collectés à la fin de l’expérience seront ensuite administrés chez la souris pour réaliser une vaccination dite passive. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 sur animal vigile - 3 secondes - 3 injections du candidat vaccin (1mL) par voie intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28,J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire (3 secondes) directement suivie d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang (2 minutes) qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant (3 secondes) pour assurer la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 - La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en place de la puce. - 2 à 3 injections intramusculaire à J0, J28, J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) -Le candidat vaccin a déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28, J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire directement suivi d’une ponction intracardiaque de 30mL de sang qui se terminera par une injection intracardiaque d’un euthanasiant pour assurer la mise à mort. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 6 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Leur mise à mort est justifiée par la nécessité de récupérer suffisamment d’anticorps pour les analyses complémentaires ce qui implique le prélèvement d’une grande quantité de sang.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seul 1 groupe de 6 lapins sera administré par le candidat vaccin (protocole de 3 immunisations) afin de compléter des données (pas de groupe control). Comme ce projet ne comporte qu’un groupe, aucun test statistique de comparaison ne sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.

Ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour implanter des cellules ou un fragment de tumeur sur le côlon ou le pancréas, ablation de la rate après injection de cellules tumorales pour les métastases du foie, ou injection de cellules dans le péritoine : 400 souris immunodéficientes Swiss Nude reçoivent d'abord ces tumeurs dans un premier établissement. Transférées dans un second, elles reçoivent sous anesthésie une injection dans le péritoine tous les sept jours d'un composé d'imagerie, passent des séances d'imagerie sous isoflurane, puis une ouverture de l'abdomen pour l'exérèse de leurs tumeurs sous caméra à fluorescence, 30 minutes par souris. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et le porteur cite comme effets possibles des chirurgies la souffrance, la perte de poids et l'infection, ainsi que les effets de grosses tumeurs et de métastases. Toutes sont tuées à la fin des procédures, pour vérifier à l'autopsie l'absence de reprise tumorale.

Objectifs

Malgré l'émergence des thérapies personnalisées, la chirurgie joue toujours un rôle essentiel dans le traitement de nombreux cancers comme les cancers colorectaux et pancréatiques. Un problème majeur réside dans la difficulté de détecter les tumeurs et de visualiser les marges tumorales. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) permet aux chirurgiens une meilleure visualisation de la tumeur en temps réel. De plus, la FGS peut être améliorée en associant de l’imagerie nucléaire (SPECT) avant l’opération pour localiser avec précision les tumeurs. Dans le projet, nous proposons de faire la preuve de concept de l’intérêt d’utiliser des anticorps ciblant les tumeurs, conjugués à une sonde (Ac bimodaux) permettant de réaliser de l'imagerie bimodale (SPECT/fluorescence) afin d'améliorer l’analysé pré-opératoire de la tumeur (SPECT), la détection pendant l’opération des tumeurs et leur élimination (FGS) mais aussi d'améliorer le suivi post-opératoire (SPECT). L’utilisation de ces Ac bimodaux dans des modèles de tumeurs sous-cutanées a déjà été démontré, ils permettent la visualisation et l’élimination de cette tumeur facile d’accès. Pour prouver le potentiel thérapeutique de l’utilisation de ces Ac bimodaux en chirurgie par fluorescence, il nous faut maintenant démontrer l’intérêt de cette technologie dans des modèles précliniques mimant la pathologie humaine, tels que des modèles de cancer du côlon et du pancréas se développant sur ces organes, mais aussi des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales. L’objet même de ce projet consiste à développer ces modèles tumoraux pus à utiliser ces Ac bimodaux pour pouvoir réaliser l’imagerie des tumeurs puis ensuite leur élimination par la chirurgie sous caméra. A terme nous nous attendons à démontrer que l’utilisation de ces Ac bimodaux permet une visualisation fine des tumeurs avant la chirurgie (imagerie SPECT) et une détection plus précise par fluorescence permettant de minimiser l'étendue de la résection. L'absence de récidive pourra être détectée en ré-injectant cet Ac bimodal quelques mois après la chirurgie pour visualiser l’absence de récidive (SPECT). Ce projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs, le premier dans lequel sera développé les modèles tumoraux, le second dans lequel l’imagerie et la chirurgie assistée par fluorescence seront réalisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est de pouvoir mettre au point des modèles précliniques mimant la pathologie humaine des cancers coliques et pancréatiques avec des tumeurs se développant sur les organes et mimant ainsi des tumeurs primaires et des modèles mimant la formation de métastases hépatiques ou de carcinomatoses péritonéales d’origine colique. Les bénéfices attendus par ce projet sont de pouvoir développer des modèles précliniques de modèles de cancers afin de pouvoir démontrer l’intérêt de l’utilisation de la chirurgie assistée par fluorescence après administration d’Ac bimodaux. Ce projet devrait permettre une meilleure prise en charge chirurgicale des patients atteints de cancers primaires ou métastatiques en permettant une meilleure détection des tumeurs, facilitant leur élimination en épargnant le tissu sain et évitant ainsi une récidive tumorale.

Procédures

Trois des modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (30 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules ou fragment de tumeur), la fermeture de la cavité abdominale. Dans le cas du modèle de métastases hépatiques, la rate de ces souris sera enlevée suite à l’injection des cellules tumorales. Pour le modèle de carcinomatose péritonéale, les cellules tumorales seront injectées en intrapéritonéale après anesthésie gazeuse des souris (1-2 min/souris). Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2. Les souris recevront 1 injection intrapéritonéale (1-2 min/souris) tous les 7 jours (sous anesthésie gazeuse) du composé permettant l’imagerie des tumeurs. Ces souris seront ensuite anesthésiées à l’isoflurane pour être imagées. Tous les animaux porteurs de tumeurs (orthotopiques ou métastases) subiront une chirurgie d’exérèse assistée par fluorescence après injection des Ac bimodaux (30 min/souris).

Impact sur les animaux

- L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le pancréas ou d’enlever la rate ou encore de ligaturer un morceau de tumeur sur le colon. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. - Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables, la taille de ces tumeurs sera estimée 1 fois par semaine par imagerie. - L’acte chirurgical d’exérèse nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris. Ces interventions chirurgicales pourraient également entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de pouvoir vérifier par autopsie l’absence de reprise tumorale.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces Acs bimodaux pour de la chirurgie assistée par fluorescence nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant. Le but est de montrer que les tumeurs sont plus facilement détectables, qu’elles peuvent être éliminées plus finement et ainsi permettre une meilleure récupération post-chirurgie et enfin qu’il y a moins de récidive. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux présentant ce type de tumeurs et sur lesquels sera fait la FGS. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits, tout comme la preuve de concept sur des modèles plus artificiels d’animaux porteurs de tumeurs sous-cutanée.

Réduction

Pour chaque Ac bimodal à tester (5), deux groupes de 5 souris (contrôle vs Ac bimodal) seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité de la chirurgie tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. La visualisation de la récidive par imagerie SPECT après injection du même Ac bimodal permet de réduire le nombre d’animaux qui sont leur propre contrôle. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Les souris ayant un déficit en système immunitaire, leur hébergement sera réalisé dans des cages sous couvercle filtrant et les interventions chirurgicales seront précédées d’une antibiothérapie préventive. Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation du soin pré au post-opératoire. Des antalgiques sous forme injectable et sous forme de gel seront utilisés lors de la chirurgie puis sous forme injectable les jours suivant l’opération. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture gélifiée sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie assistée par fluorescence. Nous utiliserons des souris immunodéficientes Swiss Nude, nous permettant d’implanter des cellules tumorales humaines. Ces souris ont déjà été utilisée lors des premiers travaux avec des tumeurs humaines implantées en sous-cutané. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Mises à jeun hydrique et isolées, elles passent dix-sept tests de double choix entre deux boissons pour mesurer leur préférence pour des "faux lipides", avant un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'isolement pendant les tests peut être source de stress et prévoit un enrichissement supplémentaire. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut remplacer la souris pour l'évaluation orosensorielle liée à l'obésité.

Objectifs

Des études récentes chez l’Homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules bourgeons du goût (de type 1, 2, et 3) que les saveurs sont détectées. Les récepteurs de lipides (CD36, GPR120) exprimés dans les papilles gustatives sont responsables non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. Ainsi ces deux lipido-récepteurs pourraient représenter la cible pour développer de nouvelles molécules (agoniste / antagoniste) permettant de moduler le comportement alimentaire lipidique chez les obèses. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras, nous avons synthétisé de faux lipides (agonistes de lipido-récepteurs), à partir de d’acides gras naturels, capables d’interagir avec les lipido-récepteurs mimant le goût du gras sans apporter de calories car ils ne sont pas métabolisables. Nous avons démontré l’absence d’effets génotoxiques et tératogènes de ces faux lipides. Cette demande représente l’extension de la précédente autorisation accordée concernant les faux lipides A et faux lipides B et qui sont brevetés L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de nouvelles molécules biosourcées « faux lipides » sur la préférence des aliments gras, et portera essentiellement sur l’évaluation orosensorielle vis-à-vis de ces faux lipides chez souris C57/BL6. Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules réduisent l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider la modulation de l’activité des récepteurs lipidiques linguales par les faux lipides chez la souris et de déterminer si ces molécules modifient la préférence pour les molécules lipidiques et réduisent à long terme l’incidence de l’obésité. Nous espérons que ce projet puisse conduire à l'élaboration de futures stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Les animaux, seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel (test de double choix entre deux boissons) afin de déterminer si les souris présentent une certaine préférence pour les molécules d'intérêt. Pour ce faire, Les animaux seront soumis à une mise à jeun hydrique de 4h avant les tests et pendant le test orosensoriel (durée 4h) les souris seront individualisées, les croquettes seront retirées et auront à leur disposition une bouteille d’eau et une bouteille de solution « test » pendant le test. Chaque lot de 15 souris subira 17 tests de double choix, avec une pause de deux ou trois jours entre les tests. A la fin de l’étude Les animaux seront mis à jeun pendant 4h et soumis à un prélèvement de sang terminal en intra-cardiaque sous anesthésie à l’Isoflurane (3%). Enfin, après mise à mort de l’animal, des prélèvements d’organes auront lieu. Aucun autre prélèvement sur animal vigile n’est envisagé.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact chez les souris puisqu’on est amené à les mettre en cages individuelles (pendant 12 h) lors des tests de double choix. Les animaux peuvent subir un stress suite à l’individualisation pendant la durée des tests. Pour minimiser l'effet de ce stress, un enrichissement supplémentaire (igloo en cellulose en plus des sizzle pad) sera apporté.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’utilisation du modèle animal (souris) s’impose dans ce projet d’une part du fait que nos molécules « faux lipides » sont nouvelles et par conséquent il n’existe aucun outil pharmacologique qui aurait pu permettre la mise en place d’une étude clinique et d’autre part par le besoin d’analyser les mécanismes multifactoriels impliqués dans la perception gustative. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En effet, malgré les résultats obtenus, in vitro, utilisant des cellules gustatives, Il n’est pas possible de se limiter à des approches in vitro pour des évaluations orosensorielles de faux lipides

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux

Raffinement

Les animaux seront parfois isolés pendant la durée du teste double choix (4 h), cependant en dehors des périodes de tests Les animaux seront hébergés en groupes (3-4 souris par cage) dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo en cellulose en plus des sizzle pad). L’état général des animaux sera surveillé de façon régulière et dès l’apparition de signes précoces de souffrance (des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix lors de l’étude des évaluations orosensorielles et les investigations de la modulation du comportement alimentaire par les faux lipides et son incidence à long terme sur l’obésité. A la suite de ce projet nous envisageons dans une seconde étape de tester les molécules les plus préférées par les souris sur l’incidence de l’obésité dans le même modèle de souris. La souris est le modèle de l’obésité qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. Des souris mâles de 8 semaines seront utilisées pour les tests de comportement orosensoriel.

600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie induisant un modèle de maladie de Parkinson, jusqu'à 168 administrations d'un composé selon les voies et jusqu'à 49 tests comportementaux neuropsychologiques. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, inflammation, infection et perte de poids, et que les troubles induits altèrent la locomotion et la démarche. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est disponible et que les animaux ne peuvent être réutilisés du fait de substances aux effets inconnus à long terme.

Objectifs

La maladie de Parkinson touche 1% de la population âgée de plus de 60 ans et 4% de la population des personnes de plus de 80 ans. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui progressivement entraine des troubles moteurs (tremblements, rigidité musculaire, impossibilité ou ralentissement des mouvements). Comme d’autres maladies neurodégénératives, il n’y a pas de traitement capable de stopper ou de guérir la maladie. Les traitements qui existent sont purement symptomatiques. Toutefois, les traitements existants entrainent des effets secondaires sérieux tels que dyskinésie (mouvements anormaux involontaires), désorientation et confusion. Plusieurs voies de recherche sont en cours pour le traitement de la maladie de Parkinson et incluent par exemple la thérapie génique, la greffe de neurones et le traitement par des molécules neuroprotectrices. Un des modèles animaux le plus utilisé dans la recherche sur la maladie de Parkinson est basé sur une lésion unilatérale et sélective par injection d’une neurotoxine dans le cerveau. Cette injection affecte chez le rat la même zone cérébrale que celle endommagée chez les patients atteints de la maladie de Parkinson et permet ainsi de mimer certains de leurs symptômes. Ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de diverses molécules sur le modèle de rat hémi-parkinsonien afin de sélectionner de nouveaux composés pour les essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de mettre en évidence des molécules qui n’ont pas d’effets secondaires sur les animaux et qui permettraient de palier en partie ou totalement aux troubles moteurs et cognitifs de la maladie de Parkinson. Nous testerons aussi sur ce modèle des molécules en phase clinique pour la maladie de Parkinson, afin de mieux appréhender sa prédictivité.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale (20-30 min) sous anesthésie, l’administration, du composé à tester sur animal vigile (sauf pour l’administration intraveineuse qui est faite sous anesthésie) pour une durée maximale de 12 semaines selon ses caractéristiques pharmacologiques ainsi qu’un maximum de 49 tests de comportement neuropsychologiques (moins de 10 min chacun) sur animaux vigiles. En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 168 fois par voie per os, sous-cutanés ou intrapéritonéale ou 84 fois par administrations intra-nasales ou intramusculaires ou encore 10 fois par intraveineuse. A savoir une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Pour le reste des administrations, la durée est de moins de 30 second en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. En parallèle des tests de comportement, des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 12 semaines en ne dépassant pas les recommandations. Les prélèvements de sang dure 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, l’intervention chirurgicale peut induire une douleur transitoire, des signes d’inflammation, d’infection et une perte de poids. De plus les troubles induits peuvent gêner les animaux dans leur vie quotidienne : locomotion réduite et démarche altérée. Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration et/ou un phénomène de mâchonnement ou une fausse route (pour le gavage). Un stress lié aux différentes manipulations et tests comportementaux peut également apparaitre.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Le développement de la maladie de Parkinson et ses symptômes sont des phénomènes complexes qui mettent en jeu plusieurs acteurs (différentes zones cérébrales, muscle, …) et différents processus, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses biochimiques ou histologiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués de 12 à 20 animaux. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, en présence de traitements antalgiques avec une aide au maintien de la température corporelle de l’animal (tapis chauffant) et en garantissant la stérilité de l’intervention. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé, les animaux recevront un antalgique pour prendre en charge leur douleur. De plus les animaux reçoivent de la nourriture en gel pour faciliter leur récupération post-chirurgicale et de la nourriture en granulé est déposée sur la litière. Le poids corporel des animaux sera suivi. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. A côté de cela, il faut noter que nous avons une longue expertise de l’utilisation des rats dans ce modèle de la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 200-250g au moment de la chirurgie). Ce choix est basé sur le fait que la pathologie est induite par chirurgie et ne dépend donc pas de l’âge des animaux. De plus les jeunes adultes supportent mieux les interventions chirurgicales, ce qui nous permet de réduire les risques liés à la chirurgie, de leur assurer une récupération plus rapide et de meilleure qualité.