Recherche appliquée

Six macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une ouverture de la barrière hématoencéphalique et l'injection d'un vecteur viral sous anesthésie, quatre prélèvements de sang et quatre de liquide céphalorachidien et deux IRM, le porteur signalant un risque d'œdème cérébral et de fuite de liquide provoquant maux de tête et signes neurologiques. Le projet relève en partie d'une prestation de service pour des entreprises, en vue d'essais cliniques humains. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le primate est requis par l'agence du médicament pour la toxicologie réglementaire.

Objectifs

Notre equipe est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et développement mais aussi de la prestation de service pour des entreprises. Ici nous voulons tester la capacités des vecteurs à permettre une expression significative dans les différentes zones du cerveau suite à un nouveau mode d’ouverture (confidentiel) de la barrière hématoencéphalique qui protège le cerveau des intrusions d’agents pathogènes et des virus, afin d’établir des voies d’administration non invasives de thérapie pour l’application en santé humaine. Au total le projet utilisera 6 primates maximum sur les 5 prochaines années repartis par groupe de 2 à 3 primates selon les doses de vecteurs administrées.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de faisabilité de l’ouverture de la barriere hématoencéphalique qui protège le cerveau par une nouvelle technologique. et nous nous attacherons à démontrer son efficacité couplée à l’administration de vecteurs viraux à but thérapeutique pour le ciblage du cerveau chez le PNH en vue de proposer des essais cliniques de phases I et II chez l’Homme et ainsi de disposer de toutes les données requises pour le dépôt d’un dossier à l’agence du médicament. La barrière hématoencéphalique est une protection du système nerveux central (SNC) des pathogènes et virus mais est pour la même raison une limite à l’atteinte efficace du SNC par les composés injectés en intraveineux.

Procédures

- une ouverture de la Barriere hématoencéphalique sur animal anesthésié et sous analgésie avec corticoides puis une injection Intraveineuse de vecteur adéno-associé sur l'animal sous anesthésie générale (durée 1h30) - 4 prélèvements sanguins, 4 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (durée du geste maximum 30min), sous anesthésie générale et analgésie. - 2 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 2h), sous anesthésie générale Dans ce projet, comme décrit précédemment, une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien + IRM)

Impact sur les animaux

Une ouverture de la barriere hémato-encéphalique avec injection intraveineuse du traitement avec un risque anesthésique et un risque d’œdème cérébral lors de l’ouverture de barrière Plusieurs prélèvements de sang et de LCR avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques ) et la formation possibles d’hématomes - stress lié à la contention en cage pour la réalisation des injections (anesthésie, analgésie, antibiotique,…)

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études post-mortem des tissus et des organes et vérifier la distribution du vecteur médicament dans les organes afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de cette approche.

Remplacement

Les études in vitro pour valider la cible thérapeutique sont effectuées en amont de ce projet afin de valider l’utilisation de notre cible thérapeutique dans les modèles murins de la pathologie. À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de culture ou de système cellulaire pour étudier l’efficacité de l’ouverture de barrière hématoencéphalique, encore moins pour évaluer l’efficacité de transduction consécutive à l’ouverture de cette barrière. Enfin, notre stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude d’efficacité, de toxicité, sur un modèle ayant un système nerveux plus développé que le rongeur et le plus pertinent pour reproduire ce qui se passera chez l’Humain est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence francaise du médicament pour toute demande d’autorisation pour la réalisation d’étude clinique (chez l’homme).

Réduction

Il y a 6 animaux maximum sur ce projet, correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité des différentes approches avec des lots d’animaux allant de 2 à 3 animaux et un suivi 6 semaines post injection L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement, perchoir, échelle, hamac…). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie. l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et les injections virales, permettra d’ éviter au maximum les inconforts. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présente pas d'amélioration suite à une prise en charge vétérinaire, il sera euthanasié (avec avis vétérinaire) après avoir été anesthésié. Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, elles sont réalisées par du personnel formé et expérimenté́. Enfin, les étapes du suivi sont prévues pour optimiser le nombre d'anesthésies en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal), ponction lombaire, imagerie par résonnance magnétique

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du macaque en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en termes de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur médicament dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole qui sera réalisé chez l’Homme. L'injection de vecteurs AAV chez le macaque est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance pour l’Homme d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par nos approches

212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue puis une série de prélèvements de sang répétés sur animal vigile, échelonnés sur vingt-huit jours, pour suivre le devenir sanguin de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que le micro-échantillonnage réduit le volume de sang prélevé et le nombre de souris. Il affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire. 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire (10min, 1h, 6h, 24h, 72h, 3 jours, 7 jours, 14 jours, 21 jours et 28 jours).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, ainsi que l’ensemble des animaux à l’issue de la procédure, seront euthanasiés.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 10% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes non anticipables afin de ne pas mettre en péril les résultats de cette expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections répétées, intratumorales, intramusculaires ou intrapéritonéales, et des gavages sur animal vigile, pour tester des immunothérapies contre des tumeurs rhabdoïdes de l'enfant. Les retombées annoncées pour les patients restent formulées comme des perspectives de soins cliniques. Le porteur affirme que l'étape chez la souris est "indispensable" pour évaluer l'efficacité de ces traitements avant une application humaine.

Objectifs

Les tumeurs rhabdoïdes (RT) sont des cancers rares mais très agressifs, qui touchent les nourrissons et les jeunes enfants, et se développent dans une grande variété d'organes, tels que le rein, le foie et le cerveau. L'agressivité de ces tumeurs nécessite aujourd'hui des traitements chirurgicaux, de chimiothérapie et de radiothérapie très intenses, qui ne sont efficaces que pour une minorité de patients et sont associés à des effets secondaires très graves. Ce scénario démontre un besoin urgent de développer des thérapies innovantes. Il a été récemment démontré que l'immunothérapie, un traitement qui renforce les défenses immunitaires naturelles de l'organisme, peut améliorer le contrôle tumoral d'un grand nombre de cancers. Cependant, elle n'a pas été testée sur les RT car, jusqu'à récemment, on pensait que ces tumeurs étaient invisibles pour les cellules immunitaires. Nos résultats préliminaires suggèrent que les RT peuvent être reconnues par les cellules immunitaires et que certaines stratégies d'immunothérapie pourraient être efficaces dans le contrôle de ces tumeurs. Ce projet a pour but d'explorer quelles molécules de la tumeur sont reconnues par les cellules qui défendent notre corps et ainsi, de développer des immunothérapies combinatoires pour renforcer les réponses anti-tumorales sans générer des effets secondaires graves. Ce projet sera développé par une équipe multidisciplinaire qui implique des pédiatres, des bioinformaticiens, des experts en chimie et en immunologie, ce qui nous permet de disposer des meilleurs outils pour mener à bien cet objectif.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier les mécanismes d’action de certains traitements par immunothérapie ciblant différentes populations de cellules immunitaires et de plus, les résultats obtenus seront importants pour des applications en soins cliniques des patients atteints de ce cancer rare. Ils pourraient également ouvrir de nouveaux champs de recherche pour d'autres cancers pédiatriques partageant des caractéristiques similaires.

Procédures

L’ensemble des procédures vise à évaluer l’effet de traitement sur la progression tumorale, donc l’ensemble des animaux seront greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée intervention inférieure à 10 min). Puis, dans une première procédure, les animaux seront traités tous les 2 jours avec 3 injections au total par voie intratumorale ou intra-musculaire sur animaux vigiles (durée du geste inférieur à 10 sec). Dans une seconde procédure, les animaux seront traités avec un produit tous les 2 jours pour 3 injections au total par voie intratumorale (durée du geste inférieur à 10 sec), et avec un autre produit chaque jour pendant 7 jours par voie intrapéritonéale, sur animaux vigiles (durée du geste inférieur à 10 sec). Dans une dernière procédure, les animaux seront traités avec un produit tous les 2 jours pour 3 injections au total par voie intratumorale (durée du geste inférieur à 10 sec). En parallèle ils seront traités avec un autre produit 2 fois par semaine tout au long de l’expérience par voie intrapéritonéale, ou chaque jour pendant 21 jours par voie intrapéritonéale (durée du geste inférieur à 10 sec), sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux sont greffés avec des tumeurs par voie sous-cutanée dont la croissance sera suivie par des mesures régulières. Les nuisances seront associées à celles d’une petite ouverture du plan cutané (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet découle de résultats préliminaires déjà obtenus d’une part in vivo démontrant l’efficacité d’une immunothérapie sur ce type de tumeur et d’autre part de l’analyse bioinformatique de gènes exprimés par les tumeurs et des gènes exprimés par les cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Après ces étapes ayant permis de démontrer l’intérêt de moduler le système immunitaire pour traiter ces tumeurs, et étant donné que la tumeur interagit avec l'ensemble de son environnement in situ (plusieurs types de cellules immunitaires avec des activités parfois contraires, vascularisation, stroma…) pour se développer, l'évaluation pré-clinique des traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours grâce à la culture et aux tests fonctionnels in vitro, l’étape chez la souris est indispensable pour évaluer l'efficacité et le mécanisme d'action de ces types de traitements combinés avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans les conditions réglementaires et sont surveillées régulièrement dont 2 fois par semaine pour mesurer la taille des tumeurs. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux Les animaux sont mis à mort lorsque les points limites énoncés dans la grille de score sont atteints. La greffe des tumeurs est réalisée sous anesthésie accompagnée de l’administration d’un anti-douleur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies anti-tumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés. Les souris seront utilisées à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire adulte.

Neuf lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, six tués pour le prélèvement des tissus, les autres réutilisés ou renvoyés à l'élevage. Ils reçoivent une administration intranasale puis des prélèvements de sang sur animal vigile, maintenus dans une boîte de contention, pour mesurer la diffusion d'une molécule candidate contre les maladies d'Alzheimer et de Parkinson. Le porteur indique que la mise à mort passe par une électronarcose, choc électrique précédant l'exsanguination. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang et les tissus et qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal dans son ensemble.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres de biodistribution et les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test dans le sang et d'évaluer la biodistribution dans les tissus aprés une administration intranasale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques de la formulation test et d'évaluer la biodistribution de cette formulation au niveau tissulaire . L'objectif est de trouver une nouvelle molécule efficace contre les maladies d'Alzheimer / Parkinson.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration intranasale. Deux pulvérisations par narine. Durée inférieure à la minute. Puis les animaux auront 1 prélèvement ( 6 animaux sur 9 concernés) ou 6 prélèvements de sang (3 animaux sur 9 concernés). Durée inférieure à la minute. Pour les administrations, prélèvements sanguin ou euthanasie les animaux seront contentionnés de manière manuelle ou dans une boite de contention. Durée de la contention entre 1 ou 2 minutes. Cela sera réalisé conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.

Impact sur les animaux

Les animaux seront contenus dans une boîte à contention pour réaliser les administrations intranasales. La contention et les pulvérisations intranasales peuvent engendrer un stress pour l'animal. Des prélèvements de sang seront fait sur animal vigile au niveau des veines jugulaires et auriculaires. Les prélèvements de sang peuvent engendrer un stress liée au prélèvement en lui même et à la contention. Les prélèvements sanguins peuvent aussi engendrer de la douleur aux sites de prélèvements. La contention de l'animal pour l'électronarcose (choc électrique avant exsanguination) peut également être génératrice de stress.

Devenir

Dans ce projet, 12 animaux seront inclus 9 animaux seront administrés avec la formulation test, ces animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus afin d'évaluer les paramètres de biodistribution. 2 animaux seront utilisés pour valider la techique d'administration (administration d'un placebo (NaCl0.9%) uniquement) 1 animal de réserve sera utilisé pour générer de la matrice témoin

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang et dans les tissus il est donc nécessiare de recourir à l'animal dans son ensemble. Les essais de biodisponibilité in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet. Les objectifs de ce projet sont de savoir quelle quantité de produit va rejoindre la circulation sanguine et d'évaluer également la distribution du produit au niveau tissulaire.

Réduction

12 animaux seront inclus dans ce projet. 9 animaux seront administrés et 3 animaux spares sont prévus. 2 animaux seront utilisés pour valider la méthode d'administration par voie intranasale et le lapin supplémentaire sera utilisé si besoin ou pourra être utilisé pour générer de la matrice témoin. Les animaux seront réparti en 3 groupes de 3 animaux. 3 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats significatifs par rapport aux paramètres pharmacocinétiques et pour pouvoir estimer la biodisponibilité de la molécule testée dans les tissus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en boxe collectif dés l'arrivée jusqu'à la fin de la phase animale. 4 boxes de 3 animaux. Cet hébergement collectif est nécessaire durant l'étude pour un contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, milieu enrichi adapté à l'espèce (copeaux, cachette, buchette à ronger ..) Toutes les manipulations sur les animaux seront faites par un personnel formé, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce fréquemment utilisée en recheche pre-clinique pour le développement de médicaments destinés à l'homme et la taille de cet animal permet de le manipuler assez facilement. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes afin de ne pas avoir de pathologies liées au vieillissement .

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ingèrent une molécule qui endommage la barrière de l'intestin et reçoivent un agent qui provoque des tumeurs, développant diarrhée, douleur viscérale, saignements et perte de poids, avec prélèvements de sang répétés et traitements deux fois par jour. L'objet est de tester des molécules anti-inflammatoires et anticancéreuses contre les maladies inflammatoires de l'intestin et le cancer du côlon, y compris sur des souris au système immunitaire humanisé. Le porteur qualifie ces modèles d'"indispensables" tout en reconnaissant que la réponse immunitaire de la souris diffère de celle de l'humain.

Objectifs

Les deux principales formes de maladies inflammatoires de l'intestin, la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, sont des troubles inflammatoires chroniques récidivants du tractus gastro-intestinal. L'étiologie est très probablement une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux favorisant la désintégration de la barrière épithéliale intestinale et la dérégulation de la réponse immunitaire au microbiote intestinal. Rien qu'en France, on dénombre plus de 200 000 patients atteints de MICI. Les cancers de l’intestin, notamment le cancer colorectal, peuvent être associés à la forme chronique des MICI et/ou aux traitements associés. N’ayant pas de traitement efficace pour les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer colorectal, de modèles pré-cliniques sont nécessaires afin de tester l’efficacité de produits candidats à visée thérapeutique. L'un des modèles les plus utilisés pour étudier les maladies chroniques de l’intestine est le modèle d'inflammation intestinale induite par le DSS (Dextran Sulfate Sodium). Afin de modéliser le cancer du colon, l’injection d’azoxymethane (AOM) associé au modèle chronique de DSS est ainsi un outil indispensable. Les modèles précliniques sont donc indispensables pour tester l'efficacité des médicaments à cet égard. Les modèles murins d’inflammation intestinales sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction de la barrière intestinale ainsi que le microbiote. En revanche, on craint de plus en plus que les mécanismes immuno-pathogènes observés dans les ces modèles ne soient pas les mêmes que ceux que l'on pense observer chez l'homme. Nombreuses études ont démontré que la réponse immunitaire murine différencie en structure et en fonction dans des nombreux cas de celles de l’homme, ce qui peut expliquer les taux d’échec dans l’utilisation des données précliniques prometteuses en nouveaux traitements en clinique. Cette réalité inconfortable a incité un certain nombre de chercheurs à entreprendre une série d'études visant à humaniser le système immunitaire murin par le transfert adoptif de cellules progénitrices lymphoïdes ou hématopoïétiques dans une nouvelle génération de receveurs immunodéficients. Ainsi, les souris humanisées au niveau du système immunitaire permettront de comprendre l’interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et également avec les tumeurs.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, le projet validera les doses de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d'AOM (azoxymethane), avant de tester l'efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires et anticancéreux) en utilisant différents modèles/stades de pathologies intestinales. En outre, ce projet évaluera ces maladies intestinales dans un modèle de souris au système immunitaire humanisé. Ces souris recevront des cellules souches humaines capables de se différencier en cellules immunitaires humaines. Il s'agit d'un modèle innovant, car peu étudié à ce jour, et qui répondra à la crainte de plus en plus exprimée vis-à-vis des modèles murins traditionnels : la réponse immunitaire humaine diffère de la réponse murine, donc les souris humanisées au niveau du système immunitaire (NXG-HIS) seront un atout comme modèle préclinique pour l'étude de ces maladies, où la composante inflammatoire et le système immunitaire jouent bien évidemment un rôle primordial. Ce modèle nous permettra également de comprendre l'interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et avec les tumeurs.

Procédures

Pour induire l’inflammation intestinale chez la souris, de l’eau de biberon contenant du DSS (Dextran Sulfate Sodium-une molécule capable d’endommager la barrière intestinale) sera donner aux animaux pendant 7 jours (modèle aigu) ou 5 jours (modèles chroniques) en 3 cycles. Pour l’induction de la tumeur au niveau du côlon, une injection d’azoxymethane (intrapéritonéale) sera donnée avant les cycles de DSS. Les animaux auront des prélèvements de sang en avant l'induction de l'inflammation intestinale ou de la tumorigenèse. Le prélèvement sera fait à la veine maxillaire (en vigile) ou au sinus retro orbitaire (sous anesthésie). D’autres prélèvements au cours de l’étude sont prévus : 1 fois après 15 jours d'intervalle pour le modèle aigu et 3 fois avec un intervalle de 12 jours entre chaque prélèvement pour les modèles chroniques. Le volume à prélever sera de maximum 10% du volume total de sang circulant de l'animal par prélèvement (64mL/kg). Les animaux seront quotidiennement traités par une des voies suivantes : orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, deux fois par jour en respectant le volume journalier à être administré. Pour le DAI (l’indice d’activité de la maladie), les fèces seront récoltées quotidiennement (pendant 12 jours, en modèle aigu et 60 jours, en modèles chroniques) afin de vérifier la présence de sang et sa consistance. La récolte est faite par isolement de l’animal dans une cage propre et sans enrichissement, nourriture et l’eau pendant maximum 30 minutes/jour. A la fin de la phase expérimentale, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement maximal de sang par ponction cardiaque. Ensuite, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’effet attendu du DSS (Dextran Sulfate Sodium) est l’inflammation intestinale qui perturbe la digestion et l’absorption des nutriments dû à l’altération de la barrière intestinale. Les effets du DSS sur la santé de l’animal seront la diarrhée, la douleur viscérale, le saignement, la perte de poids et l’apathie, principalement. Le score de l’indice d'activité de la maladie qui consiste en évaluer la perte de poids corporel, la diarrhée et le saignement) est mesuré tous les jours pendant la phase expérimentale et permettra rapidement de connaître l’avancement de la maladie et la détérioration de l’état de santé de l’animal. L’objectif du modèle est d’avoir des animaux malades, mais pas dans un état sévère d’inflammation. L’AOM (azoxymethane) est un mutagène qui induit la formation des tumeurs. Il est donc attendu que les souris perdent du poids, aient de la diarrhée, des douleurs abdominales et deviennent apathiques. On attend le développement des tumeurs au niveau intestinal, sans pour autant induire la mort des animaux. Les effets secondaires des candidats thérapeutiques à tester ne sont pas connus, ni leur nature. De ce fait, il nous est impossible de prévoir les nuisances pour les animaux. En ce qui concerne la souris humanisées et son phénotype, celui-ci n’est pas dommageable pour la souris, c’est-à-dire cela n’augmente pas la sévérité des pathologies étudiées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles in vitro, tels que les organoïdes intestinaux ou simplement des lignées cellulaires, ne peuvent pas mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En revanche, ces modèles permettent de sélectionner au préalable des molécules d’intérêt avant de passer dans un modèle pré-clinique in vivo. Ensuite, une fois les pilotes in vivo faites et le screening in vitro réalisés, des tests peuvent être fait en nombre réduit d’animaux à une quantité relevant pour garantir la puissance statistique.

Réduction

L’objectif des études pilotes prévues dans ce projet est de limiter le plus possible le nombre d’animaux dans les modèles qui seront ensuite utilisés. Pour les études pilotes, le suivi quotidien et accru des animaux permettra de sélectionner la dose de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d’AOM (azoxymethane) la plus juste afin d’avoir un phénotype pathologique, sans pour autant induire la mort des animaux. En revanche, dans les modèles pré-cliniques, le fait de ne pas connaître les effets indésirables des molécules à visée thérapeutique in vivo et avec l’objectif de garder la puissance statistique, la quantité d’animaux devra être augmentée de 20% par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et plusieurs types d’enrichissement seront mis dans les cages qui hébergent les animaux (tunnel, Aspen brick, igloo et Sizzle-Nest). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence des points limites à savoir : la prostration ou absence de mouvement, la perte de poids supérieure à 20% du poids d’origine et la diarrhée liquide accompagnée d’un saignement accru. Si un animal présente un des points limites, il serait pris en charge par l'équipe zootechnique. Si son état ne s’améliore pas dans les 24h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieront. Si l’animal présente une plaie, par exemple, des soins de nettoyage et désinfection seront effectués.

Choix des espèces

Les modèles d’inflammation intestinale par DSS (Dextran Sulfate Sodium) et le modèle de cancer du colon induit par l'AOM (azoxymethane) suivi de l'inflammation chronique induite par DSS sont très bien décrits et caractérisés dans la littérature. Pour les souris normalles, non-humanisées, la maturité sexuelle est atteint pour les mâles à 8 semaines et pour les femelles à 6 semaines. Donc, pour que les animaux soient matures, ils rentreront en étude qu'à partir de l'âge de 8 semaines. En revanche, pour les animaux humanisés, dû au processus d’humanisation, les animaux rentreront en étude à partir de 15 semaines d'âge.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses ou une implantation chirurgicale de tumeur sous la peau, puis des injections répétées d'anticorps, la tumeur pouvant provoquer perte de poids et douleurs. L'objet est de créer plusieurs modèles de cancers rendus résistants à des immunothérapies pour tester de nouveaux traitements. Le porteur affirme que la mise en place d'une résistance acquise est "davantage pertinente" dans un organisme entier qu'in vitro.

Objectifs

Plusieurs traitements par anticorps ont été approuvés pour le traitement de diverses tumeurs solides, permettant au système immunitaire d’être à nouveau activé et fonctionnel pour détruire les cellules tumorales et constituant une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Cependant, un nombre croissant d’observations réalisées chez les patients mettent en évidence un phénomène de résistance, parfois innée mais plus souvent acquise au fil des traitements à ces thérapies par anticorps. La recherche se concentre donc maintenant à contourner ou reverser cette résistance grâce à de nouveaux traitements, et il y a un besoin urgent de nouveaux modèles permettant de modéliser ce phénomène de résistance acquise. Nous avons ces dernières années développé une forte expertise dans ce domaine grâce à la mise en place de plusieurs modèles de résistance à des anticorps. L’objectif du présent projet vise donc à développer plusieurs modèles de cancers de différentes indications (pancréas, colon, mélanome, vessie, foie et poumons) avec une résistance dite acquise à des anticorps spécifiques en utilisant la méthodologie que nous avons précédemment validée. Ces modèles permettront de tester de nouvelles thérapies dans le but de contourner la résistance acquise aux anticorps et également d’investiguer les mécanismes de résistances mis en jeu.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il existe aujourd’hui peu de stratégies thérapeutiques pour les patients résistants aux thérapies par anticorps. L’étude de nouvelles stratégies grâce à la génération de lignées résistantes va permettre de développer en phase préclinique de nouveaux traitements qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Injection (unique) des cellules cancéreuses sur souris vigiles en sous-cutanée dans le flanc droit : contention et geste de quelques minutes - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous la peau, 5 minutes maximum - Injections intrapéritonéales d'anticorps non toxiques, durée du geste : 30 secondes - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Les animaux vont subir une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs en sous-cutanée, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection intrapéritonéale. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de la tumeur dans le cadre d'un passage ou d'une analyse ultérieure. Ils seront également euthanasiés si le volume tumoral atteint le volume éthique.

Remplacement

Les interactions entre la tumeur et le reste du corps sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur. Une fois les tests in vitro réalisés, il est nécessaire par la suite d'étudier leur comportement au sein de l'organisme vivant en présence de ces interactions et de ces paramètres précédemment cités. Pour ces raisons, la mise en place d’un modèle de résistance est davantage pertinente dans un organisme entier.

Réduction

Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 1152 animaux au total pour cette étude.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux).

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Cette souche de souris a déjà été utilisée pour la mise en place de ces modèles au sein de notre laboratoire et nous avions de bons résultats de prise tumorale. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous la peau un système diffusant un corticoïde pendant cinq mois, puis des prélèvements de sang et d'urine chaque semaine, des injections sous-cutanées et intramusculaires deux fois par semaine, des gavages quotidiens et des radios, provoquant traumatismes et inflammations aux sites d'implantation. L'objet est d'évaluer un traitement contre la fragilité osseuse induite par les corticoïdes. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" en affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité du traitement étudié à résorber les atteintes osseuses qui surviennent lors d’une corticothérapie chronique (La corticothérapie est un traitement à base de corticoïdes, des médicaments aux propriétés anti-inflammatoires). En effet, des études de pharmacovigilance ont montré qu’une fragilisation osseuse est induite lors d’une corticothérapie et est caractérisée par une réduction de la minéralisation osseuse, altération de l’architecture et de la densité minérale de l’os. De plus, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques agissant sur le métabolisme osseux, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal la capacité d’un traitement à éviter l’apparition d’atteintes osseuses, comme de caractériser les effets indésirables que pourrait entrainer le composé thérapeutique étudié. Cette étude permettra de définir les types de lésions osseuses (ostéoporose) qui sont observées lors de la corticothérapie, de proposer des schémas thérapeutiques d’administration adaptés afin de réduire et/ou abolir ses potentiels effets délétères, et de caractériser la capacité du traitement à stopper le développement des lésions osseuses. .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesureront à plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra de générer des informations sur la potentielle toxicité osseuse du traitement étudié. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications physiologiques osseuses chez les animaux après application du traitement. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Une implantation sous-cutanée de système de diffusion continue de corticoïde est prévue pour chaque animal. Cette procédure durera environ 20 min et se fera sur animal anesthésié. Le système de diffusion restera en place pour une période maximum de 5 mois. Des prélèvements sanguins et urinaires sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des injections sous-cutanées sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 1 min. Des injections intra-musculaires sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 2 min. Des gavages se feront sur animal vigile 1x/jour sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque gavage durera moins de 5 min. Des radios sont prévues 2x/mois sur animal anesthésié. Chaque radio durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation du système de type ALZET (dispositif de diffustion de molécules en continu). Cette procédure étant douloureuse à court terme, une anesthésie, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le traitement et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés/principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 12 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité et de ceux obtenus entre chaque protocole de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion altérée, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents traitements seront utilisés.