Recherche appliquée

48 rats et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Présenté comme un projet de raffinement destiné à améliorer le bien-être des animaux non-humains lors des prélèvements, il compare la ponction sous contention à un dispositif implanté chirurgicalement, le "Vascular Access Button", en imposant gavages, tests de tolérance au glucose et prélèvements sanguins hebdomadaires jusqu'à obturation du dispositif. Le porteur indique n'attendre "normalement" aucun effet indésirable tout en anticipant la perte de quelques animaux par complication chirurgicale, une nécropsie clôturant l'étude. L'amélioration annoncée du confort des animaux sert d'abord à valider un outil pour les futurs projets de recherche de la société.

Objectifs

La règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) est un des piliers majeurs du bien-être animal et il est aujourd’hui encore impossible de se passer totalement du modèle in-vivo pour certains projets de recherche. Quand cela est possible, l’utilisation d’animaux peut être remplacée, par des modèles in vitro (culture cellulaire, enzymologie …), des modèles non régi par l’expérimentation animale (drosophile, c elegan …) ou encore en ayant recours à de la modélisation informatique (in silico). Nos projets de recherche en développement nécessitent d’avoir recours à des prélèvements répétés de sang chez les rongeurs vigiles. Ces prélèvements en plus d’être chronophages, peuvent induire un stress aigu notamment à cause de la contention de l’animal ce qui peut participer à la variabilité des résultats. Pour répondre à cette problématique et dans un contexte de raffinement, l’objectif de ce projet de comparer deux techniques de prélèvement sanguin chez le rat et le hamster vigile. La première méthode est une des méthodes de référence pour obtenir un échantillonnage de sang via une contention de l’animal et une ponction au niveau de la veine gingivale (hamster) et de la veine caudale (rat). La seconde méthode de prélèvement nécessite d’avoir recours à une légère chirurgie pour permettre l’implantation du système « Vascular Access Button ». Ce bouton transcutané comporte un port externe avec un septum pour un accès rapide, propre et répété au cathéter implanté sur l’animal. Les applications incluent le dosage bolus ou continu, le prélèvement sanguin et l’auto-administration IV. Pour un accès intermittent, il est possible d’utiliser une seringue équipée d'un injecteur PinPort™ sans aiguille ; et pour un accès continu depuis l'extérieur de la cage, il est possible d’utiliser une attache d'accouplement. Ce système permettrait : - D’améliorer les prélèvements en contrôlant mieux le volume, la zone et la « propreté » du prélèvement (raffiner). - De diminuer le stress des animaux au moment du prélèvement (aucune contention n’est nécessaire) - D’améliorer le confort manipulateur

Bénéfices attendus

Si les résultats de ce projet sont concluants, le VAB pourra être utilisé sur hamsters ou rats sur notre plateforme de recherche. Le système de prélèvement VAB permettrait de pouvoir réaliser des échantillonnages sanguins sans avoir recours à la contention de l’animal ou sans introduction multiples d’aiguilles, notamment dans le cadre de cinétiques sanguines (type OGTT, PK).

Procédures

Évaluation de la composition corporelle : 1 fois en début d'étude et 1 fois au moment du test de tolérance au glucose. Cet examen implique une légère contention inférieure à 1 min par animal. Test de tolérance au glucose : 1 fois (composé d'un gavage d'une solution sucrée puis de 5 prélèvements sanguins). Ce test dure 2h et inclus 1 gavage durant moins de 30 secondes et 4 contentions durant chacune moins de 1 min. Mise à jeun de 5h : 1 fois avant l'OGTT. Prélèvements de sang hors OGTT : 1 fois par semaine jusqu'à obturation du dispositif (fin de la procédure). Nécessite une contention inférieure à 1 min. Chirurgie d'implantation d'un système de prélèvement sanguin : 1 fois. L’anesthésie, la chirurgie et le réveil de l’animal sont réalisés entre 30 et 45 min par animal. Chacun de ces actes sont réalisés par des personnes formées et expérimentées.

Impact sur les animaux

L’objectif étant de mettre en place un système de prélèvement permettant d'améliorer le bien-être animal lors de prélèvements répétés, aucun effet indésirable sur les animaux n'est normalement attendu. S’agissant cependant d’un projet de mise au point passant par la pose d’un VAB par technique chirurgicale, des complications liées à cette pose se traduisant par perte d’un nombre restreint d’animaux dans le temps chirurgicale pourrait apparaitre en début de projet.

Devenir

Une nécropsie de fin d'étude sera nécessaire pour évaluer le site d'implantation des dispositifs. Les animaux ne pourront pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

Le prélèvement sanguin est un acte in vivo par définition. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. D’autres techniques de prélèvement sur animaux vigiles sans recours à la chirurgie préalable existent, mais ils sont moins adaptés que la pose d’un cathéter lorsqu’il s’agit de recourir à des prélèvements répétés.

Réduction

La taille des groupes est choisie de manière à obtenir une puissance statistique minimale, mais suffisante pour les paramètres clés (évaluation de la perméabilité des capteurs dans le temps et glycémie lors de la cinétique OGTT). Les valeurs seront présentées comme la moyenne ± SEM. Les différences seront considérées comme statistiquement significatives à p

Raffinement

Tous les animaux de ce projet suivront une période d’habituation d’au moins une semaine avant de commencer les procédures, ils seront hébergés dans un environnement contrôlé et adapté (cages ventilées, 22°C, 30-70% d’humidité, cycle J/N 12 :12). Les cages seront enrichies à l’aide de matériel de nidification et d’un tube rouge permettant aux animaux de se cacher et aux techniciens de les manipuler. Un contrôle quotidien sera réalisé pour permettre de relever et documenter l’apparition de signes cliniques. Un traitement analgésique sera mis en place en péri-opératoire. La chirurgie sera réalisée sur animaux anesthésiés sous isoflurane 2.5% durant la procédure. Un traitement analgésique sera mis en place en péri-opératoire. Enfin des points limites sont déterminés et appliqués pour chaque procédure.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ces projets correspondent aux espèces et souches utilisées dans nos différents projets de recherche et developpement. Il est nécessaire de valider le dispositif dans les conditions expérimentales de son utilisation ultérieure. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 semaines à la réception et suivront une chirurgie à 10 semaines. À cet âge un poids de 100/110g pour le hamster et de 300/350g pour le rat est attendu et correspond à un stade de développement de jeune adulte. Cet âge et ce poids sont compatibles avec l’acte chirurgical à réaliser et correspondent à l’âge et au poids d’utilisation des animaux dans les différents projets de développement de la société.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier le micro-environnement des méningiomes de haut grade. Elles reçoivent des injections intracrâniennes de cellules tumorales ou de virus pour induire des tumeurs cérébrales, suivies d'injections modulant le système immunitaire. Le porteur décrit des symptômes possibles comme une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement et des crises convulsives, avant une mise à mort pour analyse du cerveau. Il affirme qu'aucune culture cellulaire de méningiome n'existe et juge le modèle murin "primordial" pour cette étude.

Objectifs

Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutations NF2 et représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une morbidité et une survie réduite sans option disponible médicamenteuse ou d’immunothérapie. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire par la diversité de leurs cellules immunes et la présence de vaisseaux lymphatiques méningés. Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes bénins par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire constitué par les cellules immunes méningées et les lymphatiques méningés, régule la progression histologique maligne des méningiomes NF2-mutés et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité en manipulant le micro-environnement pour déterminer (i) si les lymphatiques méningés régulent effectivement la malignité des méningiomes et (ii) évaluer la participation des populations de cellules immunitaires dans l'initiation et la progression du méningiome.

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes-NF2 en manipulant ses composantes lymphatiques et immunitaires dans les méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme.

Procédures

Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisées selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Injection intra-crânienne pour induire des tumeurs – de lignées celullaires ou de virus recombinants (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Injection intra-cérébrale pour augmenter le drainage lymphatique (Durée : 1 heure, préparation 30 min) Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Une injection sous-cutanée au niveau de la peau du crane (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) 2. Une injection intra-péritonéale (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) . les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet inclure les nuisances suivantes : Les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale et intracérébrale tels que dépression cardio vasculaire, hypothermie, hypovolémie, sécheresse cornée et les douleurs post-opératoires. Le stress de la contention et la douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous-cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifié par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs de l'ensemble des procédures expérimentales.

Remplacement

Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris déjà existants. La complexité du cerveau/méninges des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau/méninges humain. L’utilisation d’un modèle murin est donc primordiale pour cette étude.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 540 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs et sur un calcul de puissance, et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interpétation fiable des résultats.

Raffinement

A la réception des animaux en provenance de l’exterieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification, des bâtonnets à ronger et des maisons sont également disponibles. Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau. Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et déposé sur la litière et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie,) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zoothechnique et chaque jour de la semaine par un des membres de l’équipe de recherche (et plus si nécessité). Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine tout au long de la procédure expérimentale à partir de la première expérimentation (à l’âge de 2 mois) jusqu’à l'euthanasie (entre 5 et 15 mois selon les procédures). Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgiques.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de 2 à 15 mois de manière similaire aux précédents modèles de meningiomes publiés précédemment, un suivi d’au moins 12 mois étant nécessaire pour les modèles souris de méningiomes bénin génétiquement modifié où les méningiomes apparaissent de manière tardive

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour tester une lignée porteuse d'une mutation proche de celle des patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires. Elles subissent des tests de force et de locomotion répétés chaque semaine, un test de saignement pour évaluer la coagulation et des injections de traitement, avant une mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur présente la plupart des tests comme non invasifs tout en décrivant du stress et des douleurs liées aux injections. Il affirme qu'un modèle cellulaire ne permet pas d'évaluer la contractilité musculaire ni les effets sur un organisme entier, s'agissant d'une maladie multisystémique.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM), associée au syndrome de Stormorken (STRMK) est une maladie touchant notamment les muscles, la coagulation sanguine et la peau. Cette myopathie peut être causée par différentes mutations génétiques, et il manque encore des modèles adaptées pour étudier la maladie et la traiter. Ce projet vise donc à étudier une nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Si les principaux signes de patients sont trouvés chez les souris, cette lignée serait confirmée comme un modèle approprié pour le TAM/STRMK. Ce modèle permettra de mieux comprendre le syndrome TAM/STRMK, en fonction de la mutation. En plus, dans ce projet, nous mettrons également en œuvre une stratégie thérapeutique visant à prévenir et à inverser la maladie dans le modèle murin en ciblant un acteur clé de la cause de la maladie.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra d’approfondir notre connaissance des causes et du fonctionnement de la maladie. De plus, avoir en notre possession des modèles TAM/STRMK nous permettra de trouver la thérapie la plus appropriée, en fonction de la cause génétique spécifique. Enfin, cette étude présente un intérêt pour un éventail plus large de maladies comme la dystrophie de Duchenne ou la pancréatite aiguë.

Procédures

Des tests de comportement seront réalisés une fois par semaine sur les souris vivantes, à partir de 1 mois (cohorte 1) ou 4 mois (cohorte 2) et jusqu'à 4 mois (cohorte 1) ou 8 mois (cohorte 2) d'âge. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour. Chaque essai durera au maximum 60 secondes. Le test permettant de mesurer la force musculaire des pattes de l’animal dure 10 secondes, et sera répété 3 fois par jour. Le test permettant mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 12h. Le test de saignement, utilisé pour évaluer la coagulation sanguin, sera réalisé une fois, et il durera au maximum 10 minutes. Les mesures de force musculaire seront réalisées pendant 10 minutes. Le test de production de force du muscle durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera euthanasié. Le test pour l'obtention du sang sera répété 2 fois dans la vie de la souris, et durera 1 minute. Des injections pour administrer le traitement prendront environ 2 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Le nouveau modèle peut avoir un impact indésirable sur l'animal. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. De plus, les injections administrées pour le traitement peuvent causer de la douleur à l'animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issu des tests pour préléver les muscles nécessaires aux analyses moleculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Dans le cadre de notre expérimentation, nous employons des tests phénotypiques non invasifs, ce qui signifie que nous n'occasionnons aucun préjudice aux animaux que nous étudions. Cette approche nous permet d'effectuer un suivi longitudinal en répétant les expériences sur les mêmes individus au fil du temps. En ce qui concerne les analyses moléculaires et histologiques, elles seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui évite de constituer un groupe d'animaux pour chaque point du suivi sur la durée. . Nous cherchons également à réduire au minimum le nombre d'animaux afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nos recherches antérieures ont montré que l'utilisation d'un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire pour mener à bien une étude concluante. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysées avec des statistiques adaptés.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et un cycle de 12 h jour/nuit sera imposé. Les animaux recevront de l'eau et de la nourriture ad libitum. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour le temps de saignement et les prélèvements sanguins, l'animal sera anesthésié. Ainsi, pour les mesures de force musculaire, l’animal sera anesthésié avec un mélange de produits anesthésiants et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de souffrance de l'animal, nous mettrons en place des mesures pour minimiser son inconfort et sa douleur. Nous utiliserons une grille de scoring pour évaluer le niveau de douleur observé chez l'animal. Si nous constatons un niveau de douleur élevé, nous prendrons les mesures appropriées pour soulager la douleur et assurer le bien-être de l'animal. La grille de scoring nous permettra de surveiller attentivement l'état de l'animal et d'adapter les interventions nécessaires pour réduire toute souffrance.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris afin de mieux comprendre les propriétés physiologiques des différents muscles et organes suite à une modification génétique, ainsi que pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Cette approche globale de l'organisme revêt une importance particulière dans le cadre de notre étude sur le TAM/STRMK, une maladie multisystémique. Ayant précédemment étudié le TAM/STRMK dans un autre modèle murin de la maladie, nous souhaitons approfondir nos connaissances en utilisant cette nouvelle lignée de souris avec une mutation similaire à celle trouvée chez les patients. Les souris utilisées seront étudiées à l'âge adulte, après 4 semaines jusqu'à 8 mois (pour la caractérisation de l'animal), et après 4 semaines jusqu'à 7 mois (pour le traitement).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles reçoivent un régime riche en lipides pendant dix-huit semaines pour développer une fibrose du foie, puis des injections quotidiennes de la molécule SR9009 pendant six semaines, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur minimise les nuisances tout en reconnaissant une perte de poids pouvant atteindre 20 % et des ulcérations aux points d'injection. Il affirme que la fibrose ne peut être reproduite en culture cellulaire et conclut à la "nécessité" d'un modèle sur animal entier avant une transposition clinique.

Objectifs

Le système d’horloge interne, ou rythme circadien, inhérent à chaque individu, permet de réguler finement de nombreux processus cellulaires et métaboliques. Chaque organe possède son propre rythme circadien et la dérégulation de celui-ci peut aboutir à l’apparition de maladies. La fibrose hépatique est une atteinte du foie qui apparait lors d’infections virales, d’abus d’alcool ou suite au développement de la maladie du foie gras, également appelée maladie du soda, lié à une alimentation déséquilibrée. Cette maladie est notamment responsable de l’apparition de fibrose aggravée voire de cirrhose (dernier stade de la fibrose) qui peuvent dégénérer en cancer du foie qui est actuellement le 3ème cancer le plus meurtrier au monde. Le contrôle du développement de la fibrose est donc un enjeu majeur de santé publique pour lequel il n’existe pas de traitement à l’heure actuelle. L’apparition de la fibrose hépatique semble en partie liée à la dérégulation du rythme circadien. Le foie est en effet un tissu présentant un rythme circadien où jusqu'à 20% des gènes sont régulés via des protéines spécifiques régulant ces rythmes. Des travaux in vitro ont montré l’importance du cycle circadien dans l’activation de gènes impliqués dans le développement de la fibrose, et dont l’expression peut être régulée par des molécules modulatrice du rythme circadien. Afin de valider cette approche de modulation du cycle circadien comme potentielle thérapie contre la fibrose hépatique, nous souhaitons utiliser un modèle de souris de référence, dans lequel nous induirons le développement de la fibrose pendant 12 semaines grâce à une nourriture spécifique enrichie en lipides. Les animaux seront ensuite traités quotidiennement pendant 6 semaines avec une molécule permettant de moduler l’expression des gènes impliqués dans le cycle circadien, nommée SR9009, ou par un contrôle.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à développer une nouvelle approche thérapeutique pour traiter la fibrose hépatique en rétablissant le rythme circadien du foie. Il s’agit d’une approche nouvelle et différente des traitements ayant déjà été évalués en essai clinique. Cette étude doit permettre de faire un nouveau pas vers le développement clinique de nouvelles thérapies pour lutter contre les maladies hépatiques et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Procédures

Tous les animaux de ce projet à l’exception des animaux contrôles (ne recevant pas d’injection et étant nourri avec une nourriture classique) seront nourris par une nourriture spécifique riche en lipides pour un total de 18 semaines et à des injections quotidiennes de SR9009 ou de contrôle pendant 6 semaines. Les injections quotidiennes prennent environ une minute à être réalisée sur animaux vigiles. A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. La nourriture spécifique riche en lipides est validée de longue date et n’induit pas de détresse ou de souffrance chez les animaux sur la période étudiée (18 semaines). Tout comme chez l’Homme, la maladie se développe sans symptômes ni douleur. Une perte de poids allant de 10 à 20% peut néanmoins être observée chez certains animaux. Les injections dans l’abdomen répétées peuvent engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies, sang) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le développement de maladies hépatiques chroniques telle que la fibrose avancée est un phénomène long et complexe ne pouvant pas être reproduit en culture cellulaire. Ce sont des maladies complexes impliquant plusieurs acteurs cellulaires au sein d’un organe et la communication avec d’autres organes (exemple : les intestins). De plus l’étude du cycle circadien in vitro est limité à quelques jours, et la modulation de ce dernier ne permettrait pas d’étudier un phénomène qui apparait en plusieurs semaines voire plusieurs mois. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire à l’étude de la fibrose et de l’effet du cycle circadien sur cette pathologie. Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires cancéreuses et des cellules primaires isolées de foie de patients et ex vivo sur des tissus de patients ayant subi une chirurgie afin de valider nos hypothèses. Notre approche thérapeutique nécessite maintenant une validation dans un modèle complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes et grâce à nos expériences précédentes réalisées avec le même modèle animal. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères proches de l’homme. Le modèle animal choisi (souris soumises à un régime alimentaire modifié) permet de récapituler le plus finement possible le développement de la fibrose hépatique en quelques mois, en présentant les mêmes caractéristiques que chez l’Homme. C’est actuellement l’un des modèles le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier l’impact d’un gène/d’une protéine sur la maladie hépatique. Nous utiliserons des animaux adultes d’un âge allant de 8 semaines (début du protocole) à 26 semaines (fin du protocole), la fibrose hépatique étant une pathologie se développant surtout chez le patient adulte.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur expose chirurgicalement leur nerf sciatique pour y poser un implant libérant un immunosuppresseur, avec des mesures de l'activité électrique du nerf avant et après et un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Il décrit une douleur post-opératoire transitoire liée à l'exposition du nerf, atténuée selon lui par l'anesthésie et l'analgésie. Ce projet valide un dispositif destiné à être implanté chez l'humain, et le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit les propriétés des "organes entiers".

Objectifs

Pour la réparation des nerfs périphériques, notre laboratoire développe de nouveaux systèmes, combinant des implants et des médicaments. Le développement de ces systèmes de réparation nécessite de caractériser la libération du médicament formulé. Ce projet permettra donc de caractériser in vivo la vitesse de libération d'un immunosuppresseur (molécule limitant l’action du système immunitaire, avec de potentielles propriétés de régénération des nerfs), pour des projets sur la régénération des nerfs périphériques. L'objectif est d'évaluer le profil de libération de cette molécule d’intérêt au niveau du nerf sciatique, depuis des implants, chez le rat. Cette évaluation sera réalisée pendant une période maximale de 12 mois (période de suivi des animaux après chirurgie), et permettra de caractériser nos implants contenant l'immunosuppresseur.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider au niveau préclinique la cinétique de libération locale d'un immunosuppresseur pour la régénération des nerfs périphériques. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement d’un traitement local pour la régénération des nerfs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure : Une mesure de l’activité électrique du nerf sciatique (électrophysiologie) sera effectuée en pré-opératoire au plus tôt 7 jours avant la chirurgie sous anesthésie de l’animal (durée de 20 à 40 minutes). Le jour de la chirurgie, après anesthésie et analgésie de l'animal, le nerf sciatique sera exposé. Ensuite, chaque animal recevra une application locale d’un implant contenant un immunosuppresseur. Certains animaux pourront recevoir un implant sans molécule thérapeutique sur le nerf sciatique de la patte arrière controlatérale. La durée de la procédure chirurgicale sera d’environ 20 à 40 minutes par animal. Des prélèvements sanguins et urinaires pourront être effectués le jour après la chirurgie et des prélèvements réguliers pourront être faits en fonction de la vitesse de relarguage de la molécule thérapeutique depuis l’implant (la durée de chaque geste est d’environ 1 minute). Le jour de l’euthanasie de l’animal, l’activité électrique du nerf sciatique sera mesurée au préalable sous anesthésie de l’animal (durée de 20 à 40 minutes).

Impact sur les animaux

Les risques anesthésiques sont les suivants : hypothermie (stress thermique) et assèchement de la cornée. Les risques infectieux sont, quant à eux, peu probables, compte tenu que la chirurgie est réalisée en conditions stériles. Concernant le risque hémorragique, celui-ci est également très limité, du fait qu’aucun vaisseau sanguin majeur ne sera sectionné. L’acte chirurgical engendrera une douleur transitoire en post-opératoire liée à l’exposition du nerf sciatique (qui ne sera pas sectionné) ainsi qu’à la pose de l’implant. L’acte chirurgical étant réalisé sous anesthésie générale, après injection sous-cutanée d’un analgésique et application locale (sur les muscles puis le nerf sciatique) d’un anesthésiant, cette douleur ne devrait pas être ressentie par l’animal pendant la chirurgie. Compte tenu de la forte activité de l'immunosuppresseur, les animaux pourraient manifester des signes de perte de poids, malaise, léthargie et/ou perte de poils, typiquement associés à l'administration systémique de cette molécule thérapeutique. De plus, les animaux seront surveillés pour tout signe de diarrhée et de déshydratation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro ont déjà été réalisées. Malheureusement, ces études ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet in vivo a pour but de valider la cinétique de libération d'un immunosuppresseur depuis nos implants et permettra son développement optimal pour la régénération du nerf sciatique.

Réduction

Le nombre d’animaux (240) a été défini sur la base des études précédemment conduites en interne, pour lesquelles jusqu’à 10 animaux par groupe ont été considérés pour la chirurgie du nerf sciatique. Considérant que le nerf sciatique ne sera pas sectionné et que des analyses statistiques seront réalisées, il nous est indispensable de considérer un minimum de 5 animaux par groupe.

Raffinement

Le nombre d’animaux par cage (2 animaux) respectera la législation sur la protection des animaux de laboratoire. Les rats seront acclimatés au minimum 5 jours avant la chirurgie au sein de l’animalerie. Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des boules et/ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement analgésique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. À la suite de la procédure chirurgicale, un traitement analgésique systématique sera administré. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites : variation relative persistante du poids corporel supérieure ou égale à 20 pour cent par rapport au poids mesuré avant chirurgie (pesée quotidienne pendant 3 jours après chirurgie au maximum deux fois par semaine pour tous les animaux jusqu’à leur euthanasie. Une étiquette signalétique sera apposée sur les cages pour indiquer que le suivi du poids est assuré pour l’ensemble des animaux) ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée.

Choix des espèces

L'utilisation d'un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des nerfs périphériques. De plus, la composition des tissus des humains et rongeurs est très similaire pour plusieurs organes. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l'étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Les animaux seront bagués sur l'oreille dès leur arrivée dans l'animalerie.