Recherche appliquée

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une instillation dans la trachée ou une exposition d'une heure en chambre d'aérosolisation pour reproduire une pneumonie à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple. Le porteur indique que tout animal saignant ou respirant anormalement après l'instillation sera tué, et prévoit un analgésique en cas de signes de douleur. Les souris sont tuées pour prélever les organes et mesurer l'atteinte pulmonaire.

Objectifs

Tropheryma whipplei est l’agent de la maladie de Whipple, une maladie chronique systémique caractérisée par un syndrome de malabsoprtion, de la fièvre et des douleurs abdominales. Un certain nombre de données suggèrent que chez l’homme, l’infection résulte d’une transmission oro-fecale ou oro-orale. Les avancées en épidémiologique et techniques diagnostiques ont montré que T. whipplei étaient en fait responsable d’un large spectre d’infections et qu’à côté des infections chroniques, systémiques ou localisées, il existait des infections aigues et même un portage asymptomatique. Ainsi, il a été rapporté que chez l’homme, T. whipplei était un agent de gastroentérite, probablement au cours de la primo-infection. Des travaux de notre équipe avait alors montré qu’en infectant des souris par voie orale, on retrouvait T. whipplei dans les selles de manière transitoire et qu’elle induit une diarrhee passagere. Par ailleurs, nous avions également pu montrer qu’une lesion intestinale epitheliale prolongeait le portage de T. whipplei, aggravait de manière non significative la gastroenterite et permettait la colonisation de la muqueuse intestinale et une séro-conversion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie des pneumonies à T. whipplei. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront soumis à une instillation intra-trachéale. Le tube flexible relié à une seringue à insuline sera inséré à 0.5-1 cm dans la trachée et la solution sera injectée (volume inférieur à 50 microlitres). Afin d'éviter que l'instillat ne s'échappe de la trachée, le tube sera maintenu en place 5 sec. Il sera retiré et la souris sera maintenue en position pendant au moins 30 secondes. Pour la procédure 2, les animaux seront exposés dans la chambre d'aérolisation pendant une heure.

Impact sur les animaux

En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’instillation intra-trachéale, un analgésique (buprénorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel en sous cutané. Les effets indésirables directs de la procédure 1 seraient une mauvaise instillation intratrachéale. Ainsi, tout animal qui saigne, qui présente une respiration anormale après récupération de l'anesthésie sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, les organes seront prélevés pour être analysés et évaluer l'impact de la pneumonie.

Remplacement

Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et de comprendre les mécanismes sous-jacents dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques dans la prise en charge des patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, de par notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminer le nombre de souris nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.

4200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique d'un candidat médicament, le plus souvent par gavage, avant un test d'activité locomotrice, puis un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute de méthode alternative pour ces mesures sur le système nerveux.

Objectifs

Lors du développement d’un candidat médicament, il peut être pertinent d’évaluer si celui-ci peut induire des effets sur le niveau d’activité générale, l’activité locomotrice globale ainsi que les habitudes d’exploration chez la souris. La modification de l’activité locomotrice peut entraîner des biais pour l’évaluation correcte du candidat médicament dans certaines thématiques. Pour exemple, une diminution de l’activité locomotrice peut entraîner un comportement de type anxiolytique (une diminution de nombre de billes enfouies dans le test d’enfouissement de billes). Il est donc important de vérifier avant toute caractérisation des effets d’un candidat médicament dans ce type de modèle. L’objectif de ce projet sera d’étudier, chez la souris, l’effet d’un candidat médicament dans le test de mesure de l’activité locomotrice spontanée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier les potentiels effets indésirables de nouveaux candidats médicaments sur l’activité locomotrice afin d’éviter de biaiser son développement.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier les effets potentiels induits (fonction motrice, l'exploration, l'anxiété, l'hyperactivité ou la sédation) par des médicaments candidats sur le SNC. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6J De 5 à 10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées par ultrasons focalisés de haute intensité sous anesthésie générale, avec un suivi échographique sur un à deux mois, pour évaluer une technique destinée à traiter les varices avant un premier essai chez l'homme. Le porteur rapporte des brûlures observées lors d'essais précédents, qu'il dit avoir corrigées par un refroidissement de la peau. Les brebis sont tuées après un ou deux mois pour prélever leurs veines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet concernant le traitement HIFU en mode thermique sont : - de vérifier sa sécurité, en terme d'évaluation des effets tissulaires locaux; - de vérifier son efficacité, en terme d'occlusion veineuse. Il précède une première étude chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les varices (dilatation anormale d'une veine) sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.

Procédures

Les veines saphènes, situées sur la face interne des membres postérieurs des brebis, sont traitées par HIFU, ou par radiofréquence pour une veine de la première brebis. La veille du traitement, la zone à traiter est marquée et des mesures sont effectuées par échographie. Le traitement se fait sous anesthésie générale avec une anesthésie péri-veineuse de la zone à traiter. Un suivi échographique a ensuite lieu sept jours, quatorze jours puis un mois après le traitement. Si nécessaire, les animaux sont sédatés pour cet examen. Au bout d’un mois quatre brebis sont mises à mort pour prélever leurs veines saphènes dans le but de les analyser. Les deux dernières brebis ont une nouvelle échographie deux mois après le traitement avant d’être aussi mises à mort pour le prélèvement des veines traitées. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée est inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.

Impact sur les animaux

Dans les essais précédent des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde.

Devenir

Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiterles points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.

Réduction

Une étude de preuve de concept sur des veines d'oreilles de lapin, ainsi qu'une étude de faisabilité sur trois brebis ont déjà été réalisées. Elles ont permis de déterminer les meilleurs conditions d'utilisation du traitement par HIFU et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires dans la présente étude. De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons.

Raffinement

Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis sont logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminents. De plus, le personnel animalier observe régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels sont immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant l’administration du traitement, les brebis sont placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié poour évaluer l'occlusion veineuse. Une fois rasés, ces animaux possèdent également une peau proche de celle de l'Homme ce qui permettra aux ultrasons d'atteindre la veine sans une trop forte absorption de ceux-ci. En outre, la faisabilité a été évaluée par le promoteur qui a pris les mesures des veines saphène du mouton. Les animaux seront adultes, car c'est à ce stade que l'anatomie de leurs veines saphènes est comparable à l'humain. De plus, l'étude durant plus de deux mois pour certains animaux, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance dont le développement pourrait interférer avec les effet du traitement.

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, deux trous sont percés dans leur crâne pour y tester des membranes censées améliorer la régénération osseuse, avec deux contrôles au microscanner sous anesthésie à deux et quatre semaines. Le porteur compare la contrainte à celle d'une "simple fracture" et rapporte une perte de poids et un arrêt du toilettage de quelques jours. Il présente au conditionnel des dispositifs médicaux innovants et décrit le modèle animal comme un "préalable impératif".

Objectifs

Les traumatismes et les interventions chirurgicales peuvent engendrer des blessures au niveau de l'os qui sont plus ou moins facile à soigner. Actuellement, la greffe osseuse est majoritairement utilisée pour réparer l'os lésé. Cette technique à cependant des limites : la nécessité de procéder à deux opérations (prélèvement puis greffe), la faible quantité d’os disponible et les possibles complications post-opératoires et séquelles pour le patient. La régénération osseuse guidée est une technique chirurgicale qui utilise des membranes. Ces membranes ont un rôle barrière, elles séparent l'os à réparer de la peau ou des muqueuses, ce qui permet d'obtenir une cicatrisation osseuse de qualité. De nombreuses membranes sont actuellement commercialisées. Leurs principales limites sont le risque de contamination lors de la chirurgie et une réparation osseuse insuffisante du à leur manque de rigidité . C’est pourquoi la recherche est active pour développer des membranes avec de meilleures propriétés dans le but d’étendre leurs indications. Ce projet de recherche a pour objectif d’étudier l’efficacité de nouvelles membranes permettant une cicatriation osseuse de meilleure qualité et/ou en plus grande quantité. Les études préliminaires effectués dans notre laboratoire ont permis de sélectionner des membranes qui permettraient de réduire le risque de contamination et un gain osseux plus important. L'absence de toxicité a également été testée. L’utilisation d’un modèle animal est un préalable impératif pour envisager une application chez l'homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pouvant remplacer à ce jour l'expérimentation animale pour l'étude de la régénération osseuse. Le modèle animal choisi consiste à la réalisation de 2 trous circulaires au niveau de la surface externe du crâne. Il s’agit d’un modèle très souvent employé pour valider l'intérêt clinique de nouveaux matériaux utilisés en orthopédie et en dentisterie. Les objectifs de ce projet sont d'évaluer la tolérance de membranes à base de polymères ainsi que leur potentiel de réparation osseuse .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet d'expérmentation animal chez le rat sont à court terme : 1) la vérification de la bonne tolérance biologique et tissulaire de nos membranes, 2) une cicatrisation osseuse améliorée, 3) une dégradation des membranes implantées permettant l'optention d'une qualité osseuse biologique et mécanique optimale. Les bénéfices attendus à long terme sont de pouvoir proposer aux patients des dispositifs médicaux innovants doués de propriétés cicatrisantes, ossifiantes, antibactériennes et mécaniques améliorées par rapport aux dispositifs médicaux actuellement disponibles. Ces améliorations permettraient d'élargir les indications d'utilisation des membranes actuellement commercialisées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste à réaliser 2 défauts osseux sur le sommet du crâne. La durée de la procédure chirurgicale n'excèdera pas 30 minutes. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera pratiqué. Des examens radiologiques par microscanner seront réalisés à 2 temps intermédiaires (2ème et 4ème semaine) dans le respect des bonnes pratiques en matière de radioprotection. La durée de ces examens d'imagerie médicale dureront au maximum 12 minutes et seront réalisés sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux.

Impact sur les animaux

Les principales nuissances que nous avons préalablement observés sur ce modèle expérimental chez le rat sont une absence de toilettage durant 2 à 3 jours et une rupture des sutures (très rarement observé). Un nettoyage de la plaie à l'aide d'un antiseptique est pratiqué afin de limiter le risque de contamination microbienne. Les effets indésirables mineurs rapportés sont une perte de poids modérée (au maximum de 5% du poids initial de l'animal) durant la première semaine pour la moitié des animaux et une récupération du poids durant la 2ème semaine opératoire puis un gain de poids régulier durant toute le reste de la durée de l'étude. Les effets indésirables graves théoriques sont un saignement abondant suite à un traumatisme non contrôlé des vaisseaux sanguins lors de la chirurgie et la possible survenue d'une crise cardiaque durant l'anesthésie.

Devenir

A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront anesthésiés puis à mise à mort afin de pouvoir procéder aux prélèvements tissulaires sans souffrance.

Remplacement

Les études réalisées préalablement dans notre laboratoire sur des cultures de cellules nous ont permis de sélectionner des matériaux non toxiques et susceptibles de favoriser la cicatrisation et la repousse osseuse. Cependant, ces premiers résultats prometteurs doivent être vérifiés par une implantation dans un organisme vivant avant la réalisation des premiers essais chez l'homme. Il n'existe pas à ce jour de modèle informatique permettant de reproduire ou de prédire la réaction d'un organisme vis-à vis d'un matériau implanté avec certitude.

Réduction

Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécessaire de rats pour répondre aux objectifs de ce projet. Pour chaque groupe et temps final, un nombre de 10 rats par lot est nécessaire, avec un nombre total maximal de 480 rats demandés.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie les rats subiront une phase d’acclimatation de 14 jours aux conditions d’hébergement du laboratoire. Les animaux seront hébergés dans des cages plastiques adaptées à la taille des animaux avec un nombre de 2 à 3 animaux par cage afin de maintenir les interactions sociales. La nourriture et l’eau seront mises à disposition en continue. Les litières des animaux sont enrichies d'objets en carton afin qu'ils puissent se constituer un nid. Les cages seront changées toutes les semaines. Durant l'étude, les animaux seront observés au moins 1 fois par jour. Nous avons accumulé une expérience sur ce modèle pour dire que la souffrance des animaux durant la période périopératoire ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalente au traitement d'une simple fracture. Le risque d'infection et de douleur postopératoire sera anticipé par la prise d'antibiotique et de medicament antidouleur. Une grille d'évaluation de l'état général de l'animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur ressentie sera tenue 2 fois par jour pendant les premiers jours postopératoires, puis 1 fois par jour pendant la deuxième semaine, puis 1 fois par semaine à partir de la 3ème semaine postopératoire. En cas d'altération de l'état général de l'animal ou d'une douleur sévère non contrôlable, la mise à mort de l'animal sera anticipée.

Choix des espèces

Le modèle choisi est considéré comme un modèle de référence pour l'étude des matériaux destinés à la régénération osseuse. De nombreuses espèces animales ont été utilisées dans ce modèle de défauts osseux, notamment chez les rongeurs. Ce modèle est particulièrement bien décrit et validé chez le rat adulte. Le gabarit de l’animal par rapport à la souris permet une technique chirurgicale reproductible. Le choix du rat adulte permettra de cribler différents matériaux ou membranes avant de passer à des animaux plus grands en cas de résultats encourageants. De plus, ce modèle d’expérimentation animale dans cette espèce n’entraine pas de souffrances importantes selon nos expériences antérieures. Plusieurs souches de rats ont été utilisées dans la littérature, notamment les rats Wistar. L’animalerie dispose de l’agrément pour l’espèce et la souche choisie.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un ou deux gavages et au maximum une injection intrapéritonéale pour être infectées par la bactérie Clostridioides difficile, afin de tester des anticorps censés bloquer la colonisation intestinale. Le porteur qualifie le gavage d'"acte réflexe sans douleur" et affirme un "niveau de sévérité quasi nul", alors que la gravité déclarée reste modérée. Les souris sont tuées par dislocation cervicale à J4, J7 et J15 pour dénombrer les bactéries.

Objectifs

Clostridioides difficile, bactérie Gram positif anaérobie et sporulée, appartient au microbiote intestinal humain et représente la première cause de diarrhées infectieuses nosocomiales de l'adulte au décours d’un traitement antibiotique. Le succès d’une infection à C. difficile va dépendre pour une grande part de la capacité de ce pathogène à se multiplier et à coloniser le tractus intestinal de l’hôte. L’environnement du contenu intestinal qui fait suite à une dysbiose est complexe et ne peut être mimé in vitro que très partiellement. De plus, il a été montré que l’expression de certains facteurs de virulence comme les toxines ou certaines protéines de surface dépendait de la présence de métabolites connus pour varier au cours de la dysbiose. Le but de ce projet est d’étudier in vivo les potentialités prophylactiques et thérapeutiques d’anticorps ciblant des protéines de surface du C. difficile, démontrés par la littérature comme ayant un rôle majeur dans le processus de colonisation. Le pouvoir de colonisation de différentes souches de C. difficile sera évalué, en présence et en l’absence des anticorps monoclonaux.

Bénéfices attendus

Il est attendu une protection des anticorps monoclonaux anti-protéines de surface dans l’infection à C. difficile (ICD). Cette protection peut se traduire sous forme d’une baisse de la colonisation, d’une capacité des souris à éliminer plus rapidement la bactérie et/ou à développer de moindres symptômes de cette infection. Le modèle murin d’ICD est un modèle récapitulant l’infection chez l’homme et permettra ainsi –si les résultats sont concluants- de préparer les essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à un gavage (1 à 2 fois) ainsi qu’à au maximum 1 injection IP.

Impact sur les animaux

Le niveau de sévérité est quasi nul car les souris ne sont pas sensibles aux infections à C. difficile. Il faut noter qu’il peut apparaître une légère diarrhée après 2 jours d’infection mais généralement les souris se rétablissent vite. Par ailleurs le gavage est un acte reflexe qui est sans douleur pour la souris et sera pratiqué par des personnes expérimentées avec des sondes flexibles. La dose unique d’injection est de 100 µl et l’inoculation sera réalisée par les techniciens animaliers qui ont une haute pratique de cette procédure. Par ailleurs nous avons observés lors de nos précédentes expériences que deux gavages successifs n’ont pas d’incidence sur le bien-être des animaux. Les embouts utilisés pour ces injections ne sont pas pointus, ils n’entraînent aucun dommage au tractus digestif de l’animal et le gavage se fait par un mécanisme réflexe de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale selon la procédure approuvée par le CEEA sous la référence n°10.

Remplacement

Nous avons déjà commencé à évaluer nos anticorps sur des modèles in vitro. Plusieurs tests ont et sont développés tels qu’un test d’inhibition d’adhérence sur des cellules en plaques où nous incubons dans un premier temps les anticorps avec les bactéries avant de les mettre sur des tapis cellulaires de cellules Caco-2. Après lavage, nous évaluons le nombre de C. difficile ayant adhérés par dénombrement sur gélose ou quantification par qPCR- et dans une puce microfluidique, ainsi qu’un test permettant de regarder la formation de biofilm en présence des anticorps. Le premier test a montré une inhibition d’adhérence aux cellules par les anticorps. Le second test est encore en cours de développement. Enfin, la formation de biofilm est inhibée en présence des anticorps. Le biofilm formé par C. difficile étant un facteur de colonisation et de résistance, nous devrions voir une moindre colonisation in vivo et/ou une élimination plus rapide des bactéries par les souris. Nous avons également mis en évidence une activation des neutrophiles en présence de bactéries recouvertes de nos anticorps et une phagocytose augmentée lorsque les anticorps sont présents. Ces premiers résultats sont encourageants mais ces modèles ne sont pas toujours adaptés pour évaluer le potentiel des anticorps et restent trop simples (lignées cellulaires, absence de microbiote). N’existant à ce jour pas de modèle in vitro ou in silico capable de reproduire la complexité du processus infectieux, des modèles in vivo sont nécessaires pour en conclure sur une activité prophylactique ou thérapeutique des anticorps et ce avant d’amorcer une nouvelle phase de développement clinique.

Réduction

Chaque essai nécessitera 12 animaux soit 36 animaux par expérience. Lors d’un essai, plusieurs anticorps seront testés afin de diminuer le nombre de groupes contrôles. C’est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable en cas de décès accidentel d’un individu au cours de l’expérience. Ce nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction de notre expérience antérieure pour garantir la qualité statistique des données et minimiser le nombre de répétitions. À la suite de la quantification des bactéries présentes dans les fèces comme dans le ceacum dans les différents groupes expérimentaux, un test statistique approprié de type ANOVA nous permettra d’évaluer les différences entre les groupes.

Raffinement

Les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson et du coton est toujours présent dans les cages. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux ne sont pas isolés afin de maintenir une certaine sociabilité. Le gavage sera pratiqué par des personnes expérimentées avec des sondes flexibles. Les embouts utilisés pour ces injections ne sont pas pointus, ils n’entraînent aucun dommage au tractus digestif de l’animal et le gavage se fait par un mécanisme réflexe de l’animal. A J4, J7 et J15 jours après le gavage, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour après inoculation de l’agent pathogène. Afin de suivre l’état général des souris, nous appliquerons les critères indiqués par la grille de « Body Condition Scoring » (Guidelines for Assessing the Health and Condition of Mice. Charmaine J. Foltz and Mollie Ullman-Cullere. Lab Animal. April 1999. Vol 28, No. 4, pps. 28-32.) ainsi qu’une échelle de scoring: a) Changement de poids corporel : 0=Normal, 1=Perte de poids 20%, b) Apparence physique: 0= Normale, 1=Manque de toilettage, 2=Poil ébouriffé, yeux plissés ou bridés, 3=Poil très ébouriffé, posture anormale, c) Comportement : 0=Normal, 1=Changement mineurs, 2= Anormal : mobilité réduite, inactif, 3=Très agité ou immobile, automutilation. Au score maximum de 3 atteint dans un sous-groupe ou un score final de 6 atteint dans la somme des sous-groupes, les animaux seront euthanasiés. Lors d’une infection des souris par C. difficile, il apparaît parfois une légère diarrhée après 2 jours d’infection mais les souris se rétablissent le jour d’après. Afin d’éviter toute déshydratation, des Dietgel seront mis dans les cages dès l’administration de la bactérie. Dans le cas bien improbable où une déshydratation serait observée, une réhydratation avec du sérum physiologique par voie sous-cutanée pourra être pratiquée. Dans l’éventualité où des animaux seraient durablement malades (score décrit ci-dessus), ils seront mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle souris est le modèle de colonisation de C. difficile largement utilisé dans de nombreux travaux in vivo (à l’inverse du modèle hamster utilisé comme modèle de virulence). Nous privilégions cette espèce et ce d’autant plus que des souris axéniques sont disponibles dans notre animalerie. De plus, l’épithélium intestinal murin est anatomiquement proche de celui de l’homme, avec la présence de villosités au niveau de l’intestin grêle et de cryptes dans le colon. Aucun autre modèle animal inférieur ne possède une structure aussi similaire, qui semble intervenir dans les interactions entre C. difficile et l’hôte lors de la phase d’implantation et de colonisation. Les animaux seront des adultes âgés de 7 semaines afin d’obtenir des résultats homogènes, ce qui pourrait ne pas être le cas avec des animaux à un stade de développement plus précoce, ou bien avec des animaux plus âgés, le microbiote n’étant pas stable pour de jeunes individus, et la diversité restreintes pour des individus âgés. De plus, et pour pouvoir comparer nos résultats avec d’autres travaux, nous conserverons cet age.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une cécité est provoquée en sept jours par injection de méthylnitrosourée, qui détruit les photorécepteurs, puis les souris subissent deux tests comportementaux visuels dont la nature n'est pas précisée et une électrorétinographie sous anesthésie, pour comparer des animaux sauvages et des animaux dépourvus de la protéine FMRP. En s'appuyant sur la littérature, le porteur affirme que cette perte rapide de la vue n'engendre ni anxiété ni signe de souffrance. Il décrit le modèle animal comme "indispensable" et renvoie une éventuelle thérapie génique chez l'homme au conditionnel.

Objectifs

Parmi les troubles de la vision, les maladies rétiniennes sont une cause importante de morbidité oculaire et de déficiences visuelles. Des études de population ont rapporté une prévalence des troubles rétiniens, en particulier des troubles de la dégénérescence rétinienne (DR), allant de 5,35 % à 21,02 % chez les personnes âgées de 40 ans et plus. La dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie pigmentaire sont les manifestations pathologiques les plus courantes de la DR qui conduisent à une cécité irréversible. Ces pathologies visuelles sont dues à l'apoptose des cellules neurales de la rétine ou des tissus de soutien adjacents, principalement en raison de dommages oxydatifs cumulatifs et prolongés. Bien que les manifestations cliniques de ces maladies aient été entièrement élucidées, il est clair que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents restent à comprendre. Très récemment, un nouveau régulateur pivot de l'apoptose et de la réponse au stress oxydatif a été mis en évidence dans le tissu cérébral : la protéine FMR (FMRP). Dans la rétine, cette protéine est également connue pour être directement associée à des déficits fonctionnels rétiniens. Notre projet vise donc à mieux étudier le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR. L'identification de nouveaux acteurs dans le processus de dégénérescence de la rétine nous permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de prévention pour une meilleure prise en charge des patients. Actuellement il n’existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Sur la base de ces résultats récents et de l'implication bien connue des mécanismes de stress oxydatif et d'apoptose dans la dégénérescence rétinienne, notre projet vise à mieux caractériser le rôle de la FMRP dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne. La question est de mettre en évidence le rôle de FMRP, dans un modèle murin validé de DR, en comparant les résultats de souris sauvages (WT) versus des souris n'exprimant pas FMRP (KO FMR1).

Bénéfices attendus

Notre stratégie expérimentale (utilisation conjointe des souris KO FMR1 et d’un modèle validé de DR) vise à mieux comprendre le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR, et donc de caractériser si FMRP est une bonne cible thérapeutique dans les DR. Des stratégies ciblées de thérapie génique pourront être envisageables chez l'homme sur la base de ces travaux.

Procédures

1/ Injection i.p (traitement unique), 2/Manipulation pour analyses comportementales (2 tests - 30 minutes) dans le but de caractériser les conséquences de la DR sur des comportements "visuels", et 3/Anesthésie pour l'étude de la fonction rétinienne (ElectroRétinoGraphie ou ERG) (anesthésie unique - 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle « MNU ou MethylNitrosoUrea» de DR utilisé est extrêmement utilisé et validé dans la littérature. Ce modèle va induire une mort spécifique des cellules de la rétine (photorécepteurs), entrainant une perte rapide (7 jours) de la vision chez la souris. Cette perte de la vision est similaire à celle retrouvée chez les patients atteints de DR. Une étude récente utilisant un modèle similaire de DR induite par le MNU a montré l’absence de comportement anxieux ou de souffrance 1 à 2 semaines après injection d et, ceux malgré la perte rapide des paramètres visuels (acuité etc…). Ainsi, dans notre schéma expérimental, la perte rapide de vision n’engendre pas de comportements anxieux ou manifestation comportementale de souffrance (douleur, prostration, hyperactivité etc..).

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort en fin de la procédure, et ce par dislocation cervicale. Ainsi, à chaque temps expérimental (Jour 1, 2, 3, 5 et 7 post-traitement), un lot d’animaux sera mis à mort directement après l'étude de la fonction rétinienne et ce, encore sous anesthésie.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de la DR ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au rôle de FMRP dans les DR, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires au niveau de la rétine (neurones et cellules gliales). Bien que les expériences in vitro sur cultures cellulaires soient utilisées (lignées cellulaires de cellules rétiniennes : cellules de Müller), aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la DR.

Réduction

Notre objectif est d’obtenir une bonne robustesse de l’analyse statistique tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ce projet in vivo, il y a 5 temps expérimentaux (Jour 1, 2, 3, 5 et 7) avec 8 souris traitées et 8 souris non traitées par génotype (WT et KO FMR1) et par temps soit 32 x 5 = 160 souris au total. A chaque temps expérimental, l’ensemble des animaux seront analysés en comportement et fonction rétinienne (ERG). Puis la moitié des animaux sera mise à mort pour l’étude histologie (prélèvement des yeux) et l’autre moitié sera mise à mort pour les analyses de biologie moléculaire (prélèvement de rétines). Chaque expérience sera répétée trois fois pour une reproductibilité des résultats soit 480 souris au maximum pour 3 ans. Ainsi, nous obtiendrons pour chaque paramètre testé (comportement et ERG) 24 points expérimentaux par temps et par génotype ce qui est un minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats.

Raffinement

Une surveillance et une manipulation quotidiennes des animaux seront effectuées pendant la période d’acclimatation (15 jours) et d’expérimentation. Ces manipulations permettront de limiter le stress de l’animal lors du traitement (injection unique i.p). Par ailleurs, selon les données de la littérature, les animaux traités ne présenteront pas de phénotype autre que la perte de la vision. Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 5 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Par ailleurs, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement durant toute la durée de l’expérience pour détecter tous signes éventuels de souffrance (3 points limites mis en place). On ne s’attend pas à avoir d’atteinte du point limite dans notre étude. Néanmoins une grille de score quotidienne sera tenue durant le temps d’expérimentation. Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes de souffrance.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires rétiniennes et leurs conséquences comportementales. Pour notre projet, l’utilisation de la souris est primordiale puis que le couple structure/fonction de sa rétine comme le processus de la DR sont proches de ceux observés chez l’homme. De même, l’existence d’un modèle murin KO FMR1 (disponible au laboratoire) va faciliter l’étude du rôle de FMRP dans la DR.

24 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de deux tumeurs sous la peau, une injection intraveineuse d'une sonde fluorescente et une injection intratumorale d'un candidat médicament anticancéreux ciblant le récepteur TLR3, suivies de séances d'imagerie sous anesthésie à 24, 48 et 72 heures. Le porteur affirme avoir déjà vérifié l'absence de toxicité et l'efficacité aux mêmes doses, et présente l'étude comme une preuve de concept destinée à préparer un essai clinique chez l'homme. Sur le remplacement, il conclut que "seul un modèle animal" permet d'observer l'apoptose dans un "organisme" complet.

Objectifs

=> RATIONNEL : Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections virales. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée, appelée apoptose, spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination à long terme contre la tumeur. Une nouvelle famille d’activateurs de ce récepteur a récemment été découverte (dont le candidat médicament de cette étude), homogène, actif, spécifique et très peu toxique. => BUT DU PROJET : L’objectif de cette étude est d’utiliser une sonde fluorescente afin de suivre le mécanisme d’apoptose cellulaire induit après administration du candidat médicament en injection locale, ainsi que sa spécificité pour les cellules tumorales exprimant le récepteur TLR3, in-vivo. Ce mécanisme sera regardé dans la souris par une analyse non invasive par imagerie de fluorescence sur tous les organes. Cette analyse quantitative au cours du temps sera effectuée grâce à un outil innovant de tomographie de fluorescence. Pour analyser la spécificité de l’apoptose des cellules tumorale exprimant le TLR3 (et non sur les organes ou tissus sains), induite par le candidat médicament, ce dernier sera injecté dans deux tumeurs (flanc-droit / flanc-gauche), avec les modèles exprimant le TLR3 sur un flanc et celui ne l’exprimant pas sur le flanc opposé. Chacune de ces tumeurs sera traitée par injection locale du candidat médicament à des doses connues comme efficaces dans ces modèles. Une injection a temps unique du candidat médicament sera effectuée, afin de suivre ses effets dans le temps. La sonde fluorescente marquant spécifiquement les cellules apoptotiques sera utilisée par injection intraveineuse 2h avant le premier point de cinétique, pour un signal durant jusqu’à 3 jours post-injection. Les analyses de fluorescence quantitatives sur l'ensemble du corps de l'animal (en 3D), seront effectuées sur animaux vivants sous anesthésie gazeuse respectivement à 24h, 48h et 72h après traitement. Afin de dissocier l’effet d'inflammation de l’effet d’apoptose induit par le candidat médicament, les souris utilisées ne posséderont pas de système immunitaire.

Bénéfices attendus

Cette étude, comprenant une seule procédure, permettra de déterminer le mécanisme d’action d’apoptose spécifique des tissus cancéreux du candidat médicament dans un modèle physiologique complet et d’en apprécier la spécificité par rapport aux organes et tissus sains. Il s’agit d’une étude de recherche translationnelle, de preuve de concept et prospective, permettant de poser les bases d’une étude clinique (dans des conditions d’injection locales), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Procédures

Trois injections sont prévues dans cette expérience : 1/ La greffe tumorale bilatérale sous-cutanée (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris 2/ L’injection de la sonde fluorescente en intraveineuse (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. 3/ Le traitement en injection intratumorale et sous-cutané péri-tumorale (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. A ceci, s’ajoute l’analyse de la fluorescence sur l'ensemble des organes et tissus des souris, qui est un acte non invasif et non douloureux, mais qui nécessite cependant l’immobilité complète de l’animal par une anesthésie sous isoflurane et une contention empêchant tout mouvement.

Impact sur les animaux

# Des effets indésirables pour les animaux pourraient venir des modèles ou des traitements en eux-mêmes => L'absence de toxicité et l’efficacité du candidat médicament ont déjà été analysée sur ces mêmes modèles aux doses utilisées dans cette expérience avec d’excellents résultats. # Les actes d’injection (sonde fluorescente et candidat médicament) induisent une douleur ainsi qu’un stress => une anesthésie gazeuse sera effectuée lors de ces actes. # L’analyse de fluorescence n’est pas un acte douloureux, cependant il nécessite l’immobilité complète de l’animalsous anesthésie gazeuse et une contention empêchant tout mouvement. # La croissance tumorale (pouvant durer env 2 à 3 semaines) peut induire de nombreux effets indésirables (nécrose, perte de poids, mobilité réduite, stress, comportement anormal…). => ici les tumeurs seront analysées à une très faible taille, ce qui devrait limiter la majorité de ces effets indésirables. Cependant, une grille de score basée sur nos expériences précédentes nous permettra d’anticiper toute souffrance des animaux. De plus, la moindre plaie interférant avec les mesures de fluorescence, aucune souris ayant des plaies ou signes de nécroses ne sera incluse dans ces expériences.

Devenir

Tous les animaux ne pouvant pas rentrer en analyse (absence de croissance tumorale, présence de plaies interférant avec l’analyse ou autre critère éthique), seront mis à mort. Tous les animaux analysés seront mis à mort après la dernière analyse. En effet, aucun de ces animaux ne pourra être réutilisé. Cette mise à mort s’effectuera par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

Seul un modèle animal permettra d’analyser des phénomènes d’apoptose indésirables au niveau des organes et tissus sains. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ce mécanisme d’action ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique complexe et physiologique est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » (dans des conditions d’injection locale), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 5 souris par groupe et par modèle est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Il est à noter que la greffe des deux tumeurs différentes (sur les deux flancs de la même souris), permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude sans compromettre les résultats scientifiques. Cette expérience s’effectue sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps par des techniques douces d’imagerie, ce qui évite d’avoir à procéder à des actes chirurgicaux lourds ainsi qu’à des mises à mort de grands nombres d’animaux par des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soit une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée.

Raffinement

La mise en place d’une grille de score et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée deux fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. Les souris seront greffées sur chaque flanc en injection sous anesthésie gazeuse. Il est à noter que les deux modèles de tumeurs ont des comportements et temps de croissance très similaire. La très petite taille des tumeurs attendue dans cette étude devrait permettre à la fois une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal. Cette expérience s’effectue par imagerie de fluorescence sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps, ce qui évite d’avoir à procéder à de nombreux actes chirurgicaux et mises à mort d’animaux, avec des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soi un Raffinement des méthodes pour répondre à la question posée. L’imagerie par fluorescence est une analyse « douce », non invasive et non douloureuse mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. Pour réaliser une analyse, l'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse et est ensuite placé dans une cassette de contention pour éviter tout mouvement. Cette dernière est ensuite glissée dans la chambre noire de l’appareil. L’acquisition dure environ 5 minutes. De l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir la température de l’animal. Ce temps court d’analyse, permet à l’animal une récupération rapide et autorise de répéter les acquisitions selon la cinétique décidée. Les animaux sont ensuite placés sur un plateau chauffant avec une lumière chauffante pour qu'ils se réveillent rapidement dans de bonnes conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle vivant que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris sans système immunitaire, appareillage de fluorescence adapté...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies chez cette espèce. Une souche de souris sans système immunitaire sera utilisée pour analyser uniquement l’effet d’apoptose indépendamment des mécanismes du candidat médicament sur le système immunitaire qui pourraient interférer. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée. Des souris sans système immunitaire de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement adultes (ce qui est nécessaire dans notre étude en terme d’assimilation, maturation des organes...) etc.

6 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, conservés vivants et réaffectés ensuite à des travaux pratiques d'enseignement. Sous anesthésie générale, on leur crée des plaies cutanées sur les membres, avec deux biopsies et un séjour de deux mois au box. Le porteur indique que les désagréments tiennent aux plaies et au confinement prolongé, compensé par des promenades, et attend un pansement utilisable en clinique. Il affirme que la cicatrisation ne peut être reproduite sur cultures de cellules et qu'il faut travailler sur "l'espèce cible", le cheval ayant un métabolisme cicatriciel spécifique.

Objectifs

1. Diminuer le temps médian normal de cicatrisation par seconde intention de la peau (0.09 mm/jour, 42 jours pour une plaie de 2.5x2.5 cm) du cheval grâce à l’utilisation d’un pansement collé par rapport à une plaie non traitée pour diminuer le temps de convalescence et le coût global du traitement dans l’espèce concernée. 2. Améliorer la cicatrisation par seconde intention d’une plaie de membre chez le cheval traité par pansement collé en diminuant l’incidence de production d’un tissu de granulation exubérant.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce produit qu'il soit utilisé rapidement en clinique, pour faciliter la cicatrisation des plaies distales, pour lesquelles, actuellement, nous n'avons pas de traitement.

Procédures

Les chevaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste à créer des plaies cutanée de petite taille au niveau distal des membres thoraciques. Ils seront ensuite conservés au box pendant 2 mois pour la cicatrisation. L'intervention dure moins d'une heure. Lors de la chirurgie on réalise une biopsie cutanée. Après 60 jours, on réalise une seconde biopsie, sur le tissu cicatriciel, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les animaux vont soubir deux types de désagréments : - les plaies cutanées l- le séjour prolongé de 2 mois en box

Devenir

Au terme de la cicatrisation cutanée, les chevaux pourront être conservés. Après un temps de repos, ils serviront en pédagogie, en participant à des travaux pratiques peu invasifs.

Remplacement

La cicatrisation cutanée dépend de l'état de propreté de la peau, de la qualité de l'irrigation qui garantit la nutrition et de l'immobilité. Toutes ces conditions sont difficiles à reproduire avec des cultures de kératinocytes. Il faut pouvoir travailler avec l'espèce cible parce que le cheval a un métabolisme de cicatrisation très spécifique.

Réduction

Nous travaillons avec un nombre d'animaux qui a été réduit au maximum parce que nous utilisons chaque cheval pour réaliser 2 plaies sur chaque membre. Ceci donne deux lots de 12 plaies, un lot traité avec le traitement expérimental et un lot traité avec la méthode classiquement reconnue. Les temps médians de cicatrisation sont évalués pour les deux groupes.

Raffinement

Les plaies seront maintenues propres. En cas de douleur manifeste, les chevaux recevront des anti-inflammatoires non stéroïdiens. Les chevaux seront promenés régulièrement pour compenser l'ennui de la vie au box.

Choix des espèces

Nous testons le produit de cicatrisation afin de savoir s'il accèlère la cicatrisation chez les Chevaux, c'est pourquoi nous travaillons avec cette espèce, dont le métabolisme cicatriciel est très spécifique. Nous ne pouvons pas utiliser le poneys, dont le métabolisme est très différent. Adultes, pour avoir des animaux qui ont un métabolisme adapté

634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies jusqu'à vingt-quatre mois, elles subissent l'implantation chirurgicale d'une puce télémétrique sous la peau, un enregistrement cardiaque avec test de stress, puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux mois pour tester des molécules. Le porteur indique que ces injections répétées sur des souris âgées peuvent provoquer des douleurs, prises en charge par paliers d'antalgiques jusqu'à l'euthanasie au point limite. Il affirme que les organoïdes et les cardiomyocytes issus de cellules souches ne permettent pas d'étudier l'arythmie sur un cœur entier.

Objectifs

Au cours du vieillissement, on observe dans la population un nombre plus important de maladies du cœur, telles que les arythmies cardiaques, l’ensemble étant grevé d’un coût humain et sociétal majeur. Bien que le lien entre vieillissement et pathologies du système cardiovasculaire soit certainement multifactoriel, de nombreux travaux suggèrent l’implication d’une dysfonction des mitochondries. Ces organites cellulaires possèdent leur propre ADN, l’ADN mitochondrial (ADNmt) et jouent le rôle de centrale énergétique de nos cellules. Au cours du vieillissement, nos tissus contiennent quelques cellules présentant une perte d’activité des mitochondries, du fait de l’accumulation de mutations de l’ADNmt. A l’aide d’un modèle de souris qui accumule ces mutations de l’ADNmt de manière accélérée dans le cœur et les muscles squelettiques, nous avons pu montrer qu’au-delà d’un seuil critique, ces cellules déficientes ont un impact pathologique sur la fonction du cœur, générant des arythmies cardiaques. Le projet que nous souhaitons développer a deux objectifs principaux. Le premier est d’étudier l’influence de ces cellules déficientes en activité mitochondriale sur d’autres maladies cardiaques au cours du vieillissement. Le deuxième est de moduler deux mécanismes de contrôle qualité de l’ADNmt chez ces souris afin de ralentir l’accumulation de mutations de l’ADNmt et donc retarder voire prévenir la survenue de leurs troubles cardiaques, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques qui seront peut-être applicables chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’apporter de nouvelles connaissances sur l’influence des mitochondries sur le développement de troubles cardiaques au cours du vieillissement, qui sont un véritable problème de santé publique. De plus il devrait permettre de déterminer si l’utilisation de molécules destinées à moduler le contrôle-qualité de l'ADN mitochondrial peut s’avérer bénéfique pour la santé humaine en ce qui concerne les maladies cardiovasculaires, en conduisant à une meilleure santé des mitochondries, et donc en retardant l’apparition de troubles fonctionnels du cœur. Certaines des molécules que nous souhaitons tester sont déjà utilisées dans des études cliniques dans d’autres contextes, et de ce fait, si nous observons un effet positif sur la survenue de troubles cardiaques, l’utilisation de ces molécules pourrait être rapidement transférée à l’homme.

Procédures

Dans une première série d'expériences, les animaux vont subir une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour implanter une puce télémétrique sous la peau (durée de l'intervention: 15 minutes) afin de mesurer l'électrocardiogramme (ECG). Sept jours après chirurgie, la mesure de l'ECG sera réalisée 24h en cage, puis 10 minutes pendant un test de stress. Dans une deuxième série d'expériences, les animaux vont subir une injection intrapéritonéale (durée de l'intervention: 1 minute) quotidiennement pendant 2 mois pour tester le potentiel de molécules sur les arythmies cardiaques.

Impact sur les animaux

Pour l’échocardiographie, aucune nuisance n’est à prévoir, les souris étant anesthésiées à l’isoflurane pendant la procédure. Pour la télémétrie, les souris vont subir une chirurgie, sous anesthésie (isoflurane) et analgésie (buprénorphine), placées sur un tapis chauffant (37°) pour éviter l’hypothermie. Un délai de 7 jours entre cette opération et les mesures d’ECG permettra aux souris de récupérer. Pendant cette période, les souris seront controlées deux fois par jour pour jauger une éventuelle douleur liée à l’opération ou une perte de poids. La mesure d’ECG de 24h en cage n’entrainera pas de nuisance. En revanche, les souris seront observées pendant les 10 minutes de test de stress, et seront retirées au moindre signe d’inconfort. Enfin, la répétition d’injections intrapéritonéales des molécules à tester sur 60 jours sur souris âgées (de 16 mois à 18 mois et 22 à 24 mois) pourrait entrainer des douleurs, que nous évaluerons par une grille se score. En cas de douleur légère, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus longue sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).

Devenir

Tous les animaux prévus dans le projet (634) seront euthanasiés en fin d'expérience.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car nous voulons étudier l’influence physiologique de cellules déficientes en activité mitochondriale sur la fonction du cœur entier, et les modèles d’organoïdes 3D ou cardiomyocytes issus de cellules souches pluripotentes induites humaines ne permettent pas d’une part d’avoir un taux de mutations de l’ADN mitochondrial suffisant, du fait de l’élimination de ces mutations par contrôle qualité mitochondrial dans ces conditions. De plus, l’analyse de l’ECG par télémétrie requiert une phase de stress qui ne peut être reproduite in vitro. Enfin, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique.

Réduction

Nous réduisons au minimum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. De plus, seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échocardiographies et la télémétrie et 192 souris seront utilisées sur deux protocoles expérimentaux. En raison de l'âge avancé des animaux au moment des expérimentations, nous savons par expérience sur notre projet précédent qu'un nombre non négligeable d'animaux doit être euthanasié en raison de points limites. Pour ne pas mettre en péril le projet, tout en restant sur un nombre minimal d'animaux par procédure, nous avons inclus 20% d'animaux en plus pour chaque groupe. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas de plaie décelée, du Dermaflon ou du Cothivet sont utilisés pour favoriser la cicatrisation. En cas de douleur légère décelée chez les animaux, du paracetamol sera administré dans l’eau de boisson, en continu. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un anti-douleur plus puissant et à action plus prolongée sera administré en sous-cutané et du gel en contenant sera placé dans la cage pour la nuit. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera euthanasiée (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines et l’étude du vieillissement pathologique, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies. Dans le présent projet, la souris K320E-Twinkle est modèle de vieillissement tissulaire unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des mosaïques tissulaires mitochondriales sur ce processus de manière tissu-spécifique. Les animaux seront utilisés à des âges tardifs, car le développement des mosaïques mitochondriales dans le cœur est un processus qui prend des mois. Pour déterminer l'âge auquel les expériences seront réalisées, nous nous basons sur de précédentes publications. Nous avions observé les premières mosaïques mitochondriales à 12 mois et des arythmies cardiaques significatives à 18 mois. Ainsi les souris les plus jeunes utilisées le seront à 12 mois, et nous prévoyons des analyses sur des animaux allant jusqu’à 24 mois.