Recherche appliquée

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par la bléomycine, puis elles reçoivent un anticorps par injection quotidienne sous-cutanée pendant quatorze jours et deux injections intrapéritonéales par semaine, avant prélèvement des poumons. Le porteur indique que les souris pourraient développer une détresse respiratoire, mais que la durée courte de l'expérience conduit à les mettre à mort avant l'apparition des symptômes. Il affirme qu'il est impossible d'évaluer l'effet de l'anticorps sur l'ensemble du métabolisme sans recourir à un modèle animal.

Objectifs

Nous souhaitons étudier in vivo l'effet d'anticorps dirigés contre la molécule d'intérêt dans la fibrose pulmonaire dans un modèle murin ainsi que les mécanismes d'action intervenant dans cet effet.

Bénéfices attendus

Nous espérons observer par immunohistochimie une diminution de la fibrose dans les groupes traités avec l'anticorps. Ceci sera mesuré par immunohistochimie.

Procédures

Les animaux recevront une injection quotidienne en sous cutanné pendant 14 jours et une injection IP 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec la bléomycine pourraient développer une détresse respiratoire cependant la durée courte de l'expérience (14 jours) fait que les animaux seront mis à mort avant le développement des symptômes physique de la maladie. Cependant le suivi journalier des animaux nous permettra d'euthanasier les animaux qui développeraient une détresse respiratoire précoce.

Devenir

Afin d'évaluer la fibrose pulmonaire par immunohistochimie sur les tissus pulmonaires les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

De part la complexité des intéractions cellulaires et moléculaire il est impossible d'évaluer l'effet de nos anticorps sur l'ensemble du métabolisme sans avoir recours à des modèles animaux. Le modèle de souris a été choisi car nous disposons d'un anticorps ciblant la molécule murine équivalent à notre anticorps ciblant la protéine humaine. Si l'effet bénéfique est observé dans le modèle murin nous pourrons justifier l'intérêt de l'anticorps humains pour la clinique.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit à 100 (25 souris / groupes) ce qui nous permettra d'évaluer de façon statistique l'effet de l'anticorps sur la fibrose pulmonaire. Afin de limiter les variations entre les souris au sein d'un groupe, nous prévoyons 25 animaux par groupe afin d'être sûr d'obtenir des résultats statistiques. Le poids corporel des animaux des différents groupes sera comparé par le test statistique Two Way RM ANOVA et leur survie par Log Rank test. Approche statistique : Nous utiliserons un t Test pour comparer le groupe contrôle avec chaque groupe test

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours. Les animaux montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal être (une perte de poids supérieure à 20%, la présence de sang dans les matières fécales,l'impossibilité de mouvement ou la voussure sévère du dos) seront euthanasiés. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement sont standards à l'espèce, les souris seront par groupe social de 5 maximum par cage, avec des moyens d'enrichissement. Une surveillance quotidienne ainsi qu’un suivi clinique etcomportemental des animaux (poils hérissés, dos voûté, agressivité…) sera réalisé. Tous les animaux traités et ceux des groupes contrôles seront analysés à la fin du protocole afin d’en obtenir un maximum d’information post mortem (analyse cellulaire par cytométrie, immunohistologie, analyse d'expression ARN). Les résultats obtenus permettront de déterminer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour limiter/empêcher la fibrose pulmonaire.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été choisi car nous disposons d'un anticorps ciblant la molécule murine équivalent à notre anticorps ciblant la protéine humaine. Si l'effet bénéfique est observé dans le modèle murin nous pourrons justifier l'intérêt de l'anticorps humains pour la clinique. L'âge : les souris commandées seront des souris adultes entre 18-24 mois pour leur poids stable en fin de croissance, cela limitera les différences entre individus. L'espèce : pour la facilité de manipulation (injection des molécules en s/c et ip), de prélèvement et d'analyse d'échantillons, d'évaluation physique (bien être)

3 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des rats spontanément hypertendus servent de modèle du trouble de l'attention avec hyperactivité, testés jeunes entre trois et six semaines pour se rapprocher de l'enfant, placés seuls dans une enceinte pendant 150 minutes après administration d'un composé, puis tués pour prélever sang et cerveau. L'effectif est important et les procédures sont décrites brièvement. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer le TDAH et que le recours à l'animal de laboratoire est "nécessaire".

Objectifs

Le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention (TDAH) est un trouble complexe du développement cérébral caractérisé par l'hyperactivité/l'impulsivité et l'inattention. Cette affection touche principalement les enfants et les adolescents, mais elle peut également perdurer à l'âge adulte. Les rats SHR sont des rats spontanément hypertendus présentant une hyperactivité locomotrice et qui sont considérés comme un modèle animal validé du TDAH. Les rats WIstar Kyoto (WKY) servent de souche témoin. L’objectif de la présente étude est d’examiner l’effet d’un composé sur l’hyperactivité des rats SHR dans un test d’activité locomotrice spontanée. Ce modèle animal est un outil précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux ainsi que le développement neuronal mis en jeu dans le TDAH.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, seul des médicaments modulant les transmissions aminergiques tels ques les psychostimulants (ex :Méthylphénidate) et non psychostimulants (ex : Atomoxétine) sont utilisés actuellement comme pharmacothérapies. Ces médicaments augmentent les transmissions dopaminergiques et noradrénergiques; ces systèmes de neurotransmission sont les cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux traitements. De nombreuses recherches sur ce trouble, utilisant des approches génétiques, pharmacologiques et de neuro-imagerie, ont été réalisées. Plusieurs modèles animaux de TDAH tels que : le rat spontanément hypertendu (SHR) ou les souris knock-out DAT, ont également été utilisés. Ces modèles animaux sont donc des outils précieux pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux du TDAH.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

1) L’un des modèles animaux du TDAH les plus utilisés est le rat spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Le rat SHR montre des niveaux élevés d’hyperactivité et d’impulsivité ; ces traits sont présents avant que le rat SHR ne développe une hypertension à l’âge adulte, c’est-à-dire vers l’âge de 7- 8 semaines. Dans ce projet, l’âge des animaux est compris entre 3 à 6 semaines au moment du test ; étant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est plus pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles. Par conséquent, les animaux de ce projet n’ont pas encore développé l’hypertension spontanée. 2) Le test consiste à placer les animaux individuellement dans une enceinte et à les laisser se déplacer librement pendant une période de 150 minutes comprenant une première période d’habituation de 30 minutes et une deuxième période de test de 120 minutes. 3) Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test à un intervalle de 2 semaines. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée ou intraveineuse peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer TDAH. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

►1) Les animaux sont hébergés selon les normes d’hébergement (annexe II de l’arrêté relatif à l’agrément des EU). Les rats seront hébergés collectivement. Les cages comporteront une litière de sciure, des matériaux de nidification adéquats, ainsi que des blocs à ronger... ► 2) Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet sont : les rats spontanément hypertendus (SHR) et la souche témoin du rat SHR, le rat Normotendu Wistar Kyoto (WKY). Les rats SHR présentent des déficits d'attention soutenue, d'impulsivité motrice et d'hyperactivité dans un nouvel environnement. De plus, ils présentent une signalisation DA réduite et une expression accrue du transporteur DA (DAT), similaire aux patients atteints de TDAH. De même, le méthylphénidate (MPH) corrige les déficiences attentionnelles et motrices chez les rats SHR, apportant un soutien supplémentaire aux rats SHR en tant que modèle de TDAH humain. 3-6 semaines au moment du test. Etant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles.

1 088 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une neuropathie douloureuse leur est provoquée par quatre injections de paclitaxel, un agent de chimiothérapie, puis leur douleur est mesurée par des tests de von Frey, d'immersion et de pression de la patte. L'objet est de mettre au point un modèle de douleur neuropathique destiné à l'"offre de service" commerciale de la société pour ses clients développant des médicaments. Le porteur reconnaît que le remplacement reste limité dans l'étude de la douleur et décrit des effets attendus comme l'absence de prise de poids, la constipation et l'alopécie.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’un modèle de neuropathie chimioinduite, causé par des administrations répétées de paclitaxel. Le nombre de procédures, ainsi que le nombre d’études au sein de ces procédures et le nombre d’animaux sont basés sur l’expérience de l'entreprise dans le développement de modèles de douleur chez le rongeur. Elle a récemment mis au point un modèle de douleur neuropathique par intoxication à l’oxaliplatine. Fort de cette expérience, la société souhaite mettre en place un nouveau modèle de douleur neuropathie chimioinduite, afin de pouvoir apporter des modèles au plus proche de la clinique. Il est important de tester les molécules avec l’agent chimiothérapeutique testé en clinique. Chaque agent a une application différente due à son mécanisme d’action. Au terme de leur développement, ces modèles seront inclus dans l’offre de service de la société.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre à la société de mettre au point un nouveau modèle au plus près des conditions cliniques. L'entreprise peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causés par l’administration de paclitaxel, actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ceci va ainsi permettre une meilleure prise en charge de neuropathie due l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer

Procédures

Les animaux auront 4 injections intrapéritonéale de paclitaxel (D0-2-4-7) et auront un test comportementale de douleur (monofilament de von frey, von frey électrique, immersion de la patte, pression de patte) Les procédures 1 à 3 feront des cinétiques de test sur du long terme pour voir l'induction (tous les 3 à 4 jours entre J0 et J35 un seul timepoint) et pour les autres précédures un seul jour (selon résultats des premieres procédures) sera testé mais avec une cinétique de cinq point de mesures. Le travail s’orientant vers de l’allodynie, une partie des animaux auront simplement une sensation de gêne/chatouillement. Lors des tests, les animaux peuvent être isolés ou en contention.

Impact sur les animaux

Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Malgré tout, un article nous permet de nous attendre à une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie et de la piloérection. (Cavaletti, 1995, PMID : 7601264) Ces observations seront incluses dans nos points limites.

Devenir

Le modèle de neuropathie chimioinduite par administration de paclitaxel semble être un modèle stable dans le temps. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles . De plus, les processus biologiques causés par l’administration de paclitaxel pourrait interférer avec d’autres modèles. L’âge de ces animaux à la fin des procédures sera bien plus important que pour l’ensemble de nos modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité d’ANS Biotech, par l’utilisation d’une enceinte à CO2 dont l’air est remplacé par du dioxyde de carbone à raison de 27.5% par minute (mort par arrêt respiratoire après perte de conscience) ou par injection d’une dose létale de d’Euthasol® (sous anesthésie gazeuse, 400 mg/kg, i.p. ou i.c.) ou dislocation cervicale par du personnel spécifiquement formé à ce geste.

Remplacement

Les possibilités de remplacement par substitution complète de l’expérimentation animale sont encore limitées dans le domaine de l’étude de la douleur, mais nous les mettons en place dès qu’elles sont scientifiquement validées.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat.

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent pour la majorité des valeurs maximales à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance supplémentaire. Les procédures ont pour but de trouver les critères les moins drastiques permettant de montrer une allodynie/hyperalgésie. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise d’ANS Biotech (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien d’ANS (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II).

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente (Sneddon 2019 PMID : 31544617) et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente (Flatters 2004, PMID : 15082137) suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Des rats pesants entre 200-250g le jour de l’induction vont être utilisés. Cette gamme de poids correspond à un âge de cinq à six semaines. Ceci a été choisi en accord avec les données bibliographiques sur lesquels nous nous sommes basées pour choisir nos critères d’induction . (Favre et al. PMID : 19576881 ; Flatters et al. 2004 and 2006)

3 912 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dystonie cervicale, l'équivalent d'un torticolis spasmodique, leur est provoquée par micro-injection intracérébrale de DTG dans le noyau rouge après pose d'un guide-canule sous chirurgie stéréotaxique, puis des molécules d'un donneur d'ordre sont testées avant une perfusion au paraformaldéhyde. L'effectif est important pour une étude comportementale, et le projet relève d'une prestation pour un client industriel. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif de dystonie cervicale n'existe et que la démonstration se fait sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, souvent douloureux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Des études comportementales et biochimiques ont montré que les récepteurs σ sont impliqués dans la régulation du mouvement et de la posture. Ces récepteurs σ sont concentrés dans des structures cérébrales, telles que le noyau rouge et la substantia nigra. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et par la suite de tester les molécules du donneur d’ordre pour étudier leur potentiel effet sur les récepteurs σ : soit en induisant, par eux-mêmes, des dystonies cervicales (effet agoniste sur les récepteurs σ2) soit en inhibant les dystonies cervicales induites par l’administration de DTG, un agoniste σ2, (effet antagoniste sur les récepteurs σ2).

Bénéfices attendus

La dystonie cervicale, également appelée torticolis spasmodique, est un trouble du mouvement neurologique caractérisé par des contractions musculaires continues ou intermittentes qui provoquent des mouvements répétitifs anormaux, du cou et de la tête. Les mouvements peuvent entraîner une torsion de la tête et du cou (torticolis) ou une traction vers l'avant (antécollis), vers l'arrière (rétrocollis) ou latéralement (latérocollis). Certains peuvent avoir une combinaison de ces mouvements. En outre, les symptômes peuvent varier dans le temps et selon les individus. Les symptômes commencent généralement progressivement. Ils peuvent s'aggraver et atteindre un plateau. Le stress ou l'excitation peuvent aggraver les symptômes. De plus, certaines positions physiques peuvent activer les symptômes. Ce modèle est utile pour tester le potentiel agoniste ou antagoniste des récepteurs σ2 de molécules induisant des dystonies cervicales.

Procédures

Le but de cette étude est de mettre en œuvre le modèle de dystonie cervicale chez le rat et ainsi permettre le développement de différentes molécules. Une micro-injection intracérébrale dans le noyau rouge de 1,3-di- (2-tolyl) guanidine (DTG), qui est un agoniste des récepteurs σ 1 et σ 2, est réalisée pour induire une dystonie du cou chez le rat. A la fin de l’étude, pour vérifier le site d’injection, les animaux sont perfusés au paraformaldehyde (PFA) et des coupes histologiques sont réalisées par la suite.

Impact sur les animaux

•1- Chirurgie -Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Un guide canule (tubes en acier inoxydable de calibre 24) est implantée verticalement à 1.00 mm au-dessus du noyau rouge •2- Administration -Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour vérifier le site d’injection au niveau du cerveau, les animaux seront perfusés au paraformaldehyde (PFA) à la fin de l’étude.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle de dystonie cervicale alternatif à l’animal.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables. • Justification du nombre de groupes: 1) Le groupe témoin est nécessaire à chaque expérience 2) Le groupe DTG est nécessaire pour valider l’expérience et pour comparer l’efficacité du produit testé 3) Il est généralement nécessaire de tester le produit à trois doses pour mesurer la relation dose-effet mais un nombre de doses inférieur ou supérieur peut être justifié en fonction de l’état de connaissance du produit. L’effet attendu du produit testé est une diminution de déviation de torsion de la tête par rapport au plan horizontal. Le DTG est administré en intracérébrale. Selon les études, le produit testé et son placebo sont administrés en intracérébrale ou par voies orale (gavage), intrapéritonéale, sous-cutané, intraveineuse ou intranasale. • Justification du nombre d’animaux par groupe. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 12 animaux par groupe. L’utilisation d’un nombre inférieur d’animaux a une probabilité importante d’entraîner la non-validité de l’étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d’animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée et ils sont placés individuellement. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. La lignée de rat utilisée est : Wistar 7 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs mammaires 4T1, elles passent des examens d'IRM sous anesthésie, les effets indésirables déclarés se limitant au développement de la tumeur. L'objectif est de concevoir et valider des agents de contraste ciblant la nétrine-1 pour détecter plus tôt le cancer mammaire métastatique. Le porteur décrit très brièvement les procédures et affirme que l'étude préclinique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le projet a pour objectif la conception et la validation de nouveaux agents de contraste qui ciblent spécifiquement la nétrine-1, pour le diagnostic précoce du cancer mammaire de type métastatique.

Bénéfices attendus

Les bénfices de ce projet concerne la possiblité d'une détection précoce du cancer mammaires pour une prise en charge plus rapide et plus éfficace

Procédures

les animaux passeront des examens d'imagerie non invasive in vivo d'IRM

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés au développement de la tumeur 4T1. Une grille descoring a été établie et des points limites ont été définis.

Devenir

à l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par disclocation cervicale

Remplacement

le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’observation des animaux et l’imagerie in vivo. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront observées chaque jour de la semaine et les critères comportementaux et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du pallier de douleur (point limite) sont présentés dans les procédures. Les mêmes animaux seront utilisés pour les différents temps du suivi. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour en avoir 5 de taille homogène, nombre nécessaire permettant l’obtention d’une étude avec des souris homogènes en taille de tumeurs par stade de développement tumoral. Des tests t non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris (n=5).

Raffinement

les animaux sont observés scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place. Durant les acquisitions d’imagerie les animaux seront anesthésiés

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigénèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Les tumeurs mammaires métastatiques 4T1 étudiées sont spécifiques du modèle murin. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous la peau, puis une partie reçoit des traitements par gavage cinq jours par semaine et par injection intrapéritonéale deux fois par semaine, la tumeur pouvant atteindre 1 000 mm³. Le porteur décrit une gêne légère par geste dont l'accumulation devient modérée, et cherche à confirmer in vivo que bloquer le facteur CTGF limite l'agressivité tumorale dans le cancer du rein. Les retombées cliniques annoncées, de nouvelles combinaisons de médicaments, restent au conditionnel, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre compartiments cellulaires.

Objectifs

Les tumeurs du rein sont très riches en vaisseaux sanguins. Une des stratégies thérapeutiques est de bloquer la formation de ces vaisseaux par des traitements anti-angiogéniques. Malheureusement, les patients développent des résistances au traitement et la maladie progresse inéluctablement. Notre équipe cherche à comprendre les mécanismes moléculaires qui expliquent l’apparition de résistance chez les patients atteints de cancer du rein à cellules claires. Nos résultats in vitro montrent que les cellules libèrent des molécules en réponse au traitement. Parmi ces molécules, nous avons identifié le facteur de croissance des tissus conjonctifs (CTGF), et nous avons montré que CTGF participe à l’agressivité tumorale. Par conséquent, nos résultats suggèrent que le ciblage de CTGF pourrait représenter une stratégie thérapeutique innovante. Nous souhaitons confirmer in vivo que bloquer CTGF permettrait de limiter l’agressivité tumorale voir induire la mort des cellules tumorales. Cette étude nous permettra de conclure sur la pertinence de l’utilisation d’un anticorps anti-CTGF dans le traitement du cancer du rein à cellules claire métastatique.

Bénéfices attendus

La validation de nos résultats in vitro sur un modèle in vivo nous permettrait dans l’avenir de développer des stratégies thérapeutiques ciblant CTGF dans le traitement des RCC. Cette démarche fondamentale et translationnelle permettra d’améliorer l’efficacité des drogues par l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques / biomarqueurs de résistances. Un transfert vers la clinique avec de nouvelles voies thérapeutiques incluant des combinaisons innovantes de médicaments serait l'accomplissement de ce projet.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (une injection par souris). Ces souris seront divisées en 2 groupes. Un groupe ne subira aucun traitement, seul un suivi de la croissance tumorale sera réalisé. Pour le second groupe, lorsque la tumeur atteindra un volume suffisamment important, des traitements seront administrés aux souris en gavage et/ ou en injection intrapéritonéal. Le traitement par gavage sera réalisé 5 fois par semaine et le traitement en intrapéritonéal 2 fois par semaine. Ces injections, que ce soit de cellules tumorales ou du traitement administré, ne dureront que quelques secondes chaque fois. Le traitement par gavage, réalisé à l’aide d’une canule de gavage est également une procédure très rapide. Enfin, aucune autre intervention ne sera réalisée sur l’animal vigil ou endormi. Les souris seront monitorées quotidiennement afin d’assurer une bonne gestion de la douleur. Chacune des souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement puis mise à mort à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite. Si aucun point limite n’est rencontré, les traitements auront lieu durant 4 à 5 semaines jusqu’à atteindre un volume tumoral de 1000 mm3.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les injections sous-cutanées de cellules tumorales ainsi que les gavages sont associés à une gêne voir douleur de type légère. Ces actes expérimentaux ne nécessitent cependant aucune anesthésie. Ces cellules tumorales ne metastasent pas. Les animaux seront mis à mort suffisamment tôt afin d'éviter l'apparition de nécroses au niveau des tumeurs. Néanmoins, s'agissant d'un protocole impliquant i) l'injection de cellules tumorales, et ii) des traitements par gavage (5 jours /7) et en intrapéritonéal (2 fois par semaine), qui, individuellement, vont générer une douleur légère et du stress mais dont l’accumulation par animal entraine une nuisance globale modérée.

Devenir

Le prélèvement des tumeurs nécessitera la mise à mort des souris.

Remplacement

Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents compartiments cellulaires (endothelial, epithelial, stromal, etc).

Réduction

Avant de passer au modèle in vivo, toutes nos expériences ont été préalablement validées in vitro. Nous avons également effectué une large recherche bibliographique. Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour les doses administrées de composés pharmacologiques. Le nombre minimum de souris est établi à 10 par groupe pour être statistiquement significatif (en nous basant sur le fait que les traitements expérimentaux induiront une diminution de la prise/croissance tumorale d’au moins 20%). Enfin, nous utiliserons un test statistique paramétrique (test Anova) afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de données statistiquement exploitables statistiquement.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire tri-hebdomadaire puis 5/7 jours (à partir du début des traitements) sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de score adaptée au modèle (Annexe 1). La fréquence de ces examens sera intensifiée en fonction des symptômes relevés sur un animal jusqu'à la disparition du problème ou la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus répandus pour étudier l’effet de drogue ou traitement par anticorps sur la croissance tumorale. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. Dans ce projet, nous utilisons des souris immunodéficientes ce qui nous permettra d’utiliser des modèles humains de RCC. Les souris utilisées seront de jeunes femelles adultes agées de 7 à 8 semaines.