Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Effet d’inhibiteurs de nécrose programmée sur l’hépatite auto-immune chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hépatite aiguë leur est induite par injection de concanavaline A, puis leur sang est prélevé par voie rétro-orbitale avant une mise à mort par dislocation cervicale, pour tester des molécules inhibitrices de la mort cellulaire programmée. Le porteur qualifie la dose de concanavaline A de "sans danger" en s'appuyant sur l'absence de mortalité rapportée, alors que la procédure vise précisément à déclencher une atteinte hépatique aiguë. Il affirme que la culture d'hépatocytes ne suffit pas et que cette étude préclinique est une étape "indispensable" avant des essais chez l'homme.
Objectifs
Le foie est un organe vital assurant des fonctions essentielles de détoxification et de stockage. Tout dysfonctionnement de cet organe majeur a des conséquences graves sur la santé, allant jusqu’à engager le pronostic vital. A ce jour, il n’existe pas de réelles solutions thérapeutiques, hormis chirurgicales, pour traiter les insuffisances hépatiques aigues. Notre projet vise à réaliser des essais précliniques de molécules candidates pour réduire l’hépatite aigue induite par la concanavaline A
Bénéfices attendus
Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements des hépatites auto-immunes basés sur l'utilisation de nouvelles petites molécules inhibitrices de nécrose régulée.
Procédures
Le dépôt d'un gel anexthésiant (Xylocaïne 2%) au coin de l'oeil avant le prélèvement de sang par voie rétro-orbitale permet de limiter la douleur. Le prélèvement de sang réalisé par un expérimentateur expérimenté est rapide et la souris est immédiatement euthanasiée par dislocation des cervicales.
Impact sur les animaux
La dose de Concanavalin A de 10 mg/kg est reconnue comme sans danger pour les souris C57Bl6/J (aucune mortalité à 12 h ou 18 h de traitement, Ye T et al., Cell Physiol Biochem 2018, 46 : 1241-1251).
Devenir
Tous les animaux (768) sont gardés en vie après la procédure "Traitement par les inhibiteurs et la concanavalin A". Tous les animaux (768) sont mis à mort après la procédure "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale".
Remplacement
S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celles posées dans notre projet nécessitent une étude à l’échelle systémique. En effet, les processus de mort que nous cherchons à étudier mettent en jeu les différents types cellulaires du foie, des cellules circulantes et même d’autres organes comme la rate. Ce sont donc des processus complexes non modélisables in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre de souris engagées dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques.
Raffinement
L'étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaises induits par le traitement. Enfin, nous avons anticipé l'étude de tous les organes pertinents (2) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d'informations.
Choix des espèces
Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (au moins 8 semaines d’âge et poids corporel supérieur à 20 g) pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout les adultes.
Utilisation du BCG comme agent thérapeutique pour la guérison de plaies chroniques infectées chez l’individu diabétique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 2 020 en gravité sévère. Ces souris diabétiques reçoivent une plaie dorsale chirurgicale, dont la plupart sont ensuite infectées par des bactéries pathogènes exposant à un risque de septicémie, puis un antibiotique ou du BCG, avant d'être tuées au pentobarbital. Le porteur reconnaît qu'aucune donnée ne permet de prédire la mortalité par infection dans ce modèle. Il affirme que les modèles in vitro ou in silico "ne suffisent pas" et qu'une validation in vivo est requise pour un usage clinique.
Objectifs
Cette étude a pour objectif principal de comprendre les mécanismes cellulaires, moléculaires et vasculaires associés à l’utilisation du BCG sur un modèle de plaie chronique
Bénéfices attendus
Cette étude a pour objectif principal de comprendre les mécanismes cellulaires, moléculaires et vasculaires associés à l’utilisation du BCG sur un modèle de plaie chronique chez l’animal diabétique, dont il est attendu qu’elle favorise leur guérison. Le cas échéant, un essai clinique pour la prise en charge des infections du pied chez le patient diabétique pourrait être rapidement mené, dont la réussite se traduirait immédiatement par une amélioration considérable leur confort de vie, l’infection du pied diabétique étant souvent synonyme d’hospitalisations multiples et d’interventions menaçant l’autonomie que la « BCG-thérapie » pourrait éviter.
Procédures
les 2280 souris seront impliquées dans la procedure chirurgicale impliquant la mise en place d'une plaie dorsale. Tous les 2 jours pendant 14 jours l’évaluation de la cicatrisation se fera par photographie digitale et le suivi du flux sanguin de surface sera mesuré par doppler-laser. Un prélèvement sanguin pour un contrôle de la glycémie sera réalisé apres 14j lors de la mise à mort de l'animal soit par ponction intracardiaque. pour 2120 souris les plais seront infectés par une souche bactérienne et elle recevront ensuite une administration d'antibiotique ou de BCG
Impact sur les animaux
La procedure chirurgicale impliquera la mise en place d'une plaie dorsale dont la douleur induite sera traitee par une solution de buprénorphine (0.05 à 0.1 mg/kg) administrée par voie sous-cutanée avant le réveil de l’animal et maintenue pendant 3j par 2 administrations sous-cutanée par 24h et prolongée si des signes de souffrance ou d’inconfort sont observés. Nous sommes conscients que l’infection de plaies cutanées par des agents particulièrement pathogènes tels que S. aureus et P. areuginosa expose les animaux à un risque de septicémie précoce. En outre, il n’existe pas de données dans la littérature permettant de prédire le taux de mortalité par infection dans ce modèle. Toutefois, la profondeur des plaies ne dépassant pas le stratum granulosum, le risque d’infection généralisée reste faible.
Devenir
à la fin de l'étude pour chaque procédure tous les animaux seront mises à mort par injection d’une dose létale de pentobarbital (Euthasol) à 140 mg/kg par voie intrapéritonéale
Remplacement
Il nous tient à cœur d'appliquer au mieux la règle des 3R. . Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas en ce qui concerne l’analyse des phénomènes cellulaires et moléculaires induits par l’injection in situ de BCG car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. En outre, dans l’optique de positionner le BCG comme agent thérapeutique dans la prise en charge des IPD en clinique humaine, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo.
Réduction
Il nous tient à cœur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.
Raffinement
Il nous tient à cœur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (perte de poids importante, changement comportemental, hypothermie, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin nous permet d’étudier facilement les réponses locales induites par l’injection intra-lésionnelle de BCG. Nous utiliserons une souche de souris C57BL/6 db/db qui est le modèle de souris diabétique le plus couramment utilisé dans la recherche de thérapeutiques innovantes concernant les plaies chroniques du diabétique (Goldufsky et al., Wound Rep Reg 2015 ; Han and al., Mol Med Rep 2017 ; Mirza et al., Cytokine 2011 ; Wang et al., J Surg Res 2019 ; Xiao et al., Proc Natl Acad Sci USA 2016). Notamment parce que les souris C57BL/6 db/db présentent un retard à la cicatrisation, par rapport aux souris saine du même fonds génétique C57BL/6, proche de la pathologie diabétique humaine. Nous utiliserons des souris adultes de 10 à 12 semaines car c’est à cet âge que les souris diabétiques présentent une glycémie élevée, une atrophie des cellules bêta pancréatiques ainsi qu’un retard à la cicatrisation des plaies comparables à ce qui est observé en pathologie humaine.
Rôles physiopathologiques de deux substrats moléculaires, cibles de l’interaction sociale, dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
7 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Rendues déficientes en sociabilité par modification génétique ou par isolement, elles subissent des injections intracérébrales pouvant provoquer inflammation, infection ou mortalité, un puçage et des tests de comportement, avant le prélèvement de leurs tissus. Le porteur cherche à valider deux cibles moléculaires de l'interaction sociale. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement du comportement social in vitro" et qu'une expérimentation in vivo est "indispensable".
Objectifs
Les Mammifères, incluant notamment les humains, les animaux de ferme et les rongeurs, ont acquis une grande variété de comportements sociaux (interaction sociale, comportements affiliatifs, comportements socio-sexuels, ...) pour garantir leur succès évolutif. Les substrats moléculaires et cellulaires sous-jacents du comportement social restent peu élucidés à ce jour. Il existe de nombreux troubles du comportement social dus à des traumatismes psychologiques précoces, à l’exposition à des drogues, ou bien à des mutations génétiques. L’identification des dérégulations communes chez les souris souffrant de troubles du comportement social par rapport aux souris sauvages permet d’identifier ces substrats moléculaires et cellulaires. Ainsi, en se focalisant sur l’interaction sociale avec un congénère inconnu, deux substrats moléculaires répondant à ces critères ont été identifiés. Les objectifs de cette étude sont donc 1) de valider ces substrats moléculaires de l’interaction sociale, 2) de déterminer leur rôle physiologique exact au niveau moléculaire et cellulaire à l’état basal et au cours de l’interaction sociale et 3) de comprendre les mécanismes pathologiques menant à leurs dérégulations dans les modèles de déficit d’interaction sociale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de valider deux nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer l’interaction sociale chez les animaux sociaux dont l’Homme et les animaux d’élevage reste méconnus. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques de ces troubles de l'interaction sociale, et également de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour soulager ces troubles.
Procédures
administration de composés (1 fois, 5 sec), puçage des animaux (1 fois, 10min par animal), Procédures chirurgicales par injections intracérébrales (1 fois, 30-60 min de procédure par animal).
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. Modèles de déficit de sociabilité (génétique ou par isolement) : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être et éventuellement une augmentation légère du stress de ces animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement. Injections intracérébrales : potentielle inflammation et infection des tissus ou mortalité due à l'opération.
Devenir
administration de composés, puçage des animaux, modèles de déficit de sociabilité (génétique ou par isolement), Injections intracérébrales : les animaux sont gardés en vie afin de pouvoir réaliser les tests de comportement. Après les tests de comportement, les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode de remplacement du comportement social in vitro. Le comportement animal et les conséquences moléculaires et fonctionnelles de l’interaction sociale ou des déficits ne peuvent donc être évalués que sur des animaux vivants. Il est indispensable de recourir à une expérimentation in vivo.
Réduction
notre étude met en place des conditions spécifiques bien identifiées à l’utilisation chaque sous-groupe d’animaux et à chaque étape du projet. Dans chacun des groupes expérimentaux, la méthode ou le modèle qui semble la plus approprié sera préalablement testé, si les résultats sont probants directement, les autres méthodes ou modèles ne seront pas utilisés. De plus, si aucun effet genre n’est observé dans les premières expériences, les effectifs seront réduits de 50%.
Raffinement
La durée des procédures pour chaque animal est la plus brève possible afin de minimiser son inconfort et son stress. De plus, certaines de ces expériences mettent en place des approches thérapeutiques afin de restaurer l’interaction sociale, et donc le bien-être des animaux souffrant de déficit d’interaction sociale. Pour les animaux isolés, un enrichissement supplémentaire leur sera apporté, en plus du nid en carton, avec des frisures de papier kraft diminuant leur stress et facilitant leur thermorégulation.
Choix des espèces
Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduisent bien et vite et dont les comportements sociaux sont mesurables par des tests comportementaux bien décrits. Les expériences seront réalisées chez la souris jeune adulte (7-12 semaines) à un stade post-pubère où les neurones sont bien caractérisés et matures.
Évaluation des effets in vivo de nouvelles entités pharmacologiques dans un modèle d’hyperphagie boulimique chez la souris
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Troubles nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Hébergées seules, elles suivent un modèle d'hyperphagie boulimique avec accès intermittent à une nourriture grasse, reçoivent chaque semaine un composé par gavage pendant quinze à vingt semaines, et développent une obésité morbide avant d'être tuées au dioxyde de carbone. Le porteur signale que l'isolement en cage individuelle est lui-même une source de stress. Il affirme que l'effet d'un candidat médicament sur le comportement alimentaire "ne peut s'évaluer qu'in vivo".
Objectifs
Les études sont effectuées sur des souris C57BL/6J mâles ou femelles à partir de l’âge de 10 semaines (Janvier- Labs) selon le protocole décrit par Czyzyk et al. (2010). Les souris sont placées individuellement par cage dans une pièce de l’animalerie dédiée à ces expériences (température 22°C, humidité contrôlée, lumière/obscurité 12h/12h, lumière active à 7h). Elles ont libre accès à la nourriture classique à base de carbohydrates (A04, SAFE) et à l’eau. Un enrichissement constitué d’un sizzle pad leur est fourni afin qu’elles puissent faire un nid, ce qui diminue le stress et facilite la thermorégulation. Pour ces tests expérimentaux, il est nécessaire de constituer une cohorte de 32 animaux, 4 groupes de 8 individus : 2 groupes « continus » auxquels on propose à la fois de la nourriture classique et de la nourriture grasse 7J/7 et deux groupes « intermittents », avec la nourriture classique 7J/7, mais la nourriture grasse 1 jour/7. La nourriture grasse (high energy diet ou HED), dont la recette est basée sur celle décrite dans (Czyzyk et al., 2010), est fabriquée à façon par SAFE (89290 Augy, France). À chaque expérience hebdomadaire, la moitié des individus recevra le traitement pharmacologique et l’autre moitié le placébo. Le jour de l’expérience, à 10h, le groupe placebo reçoit le véhicule et les groupes traités la/les molécule(s) d’intérêt, par voie orale voie, ou par voie intrapéritonéale (selon les caractéristiques pharmacocinétiques des produits). Trente minutes après (plus ou moins, selon la pharmacocinétique des produits considérés) on leur fournit une quantité prépesée de nourriture HED et/ou de A04. Après 2h30 et 24h, on pèse les quantités résiduelles de nourritures HED et A04, ce qui permet de calculer la consommation alimentaire individuelle. Chaque semaine, les groupes « traité » et « véhicule » seront intervertis. On pourra ainsi utiliser cette cohorte de 32 individus pendant plusieurs semaines (15 à 20 semaines), ce qui permet de caractériser plusieurs composés pharmacologiques candidats avec un nombre réduit d’animaux. Czyzyk TA, Sahr AE, and Statnick MA (2010) A model of binge-like eating behavior in mice that does not require food deprivation or stress. Obesity (Silver Spring) 18:1710–1717.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, il est possible d’évaluer chez l’animal les effets de composés pharmacologiques qui pourraient avoir un potentiel thérapeutique dans l’hyperphagie boulimique chez l'homme ou permettre d’en mieux comprendre la physiopathologie.
Procédures
La procédure implique l'administration aux animaux de produits à visée thérapeutique. Pour cela, les souris sont saisies manuellement, avec le plus de délicatesse possible, et les administrations de composés pharmacologiques sont effectuées par voie orale, avec une sonde spécifique en plastique (ECIMED, V010430) qui ne meurtrit pas la cavité buccale ou l’œsophage, ou si nécessaire par voie intrapéritonéale (avec une aiguille fine de 26G) dans un volume de 10 ml/kg. Les groupes témoins (véhicule) ou traités (produit) alternent chaque semaine. Pour chaque cohorte, la durée de l'expérimentation est de 15 à 20 semaines, soit 15 à 20 administrations avec pour moitié le véhicule et pour moitié un produit à visée thérapeutique.
Impact sur les animaux
Développement d'une obésité morbide avec le temps. Stress lié à l'isolement des souris qui sont hébergées seules dans leur cage.
Devenir
Euthanasie de l'ensemble de la cohorte avec un appareil permettant la sédation puis la mort par augmentation croissante de CO2 (appareil règlementaire de chez Minerve).
Remplacement
L’évaluation du comportement alimentaire, qui fait intervenir des processus physiologiques fondamentaux, mais complexes – ainsi que l’effet d’un composé candidat médicament sur ce comportement – ne peut s’évaluer qu’in vivo, chez un animal.
Réduction
Dans l’article original décrivant la technique de BED chez la souris, les auteurs ont utilisé 15-20 individus par groupe (Czyzyk et al, 2021). Des études préliminaires effectuées au laboratoire montrent que l’on peut réduire de plus de 2 fois le nombre d’individus en le restreignant à 8 par groupe. Il reste ainsi possible de mettre en évidence un effet pharmacologique significatif d’un produit, supérieur ou égal à 25% (en plus ou moins) par rapport au contrôle véhicule (ANOVA à 2 voies, avec test de comparaisons multiples de Sidak ; analyses avec GraphPrism 8). L’expérience nécessite 4 lots de 8 souris, soit un total de 32 animaux. Il est envisagé d’avoir 3 cohortes de 32 animaux par an pour une durée de 5 ans, soit un total de 480 souris.
Raffinement
Un enrichissement constitué d’un sizzle pad est fourni dans la cage de chaque souris afin qu’elle puisse faire un nid, ce qui diminue le stress et facilite la thermorégulation.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J sont classiquement utilisées en expérimentation animale pour ce qui concerne les mesures de prise alimentaires, d’obésité et diabète et d’études d’efficacité. En outre, la technique que nous mettons en place dans ce protocole est celle de Czyzyk et al., 2010, effectuée sur cette souche de souris.
Évaluation de la dégradabilité de nouveaux hydrogels injectables à base de réticulation dynamique covalente chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections sous-cutanées d'hydrogels sous anesthésie, sont suivies par fluorescence sans autre prélèvement, puis tuées au dioxyde de carbone pour récupérer les hydrogels et les tissus environnants. Le porteur veut sélectionner les formulations les plus stables en vue d'un futur essai sur l'arthrose dans un modèle animal plus grand, puis chez l'humain. Il indique avoir mené des tests in vitro "afin de remplacer au maximum" l'expérimentation animale.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer la stabilité in vivo de nouveaux hydrogels injectables. Leur stabilité sera évaluée sur plusieurs semaines afin d’identifier les formulations les plus pertinentes pour une future étude d’efficacité thérapeutique contre l’arthrose dans un plus gros modèle animal.
Bénéfices attendus
L’étude permettra de sélectionner les meilleurs hydrogels candidats pour une future injection intra articulaire sur des animaux arthrosiques et pouvoir envisager des études cliniques chez l'homme afin de générer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour le traitement de l'arthrose.
Procédures
Des injections sous-cutanées d'hydrogels (200 µL par injections, 3 injections par animal) seront effectuées après anesthésie.
Impact sur les animaux
En se basant sur nos connaissances et les études antérieures nous n’attendons que de très faibles faibles nuisances sur les animaux. Le volume des injections d'hydrogels seront limitées à 200 µL par injections nous cutannée, et toutes le injections seront effectuées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Aucune douleur, gêne fonctionnelle, perte de poids, stress ou comportement anormal des animaux au cours de cette expérimentation n'est attendue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure par induction au CO2 en chambre close. Ceci est nécessaire afin de récupérer les hydrogels injectés et les tissus alentours pour effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
De nombreux tests in vitro de dégradabilité enzymatique ont été effectués afin de remplacer au maximum l’expérimentation animale.
Réduction
Plusieurs injections seront faites chez les animaux pour réduire au maximum le nombre d’individus utilisés, tout en limitant le nombre d’injections pour n’occasionner aucune gêne ou douleur chez les individus. Le nombre d’animaux est fixé à 6 souris par groupes. Ce nombre est basé sur notre expérience d’études histologiques et radiologiques permettant des résultats cohérents et reproductibles avec robustesse et significativité statistique sans être excessif en termes d’animaux. Les études statistiques comparatives seront réalisées en utilisant le test de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaison multiple de Dunn.
Raffinement
Le suivi des hydrogels se fera par un suivi de la fluorescence des matériaux pour n’effectuer aucun prélèvement lors du déroulement de l’étude avant le sacrifice des animaux. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus avec enrichissement. Toutes les injections seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Aucune douleur ou inconfort pour les animaux n’étant attendus, il n’est pas nécessaire d’utiliser des analgésiques. Les souris seront observées quotidiennement la semaine suivant la procédure puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Si des signes cliniques notables ou sévères apparaissent, les animaux seront scorés selon le tableau décrit ci-dessus et la douleur sera prise en charge comme suit: Si des signes sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit: -En présence de 1 signe notable : visite 3 fois/semaine des animaux. -En présence de 2 signes notables : administration de buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutanée toutes les 12 h -En présence de 3 signes notables ou un signe sévère : euthanasie
Choix des espèces
Le choix des souris est fondé sur plusieurs critères : - Le besoin de travailler sur des animaux adultes à la fois petits et facilement manipulables ; - La petite taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie ; - Ces animaux sont faciles à gérer en stabulation ; Les animaux inclus dans cette étude seront des animaux jeunes adultes, âgés de 10 semaines lors du début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées.
Mesure du potentiel anxiolytique d’un candidat médicament dans le modèle d’alimentation supprimée par la nouveauté
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
10 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié d'entre elles étant tuées sous anesthésie avant tout réveil. Privées de nourriture pendant 24 heures, elles sont placées dans un environnement fortement éclairé et anxiogène pour mesurer un comportement de type anxieux, reçoivent le candidat médicament le plus souvent par gavage, puis leur sang et leur cerveau sont prélevés. Le porteur revendique un "besoin" de nouveaux anxiolytiques face aux effets indésirables des traitements actuels. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que le recours à l'animal est "nécessaire".
Objectifs
Nous réalisons des études de comportement animal dans le domaine du système nerveux central. Les tests utilisés permettent d’évaluer différentes caractéristiques des pathologies étudiées et l’effet des traitements sur ces caractéristiques. L’étude de l’action des agents pharmacologiques sur le comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments à visée psychiatrique ou neurologique. Tous les tests utilisés sont ceux qui sont requis dans les phases précliniques de sélection de candidat médicament. Les traitements actuels de l’anxiété sont principalement limités aux benzodiazépines et aux antidépresseurs possédant de nombreux effets indésirables. Il demeure aujourd’hui un besoin de développement de nouveaux anxiolytiques procurant aux patients une meilleure qualité de vie. Dans un premier temps, ce projet a pour but la mise en place du test d’alimentation supprimée par la nouveauté. Ce test permet de mesurer le comportement de type anxieux chez le rongeur. Il est couramment utilisé pour mettre en évidence des effets anxiolytiques chez de nouveaux candidats médicaments. Le principe de ce test repose sur le conflit pour un animal privé de nourriture durant 24h face au choix d’approcher et de consommer un morceau de nourriture au centre d’un nouvel environnement fortement éclairé ou de rester dans un coin et d’éviter le centre de cet environnement anxiogène. Dans un second temps, il permettra de tester le potentiel anxiolytique de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de l’anxiété.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels de l’anxiété sont principalement limités aux benzodiazépines et aux antidépresseurs possédant de nombreux effets indésirables. Il demeure aujourd’hui un besoin de développement de nouveaux anxiolytiques procurant aux patients une meilleure qualité de vie. Ce modèle est utile pour tester de nouvelles molécules candidates pour améliorer la prise en charge de l’anxiété.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer le potentiel anxiolytique d’un candidat médicament, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6. Entre 5 et 10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes
Pose d’implant de télémétrie sur Chlorocebus sabaeus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 singes vervets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour un projet ultérieur. Chaque singe subit sous anesthésie une chirurgie abdominale pour la pose d'un implant de télémétrie et une cathétérisation de l'artère fémorale, avec des risques d'infection, d'hémorragie et de complications vasculaires. Le porteur présente l'ensemble comme une opération "de raffinement" destinée à équiper les animaux avant une recherche à venir. Il indique que la nécessité scientifique de cette recherche relève de l'utilisateur final et a été validée en amont, sans la détailler ici.
Objectifs
Le projet consiste en la pose d’implant de télémétrie sur 3 Chlorocebus sabaeus. Ce projet est une phase de pré-etude afin de préparer les animaux à un projet de recherche ultérieur dans un but de raffinement. La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle). Cela permet d’obtenir des données physiologiques continues sans stresser les animaux (pas de contention); de plus, cela permet des mesures en temps réel à distance, afin d’être le plus prédictif possible d’un changement d’état physiologique de l’animal et une intervention rapide du personnel si nécessaire (atteinte de point-limite….)
Bénéfices attendus
La pose d’implant de télémétrie permet le suivi en temps réel et en continu des paramètres vitaux des animaux (température corporelle, fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, pression artérielle). Ce projet est réalisé en amont d’un projet de recherche pour lequel il est important de pouvoir monitorer les animaux en continu. Dans le cadre des 3Rs, cela permet de raffiner la procédure avec l’obtention de données physiologiques continues sans stresser les animaux, et en étant plus prédictif « en direct » sur toute modification de l’état de l’animal pour une intervention plus rapide en cas d’atteinte de points-limites (monitoring avec système d’alerte possible).
Procédures
Le projet consiste en la réalisation, sous anesthésie générale et analgésie, d’une chirurgie abdominale pour la pose d’un implant intra-abdominal et une cathérisation vasculaire de l’artère fémorale sur 3 animaux.
Impact sur les animaux
Les animaux devant subir une chirurgie, les effets probables sur les animaux seront ceux inhérents à une telle intervention : - de la douleur per et post-opératoire. Cela peut entrainer secondairement une baisse de l’activité et une diminution de l’appétit transitoire pendant quelques jours après la chirurgie. De plus, inhérent à toute intervention de ce type, les risques possibles sont : - risque anésthésique, - risque d’infection, - risque hémorragique per-opératoire, - risque vasculaire sur le membre postérieur cathétérisé.
Devenir
Ce projet ne contient qu’une procédure. Tous les animaux sont gardés en vie en fin de procédure. Projet s’inscrivant comme phase de préparation des animaux en vue d’un projet ultérieur.
Remplacement
Ce projet se déroule dans le cadre de la préparation d’animaux pour fournir des animaux équipés en télémétrie comme phase de pré-étude pour la réalisation d’étude ultérieure. La nécessité scientifique de l’utilisation d’animaux est faite en amont par les utilisateurs des animaux ; leur projet de recherche est déclaré et agréé par les autorités compétentes selon la règlementation en vigueur.
Réduction
Ce projet a lieu dans le cadre d’une mise au point de technique de raffinement, elle est réalisée sur seulement 3 animaux afin d’évaluer / confirmer son intérêt scientifique et de raffinement pour cette étude. Les conclusions pourront en plus servir pour appliquer les principes de Réduction et de Raffinement à d’autres projets futurs.
Raffinement
La réalisation de ce projet s’inscrit pleinement dans un objectif de raffinement puisqu’elle a pour objectif de permettre un meilleur monitoring d’animaux per-étude (acquisition de mesures physiologiques sans intervention sur les animaux) et de pouvoir intervenir le plus tôt possible en anticipant les modifications physiologiques et notamment l’atteinte de points-limites précoces (système d’alerte lors d’atteinte de paramètres limites). Considérant la procédure elle-même, dans le but de limiter les nuisances aux animaux: - La douleur liée à l'intervention chirurgicale sera gérée par une anesthésie et une analgésie per et post-opératoire adaptées. - le risque infectieux sera limité par une asepsie rigoureuse et une antibiothérapie prophylactique per et post-opératoire. - Le risque anesthésique sera limité par le fait que le protocle a été bien adapté en amont et que le monitoring sera fait par un vétérinaire formé. - Les risques hémorragiques et vasculaires seront limités par le fait que la chirurgie est réalisée par un.e chirurgien.ne expérimenté.e dans la technique.
Choix des espèces
Ce projet est une phase « pré-étude » en vue de fournir des animaux équipés en télémétrie pour un projet de recherche ultérieur. Le Singe vert est une espèce phylogéniquement proche de l’homme et particulièrement sensible au virus considéré dans ce projet. La pertinence de l’utilisation du C.aethiops et du stade juvénile pour le projet de recherche a été établie en amont par l’utilisateur final lors de son agrément du projet lui-même.
Influence des rythmes circadiens et multidiens sur l’activité cérébrale chez l’animal sain et épileptique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
798 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent un agent épileptogène qui provoque un état de mal épileptique puis une épilepsie durable, subissent des craniotomies de cinq à dix heures et le port d'électrodes intracérébrales pendant deux à douze semaines, avant une perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique une mortalité d'environ 30 % dans le modèle d'épilepsie généralisée, des crises spontanées récurrentes et une perte de poids pouvant atteindre 30 %. Il affirme qu'il est "indispensable" de disposer d'un modèle animal et qu'aucune méthode alternative n'existe, le rat étant présenté comme l'espèce de référence.
Objectifs
Le projet de recherche fondamentale que nous mènerons pendant 5 ans consiste à déterminer comment les rythmes circadiens et multidiens contraignent la dynamique cérébrale en condition physiologique et pathologique. Cette question est primordiale sur le plan humain car toutes les fonctions de l’organismes sont régulées de façon circadienne, et que nombre de ces régulations sont modifiées en condition pathologique comme l’épilepsie. L'épilepsie est la maladie neurologique la plus répandue après la migraine et touche près de 50 millions de personnes dans le monde et 600 000 en France. Environ 30% des patients sont résistants aux traitements médicamenteux. Ce taux de pharmaco résistance n'a hélas pas changé depuis les années 1950 car les mécanismes sous-tendant l'épilepsie sont toujours mal connus. En plus des crises, de nombreuses comorbidités, comme de profonds troubles mnésiques, handicapent les patients. Ces troubles mnésiques ne sont pas pris en charges au niveau thérapeutique et sont souvent encore plus invalidants que les crises. Il est donc indispensable de disposer d'une approche pertinente permettant de comprendre les mécanismes du développement de cette pathologie afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter à la fois les crises et les déficits cognitifs associés. Les données récentes montrent de plus que les crises d’épilepsies sont non seulement régulées de façon circadienne (elles ont une plus grande probabilité de se produire à une certaine heure) mais aussi multidienne (elles montrent une périodicité de plusieurs jours/semaines). Ces résultats ont été retrouvés dans diverses espèces : homme, chien, rat et souris. Il est fondamental d’en comprendre les mécanismes non seulement pour prédire les crises mais aussi pour traiter les individus au meilleur moment.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche consiste à déterminer la relation entre crises, comorbidités cognitives et rythmes circadiens/multidiens. Pour cela, nous allons développer et utiliser des modèles animaux pertinents reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie. Notre but est de déterminer le plus grand nombre de mécanismes sous-tendant la genèse et la propagation des crises, l'apparition des déficits mnésiques dans le contexte des épilepsies généralisées et focales, et leur rythmicité circadienne/multidienne. La description de ces mécanismes pourra idéalement fournir des marqueurs prédictifs de la maladie qui pourraient être à terme transféré à l'Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis : - Traitement avec un agent épileptogène, qui induit un status epilepticus et permet le développement d'une épilepsie qui perdure à vie ; ce traitement est soit injecté IP une seule fois, soit une seule fois in situ dans le cerveau sous anesthésie générale (chirurgie de 3-4h); - Procédures chirurgicales (craniotomies) sans réveil (durant 5-6h) sous anesthésie générales et analgésie afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des microélectrodes; - Procédures chirurgicales (craniotomies) sous anesthésie générale et analgésie avec réveil et traitement adapté de la douleur éventuelle, afin d'implanter à demeure des microélectrodes (durée de la chirurgie 6-10h) afin d’enregistrer l’activité cérébrales chez l’animal vigile pendant deux à 12 semaines; - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale et analgésie profondes dans le but d’extraire les cerveaux (terminal)
Impact sur les animaux
Dans la procédure #1 la genèse des modèles d'épilepsie généralisée induisent une mortalité de 30% environ. Elle est de moins de 5% dans le modèle d'épilepsie focale de la procédure #2. Les animaux issus de ces modèles développent des crises épileptiques spontanées récurrentes. Ils subissent généralement une perte de poids pouvant aller jusqu’à 30% mais qui se rattrape dès le 2e jour post-status et une déshydratation qui peut aussi persister jusqu’à 2 jours. L’implantation d’électrodes intracérébrales (procédures #2, 4, 5) chez ces animaux (et chez les animaux contrôles) nécessite le placement d’un « chapeau » protecteur sur le crâne. La plaie au niveau du scalp cicatrise en quelques jours.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour prélever les cerveaux pour réaliser des analyses anatomiques et histologiques.
Remplacement
Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail. Ce projet utilise des rats comme modèle animal, qui est l'espèce la plus pertinente car de nombreuses études montrent que les régions cérébrales impliquées dans la mémoire sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes de la mémoire chez l’Homme.
Réduction
Ce projet utilise des outils de collection des données à la pointe de la technologie nous permettant d’obtenir des données fiables sur un faible échantillon. De plus, des tests statistiques adéquats nous permettront de limiter la taille des cohortes à un minimum.
Raffinement
ce projet propose des méthodes pertinentes pour limiter la douleur, la souffrance, le stress et l’inconfort. Nous avons mis en place des points limites adaptés et précoces pour chaque procédure (comme les interventions chirurgicales) et une réponse rapide (suivi post-opératoire, analgésie (Buprécare 0,05mg/kg/24h s.c. et Métacam 2mg/kg/24h i.p.), suivi quotidien des animaux). Tous les actes invasifs seront pratiqués sous anesthésie générale utilisant du sévoflurane (4%) ou une association de kétamine-xylazine (80 mg/kg et 10mg/kg, i.p.) - Buprécare (0,05mg/kg s.c.) et ropivacaïne (2mg/kg s.c.). Le bien-être animal est aussi privilégié au niveau des conditions d'hébergement (animaux à plusieurs dans de grandes cages, eau et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en cartons et divers objets) pour minimiser le stress et être au plus près du comportement naturel de l'espèce animale.
Choix des espèces
Ce projet utilise des rats comme modèle expérimental. C’est l'espèce de référence dans le cadre de l’étude des mécanismes de la mémoire et de l'épilepsie. Les régions cérébrales impliquées sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Ce projet est la continuité de travaux pré-existants et des projets #01451 et #20325-2019041914138115 v2. Donc dans le but de respecter la règle des 3R, nous avons choisi d’utiliser les mêmes espèces et souches animales de façon à ne pas répéter inutilement des expériences sur d’autres animaux d’espèce ou de souche différente. Nous étudions la relation entre rythmes circadiens et multidiens et épilepsie dans un cerveau dont le développement est achevé, donc nous utilisons des rats mâles adultes âgés de 6 semaines minimum à quelques mois.
Etude du rôle de la protéine X dans la thérapie du cancer par transfert de lymphocytes.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis une injection de lymphocytes T par voie rétro-orbitale, avant le prélèvement de leurs tumeurs, rate et ganglions, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'efficacité de l'immunothérapie du cancer. Le porteur fixe un point limite à un volume tumoral de 2 500 mm3, seuil au-delà duquel les souris qui l'atteignent sont mises à mort. Il indique avoir mené des expériences in vitro au préalable mais conclut que les interactions entre cellules tumorales et microenvironnement immunitaire "ne peuvent actuellement pas être remplacées" par des systèmes in vitro fiables.
Objectifs
La progression du cancer est grandement influencée par un équilibre délicat entre l'immunité et la tolérance aux tumeurs. En particulier, les lymphocytes T (LT) CD8 ont pour fonction de détruire les cellules tumorales. Leur étude a conduit au développement de deux types d’immunothérapies du cancer, qui ont révolutionné la prise en charge des patients : l’administration d’anticorps anti- PD-1 qui ciblent la fonction défectueuse des LT CD8, ainsi que l’injection de LT spécifiques d’un antigène tumoral et capables d’éliminer directement la tumeur. La combinaison de ces deux traitements est testée actuellement en clinique mais les mécanismes moléculaires régissant la réponse ou la résistance à ces thérapies sont mal connus. La protéine X joue un rôle critique dans la tolérance immunitaire dans le cancer et nos données préliminaires suggèrent qu’il pourrait également être un régulateur majeur de l’activité des LT CD8+. Dans ce contexte, nous émettons l’hypothèse que l’élimination des tumeurs par l’injection de LT spécifiques, en combinaison ou non avec une thérapie par anti-PD-1, requiert l’activation de X.
Bénéfices attendus
Ces travaux pourraient permettre d’identifier un mécanisme moléculaire impliqué dans l’effet curatif des thérapies du cancer par injection de LT. D’autre part, ces études pourraient révéler des activités spécifiques de la protéine X qui peuvent être ciblées par de nouveaux agents thérapeutiques pour améliorer la fonction des LT, seule ou de concert avec des immunothérapies existantes.
Procédures
- Rasage du flanc des souris après désinfection a l’alcool 70% sous anesthésie isofluorane (1x 2 minutes/souris) -Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie isofluorane, de cellules tumorales resuspendues dans du PBS1X stérile, dans un volume total de 100uL (1x 2 minute/souris) -Injection intraveineuse par voie rétro-orbitale, sous anesthésie isofluorane, de cellules LT resuspendues dans du PBS1X stérile, (ou du PBS1X comme témoin) dans un volume total de 100uL. (1x 2 minute/souris)
Impact sur les animaux
Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Chez la souris, l’injection d’anti-PD-1 ne provoque pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, effectuées sous anesthésie isofluorane, mais susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux 2 fois par semaine. Un enrichissement (morceau de coton) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.
Devenir
Les animaux seront mis à mort lorsqu’un des points limite (volume tumoral de 2500 mm3, nécrose de la tumeur ou altération de l'état général de la souris) sera en passe d’être atteint, par dislocation cervicale ; les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.
Remplacement
Nous allons tout d’abord effectuer un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine X dans l’immunothérapie par transfert de LT. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Dans des études antérieures décrivant les lignées cellulaires utilisées ici, il a été démontré un écart-type de 150 mm3 au point final (1250 mm3). L'effet minimal souhaité de l’ablation de X serait une augmentation > 50% de la croissance tumorale, donc une taille de 2500 mm3 au point final. En prenant en compte une puissance de 90% et un alpha de 0.05, nous calculons une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un test ANOVA à 2 voies suivi du post-test Bonferroni sera utilisé pour analyser la significativité des résultats. L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin du protocole (au plus tard à J21) ou dès l’atteinte d’un point limite par un individu pour réduire la variabilité expérimentale. Pour assurer la reproductibilité des résultats, nous répéterons l'expérience une fois. Il n’y a pas de double emploi des souris.
Raffinement
Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de NF-kB dans les réponses immunitaires anti-tumorales. D’autre part il existe un certain nombre de modèles de tumeurs transplantables chez la souris, largement décrits et utilisés par le passé. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 10 semaines.
Infection expérimentale de carnivores par Echinococcus multilocularis (Taenidae)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
50 renards et chiens viverrins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, dont dix réutilisés ensuite et quarante tués pour prélever les vers adultes dans leur intestin. Ils sont infectés par le ténia Echinococcus multilocularis par gavage œsophagien sous anesthésie, puis suivis par des prises de sang sous contention manuelle, afin de produire du matériel parasitaire de référence pour la mise au point de tests de diagnostic. Le porteur décrit l'infection comme asymptomatique et indique qu'aucun point limite n'est défini, tout en prévoyant une euthanasie en cas de pathologie sévère. Il affirme qu'il est "nécessaire d'utiliser ces espèces", hôtes définitifs du parasite, et qu'aucune méthode alternative ne permet de produire ces vers adultes.
Objectifs
Les échinococcoses telles que l'échinococcose alvéolaire causée par E. multilocularis sont des problématiques de santé publique aux niveaux national et européen. L’incidence annuelle moyenne en France est actuellement de 35 nouveaux cas/an entre 2010 et 2019 et est en constante augmentation en comparaison avec les décennies précédentes. Le nombre de cas hors des zones d’endémie connues augmente aussi, laissant supposer une zone d’endémie plus grande que celle décrite actuellement. Leur surveillance chez l'animal et dans l’environnement (sol, aliments, eau) à la source de la contamination humaine nécessite la disponibilité de méthodes de détection pertinentes requiérant du matériel parasitaire de référence. La maîtrise de l’infection par l'hôte défintif en captivité permettra de : 1/ Produire du matériel biologique de référence (oeufs et vers adultes) qui permettra d'une part de valider de nouvelles techniques de diagnostic d’E. multilocularis, 2/ Valider chez le chien viverrin la technique rapide de grattage pour le diagnostic rapide d'E. multilocularis dans l'intestin , 3/ Réaliser des infestations successives avec des souches différentes pour reproduire les conditions d'infection naturelle afin d'avoir une meilleure compréhension de la répartition des vers par identification génétique des vers tout au long de l'intestin (divisé en 5 segments). Cette distribution qui résulte de la compétition entre les vers impacte grandement les dynamiques de charge parasitaire dans le contexte d'une infection naturelle, ainsi que la détection du parasite lors du diagnostic via l’intestin et les fèces. Les réponses immunitaires périphériques et hématologiques à l’infection parasitaire seront également étudiées pour mieux comprendre l'impact du parasite sur les réponses sanguines de l'hôte.
Bénéfices attendus
L’ensemble des prélèvements collectés permettront de produire du matériel biologique de référence pour le développement d’outils de diagnostics indispensables à la surveillance du parasite chez les hôtes définitifs mais aussi afin de mieux apprehender la contamination intestinale des animaux dans un cadre controlée par une ou plusieurs souches de parasites, et enfin d'apréhender les risques de dispersion environnementale (dans le sol, les aliments, l'eau) des œufs du parasite responsables de la contamination humaine. Les réponses immunitaires périphériques et hématologiques à l’infection parasitaire seront également étudiées pour mieux comprendre l'impact du parasite sur les réponses sanguines de l'hôte. L’expérimentation consistant à inoculer deux souche Echinococcus multilocularis (d'origine différente et différenciée par leur taille et leur profil génétique) à un même renard et 14 jours d’intervalle permettra d’étudier la répartition des vers dans l’intestin pour comprendre les conditions de coinfection et leur impact sur la sensibilité du diagnostic.
Procédures
Les animaux seront manipulés pour recevoir l'injection intramusculaire de cocktail anesthésique, et être infectés expérimentalement, puis euthanasiés. Les prises de sang seront conduites sur animaux contenus mais non anaesthésiés. Les animaux supportent très bien la contention manuelle pour une prise de sang rapide, et cette procédure ne justifie pas les risques associés à une contention chimique. Nous avons tenté, dans des études antérieures, de présenter des formes larvaires directement dans des souris aux renards pour qu’ils les consomment oralement sans anesthésie, mais le succès de l’infection parasitaire était variable, contrairement à l’administration œsophagienne qui était plus standardisée dans ses résultats et son application (dose infectieuse mieux maitrisée). Cette méthode nous semble donc préférable pour augmenter la qualité des études et minimiser le nombre d’animaux requis.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress associée à la contention manuelle pour les prises de sang et l'injection des anaesthésiques. L'infection par le parasite est asymptomatique; aucun point limite n'est donc défini, mais un stress peut être induit par l'infection parasitaire. Cependant une euthanasie compassionnelle sera effectuée en cas de pathologie intercurrente sévère. Les animaux des procédures 2 et 3 seront mis à mort pour récupérer les vers adutes, car cela n'est possible que sur intestin ex vivo.
Devenir
La collecte des oeufs (procédure 1) ne nécessite pas l'euthanasie des renards qui seront vermifugés par 2 administration orale de praziquantel. Les autres procédures impliquant la collecte de vers adultes vivant ne peut se faire que dans l’intestin et nécessite donc l’euthanasie des animau.
Remplacement
Les hôtes définitifs d'Echinococcus multilocularis sont le renard et le chien viverrin. Il n'existe pas de méthode alternative pour produire des vers adultes à partir des protoscolex récoltés chez l'hôte intermédiaire. Il est donc nécessaire d'utiliser ces espèces, hôtes définitifs, pour étudier le développement du parasite, sa répartition spatiale et récolter des parasites adultes de qualité pour le développement des outils diagnostiques.
Réduction
Les animaux seront au maximum réutilisés d'autres protocoles à procédure légère sans impact sur l'infection parasitaire, et les animaux du protocole 1 pourront être réutilisés dans d'autres protocoles. Le nombre précis d'animaux nécessaire sera déterminé en fonction des résultats des premières études et des études antérieures, afin de minimiser au maximum l'utilisation inutile d'animaux et la répétition d'études non nécessaires.
Raffinement
Les renards et chiens viverrins sont hébergés individuellement pour respecter leur mode de vie dans des cages extérieures. Les conditions d’hébergement pour cette procédure tendent à répondre à la limite règlementaire de surface au sol par chien adulte (4m2) prescrit par la directive européenne 2010/63/EU. L’enrichissement de l’intérieur des cages vise de plus à stimuler le comportement naturel exploratoire, fouisseur et mordeur des animaux, et consiste en des plateformes/tunnels associées ou non à des litières (végétale, sable) d’environ 1,5m2 se rajoutant à la base de la cage de 3m2 et apportant aux animaux des aires de repos, de recherche de la nourriture et de marquage de territoire. L’abreuvement est fourni à volonté par des canalisations d’eau (thermostatées) qui courent le long de toutes les cages avec des pipettes accessibles à travers le grillage (2/3 pipettes par cage/animal). La distribution de nourriture est quotidienne. Les prises de sang sur renard sont réalisées avec une contention manuelle (non chimique) des animaux vigiles. Cette contention est rapide et sécurisée pour les animaux et les manipulateurs expérimentés, sur des tables d’examen placées près des cages, et est considérée plus sûre qu’une anesthésie générale induite par l’administration IM d’un cocktail de kétamine/médétomidine qui peut induire une hypothermie, et pour lesquels il faut mettre les animaux à jeun. A l’opposé, l'inoculation reste nécessaire par gavage, et requiert donc une anesthésie. Le gavage apporte des résultats d’infection beaucoup plus standardisés que dans un repas carné, et est donc choisi pour limiter le nombre d’animaux requis.
Choix des espèces
Les hôtes définitifs d'Echinococcus multilocularis sont le renard et le chien viverrin. Il n'existe pas de méthode alternative pour produire des vers adultes à partir des protoscolex récoltés chez l'hôte intermédiaire. Il est donc nécessaire d'utiliser ces espèces, hôtes définitifs, pour étudier le développement du parasite, sa répartition spatiale et récolter des parasites adultes de qualité pour le développement des outils diagnostiques. La technique de référence de recherche du parasite adulte est l'examen du grattage de l'intestin; une technique simplifiée et sans perte de sensibilité a été développée chez le renard. Son adaptation au chien viverrin nécessite l'étude de la répartition du parasite dans l'intestin du chien viverrin. Ce projet visent également à mieux comprendre la répartition de différentes souches parasitaires, y compris dans un contexte de co-infection, afin d'en améliorer le diagnostique et les risques de contamination de l'environnement. Tous les renards et chiens viverrins utilisés dans ce projet auront plus de 8 mois.
Mecanobiologie: role des mécanorécepteur après myéloablation ou lors de myélofibrose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées, répétées deux fois par semaine pendant quatre semaines pour une partie d'entre elles, et des prélèvements de sang par section de la queue sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leur sang et leur moelle osseuse. Le porteur étudie la formation des plaquettes et le rôle des forces mécaniques, et annonce des retombées à la fois thérapeutiques et technologiques, dont l'augmentation des rendements de production de plaquettes en bioréacteur. Il affirme que les expériences "nécessitent un animal adulte vivant" et que la souris est la seule espèce pour laquelle il dispose du modèle génétique voulu.
Objectifs
Les principaux objectifs de ce projet seront la compréhension des mécanismes de formation des plaquettes sanguines, et notamment le rôle joué par les forces mécaniques de l’environnement. Ces forces mécaniques sont perturbées dans différentes conditions pathologiques qui modifient l’environnement mécanobiologique, telles que les traitements chimiothérapeutiques, ou les cancers de la moelle osseuses aboutissant au développement de myélofibrose. Bénéfices. La mise en évidence de nouvelles voies importantes pour la formation des plaquettes
Bénéfices attendus
La mise en évidence de nouvelles voies importantes pour la formation des plaquettes permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour augmenter la production des plaquettes chez la patients, ou selon les cas pour prévenir leur chute. Un deuxième bénéfice important est d’ordre technologique. Actuellement on est incapable de produire des plaquettes in vitro à une échelle suffisamment importante pour envisager des transfusions. L’une des raisons en est que la différenciation des mégacaryocytes in vitro est inaboutie en comparaison de la différentiation in vivo. Nous avons montré que la culture des mégacaryocytes en présence de contraintes mécaniques améliore la différenciation de ces cellules et in fine double la quantité de plaquettes produites. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement pour mimer l’impact des forces mécaniques, ce qui augmentera les rendements de production de plaquette en bioréacteur en milieu liquide.
Procédures
Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections, soit en i.p., soit en s.c. Les produits injectés ont comme impact soit d’augmenter la quantité de plaquette, soit de la diminuer modérément et transitoirement, de sorte qu’ils n’ont aucun impact négatif sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront majoritairement soumis à une injection unique, soit en i.p., soit s.c. (animal vigile). L’une des procédures fait appel à des injections s.c. répétées (2 injections par semaine, pendant 4 semaines). Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang par section de moins de 1 mm à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les 4 autres prélèvements (toujours sur souris anesthésiée).
Devenir
En fin de projet, les animaux sont tous sacrifiés pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du rôle de l'environnement de la moelle osseuse dans la différenciation hématopoiétique en mégacaryocytes et dans la libération des plaquettes à travers les vaisseaux sinusoides de la moelle. De plus, nous disposons des souris identiques au niveau génétique et modifiées génétiquement afin de nous permettre d'évaluer spécifiquement l'impact de ces mécanorécepteurs et facteurs de transcription.
Réduction
Le nombre d’animal est réduit par le fait qu’un maximum d’analyses seront réalisées pour une même procédure expérimentale avec un même lot d’animaux, selon la question posée (ex. analyse du sang, récupération des os pour culture de cellules, pour récupération de moelle en vue d’analyses histologiques et de microscopie de transmission), récupération éventuelle d’autres organes. Différents manipulateurs seront ainsi réquisitionnés pour permettre d’effectuer simultanément ces différentes analyses afin d’acquérir des données fiables et définitives.
Raffinement
Tout est mis en place pour limiter l’inconfort des souris durant toute la durée de la procédure, incluant une manipulation et contention par des personnes formées et expérimentées, à l’abris du bruit. Le prélèvement caudal de sang est effectué sur souris anesthésiée à l’isoflurane, permettant une bonne anesthésie et un réveil rapide. Les souris restent ensemble dans la même cage, en présence une litière abondante et permettant la formation de nid, dans un environnement enrichi en jouets.
Choix des espèces
La mise en évidence des proplaquettes à partir des MK et cellules souches hématopoiétiques est bien maitrisée chez la souris. En outre, c'est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes qui nous intéressent sont inactivés. Animaux utilisés au stade jeune adulte (8-18 semaines), car à ce stade la moelle osseuse du fémur est encore très hématopoiétique et peu d'adipocytes sont présents.
Caractérisation vasculaire par IRM in vivo au cours du processus de développement tumoral: applications à divers types de cancers chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, le sein, le pancréas ou l'ovaire, puis des examens IRM répétés avec injection d'agents de contraste au gadolinium, avant une mise à mort par dislocation cervicale et le prélèvement d'organes pour doser le métal. Le porteur présente l'IRM comme "non invasive et atraumatique" et affirme qu'elle réduit le nombre d'animaux en permettant un suivi répété. Il indique que l'étude "ne peut se faire que sur un organisme vivant entier".
Objectifs
L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. C’est une méthode qui utilise des champs magnétique et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnement ionisants. Elle est non invasive et atraumatique. Pour un examen IRM les animaux sont endormis (anesthésie gazeuse sous isoflurane1.5%) afin d’éviter tout mouvement dans l’imageur qui provoque du flou sur les images et les rend ininterprétables. Leur fréquence respiratoire est contrôlée tout au long de l’acquisition des images (à l’aide d’un capteur placé sous la cage thoracique) Plusieurs étapes seront nécessaires afin d’étudier la réponse de l’agent de contraste pour détecter le carcinome ovarien : 1) Induction des modèles tumoraux. 2) Etude de la perfusion tumorale (vascularisation de la tumeur et perméabilité des vaisseaux) au cours du développement de la tumeur. Il s’agit de suivre l’intensité du signal au cours du temps (1heure) après injection de DOTAREM (agent utilisé en routine clinique) ou d’autres agents de contraste (4 différents). Un traitement mathématique de la courbe permet d’extraire des paramètres quantitatifs de perfusion afin de déterminer le stade de développement de la tumeur où elle est le plus vascularisée. 6 stades de développement seront utilisés au maximum (J2, J7, J14, J21 et J28 et J35 en fonction du modèle tumoral). Ce sont les mêmes souris que l’étape 1. Les agents de contraste (à base de lanthanides) qui seront synthétisés partent tous de la structure des agents commerciaux utilisés en routine clinique. Ils ont donc été approuvés pour leur mise sur le marché. Notre projet ne nécessite dons pas d’étude in vitro au préalable. Les agents de contraste seront injectés par voie intraveineuse. L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. Cette une méthode qui utilise des champs magnétiques et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnements ionisants. Elle est non invasive et atraumatique.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’identifier le stade tumoral où la tumeur sera la plus vascularisée et les vaisseaux les plus perméables afin d’optimiser le passage de l’agent de contraste dans la tumeur pour un diagnostic le plus précoce possible. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement d'une tumeur en terme d'hétérogénéité tissulaire et d'angiogénèse. Il devrait permettre de fournir une fenêtre temporelle là où la tumeur est le plus vascularisée et les vaisseaux suffisamment perméable pour laisser passer des agetns de contraste pour un diagnostic précoce ou des molécules thérapeutique.
Procédures
Imagerie par résonance magnétique. 1H par acquisition. Implantations de cellules tumorales en orthotopqiue (cerveau, sein, pancréas, ovaire)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à la croissance tumorale et feront l'objet de points limites.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale. Certains organes (rein, foie, rate) seront prélevés pour dosage de gadolinium par spectroscopie
Remplacement
le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique de croissance tumorale ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi des tumeurs permet aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de l’IRM réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Les mêmes animaux seront suivis tout au long de la procédure d'imagerie au temps (J2, J7, J14, J21, J28, J35 post induction tumorale).
Raffinement
Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique. Ils sont observés quotidiennement scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Les animaux sont anesthésiés pour les actes IRM. De plus, des points limites prédictifs ont été mis en place.
Choix des espèces
- La souris est un modèle adapté à notre imageur IRM (taille de l’ouverture). - Le modèle murin présente de nombreux avantages : nombreuses lignées génétiquement modifiées disponibles, existence de lignées immuno-compromises autorisant la greffe de cellules tumorales humaines (ici utilisation de souris Nude pour faciliter la prise de greffe tumorale dans le cas d’injection de cellules humaines). - L’administration de l’agent de contraste et son efficacité étant dépendantes de la physiologie, l’utilisation du modèle animal in vivo reste indispensable pour le présent projet Des souris femelles adultes de 8 semaines ; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation. Ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins)