Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
A_ME_13002 : Evaluation de l’efficacité et de l’innocuité de vaccins vétérinaires chez le cheval
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Les données recueillies sur des équidés alimentent le dossier d'autorisation de mise sur le marché d'un nouveau vaccin vétérinaire, préalable à sa commercialisation. 200 chevaux vont être utilisés, la déclaration en comptant 120 en souffrance légère et 80 en souffrance modérée. Ils reçoivent en général deux à trois injections de vaccin, davantage dans les études de tolérance, où les doses sont répétées "afin d'amplifier la survenue d'effets secondaires", et une jument gestante peut être vaccinée à chaque tiers de sa gestation. Lors des épreuves virulentes, un virus est inoculé par aérosol aux chevaux concernés, la maladie devant surtout s'exprimer, avec fièvre et écoulements, dans le groupe témoin. La déclaration ne prévoit aucune mise à mort : 140 chevaux doivent être proposés à l'adoption, 50 réutilisés et 10 rendus à l'élevage ou relâchés, ces 10 derniers absents du texte, qui ne parle que d'adoption ou de réutilisation dans ce projet ou un autre.
Objectifs
Afin de commercialiser un nouveau vaccin vétérinaire, un dépôt de dossier d’AMM est nécessaire. Ce projet vise à fournir les données techniques et scientifiques du dossier d’AMM permettant de démontrer l’efficacité et l’innocuité du nouveau produit.
Bénéfices attendus
Les bénéfices escomptés sont les gains sur la santé des chevaux et poneys qui recevront le candidat vaccin testé une fois celui-ci mis sur le marché. Par exemple : prévention de la rhinopneumonie, de la grippe Equine,…
Procédures
Les animaux reçoivent les vaccins testés par injection (intramusculaire, sous cutanée,…). Les injections ont une durée de l’ordre de 3 secondes, La vaccination respecte le calendrier vaccinal prévu pour le vaccin testé (En général 2 à 3 injections espacées dans le temps. Pour les étude d’innocuité, les doses peuvent être plus répétées afin d’amplifier la survenue d’effets secondaires qui ne seraient pas mis en évidence par une simple vaccination. Par exemple lors d’une étude sur mères gestantes, une jument peut-être vaccinée à chaque tiers de gestation. Par la suite, les animaux sont observés : état général, examen clinique, prise de température rectale,… L’observation d’un animal peut durer environ 10 minutes. Il peuvent aussi être prélevés (sang, écouvillons naseaux,…) afin de mesurer la réponse immunitaire ou la diminution de la présence virale grâce à la vaccination. Les prélèvements de sang durent environ 10 secondes. Les observations et prélèvements sont réalisées 2 fois le jour de l’administration, puis une fois par jour pour le reste de l’étude. Lors d’une épreuve virulente, une solution virale est inoculée aux animaux par génération d’un aérosol. Cette manipulation dure environ 1 minute pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Pas ou peu d’effets indésirables sont attendus. Les vaccins sont généralement des évolutions de vaccins plus anciens. On peut s’attendre à une élévation temporaire de la température corporelle, à l’apparition temporaire d’une grosseur au point d’injection. Lors d’une épreuve virulente, on s’attend à l’expression de la maladie principalement dans le groupe témoin. Elévation de la température, écoulement naseaux et/ou oculaires. Les expériences passées montrent de faibles signes cliniques. L’efficacité du vaccin est principalement démontrée par les écouvillons naseaux qui prouvent l’efficacité des vaccins par la baisse de la pression virale. Toute manifestation post traitement (signe clinique, comportement…) est soigneusement enregistrée et fera l’objet d’une évaluation.
Devenir
A l’issu d’un test, les animaux seront soit proposés à l’adoption, soit réutilisés pour le même projet ou un projet différent. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative au recours à l’animal permettant d’évaluer l’efficacité ou l’innocuité des candidats vaccins vétérinaires. Un nouveau vaccin doit être testé dans l’espèce cible avant d’obtenir une autorisation de commercialisation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est limité au mieux, de façon à répondre aux exigences réglementaires et scientifiques des études. La variabilité individuelle des réponses à la vaccination contraint à constituer des groupes représentatifs d’au moins 10 animaux pour les études nécessaires au dossier d’enregistrement des médicaments.
Raffinement
Bien que peu ou pas d’effets indésirables soient attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien-être lors des tests d’efficacité, d’innocuité ou d’épreuve. Dans tous les cas un traitement adapté est prodigué à l’animal en mauvais état clinique, défini par le vétérinaire. Lors des étude les animaux sont hébergés en groupe et observés quotidiennement. Une récompense alimentaire est prévue après chaque geste technique et lors de mouvements d’animaux. Lorsqu’ils sont hébergés en confinement, des jeux (balles à granulés, cônes,…) avec récompenses alimentaires leur sont proposés.
Choix des espèces
Les études d’efficacité et d’innocuité des médicaments et vaccins vétérinaires nécessitent l’expérimentation sur l’espèce cible afin de répondre aux exigences du dossier d’AMM.
Evaluation de l’efficacité des ondes magnetiques sur l’ouverture de la barrière hématoencéphalique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
100 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs viraux couplée à une ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ondes magnétiques, puis sont tuées aussitôt ou une à quatre semaines plus tard pour prélèvements. Le porteur présente un procédé "confidentiel" relevant à la fois de la recherche et d'une "prestation de service" pour des entreprises, avec des applications cliniques renvoyées à des étapes ultérieures sur de plus grands animaux. Il indique qu'aucun modèle cellulaire n'existe pour cette étude et revendique le "besoin" d'un modèle animal.
Objectifs
Notre équipe est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et du développement mais aussi de la prestation de service pour des entreprises. Ici nous voulons tester la capacité des vecteurs à permettre une expression significative dans les differentes zones du cerveau suite à un nouveau mode d’ouverture de barrière hématoencéphalique confidentiel afin d’etablir des voies d’administration de thérapie non invasives pour l’application en santé humaine. Au total le projet utilisera 100 souris sur les 5 prochaines années avec des groupes de 5 individus.
Bénéfices attendus
La barrière hématoencéphalique est une protection du système nerveux central (SNC) des pathogènes et virus mais est pour la même raison une limite à l’atteinte efficace du SNC par les composés injectés en intraveineux Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de la faisabilité de l’ouverture de la barrière hématoencéphalique par une nouvelle technologie chez la souris. Puis de coupler cette ouverture de barrière à l’injection en intraveineuse de nos vecteurs viraux thérapeutiques, afin d’amener nos vecteurs au niveau cérébral. Lorsque nous aurons validé ces étapes chez la souris nous pourrons mener les étapes translationnelles sur des modèles animaux plus grands et plus proches de l’Homme. Ces étapes sont impératives avant la mise en place des essais cliniques de phases I et II chez le patient
Procédures
- Les animaux seront utilisés pour une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5min) couplée à une ouverture de leur barrière hématoencéphalique là aussi sous anesthésie générale et analgésie (1h) Les animaux seront euthanasiés soit immédiatement après l’exposition aux ondes devant conduire à l’ouverture de cette barrière et entre 1 et 4 semaines après la procédure (ouverture de barrière avec injection de notre vecteur thérapeutique) pour évaluer l’efficacité.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - Une injection intraveineuse sous anesthésie avec un risque de décompensation respiratoire et un risque de saignement - un risque respiratoire ou d’hypothermie à l’anesthésie - un risque hémorragique lors de l’ouverture de barriere hémato-encéphalqique Un risque de non récupération suite à l’anesthésie Tous ces actes peuvent conduire à un stress de l'animal et possiblement une malnutrition mais pas de douleur liée à la procédure.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de bio distribution et de tolérance.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de culture ou de système cellulaire pour étudier l’efficacité de l’ouverture de la barrière hématoencéphalique, encore moins pour évaluer l’efficacité de l’expression de la protéine thérapeutique grâce au vecteur viral consécutive à l’ouverture de cette barrière. Notre étude dans l’espèce murine nous permet de vérifier la faisabilité de notre procédé couplant injection intraveineuse d’une thérapie génique (vecteur viral) et l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Une fois cette faisabilité vérifiée, les données de bio-distribution que nous récoltons nous permettent d’avoir une connaissance de la diffusion au niveau de la cible thérapeutique visée (cerveau) et également à l’ensemble de l’organisme (organes périphériques) pour vérifier la tolérance de ce nouveau procédé (effets secondaires, toxicité).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe mais conservons un nombre suffisant de façon à obtenir des résultats fiables et robustes. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 5 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Nous commençons par une étude pilote sur 20 animaux et poursuivrons une fois cette étape validée par de groupes de 5 à 1 animaux en fonction des thérapies géniques à tester. Un nombre total maximal de 100 souris sera donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress.. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions sanitaires contrôlees Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation/allaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne y compris le weekend en plus de la zootechnie si besoin (points limites) et de soins adaptés. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge). Les procédures sont effectuées sous anesthésie avec la mise en place de moyens pour venir contrecarrer les risques liés à cette anesthésie (monitoring respiratoire et de la température, utilisation de tapis chauffant, de couverture à circulation d'eau chaude, chambre de réveil thermostatée, alimentation gélifiée mis à disposition lors du réveil, gel oculaire pour éviter la sécheresse cornéenne). Un antidouleur est prévu lors de notre phase pilote concernant l'ouverture de barrière hémato-encéphalique par ondes magnétiques, et en amont du moment de l'euthanasie. Les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et des points limites suffisamment prédictifs sont établis afin de limiter tous stress, souffrance ou douleur.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la faisabilité de l’ouverture de barrière ainsi que pour connaître la biodistribution et l’expression des vecteurs adeno-associés recombinants suivant leur mode d’administration et ceci ne peut se faire que chez la souris contrôle comme petit animal qui nous permet de prédire le pattern d’expression et anticiper les études d’efficacité dans le modèle murin des pathologies concernées. Les souris sont utilisées à 8 semaines en rapport avec les étapes suivantes qui seront menées dans le modèle murin de la pathologie, afin d’utiliser des animaux d’âges comparables.
Evaluation de la fermentation in vitro d’ingrédients ou d’émissions de gaz à partir de matière fécale et urinaire de porcelet sevré élevé dans différentes conditions d’élevage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
240 porcelets vont être utilisé·es, dont 78 tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent jusqu'à trois prélèvements de fèces par stimulation rectale à l'écouvillon et des collectes d'urine par une poche collée sous l'abdomen, sous contention par une cordelette serrée autour du groin. Le protocole dégrade volontairement les conditions d'élevage, température de 16 à 33°C, hygiène réduite, densité supérieure au seuil réglementaire de l'expérimentation et rationnement alimentaire, pour se rapprocher d'un élevage commercial et tester des additifs destinés à la "production porcine". Les 162 porcelets gardés vivants repartent dans le circuit de production, et le porteur affirme que le porcelet, "espèce cible", ne peut être remplacé.
Objectifs
Ce projet vise à prélever des échantillons biologiques (fèces et urine) chez le porcelet sevré âgé de 21 à 70 jours et élevé dans différentes conditions d’élevage afin de pouvoir évaluer la fermentation d’ingrédients in vitro. Des bénéfices in vivo de ces ingrédients sont attendus sur la santé et les performances des animaux. En effet, les fermentations des fibres telles que les prébiotiques induisent la production d’acides gras à chaine courte et promeuvent la croissance des bactéries commensales d’où les bénéfices attendus en termes de santé digestive chez les animaux. Ces métabolites produits lors des fermentations peuvent également être utilisés comme source énergétique par l’hôte et ainsi contribuer à l’apport nutritionnel de la ration. De plus, la mise en contact in vitro de fèces et d’urine permet d’évaluer l’impact d’un aliment sur les émissions de gaz dans l’environnement (ammoniac, sulfure d’hydrogène…) et donc de concourir à l’amélioration de l’impact environnemental de la production porcine.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise en marché d’une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs permettant d’améliorer la santé des porcelets par la modulation de la composition et de l’activité du microbiote intestinal pendant la phase de post-sevrage et/ou de réduire les émissions de gaz et autres polluants dans l’environnement.
Procédures
Un maximum de 3 prélèvements de fèces pourra avoir lieu sur les porcelets par essai. Les sessions de prélèvement de fèces seront espacées d’au moins 5 jours. La récolte des fèces se fait par légère pression sur l’abdomen du porcelet ou par légère stimulation rectale pendant une minute à l’aide d’un écouvillon introduit dans le rectum. Les prélèvements de fèces seront réalisés à l’intérieur de la case afin de limiter le stress ressenti, soit sans contention particulière dans les bras de l’opérateur, soit à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. De plus, jusqu’à 3 collectes d’urine pourront avoir lieu sur les porcelets par essai. Les sessions de prélèvement d’urine seront espacées d’au moins 5 jours. La récolte des urines se fera grâce à une poche de collecte d’urine (type poche de stomie comme utilisé chez l’homme) collée grâce à du sparadrap sous l’abdomen des porcelets mâles. Pour cela, l’animal est porté dans les bras par un opérateur puis un second vient coller cette poche sous l’abdomen. Le porcelet est ensuite remis dans sa case. Le décollage de la poche de collecte d’urine s’effectue de la même manière. Cette dernière sera gardée maximum 7 heures, afin d’obtenir un volume suffisant d’urine. Les prélèvements de fèces et d’urine pourront être réalisés indépendamment les uns des autres.
Impact sur les animaux
La modification des conditions d’élevage pourra concerner 60 porcelets. Ces modifications des conditions d’élevage impliquent la modulation des conditions d’hygiène (présence ou absence de nettoyage et/ou désinfection), la variation de la température de 16°C à 33°C et/ou de la ventilation. Ainsi, ces modifications peuvent créer des situations d’inconfort sanitaire pour les porcelets. En effet, des températures plus faibles en dessous de la zone de thermoneutralité (< 24°C) et de mauvaises conditions d’hygiène peuvent engendrer des troubles digestifs comme de la diarrhée. Des températures au-dessus de la zone de thermoneutralité placent l’animal en situation de stress thermique, ce qui peut induire une fréquence respiratoire plus élevée et un appétit plus faible. De plus, la densité à partir de 55 jours d’âge, c’est-à-dire lorsque les animaux atteignent environ 20 kg, sera plus élevée que ce qui est exigé dans la réglementation expérimentation puisqu’elle sera de 0,36 m²/porc. Cette densité n’est autorisée en expérimentation animale que pour des porcelets jusqu’à 20 kg et doit ensuite être de 0,50 m²/animal pour des porcelets entre 20 et 30 kg. Toutefois, la réglementation élevage exige une surface minimale de 0,30 m²/animal pour des porcelets jusqu’à 30 kg, ce qui correspond à nos conditions. En effet, le but est de se placer dans des conditions proches d’un élevage commercial. L’utilisation d’additifs alimentaires non enregistrés dans l’Union Européenne pourrait également engendrer une baisse de la consommation entrainant un ralentissement de la croissance d’environ 10-15%. Il faut toutefois préciser qu’il existe une forte variabilité de la croissance des porcelets en élevage commercial. Les additifs qui seront testés pourront être des additifs ayant déjà été testés sur animaux ailleurs que dans l’Union Européenne ou déjà utilisés en nutrition humaine. Au maximum, 18 porcelets pourront recevoir des additifs non enregistrés. Les animaux pourront être rationnés entre 75% et 95% du niveau ad libitum observé dans l’élevage. Cela pourra créer de la compétition à l’auge pouvant entrainer de l’agitation et de légères griffures. Enfin, les prélèvements d’échantillons biologiques peuvent induire un stress lors de la manipulation des animaux (prélèvements de fèces et d’urine). Les prélèvements de fèces seront réalisés par stimulation rectale à l’aide d’un écouvillon introduit dans le rectum pouvant créer de légères irritations.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et exclus du circuit de consommation humaine s’ils ont reçu un additif non enregistré au sein de l’Union Européenne ou lorsque des prélèvements d’organes, de contenu intestinal ou d’autres tissus sera nécessaire. Ainsi, au maximum, 60 porcelets (10 essais x 6 porcelets) pourront être euthanasiés afin de prélever des échantillons biologiques (tissus, contenu caecal…) post-mortem et 18 porcelets (3 essais x 6 porcelets) ayant reçu un additif non enregistré pourront également être euthanasiés, soit un total de 78 porcelets mis à mort. Les autres animaux seront maintenus en vie et continueront leur cycle de production dans un élevage commercial.
Remplacement
Ce projet vise à développer des méthodes non animales (in vitro) en s’appuyant sur des échantillons d’urine et de fèces qui permettront de ne plus utiliser l’animal pour l’étude de certains aliments, matières premières ou additifs. Ainsi, il n’est pas possible de prélever d’autres animaux car le porcelet est l’espèce cible du projet. A ce jour, ces prélèvements ne peuvent pas être obtenus autrement que via un animal vivant. En effet, il existe des spécificités d’espèce, notamment avec un microbiote spécifique et des mécanismes de régulation physiologiques (endocrinologie, métabolisme digestif…) propres au porcelet.
Réduction
Le nombre de 5 porcelets (+ 1 porcelet remplaçant en cas de problème sanitaire ou mort de l’un des porcelets) a été défini comme étant le nombre minimal pour préparer un inoculum digestif (fécal…) de bonne qualité, c’est-à-dire présentant une diversité microbienne suffisante afin d’être représentative d’un microbiote moyen et une quantité de matière suffisante permettant la mise en culture in vitro de 30 flacons. Un flacon constituera donc une unité expérimentale. La littérature scientifique n’indique pas de nombre minimal d’échantillons à prélever pour mener à bien un essai in vitro et constituer un inoculum. Les données trouvées citent entre 5 et 15 porcelets prélevés. Le nombre de modalités expérimentales variera entre 2 et 6, c’est-à-dire que nous comparerons entre 2 et 6 groupes expérimentaux in vitro. Afin de disposer de suffisamment de réplicas (= flacons) pour chaque groupe expérimental considéré (15 minimum afin de détecter comme significatives des différences de l’ordre de 10%), ce suivi des fermentations pourra être répété 2 à 3 fois sur les mêmes animaux (donc âge des animaux évoluant entre les 3 prélèvements). Si l’on souhaite disposer d’inoculum obtenu sur des animaux de même âge, il conviendra alors de réaliser 2 ou 3 essais successifs impliquant ainsi 2 ou 3 lots de 6 porcelets différents. Dans ce cas, les animaux ne seront prélevés qu’une seule fois par essai. Notre modèle in vitro permet donc de limiter le recours à des animaux puisqu’à partir de 5 porcelets (+ 1 remplaçant), 30 flacons contenant l’inoculum pourront être préparés puis attribués à l’une des modalités expérimentales comparées. En ayant recours à des études in vivo, ces 30 flacons issus de 5 porcelets auraient été remplacés par un minimum de 30 animaux donneurs. L’exploitation des données par un test statistique ne se fait que sur les données produites (volume de gaz, microbiote…) par la mise en culture in vitro et non pas sur les données collectées sur les animaux.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’EU. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux.
Choix des espèces
L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) pouvant interférer avec le microbiote fécal sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. De plus, la spécificité des conditions d'élevage de cette espèce de rente ne permet pas de la remplacer par une autre espèce modèle. Enfin, le porc est l’espèce cible des traitements testés. Les animaux utilisés seront des porcelets sevrés âgés de 21 à 70 jours.
Développement d’un traitement innovant de la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.
Procédures
Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.
Repenser la nutrition protéique pour la santé, le bien-être et la robustesse du poussin à croissance rapide ou lente – optimisation de l’apport protéique les premiers jours de vie
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
384 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une prise de sang au sinus occipital sur animal vigile, puis est mis à mort à cinq, dix ou vingt jours pour analyser sa composition corporelle selon le taux de protéines de son aliment. Le porteur présente le prélèvement comme rapide et sans risque s'il est réalisé par du personnel habilité. Il affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne représente la complexité de la digestion, l'étude portant sur l'espèce cible elle-même.
Objectifs
La nutrition du jeune poussin est délicate du fait du passage d’une alimentation d’origine maternelle à une alimentation d’origine exogène, alors qu’elle contribue de manière importante à sa robustesse en renforçant sa santé digestive. Les apports protéiques pourraient probablement être réduits dans les premiers jours de vie et l’usage de matières premières protéiques locales souvent riches en fibres pourrait être facilité en période de croissance par une alimentation néonatale adaptée. L’objectif général du projet est de proposer des stratégies nutritionnelles précoces du poussin afin de renforcer sa santé et son bien-être, et d’améliorer l’usage de sources de protéines diversifiées et locales. La première étape, qui fait l’objet de cette demande, vise à optimiser l’apport protéique pendant les premiers jours de vie. Nous chercherons dans une deuxième étape à améliorer l’équilibre en acides aminés et évaluer l’impact de la supplémentation en acides aminés fonctionnels, et dans une troisième étape à raffiner les besoins en protéines et en acides aminés en fonction de certaines caractéristiques du régime.
Bénéfices attendus
L’objectif étant d’affiner la connaissance des besoins protéiques pour ajuster et/ou équilibrer les apports sur la phase de démarrage (premiers jours de vie), l’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale fine d’une période du développement de l’animal qui est relativement peu étudiée. La connaissance des besoins nutritionnels du jeune a été expérimentée mais jamais, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Au niveau opérationnel, les attendus sont de : mieux appréhender les besoins du jeune (incluant la période ≤ 7 jours) pour réduire les apports en protéines et équilibrer les acides aminés de manière à éviter l’excédent protéique pouvant fragiliser la santé digestive, et à terme, proposer des stratégies nutritionnelles précoces permettant de renforcer la santé des animaux tout en favorisant l’usage de matières premières locales protéiques sur toute la période d’élevage.
Procédures
Une prise de sang au sinus occipital sera effectuée sur animaux vigiles. Les animaux prélevés ne seront pas les mêmes à chaque date. Il n’y aura donc qu’une prise de sang par animal qui ne durera que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La technique de prélèvement de sang utilisée est rapide (quelques secondes) et approuvée depuis de nombreuses années. Elle ne présente pas de risques pour l'animal si elle est réalisée par du personnel habilité.
Devenir
Suite à la procédure de prise de sang, les animaux seront mis à mort pour des découpes anatomiques, à J5 et à J10 pour l’essai 1 et à J10 et à J20 pour l’essai 2, ceci afin de caractériser leur composition corporelle en fonction du taux protéique de leur aliment.
Remplacement
La connaissance des besoins nutritionnels du jeune poussin sera expérimentée sous l’angle original et complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être des animaux. Aucun test in vitro ou in silico n'est capable de représenter la complexité des mécanismes physiologiques de digestion et de métabolisme. Les analyses se feront directement sur l’espèce cible (poule domestique)
Réduction
Au total, 384 animaux seront prélevés (sang) sur l’ensemble des 2 essais (essai génotype à croissance rapide et génotype à croissance lente). Le nombre d’animaux expérimentaux choisi pour chacun des 2 essais est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte 1) de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse tout au long de l’expérimentation (cf ci-dessous), et de 2) de la réalisation, à différents jours de la phase de démarrage, de prélèvements (sang) suivis de mise à mort pour découpe anatomique. Nous cherchons à mettre en évidence des variations possibles de la baisse du taux protéique du régime (dose-réponse avec 6 régimes) sur les performances de croissance. L’unité statistique pour les analyser sera le compartiment. Huit compartiments par groupe sont nécessaires et suffisants pour détecter des différences de consommation d’aliment et d’indice de consommation entre régimes d’après des travaux publiés en 2017 sur la baisse de protéines chez les poulets en fin de période d’élevage. Ces paramètres seront analysés statistiquement pour comparer les différents traitements, et utilisés pour modéliser la croissance des animaux. L’unité statistique pour les dosages sanguins sera l’animal. Un effectif de 16 animaux par régime et par âge au prélèvement (2 par compartiment , par régime et par âge au prélèvement), soit 192 animaux par essai, est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes et de la variabilité interindividuelle attendue des paramètres sanguins mesurés : utilisation des résultats d’un projet précédent et des avancées méthodologiques rapportées dans un article publié en 2021. Un test statistique permettra de comparer les groupes.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol dans des compartiments où ils resteront en groupe. La taille du compartiment est suffisante pour permettre aux poussins de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Le suivi des performances sera fréquent avec des mesures tous les 2 ou 3 jours sur la période étudiée. Toute manifestation de symptômes persistants tels que « animal prostré » plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver, entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu à part des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés de souches à croissance rapide (essai 1) ou lente (essai 2) seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur puis les animaux sont élevés jusqu’à 10 jours (essai 1, poulets standards) ou 20 jours (essai 2, poulets à croissance lente).
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aigüe à l’aide de modèles de sepsis chez le rongeur (souris et rats)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Rats : 3900
5 070 souris et 3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs déclenchent un sepsis par injection de toxine LPS ou par ligature du caecum, provoquant septicémie, inflammation, perte de poids, atteintes pulmonaires et choc septique, pour tester de nouveaux traitements du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur n'attend pas de nuisance liée aux traitements eux-mêmes, qu'il présente comme non toxiques. Il affirme que le rat et la souris reproduisent au mieux la maladie humaine et que les essais in vitro ne suffisent pas.
Objectifs
Le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA) est un syndrome clinique d'inflammation et d'œdème pulmonaire diffus qui provoque généralement une insuffisance respiratoire aiguë. Le SDRA peut être causé par des déclencheurs infectieux ou non infectieux qui impliquent l'activation et la dérégulation de multiples voies de lésion, d'inflammation et de coagulation qui se chevauchent et interagissent dans les poumons et dans le système. Le plus souvent, le SDRA peut se développer dans le cadre d'une pneumonie, d'une septicémie (39% des cas), d'une aspiration du contenu gastrique ou d'un traumatisme grave. Le SDRA représente 10 % de tous les patients dans les unités de soins intensifs dans le monde entier, avec un taux de mortalité élevé (30-40 %). Le SDRA se caractérise par une mauvaise oxygénation et des poumons non conformes ou "rigides", c'est pourquoi la ventilation mécanique et les thérapies de soutien sont les piliers du traitement de la maladie. Cependant, le taux de mortalité est toujours très élevé, il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques visant à découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la pathologie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du SDRA avec la mise en place de modèle animaux reproduisant ces pathologies chez la souris ou le rat. L’objectif est de trouver des molécules pouvant retarder la progression de la maladie et améliorer la qualité de vie des patients atteints par cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la septicémie et le SDRA. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui ralentiraient la progression de la maladie évaluée par des analyses sanguines (marqueurs inflammatoires, de toxicité, de NEToses (formation de pièges extracellulaires des neutrophiles) et de fibrose) ou par analyse histologique (recrutement des fibrocytes, fibrose, NEToses, toxicité).
Procédures
Tous les animaux des groupes 2 à 7 subiront soit une injection unique en intra-péritonéale de LPS, soit une administration unique en intra-nasale de LPS, soit une administration unique en intra-trachéale de LPS, soit une ligation du caecum par méthode chirurgicale pour induire la pathologie. L’injection intra-péritonéale se fera sur animaux vigiles tandis que pour l’administration intranasale et intratrachéale ainsi que pour la méthode chirurgicale, l’induction se fera sur animaux anesthésiés. Les animaux du groupe 1 quant à eux recevront du sérum physiologique, du PBS ou seront opérés à blanc. Les injections intra-péritonéales dureront moins d’une minute par animal. Les administrations intra-nasales et intra-trachéales dureront environ 5 minutes par animal et la méthode chirurgicale durera environ 20 minutes par animal. Les traitements pourront être administrés en préventif (jusqu'à 1 mois avant l'induction du modèle) et/ou en curatif (jusqu'à 4 semaines après l'induction du modèle). Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra- péritonéale, sous-cutanée, par voie orale, par voie topique sur animal vigile ou par système de mini-pompe osmotique qui sera la voie préférentielle. Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques. Les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés avec un mélange de kétamine /xylazine, qui sera administré par injection intra-péritonéale ou par inhalation d’isoflurane. Lors des prélèvements de sang intermédiaires par voie rétro-orbitale ou lorsque qu’un animal présentera un score total compris entre 5 et 7, toutes catégories confondues dans le tableau des points limites, les souris et les rats seront traités avec de la buprénorphine. Le prélèvement sanguin durera environ 5 minutes par animal. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort selon les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer une septicémie associée à une élévation des marqueurs inflammatoires, une perte de poids et des complications aux longs termes telle que des dommages dans les poumons et un choc septique. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
Euthanasie : le poumon sera prélevé pour analyse histologique et prélèvement de sang.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, le recrutement des neutrophiles et la fibrose implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie du sepsis et du SDRA. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation et les dommages pulmonaires pouvant mener à la fibrose, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en modèle cellulaire.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux grâce à une approche statistique, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude donc une analyse statistique appropriée sera réalisée.
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, prélèvement de sang) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque) ou par injection de kétamine/xylazine en intra-péritonéale. Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Pour les modèles d’induction par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique qui sera administré en phase pré- et post-opératoire ainsi qu’un analgésique local appliqué lors de la procédure chirurgicale. En dehors de la phase de chirurgie, l’utilisation d’antibiotiques peut être nécessaire afin de retarder le choc septique. Toutefois, en cas de douleur ou de souffrance importante, un analgésique pourra être employé. Nos études étant basées sur des modèles inflammatoires, les anti-inflammatoires ne sont pas applicables. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 5 premiers jours qui suivent l’induction puis trois fois par semaine pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est compris entre 5 et 7, l’animal recevra une injection de buprénorphine ou de meloxicam. Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour ces modèles en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de rat Sprague Dawley (SD) est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Chez la souris, les souches C57Bl/6 et Balb/c représentent les souches de choix. Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier du modèle utilisé, des objectifs et des besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés d’au moins 8 semaines au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Etude de la formation de la cardiomyopathie atrial associée à la réponse immuno-inflammatoire dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 70
Nourries quatre mois d'un régime enrichi en graisse, des souris sont prélevées d'une goutte de sang à la queue huit fois en deux heures, éveillées et chacune isolée dans une cage, puis examinées sous anesthésie par échocardiographie. D'autres souris et des rats subissent une chirurgie cardiaque destinée à installer une insuffisance cardiaque, et d'autres souris encore sont irradiées puis reçoivent le lendemain des cellules de moelle osseuse de souris donneuses. Au total, 1 370 souris et 70 rats, soit 1 440 rongeurs, vont être utilisés, la déclaration en comptant 1 100 en souffrance modérée et 340 en souffrance sévère. Le porteur cite comme effets possibles des difficultés à se déplacer et à s'alimenter, des douleurs après l'opération, des arrêts cardiaques et un affaiblissement après l'irradiation. Tous seront tués à la fin des actes, pour les prélèvements et les analyses.
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.
Procédures
Procédure souris obèses : les souris seront mises sous régime enrichie en graisse pendant 4 mois. Elles seront soumises à une prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures pour tester l'évolution de syndromes métaboliques. Pour cela, les animaux sont vigiles, isolés les uns des autres dans 1 cage. Lors du prélèvement à la queue, chaque souris est posée tranquillement sur la grille, sans contention et le prélèvement d’une goutte de sang est effectuée en quelques secondes. Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Durant toute la procédure, les animaux seront anesthésiés. Procédure, insuffisance cardiaque : les souris et les rats subiront une chirurgie cardiaque, sous anesthésie avec un anesthésiant et une injection de combiné de deux analgésiques pour respecter le bien-être animal. La durée de l'intervention est de 10-15 minutes. Puis, des mesures échocardiographies sous anesthésie seront réalisées, la durée est de 5minutes par animal. Procédure irradiation : les souris receveuses, seront irradiées, la durée est de 5 minutes par animal. Le lendemain elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses.
Impact sur les animaux
L'obésité peut conduire à des difficultés de déplacement, un changement cutané et du pelage mais également à une obésité, un diabète. L'insuffisance cardiaque engendre des difficultés de déplacement et d'alimentation les 1ers jours et des arrêts cardiaques. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques (détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire) mais aussi à des douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux. L’irradiation peut également induire un affaiblissement général en plus du risque infectieux accru.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.
Réduction
La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1370 souris + 70 rats = 1440 animaux
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 30 minutes avant la fin de la procédure. La 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Evaluation des effets de composés pharmacologiques sur la dysfonction érectile chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
1 260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs sectionnent les deux nerfs caverneux sous anesthésie pour provoquer une dysfonction érectile, administrent des composés pendant une à douze semaines, puis mesurent l'érection par stimulation du nerf sous anesthésie. Le porteur reconnaît des risques de douleur, d'infection et d'inconfort liés aux chirurgies de l'abdomen, à la lésion nerveuse et aux prélèvements en cage à métabolisme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'érection, résultat de l'interaction entre système nerveux et vaisseaux, ce qui imposerait le recours au rat.
Objectifs
La dysfonction érectile (DE) est définie comme l’incapacité à obtenir et ou à maintenir une érection suffisante pour l’accomplissement d’un rapport sexuel, de manière constante ou récurrente. La DE peut être psychogénique (médié par l’adrénaline), d’origine organique ou mixte. Les causes d’une DE organique sont nombreuses : neurogéniques (lésion de la moelle épinière, sclérose en plaques, maladie de Parkinson etc..), vasculaires (athérosclérose, hypertension artérielle, diabète etc…), iatrogéniques (suite à la prise de certains médicaments comme les béta-bloquants, certains antidépresseurs etc..) ou hormonales. Toutes les études ont montré une augmentation de l'apparition de la DE avec l’âge. En effet, la DE touche entre 1 et 9% des hommes de moins de 40 ans, et plus de la moitié des hommes de plus de 70 ans. La DE a des conséquences personnelles négatives telles que la frustration, soucis, souffrance psychologique et ou l’évitement de l’intimité sexuelle, ce qui occasionne une altération de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple. Actuellement, différents traitements sont disponibles pour la DE, comme les comprimés de sildénafil (viagra) ou de vardenafil (Levitra), les injections dans l'urètre ou directement dans le corps caverneux du pénis d’alprostadil, les pompes à vide, la pose d’implant, ou plus récemment les thérapies par onde de choc. Cependant, ces traitements peuvent être inconfortables (nécessité de planifier l’acte sexuel, des injections invasives) ou contre-indiquées avec certains autres traitements (contre-indication entre la prise de sildénafil ou vardénafil avec les dérivés nitrés, ces derniers étant utilisés pour traiter l’angor). De plus, certains types de patients (diabétique, personne ayant eu une prostatectomie) répondent difficilement ou sont insensibles aux traitements actuels. Au final, il y a encore une forte proportion de patients avec une DE qui nécessite une alternative thérapeutique dans leur prise en charge. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre du développement des traitements pharmacologiques pour la DE, ou dans la recherche d’un effet indésirable sur la fonction érectile d’un traitement médicamenteux.
Bénéfices attendus
La DE est une pathologie fortement liée à l’âge, ainsi l’allongement de l’espérance de vie augmente le nombre de personnes ayant une DE dans la population. Cependant, chez les patients souffrant de pathologies cardiovasculaires et ou métaboliques, la DE s’accompagne d’une résistance aux traitements thérapeutiques disponibles actuellement. De plus, il n’existe pas encore de traitement médicamenteux curatifs à la DE, en effet, les traitements médicamenteux actuels restent symptomatiques. La recherche de médicaments pour compléter l’arsenal thérapeutique actuel contre la DE est donc indispensable et reste active. Ce projet permettra de sélectionner les candidats médicaments efficaces dans le traitement de la DE et ou de discriminer ceux qui pourraient avoir un effet néfaste sur la fonction sexuelle. De même, ce projet donnera une preuve d’efficacité à un candidat médicament, dans un modèle animal standardisé, complétant les études précliniques règlementaires avant les essais chez l’homme.
Procédures
Les interventions que vont avoir les animaux sont : - L’induction du modèle de DE par lésion bilatérale du nerf caverneux chez le rat anesthésié. Cette procédure est réalisée une seule fois afin de mettre en place la DE, et l’opération dure environ une heure. Elle permet de mimer la lésion du nerf caverneux au cours d'une chirurgie de prostatectomie, sans réaliser la chirurgie. - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. - Mesure de la fonction érectile suite à une chirurgie sur animal anesthésié: stimulation artificielle du nerf caverneux et mesure de l’augmentation de la pression intracaverneuse (signe de l’érection). Cette procédure est sans réveil, donc réalisée une fois par animal, et la mesure dure environ 2 heures incluant le temps de chirurgie. - Si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés. Les prélèvements sanguins respecteront les normes en vigueur, limitant le volume inférieur à 10% du volume total sanguin de l’animal, et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours. Chaque prélèvement sanguin, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes. Si le protocle le recquiert, des récoltes d'urine par isolement de l'animal dans un hébergement individuel peuvent être réalisés, à raison d'une fois par semaine au maximum, et l'isolement est inférieur à 24 heures. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Les chirurgies de l'abdomen (pour réaliser les lésions nerveuses, les administrations intraprostatiques ou intracaverneuses, ou encore pour mesurer la fonction érectile) présentent des risques de douleur, d’infection et d’inconfort. - La lésion des nerfs caverneux pour créer la dysfonction érectile peut présenter des risques de douleur - L’administration du composé à tester qui nécessitera une contention, et l’implantation des pompes osmotiques peuvent entraîner des risques de stress et de douleur - Prélèvements de sang et d’urine en cage à métabolisme peuvent stresser l’animal. Les risques de douleur et d'infection sont pris en compte pendant le projet par l’utilisation des antalgiques et/ou antibiotiques. De plus, les personnels qualifiés et tutorés vont limiter le stress au maximum. A noter que tous les animaux ne vont pas forcément subir toutes les procédures dans la liste.
Devenir
Tous les animaux vont avoir au minimum un traitement par le composé à tester et des composés témoins. Ensuite, selon les paramètres à analyser, suite à des prélèvements d’organes, et ou de sang, et ou la mesure de la fonction érectile, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés par un surdosage en anesthésique.
Remplacement
L’érection survient suite à une interrelation entre le système nerveux (centrale et périphérique) et différents types cellulaires, conduisant à cet afflux de sang au niveau du corps caverneux du pénis. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer cette fonction et la sélection de candidat médicament efficace dans le traitement de la DE. De plus, la survenue d'une DE est la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques chez les diabétiques et les personnes atteintes d’une hypertension artérielle. Ainsi, la possibilité d’utiliser des souches de rats diabétiques et hypertendus est essentielle afin de sélectionner un candidat médicament efficace contre la DE associé à ces pathologies.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. La formule est n=1+2C (s/d)^2 pour calculer la taille du groupe pour des variables continues. D’après notre expérience suite aux expérimentations réalisées précédemment dans le laboratoire, le critère principal a une déviation standard (s) de 0,5. Afin de mettre en évidence un effet significatif, le produit d’intérêt devrait modifier ce critère de 0,75 par rapport au groupe contrôle (d). Avec une puissance (1-β) de 90% et un niveau de significativité (α) de 5%, la constante C correspond à 10.51. Ainsi, en reprenant la formule, le nombre de rats par groupe nécessaire pour l’étude est : n= 1+ 2*10.51*(0.5/0.75)^2 = 10,3. Notre expérience passée nous a permis de fixer la taille du groupe expérimental à n=12 rats afin d’obtenir des données interprétables pour 10 animaux/groupe avec les tests statistiques utilisés car 20% des données sont non interprétables, inhérentes aux difficultés techniques du modèle expérimental.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - L’induction de la DE par une lésion du nerf caverneux se fait sous analgésie et anesthésie générale. Un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. - L’évaluation de la fonction érectile se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence (voir dans la description de chaque procédure) et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et l’homme. De plus, les modèles pathophysiologies de diabète et d’hypertension artérielle présentant une dysfonction érectile ont été décrits chez le rat. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 7 semaines d’âge, en effet l’évaluation de la fonction érectile se fait forcément après la maturité sexuelle. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Etude des effets anti-tumoraux de perturbateurs du métabolisme cellulaire dans le cancer de la prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules cancéreuses sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, puis des injections répétées de composés jusqu'à vingt-cinq semaines, développant tumeurs et métastases qui reproduisent la maladie humaine. Le porteur reconnaît des pertes de poids et des atteintes au point d'injection pouvant aller jusqu'à la nécrose. Il affirme avoir mené des essais in vitro sur cellules humaines et conclut à la "nécessité" de la souris pour tenir compte de toutes les interactions de l'organisme.
Objectifs
Selon le dernier rapport de l'Institut National du Cancer, le cancer de la prostate (PCa) est le cancer le plus fréquent chez l'homme et la troisième cause de décès par cancer en France. Le cancer de la prostate représente plus de 50000 nouveaux cas et 8000 morts par an en France. L'ablation de la prostate (prostatectomie) ou la radiothérapie sont les traitements des tumeurs localisées. Lorsque le cancer devient métastatique, des traitements anti-hormonaux (anti-androgènes) et/ou une chimiothérapie (Docetaxel) sont prescrits. Cependant, à très court terme (1 à 2 ans) les patients développent une résistance. Ainsi, la nécessité de trouver de nouveaux traitements est cruciale. Au laboratoire, nous travaillons sur le métabolisme des cellules cancéreuses, en effet, celle-ci ont un métabolisme différent des cellules normales. Notre stratégie est donc de cibler cette particularité est ainsi identifier des approches thérapeutiques nouvelles qui vont contrecarrer les résistances aux thérapies existantes. Grâce à l'expérimentation animale nous pouvons ainsi valider dans un modèle intégré les résultats obtenus dans des cellules en culture.
Bénéfices attendus
100% des options thérapeutiques actuelles pour le cancer de la prostate métastatique conduisent à une résistance aux traitements. Il est donc important de trouver de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du métabolisme des cellules cancéreuses de prostate est une piste thérapeutique intéressante. Nous caractériserons l'action anti-tumorale et anti-métastatique de molécules qui ont un effet anti-prolifératif et diminuent l'agressivité des cellules cancéreuses in vitro. Cela apportera la preuve de concept que dans un système physiologique intégré (étude préclinique) ces molécules ont un effet anti-cancéreux.
Procédures
Nous réalisons différentes expériences qui nous permettent de tester les effets anti-tumoraux de nouveaux composés. Au total, nous réalisons 4 types d'interventions dont une procédure chirurgicale : 1) injections en sous-cutanée de cellules cancéreuses, cette intervention est réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 540 souris. 2) injection intra-veineuse réalisée une seule fois par souris et pour une procédure, elle dure 10 secondes. Cette nuisance concerne 180 souris. 3) injection intra-péritonéale des agents, elle est réalisée 3 fois par semaine pour une durée allant de 6 à 25 semaines en fonction des procédures. Cette nuisance concerne 915 souris. 4) Une procédure chirurgicale ou les souris recevront une injection dans la prostate (greffe orthotopique) après une intervention chirurgicale qui dure 20 minutes. Cette nuisance concerne 185 souris. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables peuvent être la perte de poids. Les injections intrapéritonéales et dans une moindre mesure sous-cutanée pourront entraîner des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Il y aura également le développement de tumeurs intra-prostatique et de métastases qui reproduisent la pathologie humaine.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures et des traitements, nous étudions les tumeurs générées par xenogreffe sous-cutanée, in situ (dans la prostate) ou bien aux métastases dans différents organes, il est donc nécessaire de mettre à mort l'animal, afin de prélever ces tissus pour les analyser.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études in vitro sur des cellules cancéreuses humaines (prolifération, capacités migratoires et invasives des cellules) et nous avons montré que nos composés d'intérêt inhibent la prolifération des cellules cancéreuses ou induisent la mort. Il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de toute la complexité et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme. La formation de métastases est un processus complexe dont l'intégralité des étapes ne peut être étudiée que sur animal vivant.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée avant d'initier ce projet pour s'assurer de la non-reproduction de résultats déjà publiés. De plus, pour satisfaire à la réduction, chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Concernant les souris transgéniques, nous ne maintiendrons en élevage que les souris ayant un phénotype non dommageable et nous réaliserons des croisements uniquement pour générer le nombre d'animaux requis pour l'expérience, nous ne conserverons que les mâles qui génèrent un cancer de la prostate.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des conditions stériles permettant de maintenir l’environnement adapté à des animaux immunodéprimés. Nous assurerons un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des souris. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance et ainsi rendre en charge immédiatement tout mal être.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Sa physiologie est adaptée aux expériences que nous désirons réaliser. Dans notre projet, nous utilisons des modèles animaux déjà établis et disponibles auprès de fournisseurs agréés, il n'est donc pas utile de générer de nouveaux modèles. Enfin, nous étudions des composés qui ont déjà été utilisés chez la souris, ils ne sont pas toxiques, mais on ne connait pas leurs effets dans le cancer de la prostate. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour faire des analyses protéiques, génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Nous travaillons sur la prostate, nous utilisons donc que des souris mâles. Les procédures expérimentales proposées sont réduites dans leur durée au temps suffisant pour établir les effets anticancéreux potentiels des nouveaux composés testés. Nous n'utilisons que des souris mâles adultes à maturité sexuelle qui sécrètent les hormones mâles. La maturité sexuelle est obtenue entre 6-7 semaines chez la souris. Les animaux seront donc utilisés à partir de cet âge.
Etude de la digestibilité fécale d’aliments supplémentés ou non avec une enzyme, à différentes doses, sur poulets de chair en croissance
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
192 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et douze rendus à l'élevage. Enfermés jusqu'à huit jours en cage individuelle pour recueillir leurs fientes, ils testent la digestibilité d'aliments additionnés d'une xylanase non encore homologuée dans l'Union européenne. Le porteur reconnaît que le confinement peut provoquer stress, prostration, frustration et parfois des boiteries sur le grillage. Il indique que les animaux ayant consommé cette enzyme ou des marqueurs ne peuvent entrer dans le circuit de consommation, ce qui explique leur mise à mort et leur envoi à l'équarrissage.
Objectifs
Parmi les matières premières utilisées pour la formulation des aliments pour poulets, certaines d’entre elles, très intéressantes pour leur apport en énergie, contiennent également des fibres, dont les parois cellulaires sont indigestibles pour cette espèce animale. Les parois cellulaires végétales encapsulent le contenu cellulaire, réduisant la disponibilité des nutriments (acides aminés, phosphore, …) et augmentent également la viscosité de l’aliment, conduisant à une moindre digestion jusqu’à l’iléum. Les xylanases sont des enzymes capables de dégrader les parois cellulaires ; leur utilisation permet donc d’améliorer la digestibilité des aliments contenant des fibres. L’objectif de ce projet est l’évaluation de la digestibilité des aliments chez le poulet en croissance par l’incorporation d’une nouvelle xylanase, non enregistrée en Union Européenne, pour laquelle doivent être établies des mesures de digestibilité de l’énergie et de la protéine afin de constituer son dossier d’homologation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise sur le marché européen d’une nouvelle xylanase permettant d’améliorer la digestibilité de régimes alimentaires riches en fibres pour les poulets/volailles. Cette solution permettra de diversifier les sources de matières premières dans les aliments.
Procédures
En démarrage, de J0 (jour de l’éclosion) à J16, 4 aliments avec ou sans enzyme seront distribués. En croissance, de J16 à J23, 4 aliments avec ou sans enzyme avec marqueurs seront distribués. De J16 à J23, les poulets seront soumis à un hébergement en cages individuelles sur une durée maximale de 8 jours, permettant une collecte individuelle des fientes (d’une durée de 3 jours) nécessaire aux évaluations de digestibilité.
Impact sur les animaux
Le confinement des animaux dans des compartiments de surface réduite pendant la période en cage individuelle de 8 jours peut être à l’origine de réactions physiologiques ou comportementales au stress (morbidité, prostration, …). Les animaux peuvent ressentir un sentiment de frustration d’être logé en cage individuelle. Le logement sur grillage pourra entrainer dans de rares cas des boiteries. L’incorporation des marqueurs et de l’enzyme dans les aliments ne présente pas de nuisances pour les animaux.
Devenir
A la fin de l’essai, les 144 animaux en cage individuelle seront euthanasiés puis envoyés à l’équarrissage, car ils auront consommé des marqueurs, ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. D’autres part, les animaux des groupes 2, 3 et 4 auront consommé une enzyme non enregistrée en Europe ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. Les animaux surnuméraires des groupes 2, 3 et 4 élevés au sol seront euthanasiés car ils auront consommé une enzyme non enregistrée en Europe ce qui ne leur permet pas d’entrer dans le circuit de consommation. Les animaux surnuméraires du groupe 1 élevés au sol ne seront pas euthanasiés car ils n’auront pas consommé d’enzyme non enregistrée en Europe, ni de marqueurs et seront remis dans le circuit de consommation.
Remplacement
Des études préalables d’évaluation de différentes souches de xylanases ont été réalisées in vitro, afin de sélectionner la souche la plus efficace, dans ces conditions. L’enzyme a ensuite été évaluée sur poulets dans des essais de tolérance et d’efficacité. En revanche l’étape suivante d’évaluation de la digestibilité des aliments supplémentés avec cette enzyme n’a encore jamais été réalisée. L’effet d’une xylanase dans un aliment pour poulet sur sa digestibilité est la résultante d’une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet donc pas d'utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d'études in vitro.
Réduction
Les animaux choisis seront issus du même parquet de reproducteurs, et seront tous des mâles, afin de limiter la variabilité individuelle. En effet, le sexe fait partie des variables indépendantes qui peuvent influencer la digestibilité des nutriments. La méthode de référence en Europe pour la détermination de la digestibilité de l’énergie en volaille est basée sur l’utilisation de poulets mâles. Le nombre de répétitions (de mesures de digestibilité) est estimé à 18 par groupe expérimental, avec 4 groupes au total. En effet, la mise en cage individuelle permet de récupérer 144 échantillons de fientes, soit 36 échantillons de fientes par traitement expérimental. Ils sont ensuite poolés par 2 échantillons. Le pool est nécessaire pour avoir assez de contenus sur sec pour réaliser les différentes analyses de digestibilité. Il y a donc 18 répétitions de digestibilité par traitement. Ceci correspond au nombre de répétitions nécessaires pour obtenir : - une différence significative de 1.56 point en digestibilité de la protéine, avec un coefficient de variation de 2% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, - une différence significative de 71.6 kcal en digestibilité de l’énergie (énergie métabolisable apparente), avec un coefficient de variation de 2.2% sur ce paramètre, en prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%. La distribution des données sera évaluée selon des diagrammes en boite à moustache afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, des analyses statistiques seront réalisées sur les données zootechniques et la mortalité. Le niveau de significativité est fixé à p
Raffinement
L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Des points limites stricts et définis à l’avance seront appliqués tout au long du projet. Chaque cage disposera d’une ficelle, afin que les animaux puissent la manipuler. Les poulets ont la possibilité de se voir, de s’entendre et d’émettre des vocalises.
Choix des espèces
L’espèce choisie pour la réalisation du projet est le poulet car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet lui sont spécifiques. Les animaux seront utilisés du jour de l’éclosion jusqu’à 23 jours d’âge. Ils pèseront environ 42g à leur arrivée, et environ 1,4 kg à 23 jours. Le projet porte sur l'évaluation de la digestibilité chez le poulet en croissance, autrement dit chez le poulet âgé de quelques semaines.
Surexpression de DNM2 par thérapie génique pour l’étude et le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à DNM2.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix servent à entraîner un geste d'injection, les autres reçoivent un virus porteur d'un gène puis subissent une batterie de huit tests, dont la suspension pour la force musculaire, le tapis roulant et la barre crantée pour la coordination, l'immersion de la queue en bain-marie et la plaque chauffante pour la sensibilité. Le porteur annonce une "preuve de concept thérapeutique" et une "étape essentielle vers les essais cliniques", bénéfices renvoyés à un stade ultérieur, pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Il affirme qu'une étude sur cellules ne "pourrait pas se suffire à elle-même" car les effets sur l'organisme entier et la force musculaire y seraient impossibles à évaluer.
Objectifs
Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.
Procédures
Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.
Devenir
Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.
Choix des espèces
Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.
Cytokines inflammatoires et cardiopathie septique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs percent leur tube digestif sous anesthésie pour déverser les selles dans l'abdomen et provoquer une péritonite, puis suivent la défaillance cardiaque par échographie avant de prélever le cœur. Le porteur indique que l'infection peut provoquer stress, perte de poids et baisse de mobilité, et estime que garder ces souris en vie ne serait pas éthique vu la sévérité des procédures. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier le tissu cardiaque lui-même est "indispensable" et que ni les essais en tube à essai ni la modélisation informatique ne peuvent mimer l'infection de façon fiable, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à la souris.
Objectifs
Les infections sont des maladies extrêmement fréquentes et potentiellement graves. Dans leur forme la plus sévère (sepsis), l’inflammation provoquée par l’infection touche le corps entier et peut nuire au fonctionnement des différents organes, dont le cœur. Ce mauvais fonctionnement du cœur ne répond pas toujours au traitement par antibiotique. Il n’existe pas de traitement à ce jour qui traite spécifiquement l’inflammation responsable de la dysfonction du cœur au cours d’une infection sévère. Notre premier objectif est d’étudier cette dysfonction cardiaque induite par le sepsis. Pour cela, nous utiliserons un modèle d’infection sévère chez la souris. Les souris seront opérées sous anesthésie générale (elles seront endormies) afin de créer un petit trou dans leur tube digestif qui permettra aux selles de se déverser dans l’abdomen provoquant ainsi une infection appelée péritonite. Les souris ainsi infectées recoivent des anti-douleurs, et du liquide pour maintenir leur pression arterielle. Ce modèle a déjà été utilisé par plusieurs équipes et l’inflammation qu’il engendre provoque une dysfonction cardiaque similaire à celle observée chez l’homme. Nous pourrons ensuite caractériser le fonctionnement du cœur par échographie. Notre second objectif est d’étudier les paramètres de l’inflammation responsables de la dysfonction du cœur. Pour cela, les cœurs des souris infectées comme précédemment décrit seront prélevés et analysés après le décès de la souris et nous déterminerons quelles sont les protéines de l’inflammation qui sont exprimées à l’intérieur du cœur au cours de l’infection. Enfin, notre troisième objectif est de tester des traitements ciblant les protéines de l’inflammation qui auront été trouvées dans les cœurs des souris infectées. Nous injecterons aux souris infectées ces traitements par une piqure sous la peau et comparerons à des souris infectées traitées par placébo. Les points de comparaison reposeront sur l’analyse par échographie de la fonction du cœur et sur la survie des souris à l’infection.
Bénéfices attendus
Les infections sont très fréquentes en santé humaine et potentiellement graves avec un taux de décès élevé. Le décès peut être en lien avec des organes qui ne fonctionnent plus, dont le cœur, à cause de l’inflammation qui s’est propagée dans tout le corps et ce malgré un traitement antibiotique. A ce jour, aucun traitement spécifique n’existe pour soigner ce mauvais fonctionnement du cœur dû à l’infection. Notre travail permettra de mieux décrire cette dysfonction du cœur au cours de l’infection, de comprendre à quoi elle est due précisément et d’évaluer finement l’efficacité sur cette atteinte du coeur de traitements contre l’inflammation. En cas de résultats encourageants, notre étude ouvrira la porte à des études de ces traitements chez l’Homme
Procédures
Les souris sont opérées sous anesthésie générale. Elles sont endormies grâce à un gaz anesthésiant. La durée de la chirurgie est d’une dizaine de minutes. Une injection dans le ventre (intra-péritonéale) de médicament contre la douleur est réalisée avant la chirurgie et répétée toutes les 12 heures après pour les souris encore en vie. Dans la procédure qui teste les traitements, les souris les reçoivent soit par une injection dans le ventre soit par une prise orale, selon le mode de fonctionnement du médicament.
Impact sur les animaux
Les souris pourront ressentir une douleur après la chirurgie liée à l’ouverture du ventre. Celle-ci est prévenue par des médicaments contre la douleur qui sont systématiquement donnés. L’infection peut provoquer un stress, une perte de poids, une diminution ou augmentation de la température corporelle, une diminution de la mobilité des souris ou un défaut de leur toilettage. Les traitements seront administrés par injection dans le ventre ou sous la peau ou par la bouche. Les souris pourront ressentir un stress lié à la contention et une douleur liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, il s’agit de procédures sévères, il ne serait donc pas éthique pour le bien être animal de les garder en vie.
Remplacement
L’étude de la fonction du cœur chez l’Homme au cours des infections sévères a été déjà réalisée de manière aussi complète que possible avec des analyses non-invasives. Cependant, pour aller plus loin dans la compréhension de ce phénomène, il est indispensable d’étudier le tissu du cœur en lui-même, or cela n’est pas possible chez l’Homme. Il n’existe pas à ce jour d’expérience dans les tubes à essais ou de modélisations sur l’ordinateur qui pourraient mimer l’infection de manière fiable car celle-ci a plusieurs causes et se propage dans tous le corps mettant donc en jeu des mécanismes complexes. De plus, il n’est pas éthique de tester des médicaments directement chez l’Homme. Ces raisons rendent nécessaire le recours à des modèles animaux.
Réduction
L’ensemble des études déjà réalisées sur le sujet dans le monde sera étudié avant de débuter les expérimentations animales. Ainsi, tous les traitements déjà essayés et non-efficaces ne le seront pas à nouveau ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Nous n’étudierons que les animaux mâles car il a été montré que la mauvaise fonction du cœur au cours de l’infection était plus fréquente chez eux. Ainsi, cela permettra de ne pas inclure des femelles qui pourraient ne pas présenter de dysfonction du cœur et donc ne pas être analysées dans la suite du travail. L’étude de la fonction du cœur se fait par échographie ce qui est non-invasif pour la souris. Ainsi, les échographies peuvent être répétées chez une même souris au cours du temps sans avoir besoin de la mise à mort ce qui permet également de réduire le nombre d’animaux. L’analyse de l’expression des protéines de l’inflammation dans le cœur lui-même est une technique performante qui détecte un grand nombre de protéines en utilisant un nombre très faible d’animaux. L’analyse préalable de ces protéines guidera les traitements qui seront ensuite testés : seuls les traitements dirigés contre les protéines exprimées dans le cœur des souris au cours de l’infection seront testés. Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentation. Un suivi quotidien sera réalisé avant le début de l’expérimentation puis toutes les six heures dès que celle-ci aura commencé. La chirurgie est réalisée sur une souris anesthésiée.. La douleur post opératoire est systématiquement prévenue par l’administration d’un médicament contre la douleur avant la chirurgie et au bout de 12 heures. Les souris seront mises à mort si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie toutes les heures dès le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection sévère chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris mâles car le mauvais fonctionnement du cœur au cours de l’infection sévère est plus fréquent chez les souris mâles. Ces souris seront des souris adultes de 8 à 12 semaines car nous nous intéressons à l’infection sévère chez les humains adultes