Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rôle de deux enzymes dans l’épileptogenèse chez la souris atteinte de la sclérose tubéreuse de Bourneville sur le cerveau. 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie crânienne sous anesthésie pour des injections, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et 600 sont opérées pour la pose de transmetteurs enregistrant les crises. Le porteur indique que ces souris, modèles de la sclérose tubéreuse de Bourneville, développent des crises d'épilepsie pouvant être létales pour 10 % d'entre elles. Les bénéfices avancés, de nouveaux biomarqueurs et pistes thérapeutiques, restent formulés au conditionnel.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Influence de variétés de colza et de procédés de fabrication de tourteaux sur le stress oxydant de vaches laitières multipares en péripartum et de leurs veaux
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
92 bovins, vaches et veaux, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les vaches replacées dans l'élevage et les veaux vendus pour la croissance selon la pratique commerciale. L'essai teste des variétés de colza et des procédés de fabrication de tourteaux censés réduire le "stress oxydant" autour de la mise bas, avec sept prises de sang sur les vaches et cinq sur les veaux. Le porteur affirme qu'aucun impact négatif de l'alimentation n'est attendu et que la traite reste conforme à la pratique standard. La finalité affichée est de fournir à la filière laitière un tourteau valorisable et un lait enrichi en antioxydants, un objectif commercial autant que sanitaire.
Objectifs
Nous étudions les effets de régimes à base de colza sur le concept d'une seule Santé pour l'animal et pour l'homme. Certaines variétés de colza apporteraient des composés spécifiques permettant de diminuer le stress oxydant des vaches ingérant des tourteaux de ces colzas. Le stress oxydant de souris modèle de l'homme et de veaux ingérant le lait de ces vaches pourrait également être diminué. Cette demande d'autorisation à expérimenter porte spécifiquement sur un essai sur vaches autour de la période de mise bas et sur des veaux recevant le colostrum et le lait de ces vaches. La période autour de la mise bas pour la vache et de la naissance pour son veau sont des périodes où le stress oxydant est important. Les vaches (4 groupes) recevront donc avant la mise bas et en début de lactation 4 régimes alimentaires. Deux régimes contiennent ces variétés de colza spécifiques et un régime n'en contient pas. Un quatrième régime permettra de tester sur une des 2 variétés de colza si le processus de fabrication du tourteau a dégradé l'apport de ces composés spécifiques par une intensité de chauffage du tourteau trop importante à la fabrication. Le lait des mères sera distribué aux 4 groupes de veaux pendant 5 semaines à partir de la naissance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier l’effectivité de variétés de colza et de traitements technologiques protecteurs lors de la fabrication de tourteaux pour préserver la vache et son veau du stress oxydant autour de la mise bas. Il pourrait donc fournir des pistes pour la filière bovine laitière pour développer des tourteaux de colza qui seraient bénéfiques à la santé des vaches et des veaux, avec le potentiel de réduire l’usage des traitements médicamenteux en élevage. Ces tourteaux pourraient apporter un atout nutritionnel supplémentaire au lait de consommation, enrichi ainsi en antioxydants. D’un point de vue des connaissances scientifiques, il permettra d'étudier si les molécules d'intérêt contenues dans ces colzas sont métabolisées et présentes dans le sang des vaches alimentées avec ce type de régime, puis dans leur colostrum et le lait, et enfin, s’ils sont transmis au veau in utero puis lorsqu’ils sont nourris avec le colostrum puis le lait. L’objectif est de déterminer le statut oxydant des vaches et de leurs veaux et les relations avec leur statut immunitaire.
Procédures
Des prises de sang, réalisées sur vaches (7 prélèvements répartis sur 9 semaines) et veaux (5 prélèvements répartis sur 5 semaines), permettront un suivi précis des hormones et métabolites d’intérêt. Ces prises de sang dureront chacune au maximum 5 min.
Impact sur les animaux
Dans cet essai, les apports alimentaires sont conformes aux recommandations préconisées en alimentation pour l’élevage de vaches en fin de gestation et début de lactation ainsi que pour celui des veaux dans les 5 premières semaines de vie. Il ne devrait donc y avoir aucun impact négatif de l’alimentation sur la santé ou le bien-être des animaux. La traite est pratiquée selon la pratique standard en élevage et n’engendre pas de contrainte aux vaches. Les prises de sang, réalisées sur vaches et veaux, peuvent générer un léger stress pour les animaux, mais leurs réalisations rapides (au plus 5 min), par le personnel formé de l’établissement utilisateur, permettront de limiter ce stress.
Devenir
Les 2 procédures expérimentales, l'une sur vaches, l'autre sur veaux, sont légères. Les vaches seront replacées dans l'établissement utilisateur après l'essai, les veaux seront vendus pour continuer leur croissance selon la pratique commerciale standard.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative in vitro pour tester l’effet des composés bioactifs présents dans la ration pour réduire à la fois le stress oxydant qui survient chez la vache laitière au moment de la mise bas et celui de son veau recevant son colostrum (première sécrétion lactée, riche en immunoglobulines) puis son lait.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de vaches et de veaux à utiliser dans ces 2 procédures en nous référant à des essais similaires publiés sur l’effet d’autres types de composés (comme les vitamines) sur le stress oxydant des vaches à la mise bas et sur celui des veaux à la naissance et dans les premières semaines de vie. Le nombre de vaches (52) a été raisonné pour avoir 4 lots de 12 vaches en début d’essai (48 vaches) qui recevront 4 traitements alimentaires. De plus, 4 vaches nourrices recevant chacune un des 4 régimes alimentaires fourniront du lait en début de lactation aux premiers veaux à naitre. Le nombre de veaux retenu pour réaliser l’essai est de 40 veaux mâles (4 lots de 10 veaux qui recevront 4 traitements alimentaires). Dans les 2 essais, le schéma expérimental sera continu. Les analyses statistiques pratiquées seront des analyses de variance.
Raffinement
Hormis les prises de sang, le protocole ne modifie pas les conditions d’élevage des vaches et des veaux nouveaux nés. En effet, les apports énergétiques et protéiques des rations seront ajustés dans la gamme des apports recommandés pour les vaches et leurs veaux, visant à ne pas engendrer de perturbation par rapport à une conduite d’élevage classique non expérimentale. La traite des vaches est pratiquée selon la pratique standard en élevage et n’engendre pas de contrainte aux vaches. Pour réaliser les prises de sang, les vaches seront placées devant leur auge et bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation. Elles ne subiront donc aucun stress lié à ce blocage car elles y sont habituées (pratique quotidienne). La durée maximale pour le prélèvement de sang est limitée à 5 min chez la vache comme chez le veau afin de limiter le stress induit. Lors de la réalisation des prises de sang, le temps de contention manuel pratiqué sur les jeunes veaux sera minimisé à 5 min afin de limiter le stress induit. De plus, le personnel des installations est formé à la réalisation de ce geste ce qui contribue à minimiser le stress induit. Ce personnel est de plus formé en expérimentation animale et est sensibilisé à la douleur animale.
Choix des espèces
La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières et à leurs veaux, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les veaux sont des veaux mâles croisés Prim’Holstein et Blanc Bleu Belge qui est une race à viande. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Il nous faut des vaches laitières adultes pour étudier l’effet des molécules d’intérêt présentes dans le lait apporté aux veaux. Dans cet essai, nous utiliserons des vaches multipares ayant déjà mis bas au moins une fois et ayant réalisé au moins une lactation. Le stress oxydant chez les vaches laitières se produit au moment de la mise bas ; c’est pourquoi nous étudierons la phase autour de la mise bas (4 semaines avant la mise bas et 5 semaines après). Le stress oxydant chez les veaux est maximum au cours des premières semaines de vie et l’immunité propre s’acquiert lors de cette période. Le veau dispose d’abord d’une immunité transmise via le colostrum de sa mère, qui diminue pour être minimale à l’âge de 3 semaines de vie, avant de développer sa propre immunité. C’est pourquoi, nous avons choisi d’étudier l’effet de ces apports de molécules par le lait, de la naissance à l’âge de 5 semaines chez le veau.
Régénération de la membrane tympanique dans l’otite moyenne chronique par des systèmes à base de biomatériaux contenant des probiotiques.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
123 cobayes vont être utilisés, avec au programme une anesthésie générale par semaine pendant onze semaines pour examiner leur tympan, en plus de celles de la perforation du tympan, faite par une chirurgie sans incision, des trois mesures de l'audition, des prélèvements du microbiote de l'oreille et de l'administration des traitements. Tous sont mis à mort à l'issue pour des analyses histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La perforation peut causer une douleur faible à modérée traitée par antalgiques, une perte auditive légère et, dans des cas exceptionnels, une infection avec écoulement purulent, et l'équipe cherche à obtenir une perforation qui dure plus de huit semaines, un état que le porteur dit "difficile à obtenir". Pour les enfants atteints d'otite moyenne chronique, le bénéfice reste à venir : le porteur écrit qu'en cas de succès, le projet "serait poursuivi par des études cliniques".
Objectifs
L'otite moyenne chronique est la maladie infantile la plus fréquente dans le monde. Elle se caractérise par des écoulements auriculaires dus à une perforation persistante du tympan. Cette membrane sépare l'oreille moyenne de l'oreille externe. Sa fonction principale est la transmission des sons. L'otite moyenne chronique est une cause fréquente de perte auditive, voire de décès dûs à des complications intracrâniennes, notamment dans les pays en développement. L'administration d'antibiotiques à large spectre induit des effets secondaires et est en partie responsable de l'augmentation de la résistance aux antibiotiques. Si la perforation ne se répare pas d'elle-même, une intervention chirurgicale (sous anesthésie générale) est nécessaire mais son accès peut être compliqué dans les pays en développement qui ne sont pas bien équipés (par exemple, absence de loupe binoculaire pour la chirurgie). Ce projet propose une nouvelle approche de soins combinant une procédure simple de réparation du tympan et une alternative aux antibiotiques. Des biomatériaux actifs de type gel ou patch avec des propriétés mucoadhésives et cicatrisantes faciles à administrer et contenant des probiotiques seront introduits dans l’oreille pour fermer la perforation du tympan et ainsi faciliter sa cicatrisation tout en restaurant le microbiote local. Nous faisons l'hypothèse qu'une telle stratégie sans chirurgie associée à des probiotiques pourrait être une approche pertinente pour traiter l’otite moyenne chronique chez l'enfant et prévenir les récidives d'otites. Cette étude a pour objectif de tester différentes stratégies de réparation tympanique (gel ou patch ou patch+gel, avec ou sans probiotiques) sur un modèle animal afin de trouver la solution la plus adaptée et efficace possible.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels de l’otite moyenne chronique chez l'enfant sont confrontés à plusieurs limitations : résistance croissante aux antibiotiques, accès à des chirurgiens et des centres médicaux experts, procédures coûteuses et longues, risque de complications anesthésiques, inégalité d'accès aux traitements dans les friches médicales et les pays en développement. Compte tenu de la forte prévalence de cette pathologie chez les enfants et de son impact négatif sur la qualité de vie et le développement de ces jeunes patients, il est crucial d'ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à développer un dispositif biomédical pour régénérer le tympan perforé en utilisant des gels et des patchs aux propriétés mucoadhésives et cicatrisantes associés à des probiotiques. Ce projet est particulièrement novateur car il va au-delà de l'état actuel de l'art. À notre connaissance, il n'existe pas de système permettant simultanément l'administration de probiotiques dans l'oreille moyenne et la réparation du tympan. En cas de succès, ce projet serait poursuivi par des études cliniques en collaboration avec des hôpitaux pédiatriques. L'approche probiotique locale pourrait également être proposée en cas de perforation recente dans les pays en développement.
Procédures
Les cobayes seront soumis à différents gestes techniques : une chirurgie sans incision sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes; une mesure de l’audition sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes, répétées 3 fois sur 11 semaines (procédure non douloureuse); des prélèvements du microbiote du conduit auditif et de l’oreille moyenne sous anesthésie générale, répétés deux à trois fois, d’une durée de quelques secondes (procédure non douloureuse); une administration des traitements sous anesthésie générale, par voie locale, d’une durée de 5 minutes; un examen otoscopique du tympan une fois par semaine sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes pendant 11 semaines (procédure non douloureuse).
Impact sur les animaux
Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. La perforation du tympan peut entrainer une douleur faible à modérée qui sera traitée par des antalgiques. Elle peut aussi induire une perte auditive légère. Dans des cas exceptionnels, un écoulement purulent de l’oreille qui marque une infection peut apparaitre.
Devenir
Tous les cobayes seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Des analyses histologiques sur les organes d’intérêt seront réalisées.
Remplacement
L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle cellulaire permettant de reproduire le tympan qui est une membrane séparant deux compartiments aériens. Le seul moyen permettant d’étudier des traitements pour soigner l’otite moyenne chronique impliquant la cicatrisation du tympan perforé reste l’utilisation d’un modèle animal vivant. Le maintien d’une bonne audition est aussi un paramètre primordial et seul l’animal nous permet de mesurer et d’évaluer la fonction auditive. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer des traitements innovants sur la capacité régénérative du tympan et la fonction auditive.
Réduction
Dans chaque groupe, le nombre d’animaux a été fixé afin de s’affranchir des variations individuelles et garantir la validité statistique de l’étude. La mise au point (procédure 1) permettra de valider le modèle de perforation chronique de la membrane tympanique et nécessitera au maximum 25 animaux. Le tympan est une membrane avec des fortes capacités de régénération et un modèle chronique de perforation (> 8 semaines) est difficile à obtenir. Dans la littérature, le pourcentage de succès varie de 0 à 84% selon les études Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui a permis de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Une étude pilote avec un nombre limité d’animaux permettra la mise au point du modèle avant de tester les différents traitements. Un plan d’expérience rigoureux a été pensé afin d’optimiser les groupes expérimentaux et réduire le nombre d’animaux. Si les traitements ne présentaient pas l’efficacité escomptée, la procédure serait arrêtée.
Raffinement
La semaine précédant l’expérimentation, les cobayes seront manipulés afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Chaque geste chirurgical sera court et réalisé sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert. D’après notre expérience, l'altération potentielle de la fonction auditive n'entraine pas de trouble du comportement ni d'agressivité chez le cobaye. Les points limites seront déterminés, à partir d’une grille d’évaluation de l’état général de l’animal, pour détecter une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort et seront strictement appliqués. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les cobayes seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi afin de favoriser des comportements naturels.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le cobaye. C’est une espèce très utilisée dans la littérature en recherche ORL. L’anatomie du tympan est similaire à celle de l’homme et la surface du tympan est adaptée à la réalisation des gestes techniques. Son conduit auditif court permet un accès facile et une bonne visualisation du tympan. Des cobayes adultes, avec un poids entre 300 et 350 grammes seront utilisés. La taille du tympan chez le cobaye adulte est plus adaptée pour ce travail.
Impact des acides biliaires sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, le métabolisme, l’immunité anti-tumorale et la réponse aux immunothérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de la tumeur, du foie, de l'intestin, des ganglions et de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les procédures, elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries et quatre d'acides biliaires, une injection d'un traceur dans un ganglion et une prise de sang finale. L'équipe veut savoir si des acides biliaires déjà présents dans la pharmacopée humaine pourraient restaurer l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez les patients traités par antibiotiques, un bénéfice que le porteur formule au conditionnel. Il dit avoir défini un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe", sans en donner la valeur ni le nombre de groupes qui mène à 8 256 souris.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur.
Bénéfices attendus
Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min).
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.
Etude de pharmacologie (biodistribution, élimination) de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques chez le rat en vue d’une application en oncologie humaine – Étude 3
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent par voie intraveineuse, sous anesthésie, des molécules radiomarquées destinées au diagnostic ou au traitement du cancer, passent deux imageries, puis sont tués pour prélèvement d'organes et comptage de la radioactivité. Le porteur affirme que l'animal est la "seule alternative", un système in vitro ne reproduisant ni circulation sanguine ni excrétion, et justifie le choix du rat par un métabolisme différent de celui de la souris. Le projet sert un industriel qui cherche à écarter les composés à risque avant la suite de son développement.
Objectifs
Lors du développement de nouveaux médicaments et/ou sondes d’imagerie, il est nécessaire d’étudier la façon dont la molécule d’intérêt se distribue et est éliminée de l’organisme. Cette étape permettra de valider qu’un agent diagnostic sera éliminé rapidement de l’organisme sans causer de toxicité ou qu’un composé thérapeutique restera suffisamment longtemps dans l’organisme pour exercer son action. Pour cela, nous avons d’abord vérifié sur culture cellulaire que les composés à étudier n’exercent pas de toxicité. Les composés à étudier ont, d’autre part, déjà été injectés à la souris sans causer d’effets secondaires. Nous allons ensuite procéder au radiomarquage de la molécule (ajout d’un isotope radioactif pour pouvoir la détecter : Indium111 ou lutétium 177) puis au contrôle in vitro sur culture cellulaire de la préservation de l’activité biologique de la molécule suite à ce marquage. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés pharmacocinétiques d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative est l’utilisation d’animaux. L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. L’industriel développant les composés à évaluer dans ce projet a pu remarquer lors de ses développements précédents que certains de ses composés pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris (notamment au niveau des organes excréteurs que sont le foie et les reins). Les métabolismes du rat et de la souris sont très différents, et cette différence de métabolisme induit des différences sur le comportement pharmacocinétique des médicaments. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat (d’autres travaux menés conjointement seront réalisés chez la souris porteuse de tumeur pour identifier des différences de comportement selon les espèces et permettre ainsi une meilleure prédiction du comportement des composés chez l’homme). L’objectif de notre projet vise donc à suivre jusque 5 composés par expérience, chez des rats sains, après administration par voie intraveineuse grâce à l’utilisation de l’imagerie et du comptage de la radioactivité.
Bénéfices attendus
Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de caractériser précisément et simultanément le comportement de 5 composés dans l’organisme afin d’orienter les développements ultérieurs vers le diagnostic ou la thérapie, et d’écarter des composés à risque pour la suite des développements (rétention trop importante dans un organe non ciblé).
Procédures
- Préhension et mise sous anesthésie (3 fois maximum : injection et 2 imageries – quelques secondes) - Injection intrraveineuse d'un agent d’imagerie sous anesthésie (1 fois, quelques minutes) - Imagerie (2 fois, 45 minutes maximum par imagerie)
Impact sur les animaux
La préhension pour induction de l’anesthésie pourrait causer un certain stress aux animaux. Les injections, imageries et euthanasies seront réalisées sous anesthésie par du personnel expérimenté et ne devraient pas provoquer de nuisances supplémentaires. Les composés à tester ont déjà été injectés à l’animal (à une dose supérieure à celle que nous utiliserons) et n’ont pas provoqué d’effet secondaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Le prélèvement des organes étant nécessaire pour réaliser des analyses complémentaires et affiner les résultats d’imagerie par comptage précis de la radioactivité, l’euthanasie des animaux est inévitable.
Remplacement
Les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum (n=3 par groupe et par temps). Le nombre d'animaux a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide d'une analyse statistique.
Raffinement
Les gestes de ce projet (injection, imagerie, euthanasie) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux seront observés quotidiennement et le suivi pondéral sera réalisé 2 fois par semaine. Aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de l’euthanasie.
Choix des espèces
L’espèce de choix pour l’étude de la biodistribution est le rongeur. L’industriel développant les composés à évaluer dans ce projet a pu remarquer lors de ses développements précédents que certains de ses composés pouvaient avoir un comportement différent chez le rat et la souris. De plus le métabolisme du rat est différent de celui de la souris et plus proche de l'homme pour les molécules étudiées. C’est pourquoi le présent projet sera mené chez le rat. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge), puisque les études prévues par la suite seront réalisées sur des animaux adultes présentant un cancer.
Conditionnement Pavlovien trans-Générationnel (CpG)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
168 lapins vont être utilisés, gardés en engraissement à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis à un conditionnement pavlovien qui associe un son à un stimulus aversif déclenchant une fuite, répété jusqu'à ce que le son seul provoque la réaction. Le porteur indique qu'un stress est attendu, jugé nécessaire au conditionnement, et affirme qu'aucune autre intervention n'est pratiquée. Il présente comme retombée la possibilité de transmettre aux portées un comportement appris utile à la conduite d'élevage, une application zootechnique plus qu'un objectif de connaissance.
Objectifs
Jusqu’à présent, la recherche des causes génétiques de la variabilité des caractères a été réalisée sous l’hypothèse d’un déterminisme génétique additif simple. Cependant, les connaissances sur l’hérédité des caractères ne cessent de progresser. Par exemple, nous savons aujourd’hui que les interactions gène x environnement joue aussi un rôle non négligeable dans l’expression des phénotypes des animaux. De plus, la question de l’influence des paramètres transmissibles non génétiques commence à être traitée, principalement via les nouvelles connaissances sur l’importance des mécanismes épigénétiques dans la variabilité des caractères. Afin d'en évaluer l'importance, des dispositifs expérimentaux dédiés doivent être mis en place. Le présent projet, qui utilise le lapin comme modèle d’étude, vise à créer un modèle de transmission non génétique des caractères qui pourra servir de base à ces recherches. Le principe de ce projet est d’utiliser le concept de conditionnement classique proposé par Ivan Pavlov, afin de créer un réflexe conditionné chez le lapin en prenant en considération les contraintes d’élevage et les connaissances comportementales de cette espèce. Le conditionnement de Pavlov apparaît lorsqu'un stimulus neutre (SN) est présenté un peu avant un stimulus inconditionnel (SI). Le SI est choisi pour être aversif pour l’animal, qui aura pour réflexe de se cacher (Reflexe Inconditionnel RI). A force de répéter cette présentation (SN+SI), le stimulus neutre finira par déclencher le comportement avant l’apparition du stimulus inconditionnel. Ce réflexe (dans notre cas la fuite de l’animal face à un stimulus neutre) peut être vu comme un caractère acquis. Dans une précédente expérimentation nous avons testé plusieurs stimuli pour choisir le meilleur pour l’acquisition d’un « réflexe conditionné »: Le SI retenu est un court choc électrique et le SN un son ambiant de 1 kHz. Il nous reste à (i) en évaluer l’apprentissage, et à (ii) quantifier sa transmission à la génération suivante.
Bénéfices attendus
Selon les résultats obtenus, plusieurs retombées peuvent être envisagées à l’issue de ce projet. Sur le plan génétique, ces résultats permettront de revisiter la façon de prendre en compte dans des études génétiques, la transmission d'un caractère acquis (évolution des modèles d’évaluation avec une prise en compte de la composante épigénétique). Dans le cadre des travaux réalisés pour répondre aux besoins de diversification des systèmes d'élevage et des pratiques associées, les résultats permettront d’envisager de prédisposer les petits à certains comportements adaptés à une conduite d’élevage via la transmission d’un caractère appris aux parents. Dans le cas du conditionnement testé dans le projet il pourrait permettre de rassembler des animaux dans un bâtiment grâce à la diffusion du son utilise comme SN chez les parents.
Procédures
Aucune intervention autre que le conditionnement n'est prévu sur les animaux.
Impact sur les animaux
Dans un premier temps, un stress est attendu. Ce stress va permettre le conditionnement des animaux face au stimulus neutre. Aprés l'expérimentation, les animaux ne seront soumis à aucun stimulus faisant partie de l'expérimentation et ne seront donc plus soumis à aucun stress inhérent à celle-ci.
Devenir
Tous les animaux seront conservés en engraissement.
Remplacement
Le recours aux animaux est indispensable dans la mesure où ce projet vise à étudier la transmission d’un caractère acquis chez les animaux d’élevage. Le statut de proie du lapin et son comportement associé est un levier fondamental du comportement du lapin, particulièrement adapté à notre expérimentation.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire au total pour cette expérimentation est de 168. - 8 animaux afin de choisir l'intensité du stimulus minimum générant le retrait des animaux. - 8 autres animaux afin de valider un protocole expérimental répétable. - 40 animaux (G0) sont ensuite nécessaires : avec un taux de réussite de conditionnement supérieur à 50%, cela permettra de disposer de 10 mâles et 10 femelles pour constituer 10 accouplements d’animaux conditionnés à l’issue de cette phase. - 112 animaux (56 G1 et 56 naïfs) seront nécessaires pour des raisons de puissance statistique afin de comparer les deux groupes d’animaux.
Raffinement
Aucun prélèvement ne sera fait dans le cadre de ce projet sur les animaux. L’isolement des animaux en cage individuelle sera limité à la stricte période du conditionnement (pour les animaux G0) ou de son évaluation (pour les descendants G1). Les animaux seront positionnés dans les logements du test 24h en amont du test afin qu’ils s’habituent et découvrent leurs nouvelles conditions de logement (la zone de vie Z1 avec distributeur d’eau et de nourriture et bois à ranger et la zone isolée Z2). Une fois les animaux conditionnés, ceux- ci ne subissent pas le stimulus aversif (SI) étant donné que le stimulus neutre (SN) seul provoque le retrait de l’animal en Z2. La mesure du conditionnement sera automatisée grâce à une caméra en dehors de la cage, ce qui permettra de limiter les contacts de l’expérimentateur avec les animaux, et les possibles interférences que cela peut occasionner sur le comportement des animaux.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce d’élevage qui est aussi une proie. Ce statut de proie fait que le lapin est naturellement prédisposé à repérer les situations potentiellement dangereuses et à avoir une attitude de fuite, facilement détectable. De plus, c’est dans cette espèce que les études des mécanismes moléculaires sous-jacents à la transmission non génétique du comportement seront ensuite développées. Finalement, les conditions d’élevage du lapin, en cage, sont idéales pour la mise en place de ce type de protocole. Nous utiliserons des animaux d'au moins 6 semaines d'âge et au maximum âgés de 10 semaines. A cet âge, les animaux sont sevrés mais ne sont pas encore en conduite de reproduction. Nous évitons ainsi le stress des animaux lors du sevrage. De plus, les cages lors de la conduite de reproduction sont différentes des cages utilisées lors de l’engraissement, il n’est donc pas pertinent de tester le dispositif sur ces animaux.
Étude métabolique et fonctionnelle en imagerie in vivo d’un modèle de gliomes chez la souris (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines de glioblastome dans le cerveau par chirurgie, puis passent trois séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses post-mortem. Le porteur indique que l'injection peut provoquer une neuroinflammation, un état fébrile, une perte d'appétit et une léthargie pendant une douzaine d'heures. Les bénéfices avancés, un biomarqueur d'imagerie utile pour évaluer de futures thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont renvoyés au conditionnel.
Objectifs
Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquente. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelée IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie pat tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure afin de permettre des analyses post-mortem in vitro. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.
Remplacement
Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en blocs expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en blocs (de 5 à 7 souris s) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque bloc. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultrasons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonore est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.
Développement du cancer colorectal chez le rat : analyse de la contribution du microbiote intestinal dans l’effet du régime alimentaire.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous-cutanée, un gavage de microbiote humain et une injection d'azoxyméthane, un composé cancérigène destiné à déclencher des lésions précoces du côlon, puis subissent trois prélèvements de fèces avant d'être tués pour analyse. Le porteur décrit ces gestes comme générant un stress et une douleur "minimes" et affirme que l'injection du cancérigène n'engendrera pas de douleur. Les retombées annoncées, une piste nutritionnelle contre le cancer colorectal moins coûteuse que le médicament, restent formulées comme une possibilité.
Objectifs
Le risque de cancer colorectal (CCR) est fortement affecté par l’alimentation, avec un risque augmenté par la consommation de viande rouge et un risque réduit par un régime pesco-végétarien (sans viande mais avec des oeufs et des produits laitiers en plus des végétaux, auquel on ajoute des produits de la mer comme les poissons, les crustacés et les mollusques). Le projet porte sur l’étude de la contribution du microbiote intestinal dans ces effets de l’alimentation sur le risque de CCR.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle du microbiote intestinal en lien avec le régime alimentaire dans le développement du cancer colorectal, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour favoriser un microbiote limitant le risque de cancer colorectal. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.
Procédures
- 1 implantation sous-cutanée d’une puce électronique destinée à identifier les rats de manière unique et pérenne (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes. - 1 gavage unique de microbiote humain dilué (1 ml) (rats vigiles, tous les rats), durée : 10 secondes - 1 injection intra péritonéale unique d’un composé cancérigène (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes - 3 prélèvements de fèces (2 semaines après l’inoculation, à 7 semaines, et à 14 semaines après l’inoculation). Pour cela, chaque rat est placé quelques minutes dans un grand pot en plastique transparent ; les rats émettent spontanément et rapidement les 1-2 crottes nécessaires (rats vigiles, tous les rats)
Impact sur les animaux
Le projet porte sur les liens entre alimentation, microbiote intestinal et cancer colorectal. Il est donc attendu que les rats présentent, suite à l’injection d’azoxyméthane, une augmentation des marqueurs de cancérogenèse au niveau du côlon. Toutefois, il s’agit d’une procédure établie pour étudier les stades précoces de la cancérogenèse (foyer de cryptes aberrantes, lésions prénéoplasiques…) qui n’engendreront pas de douleur. Les interventions sur les animaux seront d’une part l’inoculation des microbiotes par gavage et d’autre part l’injection intra-péritonéale d’une solution tamponnée d’azoxyméthane. Ces gestes sont assurés par des personnels expérimentés et généreront un stress et une douleur minimes. LLes prélèvements fécaux n’occasionneront que peu de stress ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques associés au développement du cancer colorectal.
Remplacement
A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote et de l’alimentation sur le cancer colorectal nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique suffisamment sophistiquée pour le remplacer.
Réduction
Nous utiliserons 10 rats par groupe. Notre expérience, et celle d’autres groupes de recherche, dans l’étude de l’effet du régime alimentaire et/ou du microbiote intestinal sur la cancérogenèse colique, indique qu’un effectif de 10 rats par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En particulier, les résultats obtenus lors d’un protocole similaire (mais avec transfert de microbiotes de rats) ont montré que ce nombre d’animaux permettait de mettre en évidence des effets du microbiote sur certains marqueurs de la cancérogenèse.
Raffinement
La solution du composé cancérigène est préparée de façon à ce qu’elle évite une douleur au point d’injection. Il n’y aura pas d’autres manipulations provoquant de la douleur pendant cette procédure, et l’étude est arrêtée au stade de lésions précancéreuses qui ne provoquent pas de douleur. Tous les rats auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l'ajout de feuilles de cellulose (pour faire le nid), d'un bâton de bois à ronger et des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper. Les rats seront 2 par cage pour éviter l'isolement et auront libre accès à la nourriture et à l'eau. Tous les rats recevront de l'eau stérilisée à l'autoclave et un régime alimentaire standard irradié.
Choix des espèces
Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est l’injection unique d’un composé cancérigène qui a l’avantage de provoquer des stades précoces du cancer colorectal comparable à la situation humaine. Nous utiliserons des rats adultes, âgés de 5 semaines au début de l’expérimentation, l’objectif étant d’étudier la relation alimentation-microbiote-cancer colorectal chez l’adulte.
Impact de la cryothérapie sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique
- Recherche appliquée
- Cancers
8 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux étant opérés sous anesthésie sans réveil. Les six autres subissent une chirurgie cérébrale d'une heure puis des IRM hebdomadaires sous anesthésie de deux heures pendant six à huit mois, pour suivre l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique après cryothérapie. Le porteur signale des effets liés aux anesthésies répétées et à la chirurgie du cerveau, œdème cérébral, déficit moteur, vomissements et céphalées, avant mise à mort pour analyser les tissus. Il justifie le recours au porc par un cerveau proche de celui des primates et présente ce modèle comme préparant un "transfert rapide" vers un essai clinique.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale maligne primitive la plus fréquente et est extrêmement agressif. Actuellement, le traitement de référence est une chirurgie pour enlever la zone tumorale si elle est accessible, accompagnée par une radiothérapie puis une chimiothérapie. Malgré un traitement bien conduit, tous les patients présentent une récidive tumorale locale ou régionale. Forts d’une première étude ayant démontré un gain important dans la survie des patients traités par cryothérapie, nous souhaitons affiner la compréhension des mécanismes en jeu et plus spécifiquement, l’impact de la cryothérapie sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), véritable muraille protégeant le cerveau mais bloquant l’arrivée des molécules thérapeutiques. En effet, lors de notre étude clinique, la BHE des patients s’est révélée fragilisée. Or, l’ouverture de la BHE représente un facteur important d’amélioration du pronostic des patients en permettant l’arrivée des médicaments dans le cerveau et donc aux cellules tumorales. Dans ce contexte, notre objectif consiste tout d’abord à confirmer cette ouverture de la BHE par la cryothérapie cérébrale sur un modèle porcin, puis, dans un second temps, de déterminer le délai d’ouverture de la BHE qui offrirait une fenêtre thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et déterminer la durée de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique suite à une cryothérapie, offrant une fenêtre thérapeutique pour l’administration de chimiothérapies dans le traitement de tumeurs cérébrales. Le protocole défini pour ce projet se rapproche au maximum des conditions chez le patient, aussi bien pour la chirurgie que pour le suivi mini-invasif utilisant l’IRM, préparant un transfert rapide vers un essai clinique. Ainsi, une étude clinique prospective rentrant dans le cadre d’un programme hospitalier de recherche clinique (PHRC) pourrait ensuite être réalisée afin d’évaluer l’efficacité de la cryothérapie cérébrale sous IRM combinée à un traitement adjuvant chez des patients atteints d’une récidive de glioblastome.
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale initiale d’une heure sous anesthésie générale, puis à des examens IRM hebdomadaires sous anesthésie de deux heures pour suivre sur 6 à 8 mois le statut de la barrière hémato-encéphalique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant survenir sont liés aux anesthésies répétées (stress, nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale) et à la chirurgie cérébrale (inflammation de la plaie, œdème cérébral, déficit moteur controlatéral, vomissements et céphalées).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus cérébraux qui complètera les données IRM sur l'état de la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Ce projet fait suite à une étude clinique démontrant le fort intérêt thérapeutique d’utiliser ce traitement innovant chez des patients atteints de glioblastome en récidive. Le but étant la validation de l’ouverture de la BHE par la cryothérapie, nous devons travailler dans un tissu vivant sain afin de soustraire tout effet de la pathologie sur l’intégrité de la BHE. Par conséquence, nous ne pouvons éviter à ce jour l’utilisation d’un modèle animal. Préalablement aux études in vivo, la mise au point de la chirurgie est validée sur cadavre de porc afin d'adapter le protocole aux variations anatomiques et de réduire à moins de 2 cm l'ouverture nécessaire pour l'insertion de la sonde de cryoablation.
Réduction
Il s'agit d'une preuve de concept. Le nombre d’animaux ainsi que leur répartition entre les procédures ont été estimés au plus juste pour répondre à notre problématique. Le protocole d’une procédure dépendra du résultat de la précédente. L’usage de l’IRM, méthode non invasive et non irradiante utilisée en clinique pour observer l’intégrité de la BHE nous permettra de suivre un même animal au cours du temps et ainsi de limiter les effectifs requis.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiance sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés pour être transportés sans stress dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant la chirurgie et l’acquisition d’images IRM. Suite à la chirurgie, les animaux sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et tous les jours suivant l’intervention. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Une videosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Des points limites sont définis pour détecter les signes précoces d’une détérioration et arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Le cerveau circonvolutionné du porc ressemble davantage au cerveau des primates que le cerveau lissencéphale (cortex lisse, sans circonvolutions) des rongeurs, et la littérature rapporte le modèle porcin comme pertinent dans de nombreuses approches en neurosciences notamment dans l’étude de la BHE. L’accès à un modèle de grande taille est nécessaire pour reproduire la cryothérapie chez le patient. Le volume et l’anatomie du cerveau de jeunes porcs de 30 à 50 Kg répondent à cette limitation et permettent d’envisager la survie l’animal dans de bonnes conditions.
Modulation métaboliques et transcriptionnelles dans la rétine au cours du processus neurodégénératif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour étudier les atteintes de la rétine dans des maladies neurodégénératives. Elles subissent des prélèvements de larmes, des injections intrapéritonéales et des injections dans l'œil de vecteurs viraux sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le système nerveux central. Le porteur indique que l'injection dans l'œil provoque une douleur locale et une sécheresse oculaire, traitées par gel et antalgique, et que les modèles de Parkinson restent asymptomatiques sur la période étudiée. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable, tout en prévoyant d'approfondir ensuite les analyses sur des cultures de rétine.
Objectifs
L'impact des handicaps visuels (atrophies optiques, glaucome, dégénérescence maculaire) s’accroît dans nos pays développés avec l’augmentation de la communication visuelle et le vieillissement de la population. Des déficiences du système visuel sont également retrouvées dans des pathologies neurodégénératives, qu’elles ciblent directement le système visuel comme dans le cas de l'Atrophie Optique Dominante (AOD), ou indirectement comme la Maladie de Parkinson (MP). En effet, la patients atteints de MP subissent des troubles visuels très précocement, avant même l’apparition des premiers symptômes moteurs. De ce fait, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires expliquant ces défaillances visuelles pourrait permettre de déterminer des facteurs prédictifs ou pronostiques de l'évolution de ces pathologies. L’AOD et la MP ont des étiologies très différentes mais présentent toutes 2 des troubles dans la physiologie de la rétine et/ou du nerf optique, liées à des défauts de l’activité des mitochondries. Ces dysfonctions mitochondriales produisent un stress cellulaire auquel les cellules tentent de répondre en modifiant leur activité métabolique et ceci passe par une reprogrammation de l’expression de certains gènes. Ainsi, notre projet vise à étudier le remodelage métabolique et transcriptionnel de la rétine et du nerf optique au cours de l’évolution des processus dégénératifs dans le but d’étudier la sensibilité particulière de la rétine dans le processus neurodégénératif et de déterminer de potentiels biomarqueurs pronostiques précoces pour ces pathologies.
Bénéfices attendus
Notre projet, validé par différentes instances scientifiques et financeurs, permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes physiopathologiques de ces maladies, notamment dans leurs étapes précoces impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux dans les neurones. Nos résultats permettront également de définir des biomarqueurs pronostiques précoces, voire des cibles thérapeutiques pour ces pathologies pour lesquelles il n’existe encore à l’heure actuelle que très peu de prise en charge.
Procédures
Les animaux seront soumis à (1) des prélèvements non-invasifs sur animaux vigiles (larmes), de facon hébodmadaire tout au cours de lexpérimentation - ces prélèvements sont réalisés à l'aide de papier buvard (30 secondes) ; (2) injections intrapéritonéales sur animaux vigiles (1ml/100g, 5 secondes) ; (3) des procédures chirurgicales sous anesthésie : injections intravitréennes de vecteurs viraux (2ul, 1 min). Tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Les injections intravitréennes de vecteurs viraux induisent une douleur locale et transitoire qui sera gérée par l’application de d’un antalgique oculaire juste après l’injection. Une sécheresse oculaire peut également être observée dans les 2 à 3 jours qui suivent l’injections. Nous appliquerons systématiquement et quotidiennement un gel lubrifiant sur les yeux des souris les 3 premiers jours après l’injection. Les modèles de Parkinson que nous utiliserons dans ce projet sont asymptomatiques pour les périodes étudiées, les souris ne devraient donc pas présenter de stress, douleur ou de souffrance particulière en dehors des procédures d’injection et chirurgie, qui seront elles réalisées sous analgésie/anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanisés en fin de procédure car les études porteront sur les tissus frais du système nerveux central.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies et des interactions cellulaires impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Néanmoins, une fois que nous aurons validé ces points chez l’animal, l’analyse des mécanismes moléculaires sera approfondie à partir de cultures organotypiques de rétines murines que nous avons également mis en place au laboratoire.
Réduction
Nous planifierons chaque expérience pour minimiser le nombre d’animaux tout en permettant une analyse statistique fiable de nos résultats. Pour le modèle d’AOD, la déplétion d’OPA1 induite avec une injection de vecteur viral sera réalisée sur un œil, tandis que l’autre œil recevra le vecteur contrôle, minimisant ainsi à la fois le nombre de souris et le risque de variabilité inter-groupes. Les modèles d’induction de Parkinson choisis ont été déjà validés par nous-mêmes et nos collaborateurs et nous savons que des groupes de 5 souris sont en général suffisants pour pouvoir exploiter les résultats. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi rapproché quotidien des animaux dès l’initiation des différents modèles. Ce suivi nous permettra d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée et l’animal euthanasié en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences tenus à jour des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour le développement de ces modèles pathologiques du fait de son faible coût, de sa facilité de manipulation et de son adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour être déficients en Foxo3 ou exprimer une sous unité ribosomique taguée qui n’existent que chez la souris. Enfin, les caractéristiques des modèles de MP et d’AOD utilisés dans ce projet ont été établis chez cet animal, et nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc ...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
402 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester une phéromone censée augmenter leur production de mucus protecteur. Elles sont exposées au produit pendant sept jours, avec une intrusion quotidienne du bras de l'opérateur dans le bac et quatre captures à l'épuisette, avant mise à mort pour prélever peau, branchies et tube digestif. Le projet vise à limiter le recours aux médicaments en pisciculture en renforçant les défenses naturelles des poissons d'élevage. Le porteur affirme que le remplacement est impossible car la réponse à une stimulation sensorielle exige un "organisme entier".
Objectifs
Les deux espèces de salmonidés les plus couramment produites en pisciculture, sont le saumon Atlantique (Salmo salar) et la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Il ne s’agit pas, à proprement parler, d’espèces domestiques, mais plutôt de poissons en cours de domestication. En dépit de la sélection basée notamment sur la recherche de souches moins farouches, ces poissons continuent à présenter des réactions de stress très intenses, aigües, mais aussi chroniques, ayant des conséquences physiologiques importantes, parmi lesquelles on note des altérations des défenses spécifiques et non-spécifiques contre les infestions. Ces perturbations sont à l’origine de nombreuses infections bactériennes, virales, fongiques et parasitaires, qui conduisent à l’emploi de différents xénobiotiques (antibiotiques, antiparasitaires, antifongiques, antiseptiques divers), mais aussi de traitements physiques préjudiciables pour le bien-être des poissons. La phéromone SNAP (Salmon Nest Appeasing Pheromone) augmente l’activité des cellules à mucus de la peau et du tube digestif, entraînant une augmentation de la production de mucus, une augmentation de l’activité enzymatique mesurée dans celui-ci et de l’expression de certains gènes par la peau, impliqués dans le métabolisme et le stress oxydatif, mécanismes qui pourraient être à la base d’une meilleure barrière naturelle (immunité non-spécifique) et d’une meilleure protection contre les micro-organismes et pathogènes. L’objectif de ce programme est de préciser les modalités d’action de cette phéromone et de ses analogues structuraux, chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) et de mesurer sa capacité à optimiser leur état de santé et leurs défenses naturelles en élevage, afin de limiter le retour aux traitements médicamenteux. En particulier, plusieurs paramètres relatifs à l’immunité et à la composition du mucus au cours du temps en fonction des traitements seront évalués.
Bénéfices attendus
Chez les poissons, le mucus cutané et le mucus digestif jouent un rôle de premier plan dans la défense contre les infections. Les résultats précédemment acquis permettent d’espérer une activation des glandes à mucus, avec production d’un mucus plus riches en enzymes comme les chitinases, ou les peroxydases, qui jouent un rôle important dans la protection contre le pou de mer et différents autres pathogènes. La validation de la SNAP permettrait de proposer ce traitement naturel et dépourvu de toxicité, tant pour les poissons, que pour le consommateur et l’environnement, comme alternative aux solutions actuelles. Le contrôle de ces infections et infestations constitue une cause importante de souffrance pour les salmonidés en pisciculture.
Procédures
Les truites seront exposées au traitement (phéromone apaisante de salmonidés) pour une durée de 7 jours. De plus, l'administration du traitement entraîne l'intrusion du bras de l'opérateur dans les bacs d'essai une fois/jour (durée estimée de l'intervention à environ 15 sec.).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont les suivantes : 1) Stress causé par le changement de lieu de vie (passage des bacs d’élevage aux bacs expérimentaux) au tout début de la procédure; 2) Stress lors de l’administration des traitements via l’intrusion du bras dans le bac qui vient administrer le traitement une fois par jour (dure environ 15 sec.); 3) Stress lors de la capture à l’épuisette des animaux dans les bacs aux différents temps de prélèvements. Ce stress est de courte durée, qui ne sera appliqué que 4 fois au cours de l’étude.
Devenir
La nature des prélèvements de tissus effectués, en particulier les prélèvements de patchs de peau, de branchies, de tubes digestifs, en vue de la mesure des paramètres choisis pour l'étude (analyses histologique et transcriptomiques) ne permettent pas de laisser les animaux en vie. C'est pourquoi ils nécessitent la mise à mort des animaux et sont effectués post-mortem pour éviter toute souffrance/douleur irrémédiable de l'animal.
Remplacement
Il s'agit d'une étude de recherche fondamentale investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante libérée lors de l’éclosion des alevins (SNAP). En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement sémiochimique est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle.
Réduction
Afin de réduire le nombre de sujets nécessaires à la mise-en-évidence de l’efficacité des différents analogues potentiels, nous avons préalablement mené une étude du pharmacophore de SNAP par bioinformatique, ce qui a permis de cribler ses analogues potentiels par analyse de similarité et de réduire leur nombre à 3 à tester in vivo. Des tests statistiques de calcul de taille d’échantillons nécessaires pour révéler un effet traitement significatif à une puissance statistique de 80% ont été réalisés à partir des données scientifiques disponibles, obtenues lors d’études préliminaires sur des tissus de saumons abattus dans le cadre de la production, en Norvège. Ils montrent que le paramètre principal de notre étude (nombre de cellules à mucus par mm2 de peau) requiert un minimum de 3 sujets par point de prélèvement, pour pouvoir mettre en évidence des différences significatives. Compte tenu du nombre de groupes-traitements, on peut optimiser les chances de mettre en évidence des différences avec 6 sujets par point de prélèvement. De même, pour l’étude des effets sur les modifications de la composition du mucus, nous nous sommes appuyés sur les résultats d’analyses préliminaires de mucus de saumons, récupérés après abattage en Norvège. L’analyse statistique des variations de concentration des enzymes d’intérêt, montre qu’il est nécessaire de disposer des prélèvements de 10 sujets. Les prélèvements de peau pour l’analyse histologique et les prélèvements de mucus cutané (par raclage de la peau) pour l’analyse enzymatique ne pouvant être réalisés sur les mêmes animaux (la couche de mucus et la couche de peau doivent être intacts pour la qualité des résultats d’histologie), cela porte le nombre d’animaux à 16 par traitement et par point de prélèvement, soit un total de 384 truites. Également, un surplus de seulement 3 animaux par bac de traitement a été décidé tout au long de l’étude, pour pallier d’éventuelles pertes d’animaux au cours de l’essai, amenant le nombre total de truites à 402.
Raffinement
Au cours de la procédure, les poissons sont hébergés dans des bacs d’expérimentation disposant d’un courant d’eau continu (douce pour les truites, issue d'une rivière, à la température optimale pour les truites). La rivière possède une eau de grande qualité et abrite naturellement plusieurs espèces de salmonidés. Les bacs d’expérimentation seront recouverts de filets sur leurs ouvertures supérieures pour éviter les attaques de prédateurs. Le circulation de l’eau s’effectue à un débit adapté et avec une qualité appropriée pour l'espèce, assurant un renouvellement de l’ensemble de l’eau du bac d’expérimentation en moins de 20 minutes. La capacité du bac et la masse totale de truites par bac permettent de garder la densité des poissons sous le seuil défini dans la littérature comme risquant de compromettre le bien-être des truites. Le taux d’oxygène dissous dans l’eau des bacs sera mesuré régulièrement pour tenir compte des variations naturelles du taux d’oxygène de la rivière alimentant les bacs d’expérimentation sous l’effet de la photosynthèse. En complément, une alimentation en oxygène sera apportée dans chacun des bacs pour y garantir un niveau conforme aux recommandations du pisciculteur fournissant les animaux et aux indications de la littérature. De même, afin de perturber le moins possible les animaux, les truites seront nourries dans les mêmes conditions que celles pratiquées préalablement par le pisciculteur : même aliment (granules solides commerciales identiques à celles utilisées par le fournisseur), selon la même fréquence et la même quantité. Les manipulations susceptibles d’entraîner un stress majeur ou une douleur/altération physique sont réalisées post-mortem. Les manipulations réalisées avant la mise à mort ne sont de nature qu’à engendrer un stress de faible intensité, atténué de surcroit par la mise en place d’une période d’habituation et des évènements stressants de courte durée (capture) réalisés que 4 fois au cours de la procédure. La durée totale de la procédure est elle-même courte (9 jours au total).
Choix des espèces
La Truite arc-en-ciel : Oncorhynchus mykiss. Il s’agit d’une des espèces de salmonidés les plus massivement produits en aquaculture. C'est l'espèce même ciblée par le traitement phéromonal SNAP. Les truites utilisées sont âgées de 12 à 18 mois, d’environ 250 à 350 g (« taille portion ») : cet âge est imposé par le pisciculteur, pour ne pas déranger sa conduite d’élevage. Ce stade est compatible avec la mesure des paramètres histologiques de la peau et du tube digestif, des mesures de caractérisation biochimique et transcriptomique du mucus, puisque permettant de prélever des échantillons en quantité suffisante pour réaliser toutes ces analyses.
Étude de l’impact du biallélisme Tlr7 sur l’immunité humorale protectrice lors de la vaccination contre la grippe H1N1 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.
Objectifs
La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.
Bénéfices attendus
Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.
Procédures
prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure
Impact sur les animaux
Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure
Remplacement
Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)
Réduction
Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).
Raffinement
Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).
Choix des espèces
Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance