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Étude de l’efficacité d’un anticorps monoclonal dans un modèle génétique de cholangite sclérosante primitive partiellement humanisée

(NTS-FR-621705v1 – 15/06/2023)

Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux

Souris : 92

Souffrances

▲ -

▲ 46

Devenir

92 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La moitié reçoit 24 injections et 4 prises de sang sur douze semaines, l'autre moitié 92 injections, 6 prises de sang et une échographie hépatique mensuelle sur quarante-six semaines, dans un modèle de cholangite sclérosante primitive partiellement humanisé pour évaluer un anticorps. Le porteur indique que la maladie provoque fibrose des voies biliaires et tumeurs, que la perte de poids peut atteindre 30 % et que les prises de sang répétées peuvent entraîner une cécité, la souffrance cumulée étant classée sévère. Le bénéfice avancé, un traitement pour une maladie sans option en dehors de la greffe, reste présenté comme un objectif de recherche.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'efficacité d’un anticorps monoclonal dans un modèle de souris génétiquement modifié de cholangite sclérosante primitive. La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires du foie qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La CSP est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés par la CSP, il n’existe actuellement aucun autre traitement pour cette maladie. Il est donc urgent de développer de nouveaux traitements pour la CSP. Ce modèle génétiquement modifié est reconnu dans la littérature comme un modèle fiable pour la cholangite sclérosante primitive et sera croisé avec des souris transgéniques exprimant une protéine partiellement humanisée afin d'obtenir un modèle hautement pertinent permettant une fixation optimale de notre anticorps sur sa cible. Ces souris génétiquement modifiées développent spontanément une fibrose biliaire en quelques mois. De plus, elles développent spontanément des nodules du foie en 7 à 12 mois, qui évoluent en tumeurs hépatiques à l'âge de 16-18 mois. Ainsi, l’objectif de ce projet est d'évaluer les effets d’un anticorps monoclonal sur le développement de la fibrose biliaire et sur l’apparition de nodules chez ces souris humanisées et génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Le projet permettra l'évaluation des effets d'un anticorps thérapeutique sur un modèle très pertinent de cholangite sclérosante primitive, une maladie chronique du foie pour laquelle il n'existe actuellement aucune option thérapeutique, à l'exception de la greffe du foie.

Procédures

46 animaux du projet seront soumis à : - 2 injections par semaine pendant 12 semaines, d’une durée de moins d’une minute, pour un total de 24 injections par animal - 1 prise de sang toutes les 4 semaines, sous anesthésie générale, d’une durée d’une minute, pour un total de 4 prises de sang par animal 46 animaux du projet seront soumis à : - 2 injections par semaine pendant 46 semaines, d’une durée de moins d’une minute, pour un total de 92 injections par animal - 1 prise de sang tous les 2 mois, sous anesthésie générale, d’une durée d’une minute, pour un total de 6 prises de sang par animal - 1 échographie du foie par mois à partir de l’âge de 7 mois, sous anesthésie générale, d’une durée de 10 à 15 minute, pour un totale de 5 échographies par animal.

Impact sur les animaux

Les souris Mdr2KO-m/hCLDN1développent spontanément une maladie hépatique caractéristique de la cholangite sclérosante primitive avec dépôt de tissu cicatriciel (fibrose) et apparition de tumeurs des voies biliaires. A un stade avancé, l’apparition de tumeur et la dégradation du foie peuvent mener à une perte de poids allant jusque 30%. Stress physique et détresse sont attendus lors de la manipulation et de la contention nécessaires aux injections. Les animaux peuvent développer une induration ou une ulcération sur le site d’injections répétées. Les prises de sang peuvent entraîner l’apparition d’une cécité. Détresse et stress physique d’intensité légère sont attendus lors de la manipulation des animaux avant la réalisation des gestes échographiques. L’échographie est non invasive et n’entrainera pas de douleur. L’apparition des tumeurs des voies biliaires, ainsi que la répétition fréquente des gestes pendant 3 à 12 mois peuventcauser une souffrance cumulée de degré sévère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le sang et le foie des animaux afin d'analyser l'effet thérapeutique de notre anticorps.

Remplacement

Plusieurs stratégies de substitution ont été mises en place afin de réduire au minimum le recours à l'expérimentation animale. Par exemple, les essais sur des modèles in vitro sur des cultures cellulaires sont privilégiés pour générer des hypothèses scientifiques. Cependant, la validation de ces dernières nécessite le recours à l'expérimentation animale en raison de sa complexité majeure. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe de la cholangite sclérosante primitive. Un protocole analgésique sera mis en place en cas de signes de douleur.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant d’arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée auparavant en se basant sur les résultats de plusieurs expériences publiées dans la littérature.

Raffinement

Afin d'affiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L'environnement des animaux est enrichi avec des tubes en coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Des points limites précoces ont été établis pour interrompre la procédure de manière précoce, permettant de soustraire les animaux à la souffrance si nécessaire. Une méthode d'anesthésie et d’analgésie est utilisée lors de la prise de sang et en cas d’apparition de signes de souffrance. Les animaux sont observés quotidiennement. Ils auront accès sans restriction à la nourriture et à l'eau pendant toute la durée de l'expérience. Les animaux seront hébergés par groupes de trois minimum dans des cages ventilées.

Choix des espèces

Ces souris génétiquement modifiées sont considérées dans la littérature comme le modèle le plus pertinent pour étudier la cholangite sclérosante primitive. Les souris seront utilisées entre l’âge de 6 semaines et de 12 mois, pour les traiter au fil du spectre entier de la pathologie, depuis l’activation précoce de la fibrose du foie jusqu’au développement de nodules.

Développement d’un modèle d’excès de minéralocorticoïdes chez le chat

(NTS-FR-387594v1 – 15/06/2023)

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- Maladies animales

Chats : 16

Souffrances

▲ -

▲ 2

▲ 14

▲ -

Devenir

16 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous gardés en vie et réutilisés à l'issue. Ils reçoivent une molécule provoquant un déséquilibre en sels minéraux, subissent des ponctions de la vessie sous échographie, jusqu'à neuf prélèvements de sang en vingt-quatre heures et un isolement avec mise à jeun. Le porteur reconnaît un stress lié à l'isolement et à la contention, ainsi qu'une possible douleur aux ponctions et aux sites de prélèvement. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit ces désordres urinaires et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal "dans son ensemble", pour un modèle destiné à un produit vétérinaire.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d'évaluer les effets d'une molécule A à différentes doses et de comparer cet effet aprés la prise d'une molécule B chez le chat. L'effet de la molécule A se traduit par un désordre dans les électrolytes sodium /potassium présents dans des échantillons d'urines. Ce désordre d'électrolytes dans les échantillons d'urine sont également présents dans les pathologies cardiaques comme les cardiomyopathies. L'objectif est donc de trouver un modèle fiable pour soigner certaines pathologies cardiaques chez le chat

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir développer un modèle fiable et reproductible d'excés en minéralocorticoïd ches le chat. Ce modèle pourra être utilisé dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le traitement de certaines maladies cardiaques chez le chat.

Procédures

Les nuisances ou effets indésirables attendus: - Les animaux seront hébergés en conditions individuelles pendant une durée d'environ 24 heures. Alimentation et recueils d'urine par miction spontanée en condition individuelle. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. - Les animaux auront 2 prélèvements d'urine par cystocentèse espacés de 6h. Ces prélèvements se feront sur animal vigile, par un vétérinaire expert. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute. Les animaux auront un entraînement à la contention pendant au moins deux semaines avant le début de ce projet. - Les animaux seront mis à jeun 12h avant la première cystocentèse. Distribution d'1/3 de la ration alimentaire 1h avant et le restant distribué 6h aprés. Les animaux auront également un entraînement de 2 semaines avant le début de ce projet. - Des prélèvements de sang seront réalisés au niveau des veines jugulaires. Un nombre maximal de 9 prélèvements sur 24h. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Durée d'un prélèvement inférieur à la minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus: - Les animaux seront hébergés en conditions individuelles pendant une durée d'environ 24 heures. Cela peut engendrer un stress pour l'animal. - Deux recueils d'urine par cystocentèse échoguidée seront réalisés par animal : cela peut engendrer du stress pour l'animal liée à la contention, peut être aussi de la douleur. - Des prélèvements de sang seront réalisés: 9 sur 24h. Du stress lié à la contention, de l'inflammation ou douleur aux sites de prélèvements pourront être observés.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de développer un modèle fiable et reproductible d'excés de minéralocorticoïdes chez le chat. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de mimer les désordres d'électrolytes dans l'excretion urinaire il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble.

Réduction

Pour la phase 1: 2 animaux sont prévus pour valider la bonne tolérance de l'administration en intra musculaire de l'aldostérone. C'est le nombre minimal d'animaux pour valider ce point. Pour la phase 2: 12/14 animaux seront administrés. Les 12 animaux seront répartis en 2 groupes de 6. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables. Pas d'approche statistique réalisé pour ce projet.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 ou 3 par sexe pendant la periode d'acclimatation de 7 jours. Puis les animaux seront en condition d'hébergement individuelle. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Les animaux devront manger 1/3 de la ration alimentaire journalière dans l'heure qui précède la cystocyntèse. Les animaux auront un entraînement durant les 2 semaines précédentes. Un entraînement des animaux est également prévu pour la contention, pour faire les prélèvements d'urine par cystocentèse. L'entraînement se fera durant les 2 semaines précédentes. Ce modèle s'appuie sur un modèle qui existe déjà chez le chien. Les prélèvements d'urine par cystocentèse seront échoguidée.

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux de poids compris entre 3et 6 Kg. Nécessaire pour avoir des doses homogènes entre les groupes

Evaluation de l’effet de différents traitements dans des modèles d’epilepsie chez le rat

(NTS-FR-192738v1 – 15/06/2023)

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- Troubles nerveux

Rats : 1008

Souffrances

▲ -

▲ 1008

Devenir

1008

1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes dans le cerveau, des gavages quotidiens pendant près d'un mois et des injections de substances qui déclenchent des crises, avec des états de mal épileptique pouvant durer deux heures et des isolements, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie, aux crises et aux administrations répétées, et prévoit d'administrer une benzodiazépine au-delà de deux heures de crise. Il affirme que les crises d'un cerveau entier ne se reproduisent pas in vitro et que la modélisation informatique manque encore de données.

Objectifs

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements (pharmacologiques et probiotiques) sur 1) la prévention et 2) la terminaison de l’état de mal épileptique (status epilepticus) et des crises spontanées, induits chez l’animal. L’état de mal épileptique (status epilepticus) est défini par une crise prolongée (plus de 5 min) qui induit à long terme des altérations neurologiques graves. Bien que la plupart des patients répondent bien aux benzodiazépines (médicament donné en première intention), certains patients sont réfractaires (un tiers) et nécessitent d’autres traitements. L’état de mal épileptique est généralement accompagné par l’occurrence de crises spontanées après une période dite de latence. Nous proposons ici d’utiliser 2 modèles d’épilepsie présentant un état de mal épileptique et des crises spontanées, et de tester l’efficacité de traitements chroniques (administrés par voie orale) sur la prévention et ou la terminaison des crises induites.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de traitements anti-épileptiques pharmacologiques et probiotiques nouveaux sur l’état de mal épileptique et les crises spontanées associées. Le but est de proposer ces traitements chez l’humain, soit pour prévenir de l’état de mal épileptique, présent dans de nombreux syndromes épileptiques, dont le syndrome de Dravet; soit pour terminer un état de mal épileptique afin d’éviter la survenue d’altérations neurologiques. L’état de mal épileptique prolongé (réfractaire aux traitements actuels) touche 1 tiers de patients épileptiques et peut avoir des conséquences délétères pour le cerveau, voire entrainer la mort des patients.

Procédures

- Chirurgie d’implantation d’électrodes EEG : anesthésie générale et analgésie, une fois par animal, 1008 animaux, durée de la chirurgie maximum 1h - Gavage oral : animaux vigile, une fois par jour pendant 27 à 35 jours selon les procédures (336 animaux par procédure) - Injection sous-cutanée : animal vigile, 12 fois pour 336 animaux, 2 fois pour les 672 autres - Injection intrapéritonéale : animal vigile, une fois pour 672 animaux et éventuellement une 2ème fois (pour stopper l’état de mal épileptique) pour 1008 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue de crises épileptiques et un état de mal épileptique (d’une durée maximale de 2h) , qui peuvent entrainer à plus long terme des altérations neurologiques 2) un stress et une douleur dus à la chirurgie pour l’implantation d’électrodes et au suivi des crises 3) un stress dû à l’isolement (de 2h à 24h) pendant les périodes d’enregistrement des crises 4) un stress et une douleur dus à l’administration chronique sous cutanée des convulsivants 5) un stress et une douleur dus à l’administration chronique par gavage des traitements proposés Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées au niveau cellulaire chez l’humain. (2) Les méthodes expérimentales in vitro ne reproduisent pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier (et ceux malgré le développement de méthodes alternatives). (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore insuffisantes pour produire des données applicables chez l’humain.

Réduction

Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord les traitements préventifs avant de tester les traitements curatifs. Selon le « Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals (Festing, Altman) », il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. L’induction d’un état de mal et des crises pouvant entrainer une mortalité, nous envisageons d’utiliser au maximum 14 animaux/groupe afin d’atteindre un nombre minimum de 10 en cas de perte d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec des tunnels en plastiques (ou des huttes en carton après implantation d’électrodes). La température est controlée. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Avant chirurgie, une dose d’analgésique est administrée (environ 45 min avant). Pendant la chirurgie, un gel est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Un spray d’anesthésique local est appliqué au niveau de la peau incisée pour limiter la douleur. De plus, l’animal est maintenu à une température de 37°C à l’aide d’un tapis chauffant avec rétrocontrôle. Puis, à la fin de la chirugie, une deuxième dose d’analgésique est administrée dans les 4h (soit 6h après la première) pour réduire la douleur postopératoire, puis un antalgique dans l’eau de boisson est donné pendant 48h. Une distribution d'aliment hydraté pourra être effectuée pour faciliter l'alimentation. Lors de l’induction d’un « état de mal » épileptique (status epilepticus), les animaux sont suivis par vidéo-EEG. Si cet état de mal dure plus de 2h, les animaux recevront une dose d’une benzodiazépine afin de stopper le phénomène épileptique, et ainsi limiter les conséquences. Les traitements que nous proposons de tester ont pour but de prévenir et/ou de terminer cet état de mal. Les administrations (intrapéritonéale, sous-cutanée ou par gavage oral) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L’espèce que nous avons choisi (rat Sprague Dawley) est le modèle le plus décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induit par les proconvulsivants utilisés dans cette étude. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. De plus, la lignée Sprague Dawley choisie montre un taux de survie élevé suite à l’induction des crises proposées. Pour toutes les procédures, des animaux adultes seront utilisés (à partir de P60). Les modèles proposés ont montré leur efficacité chez le rat adulte.

Etudes fondamentales et appliquées des interactions entre bactériophages et bactéries chez l’animal

(NTS-FR-886598v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire

Souris : 12916

Souffrances

▲ -

▲ 5112

▲ 7804

▲ -

Devenir

12916

Infectées par une bactérie pathogène, 12 916 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec selon les cas des gavages et des recueils de fèces en boîte jusqu'à deux fois par jour et une prise de sang. Toutes sont tuées à l'issue, parce qu'elles peuvent rester porteuses de la bactérie, la plupart pour l'analyse de leurs organes vitaux. L'équipe étudie dans les poumons et l'intestin les interactions entre bactériophages et bactéries, en vue d'élargir l'usage de ces virus contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. Une souris qui ne bouge plus et reste prostrée, perd plus de 20 % de son poids ou présente une diarrhée depuis plus de 48 heures est mise à mort. Le porteur attribue à l'infection perte de poids et douleur, la juge "nécessaire pour étudier les paramètres affectant l'efficacité d'un traitement", et n'en précise ni la voie ni la durée.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de faire avancer les connaissances sur l’utilisation thérapeutique des bactériophages. Les bactériophages sont des virus qui infectent uniquement les bactéries. Ils peuvent donc être utilisés pour tuer les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ils présentent l’intérêt d’être très spécifiques des bactéries ciblées. D’autre part, les bactériophages font partie de la flore naturelle au même titre que les bactéries. Très abondants dans le tube digestif des animaux ils jouent un rôle important dans le maintien de la santé de l’appareil digestif. Leur utilisation (transplantation virale) pour rétablir une homéostasie intestinale est soutenue par des données cliniques préliminaires encourageantes. Ainsi, nous étudierons les interactions dynamiques entre les bactériophages et les bactéries dans deux organes cibles : les poumons et les intestins. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de mieux appréhender le potentiel thérapeutique des bactériophages dans le but de permettre leur utilisation plus large en clinique.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors d’une phagothérapie. Ces mécanismes recouvrent non seulement les interactions entre les bactériophages et les bactéries mais aussi celles avec l’hôte et notamment son système immunitaire. La meilleure compréhension de l’utilisation thérapeutique des bactériophages permettra d’augmenter le nombre de patients traités dans des conditions optimales d’efficacité. Permettre à des patients d’accéder à ce type de traitement alors que les antibiotiques ne sont plus efficaces permettra de réduire le nombre d’impasses thérapeutiques et le coût des frais hospitaliers mais surtout d’améliorer les conditions de vie de ces patients.

Procédures

Les prélèvements sur animaux vigiles seront limités à un seul prélèvement sanguin (quelques secondes), ou des prélèvements fécaux (chaque animal est placé dans une boite pendant quelques minutes et jusqu’à 2 fois par jour). Les administrations par gavage (quelques secondes) seront limitées à 2 par jour.

Impact sur les animaux

Les nuisances causées aux animaux seront liées au développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites) qui est nécessaire pour étudier les paramètres affectant l’efficacité d’un traitement par les bactériophages. Aucun effet indésirable n’a jamais été rapporté lors de l’utilisation de bactériophages que ce soit dans des modèles expérimentaux ou dans les études rapportant des traitements compassionnels.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, la plupart d’entre eux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

L’évaluation des différents points évoqués dans le résumé du projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). Par ailleurs, s’agissant de bactériophages, l’évaluation pharmacocinétique ne peut s’appuyer sur l’existence de modèles mathématiques. De même, l’étude in vitro des communautés microbienne d’un tube digestif prenant en compte la structuration spatiale des organes n’est pas encore disponible.

Réduction

D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. D’autre part, autant que possible, le nombre maximal de paramètres sera collecté pour chaque animal de façon à limiter le nombre total d’animaux utilisé. Un maximum de 6 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 3 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. Pour les données quantitatives, la distribution normale des variables sera vérifiée et les tests statistiques appropriés seront alors choisis. Pour les variables qualitatives d’autres tests seront effectués. Les éventuels effets confondants (sexe et cage par exemple) seront pris en compte au moment de l’analyse en utilisant des modèles linéaires à effets mixtes. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les animaux infectés seront observés 2 à 5 fois au cours du premier jour puis au moins une fois par 24h durant les 2 jours suivants puis ensuite une fois par période de 48h. Ils seront pesés au moins une fois par période de 48h dès le début du protocole. Une grille d’évaluation à 3 niveaux (0, 1, 2) permettra de suivre l’état de santé de chaque animal. Le score de 1 déclenchera l’ajout d’un diet gel pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Le score 2 sera attribué aux animaux ne bougeant plus et ayant une posture prostrée, ou présentant une perte de poids supérieur à 20%, ou présentant de signes de diarrhée pendant plus de 48h. Tout animal présentant un score de 2 pour l’un des critères sera mis à mort. Au cours des expériences, toute modification des procédures visant à réduire la douleur des animaux (par exemple, réhydratation sous-cutanée, chauffage des cages) sera évaluée avant d’être mise en place.

Choix des espèces

A ce stade expérimental du développement de la phagothérapie, la souris représente l’espèce la plus pertinente pour l’évaluation des paramètres pharmacocinétiques et l’innocuité du traitement. Il s’agit d’un mammifère dont le système immunitaire est bien connu et comporte de très grandes analogies avec celui de l’homme. L’utilisation d’autres animaux plus proches de l’homme (primates) ou de références en pharmacocinétique (porc Yucutan) ne peuvent représenter des animaux de première intention à ce stade de nos travaux. De même, la disponibilité d’élevages de souris gnotobiotiques est un outil de choix qui n’est pas encore disponible pour d’autres espèces. Dans tous les cas, seuls des animaux adultes seront utilisés (>= à 7 semaines) car leur système immunitaire est arrivé à maturité au contraire d’animaux plus jeunes.

Production de sérums immuns de canards dindes ou poulets par immunisation à l’aide de vaccins aviaires en vue de recherches portant sur la réponse immunitaire humorale des volailles

(NTS-FR-977990v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Maladies animales

Poules : 150
Dindes : 50
Autres oiseaux : 100

Souffrances

▲ -

▲ 300

▲ -

Devenir

300

300 oiseaux, poulets, dindes et canards, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit jusqu'à trois administrations de vaccins et jusqu'à trois prises de sang, avant mise à mort pour récolter un maximum de sang. Le porteur décrit une douleur liée aux injections intramusculaires et aux prélèvements, et prévoit d'euthanasier tout animal en détresse, l'objectif étant de produire des sérums pour étudier l'échappement des virus aviaires. Sur le remplacement, il affirme que la variété d'anticorps recherchée ne peut s'obtenir qu'en immunisant des oiseaux de l'espèce concernée.

Objectifs

L’équipe de recherche étudie les maladies virales ou bactériennes des volailles ainsi que l’évolution des agents responsables de ces maladies. Les anticorps produits suite à la vaccination des volailles jouent un rôle prépondérant dans les mécanismes immunitaires de défense contre les pathogènes ciblés, mais ils sont également impliqués dnas la sélection de variants antigéniques des mêmes agents pathogènes. Il est donc important de pouvoir étudier cette réponse anticorps chez les volailles. Le présent projet vise à produire des sérums immuns contenant des anticorps spécifiques d’agents pathogènes chez du canard, du poulet ou de la dinde. Ces sérums seront utilisés à des fins de recherches menées par l'unité de recherche dans le cadre de ses missions et projets de recherche portant sur les viroses aviaires. Pour ce faire, des dindes, canards ou poulets recevront des vaccins avec une autorisation de mise sur le marché (AMM) ou une autorisation temporaire d'utilisation (ATU) en France. Suivant l’objectif spécifique de la procédure un maximum de 3 administrations (soit une primo-vaccination puis deux rappels) pourront être réalisées afin d’obtenir des concentrations sanguines en anticorps élevées à très élevées et/ou permettant de reconnaître plusieurs agents viraux d'une même espèce mais aux caractéristiques antigéniques distinctes. Juste avant les éventuelles seconde et troisième administrations, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la quantité d’anticorps présents dans le sang des animaux et décider de la pertinence ou non de l’administration de doses de rappel. Les valeurs-objectifs des titres anticorps dépendront des virus considérés et des techniques sérologiques mises oeuvre. A titre indicatif, seront recherchés des titres: - d’un minimum de 64 en inhibition d’hémagglutination pour les virus influenza ou de la maladie de Newcastle - d’un titre neutralisant minimum de 160 par séroneutralisation pour des virus tels que les réovirus ou le virus de la bursite infectieuse aviaire - d’un titre comparable à celui des témoins positifs employés dans les kits diagnostiques commerciaux d'ELISA.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir des sérums riches en anticorps spécifiques qui seront utilisés dans des projets de recherche et permettront, notamment, d’étudier comment des virus échappent à la neutralisation médiée par des anticorps issus d’animaux vaccinés. L'observation d'un tel échappement par un agent pathogène indique qu'une mise à jour du contenu antigénique du vaccin peut être nécessaire pour contrôler plus efficacement la maladie.

Procédures

Les animaux recevront les préparations vaccinales : ils seront soumis à un maximum de trois administrations (durée de quelques minutes) par les voies prévues par le résumé des caractéristique du produit (RCP) pour les vaccins disposant d'une AMM ou d'une ATU. Les animaux seront soumis à un maximum de 3 prises de sang (prélèvements effectués en quelques instants) d'un volume maximal calculé selon leur poids.

Impact sur les animaux

Les préparations utilisées pour immuniser les animaux seront des vaccins (inactivés ou à agent vivant atténué) disposant d’une autorisation de mise sur le marché ou d'une ATU, pour lesquels des données d’innocuité sont disponibles. Ces derniers seront utilisées selon les modalités (âge des animaux, voie d’administration, précautions particulières …) décrites dans le résumé des caractéristiques du produit. Aucun effet indésirable grave n’est donc attendu chez les animaux au-delà de la douleur due à une injection intra-musculaire et des prises de sang en vue d'analyses sérologiques. Lors de chaque intervention (prise de sang ou injection), une pesée individuelle des animaux sera effectuée. Une surveillance quotidienne selon une grille d’évaluation clinique des animaux sera néanmoins réalisée et tout animal présentant des signes cliniques témoignant d’une souffrance ou d’une blessure sévère (observation de prostration, incapacité à se déplacer, à s’abreuver ou à se nourrir, signes de détresse respiratoire, signes nerveux qui constitueront un point-limite éthique), signes qui correspondent au point-limite éthique, fera l’objet d’une euthanasie.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs du projet (récolte d'un maximum de sang pour analyses).

Remplacement

La production de sérums immuns ne peut pas être réalisée sur des modèles alternatifs. Ces sérums contiennent en effet une variété d’anticorps reconnaissant divers constituants de l’agent utilisé pour l’immunisation. Ainsi, dans le cas d’une vaccination contre un virus, différents types d’anticorps dirigés contre diverses protéines constituant le virus sont produits. La variété des anticorps produits est importante pour étudier la réponse immunitaire des animaux. Cette variété ne peut être obtenue, à ce jour, qu’en immunisant des animaux de l'espèce considérée.

Réduction

Un maximum de 10 animaux par procédure sera employé. Ce nombre permet de produire un volume de sérum suffisant pour couvrir la plupart des projets scientifiques tout en offrant une diversité des réponses individuelles.

Raffinement

Les procédures seront menées dans le respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010/ 63/ UE et spécifiques de chaque espèce. Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : - Respect des normes d’hébergement (taille des cages, densité etc.) spécifiées dans la directive 2010/63/UE - Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie) ; - Enrichissement du milieu (cordelettes avec jouet (bouchon suspendu), aires de perchage), possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement. - Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des oiseaux) sans restriction ; - Suivi clinique quotidien selon grille de notation clinique - Manipulation et contention des oiseaux par du personnel qualifié, notamment lors des interventions (injections ou prises de sang) - mise en place de points-limites.

Choix des espèces

Les espèces choisies représentent les espèces-cibles des maladies étudiées. L’âge des animaux en début de procédure correspondra à l’âge d’administration des vaccins sur le terrain.

Evaluation de traitements anti-cancéreux chez le Chien

(NTS-FR-555248v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
Recherche fondamentale
- Oncologie

Chiens : 50

Souffrances

▲ -

▲ 50

▲ -

Devenir

50 chiens vont être utilisés sur trois ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une trentaine étant tués à l'issue, dix réutilisés et dix adoptés. Ils reçoivent des candidats médicaments anticancéreux par voie orale ou par perfusion, avec des prélèvements répétés d'urine, de sang et de fèces, et peuvent présenter des troubles digestifs et des atteintes des paramètres sanguins. Le porteur indique que la mise à mort sert le plus souvent à prélever des organes, le maintien en vie n'étant possible que si aucun prélèvement n'est nécessaire et si la molécule n'est pas disséminée dans l'environnement. Il affirme qu'un "organisme complet et vivant" est "indispensable" pour évaluer ces traitements avant des essais cliniques vétérinaires, parfois humains.

Objectifs

Notre projet a pour objectif l'évaluation chez le Chien, de nouveaux composés à visée thérapeutique vétérinaire, et parfois humaine, dans le traitement de pathologies cancéreuses (sureté, données de toxicité, détermination de dose optimale, excrétion d'OGM, etc...). Ces études permettront: - de développer des traitements anti-cancéreux pour les chiens, avec une application clinique rapide sur des patients canins, permettant ainsi la prolongation de leur durée de vie. - d'évaluer (rarement) des traitements destinés à l'Homme: le chien est considéré comme un modèle pertinent pour certains cancers, cela nous permettra d’obtenir des données supplémentaires pour des applications en clinique humaine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'obtention de données permettant un passage rapide à des essais cliniques chez le Chien, permettant la mise en place de nouveaux traitements anticancéreux, mais également l'exploration de nouvelles voies thérapeutiques chez l'Homme.

Procédures

Les animaux recevront une ou des administrations de médicaments, par voie orale ou parentérale. La fréquence dépendra du médicament évalué, l'administration en elle même durera généralement quelques secondes à 1 minute. Dans certains cas, une perfusion pourra être effectuée, pour une durée maximale d'1h. Des prélèvements seront réalisés: prélèvement d'urine directement dans la vessie (env. 2 minutes, maxi 1x/jour), prélèvement de sang (env. 2 minutes, maxi 1x/jour), écouvillons nasaux/buccaux/cutanés (env. 1 minute, maxi 1x/jour), prélèvements de feces (quelques secondes, maxi. 1x/jour)

Impact sur les animaux

Les animaux recevront les traitements de la même façon que ces derniers seront utilisés en clinique: ils sont donc susceptibles de ressentir des effets secondaires associés à ces traitements, le plus souvent des désordres digestifs (nausées, vomissements), mais également possibilité d'apparition de petits boutons sans gravité sur la peau et perturbations transitoires des paramètres hémato-biochimiques.

Devenir

Les animaux devront le plus souvent être euthanasiés pour prélever des organes et du sang afin de faire des analyses (analyses histologiques, dosages du produit administré, etc...) Par ailleurs, beaucoup des produits évalués sont des molécules qui ne doivent pas être disséminées dans l'environnement. Le maintien en vie des animaux ne sera donc possible qu'à la condition: que les prélèvements précédemment cités ne soient pas nécessaires ET que des données de non excrétion de la molécule administrée soient disponibles. Ce maintien en vie pourra parfois nécessiter l'autorisation d'autorités réglementaires/sanitaires.

Remplacement

Les produits que nous souhaitons tester ont pour finalité d’apporter de nouvelles solutions thérapeutiques dans la lutte contre le cancer chez le Chien, et dans certains cas, chez l'Homme. Il est nécessaire, bien que des tests de toxicité aient été réalisés in vitro et sur d'autres modèles animaux, d’étudier l'administration de ces produits chez le Chien avant de démarrer des études cliniques chez des animaux spontanément malades. L'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable dans le cadre de l'évaluation de traitements anti-cancéreux, car la complexité des réactions immunitaires, inflammatoires, ainsi que les effets secondaires sur les organes ne peuvent être reproduits par des méthodes de substitution

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera d'au maximum 50 chiens sur 3 ans, pour l'évaluation de plusieurs candidats thérapeutiques. Le nombre d'animaux a été réduit au minimum permettant d'avoir des résultats scientifiquement exploitables et permettant un passage sans risque sur des patients canins malades.

Raffinement

Durant tout le projet, une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment en conservant l'hébergement en groupe autant que possible en fonction du candidat vaccin testé, par la mise à disposition de jouets régulièrement renouvelés, et par des interactions fréquentes avec les personnes en charge des soins (jeux, caresses, récompenses lors des pesées et examens cliniques…). Si les animaux doivent être hébergés individuellement, pour compenser cet isolement, ils seront hébergés dans des box attenants avec contact olfactif et visuel. Des effets secondaires sont susceptibles d'apparaitre suite aux traitements anti-cancéreux: ils feront l'objet de traitements symptomatiques comme c'est le cas en clinique. Des points limites adaptés seront mis en place afin de limiter l'inconfort des animaux en cours d'étude. Les animaux seront pris en charge par du personnel formé et habilité, et un suivi vétérinaire sera effectué de façon très régulière.

Choix des espèces

Le chien est l'espèce cible pour la plupart des produits qui seront évalués, l'objectif principal étant de vérifier l'innocuité de ces produits avant un passage en essai clinique sur patients canins. Si des thérapies à destination humaine sont évaluées chez le Chien, cela se fera sur la base de publications scientifiques sur le sujet. Les chiens ont en commun avec l'Homme certaines voies de signalisation et récepteurs cellulaires impliqués dans la mise en place du cancer et sont donc un modèle pertinent pour des objectifs scientifiques précis. Les animaux utilisés seront adultes, voire âgés, en raison de la manifestation généralement tardive des cancers.

Validation d’un modèle de la maladie de Parkinson chez le rat par injection d’un vecteur viral

(NTS-FR-445039v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie

Rats : 21

Souffrances

▲ -

▲ 21

▲ -

Devenir

21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce dossier reprend le même protocole qu'une autre demande du lot, une injection virale dans le cerveau pour induire une maladie de type Parkinson, deux IRM de deux heures sous anesthésie, des gavages et des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que la chirurgie n'induit ni souffrance ni troubles hors de la maladie, tout en reconnaissant plus loin une douleur possible, une perte de poids et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du lien entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.

Procédures

- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisée 2 fois, en semaine 7 et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.

Remplacement

L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.

Choix des espèces

La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.

Validation d’un modèle de la maladie de Parkinson chez le rat par injection d’un vecteur viral

(NTS-FR-440139v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie

Rats : 21

Souffrances

▲ -

▲ 21

▲ -

Devenir

21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans le cerveau sous anesthésie pour induire une maladie chronique de type Parkinson, puis deux séances d'IRM de deux heures et des gavages, avec des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur reconnaît des effets liés à la chirurgie, douleur, perte de poids et hypothermie, et un stress lié à l'isolement, tout en décrivant par ailleurs le geste comme sans souffrance en dehors de la maladie induite. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du couplage entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Bénéfices attendus

Procédures

- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisé 2 fois, en semaine et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.

Impact sur les animaux

Devenir

Remplacement

Réduction

Raffinement

Choix des espèces

Impact de l’administration de l’acide-tout-trans-rétinoïque par voie orale sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, sur la croissance et l’immunité tumorale.

(NTS-FR-289923v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Cancers
Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire

Souris : 1944

Souffrances

▲ -

▲ 1944

▲ -

Devenir

1944

1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des administrations orales de bactéries et d'acide rétinoïque, une injection dans un ganglion et un prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever tumeur, foie, intestins, ganglions et rate. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et un inconfort lors des administrations, l'objectif étant de restaurer l'efficacité des immunothérapies en cas de déséquilibre du microbiote. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et "entier" permet d'étudier l'immunité antitumorale, impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant un déséquilibre de la flore intestinale ou dysbiose. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin (MAdCAM-1). L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. De plus, il a été montré que l’acide tout trans rétinoïque (ATRA, all tran retinoic acid) (dérivé de la vitamine A utilisé pour traiter des leucémies) augmente l’expression du ligand de MAdCAM-1 sur les lymphocytes et réprime l’induction de certaines cellules néfastes. Cette surexpression de ce ligand permettrait une meilleure captation des cellules immunitaires intestinales vers l’intestin en cas de dysbiose. Pour comprendre ce lien entre l’ATRA et la réponse anti-tumorale, nous souhaitons dans un contexte de dysbiose supplémenter nos souris en ATRA pour comprendre son effet sur le MI, sur l’effet des immunothérapies, sur l’expression de MAdCAM-1 et de son ligand et sur la migration des cellules immunitaires entre l’intestin et la tumeur. Pour cela, nous voulons administrer l’ATRA par voie orale. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet bénéfique de la supplémentation en ATRA sur la réponse anti-tumorale aux immunothérapies en cas de dysbiose en capturant les cellules néfastes au niveau de l’intestin permettant ainsi la recirculation des cellules immunitaire bénéfiques vers la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous voulons ainsi montrer la restauration de l’efficacité des immunothérapies post traitement par l’ATRA (all trans retinoic acid) malgré le contexte de dysbiose intestinale. (dérégulation de la flore) Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunitaires néfastes de l'intestin vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, l’ATRA, déjà disponible dans la pharmacopée humaine semble être une bonne molécule pour atteindre cet objectif.

Procédures

Les interventions seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute) sous anesthésie locale, l’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’ATRA (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) sous anesthésie locale, et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 1min) sous anesthésie locale ou générale suivant les prélvèement..

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acide tout-trans-rétinoïque (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Ce résultat statistique sera basé sur l'expression tissulaire de MAdCAM-1 ou sur la différence de taille tumorale entre les groupes. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les souris seront donc adultes ce qui permettra un passage plus aisé à l'Homme dans la suite de l'étude.

Etude de l’effet antalgique de l’oligodésoxynucléotide IMT504 sur l’hypersensibilité viscérale d’origine colique dans un modèle d’inflammation intestinale

(NTS-FR-285392v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux

Souris : 120

Souffrances

▲ -

▲ 80

▲ 40

Devenir

120

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du dextran sulfate de sodium qui détruit la barrière intestinale et provoque une colite, subissent des injections quotidiennes pendant cinq jours et un test de distension du côlon au moyen d'un ballonnet, avant mise à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique évaluer la sévérité de la colite par la consistance des selles, la perte de poids et la présence de sang, et teste une molécule antalgique, l'IMT504. Il affirme que l'étude du comportement douloureux ne peut se faire que sur l'animal vigile, la caractérisation du mécanisme étant ensuite renvoyée à des modèles cellulaires.

Objectifs

La prise en charge des douleurs viscérales reste, à ce jour, limitée en raison de la faible efficacité des thérapies antalgiques actuellement disponibles, de leurs effets indésirables, notamment sur la physiologie intestinale, et de l’origine de ces douleurs souvent multifactorielle et hétérogène selon les pathologies considérées. Le besoin d’innovation thérapeutique demeure ainsi pressant dans ce domaine de recherche puisque ces douleurs présentent généralement une forte composante cognitivo-émotionnelle pouvant affecter durablement la qualité de vie des patients. L’IMT504 est une molécule agissant sur le système immunitaire initialement développée en tant qu’adjuvant vaccinal permettant de promouvoir la production d’anticorps afin d'accroître l'efficacité des vaccins. Depuis ces premières études, un rôle nouveau de cette molécule a été mis en évidence dans le traitement des douleurs chroniques au niveau cutané en agissant notamment sur le recrutement et l’activation de cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l’inflammation. Le côlon est un organe soumis à une surveillance immunitaire permanente du fait de sa proximité avec la lumière intestinale contenant une multitude de corps étrangers alimentaires et microbiens. La rupture de la barrière intestinale est un évènement fréquemment associé aux pathologies intestinales entrainant, de fait, un passage accru de ces corps étrangers à travers la paroi intestinale aboutissant à une réaction immunitaire et inflammatoire et, consécutivement, à la sensibilisation des neurones innervant l'intestin transmettant l'information douloureuse intestinale. Ce phénomène peut être modélisé chez l’animal par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez l’animal. Cette molécule, en détruisant les cellules intestinales séparant le contenu du tube digestif du reste de l'organisme, va rompre l’intégrité de la barrière intestinale et, par le biais des mécanismes cités précédemment, provoque une hypersensibilité viscérale. Le but de ce projet est donc, dans un premier temps, d’étudier la cinétique de recrutements de populations de cellules immunitaires dans le modèle d'inflammation colique au DSS et, par la suite, d’évaluer les effets de l’administation d’IMT504 sur la sensibilité viscérale dans ce modèle en lien avec la modulation des populations de cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Ce projet a un objectif double. Tout d'abord évaluer l'effet de l'IMT 504 sur la douleur viscérale dans un contexte inflammatoire. Actuellement, un projet d'étude clinique réalisé par nos collaborateurs argentins expérimentant l'effet de cette molécule sur des douleurs d'origine somatique va bientôt être mis en oeuvre. Ainsi, cette molécule pourrait constituer une alternative aux molécules antalgiques actuellement disponibles dans le traitement des douleurs viscérales avec un transfert potentiellement rapide chez l'homme. Dans un second temps, l'IMT504 constitue un outil de recherche fondamentale nous permettant de caractériser les interactions entre les cellules neuronales et immunitaires dans un modèle de douleur intestinale. En effet, la capacité de l'IMT504 à recruter des cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l'inflammation nous permettra d'étudier la capacité de ces cellules à réduire l'activité neuronale, et par là-même, le contrôle du message douloureux par les cellules immunitaires. Ainsi, outre le caractère pharmacologique de ce projet, de nouveaux aspects sur la physiopathologie des douleurs viscérales inflammatoires seront étudiés.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une injection sous-cutanée quotidienne durant 5 jours consécutifs d'IMT504 ou de la molécule contrôle (Chlorure de sodium). Pour l'evaluation de la sensibilité colique, les animaux seront soumis à un test de distension colorectale qui consiste à appliquer des pressions de distensions croissantes à l'aide d'un ballonnet préalablement inséré dans le côlon distal des animaux. Chaque distension dure 20s et un intervalle d'au moins 4min est respecté entre chaque épisode de distension. Au total le test de sensibilité colique dure donc 30 minutes.

Impact sur les animaux

L'administration de DSS induit une colite dont la sévérité sera évaluée quotidiennement par l'expérimentateur par la mesure du score DAI (Disease Activity Index) en prenant en compte les 3 critères suivants: consistance des selles, perte de poids, et présence de sang dans les selles.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour la collection de tissus et des analyses mécanistiques réalisées in vitro.

Remplacement

Les études sur le comportement douloureux des animaux ne peuvent être effectués uniquement sur l'animal vigile. Les expérimentations visant à caractériser le mécanisme d'action de l'IMT504 seront ensuite réalisées in vitro sur des modèles cellulaires.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.

Choix des espèces

Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (10 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

Evaluation préliminaire de la marge de sécurité en vue de l’utilisation clinique d’un candidat médicament pour lutter contre la maladie de Huntington

(NTS-FR-035855v1 – 13/06/2023)

Recherche appliquée
- Troubles nerveux

Souris : 36

Souffrances

▲ -

▲ 36

▲ -

Devenir

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties en six groupes de doses, elles reçoivent un candidat médicament par voie orale puis subissent des prélèvements de sang à la queue, avant mise à mort pour examiner leurs organes et doser l'accumulation du produit. Le porteur indique qu'une toxicité peut apparaître aux fortes doses, avec des signes d'inconfort, l'objectif étant de fixer la dose maximale tolérée avant des essais réglementaires puis cliniques contre la maladie de Huntington. Sur le remplacement, il affirme que les études de toxicité sont obligatoirement menées sur l'animal et "indispensables" avant le passage en clinique.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Il a été identifié une molécule capable de restaurer le transport neuronal, défaut primaire associé à la maladie de Huntington, dans les neurones humains et murins. Il a ensuite été démontré qu’un traitement sous cutané d’un mois avec ce candidat médicament permettait d’améliorer les défauts moteurs et psychiatriques dans un modèle souris de la maladie de Huntington. Afin de développer le candidat médicament pour des patients atteints de la maladie de Huntington, l’équipe de recherche suit les directives de l’agence européenne du médicament parmi lesquelles figurent l’obligation de réaliser des études de sécurité non-clinique (nommées « études réglementaires ») en amont des études cliniques (voir la guideline européenne ICH M3(R2). Le projet a donc pour objectif de préparer ces études réglementaires pour 1/ aider à identifier la dose maximale tolérée et 2/ réaliser une première évaluation de la marge de sécurité du candidat médicament. Le candidat médicament cible une voie thérapeutique jamais évaluée auparavant, et n’a jamais été utilisé chez l’homme, cette étude préliminaire permet donc d’orienter la conception des études réglementaires notamment en termes de choix des doses.

Bénéfices attendus

Il a été démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris de la maladie. Il est nécessaire maintenant d’identifier la dose maximale tolérée afin de borner le choix des doses à utiliser pour les études de toxicité réglementaire en dose répétée, études préconisées par l’agence européenne du médicament avant le passage en clinique. L’identification d’une dose maximale tolérée élevée et éloignée de la dose efficace connue permettra également de rassurer quant au profil de sécurité du candidat médicament pour les études cliniques

Procédures

Le traitement sera administré par voir orale. Le geste permettant l’administration orale dure 10 secondes. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après administration du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin. Ces actes expérimentaux n'impliqueront que des nuisances mineures chez l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation. Une toxicité d’une dose unique et rapide induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer visuellement l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de doser l’éventuelle accumulation du produit dans les organes cibles.

Remplacement

Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont indispensables à la validation du profil de sécurité du médicament avant d’envisager le passage en clinique. Notre étude permet de documenter le profil de sécurité du médicament in vivo et les résultats seront utilisés pour concevoir les études de toxicités réglementaires.

Réduction

Pour cette procédure, nous limitons au maximum le nombre d’animaux afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 6 groupes différents (différentes doses). Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations du médicament dans le plasma ainsi que pour écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites, et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement oral et les prélèvements de plasma seront réalisés par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ces deux gestes. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation palliée par une injection de liquide physiologique en sous cutané.

Choix des espèces

Les études preuves de concept et pharmacocinétique précédemment réalisées avec notre candidat médicament ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter notre corpus de données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à définir la dose maximale tolérée et donc à préparer les études de toxicité réglementaire qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.

Etude des conséquences sur le métabolisme et le vieillissement de mutations dans les canaux ioniques

(NTS-FR-045378v1 – 08/06/2023)

Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux

Souris : 4

Souffrances

▲ 1

▲ -

▲ 3

Devenir

Quatre souris sont recensées dans le tableau des dommages attendus, une sans réveil et trois en souffrance sévère, alors que le résumé annonce par ailleurs 480 animaux. Le porteur décrit l'induction d'une migraine chronique par injections répétées, une douleur qui ne sera soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées, les animaux étant tués en fin de procédure pour prélèvement des tissus. Il indique surveiller des points limites et euthanasier tout animal atteignant un score de douleur élevé ou perdant du poids. Sur le remplacement, il affirme que les effets métaboliques à long terme et le vieillissement exigent un "organisme vivant" impossible à modéliser in vitro.

Objectifs

La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'incidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.

Bénéfices attendus

La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.

Procédures

Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (4 tests dans la vie de l'animal) et thermique (4 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (4 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 4 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons. Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, pelage non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur en annexe.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chacune des procédures. Dans le cadre des procédures 1 et 2, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Dans le cadre des procédures 3 et 4, les animaux seront anesthésiés (procédure sans réveil) et une perfusion intracardiaque sera réalisée afin de prélever des tissus de qualité optimale pour les analyses histologiques post mortem.

Remplacement

Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.

Réduction

Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.

Raffinement

Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles génétiques des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.