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Etude de l’environnement inflammatoire cérébral post-radiothérapie : suivi par microdialyse sur rat porteur de glioblastome (EU porteur; EU 1/2)
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- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale humaine est implantée dans leur cerveau, puis une sonde de microdialyse qui ressort du crâne et y reste jusqu'à la mise à mort, des prélèvements de liquide cérébral étant réalisés sur l'animal conscient et maintenu en contention entre le 11e et le 17e jour. Ils subissent aussi radiothérapie et imagerie sous anesthésie, la mise à mort survenant dès un point limite ou au plus tard à 90 jours. Le porteur présente la microdialyse comme un moyen de réduire le nombre d'animaux et affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible".
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes et sont généralement agressives. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nouvelles molécules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique d'un médicament innovant (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine implantée chez l'animal. L’objectif du projet étant d'étudier la réponse immunitaire après traitement par ce médicament innovant en association avec la radiothérapie. Pour cela nous utiliserons une technique qui permet un dosage répété des molécules présentent dans l'environnement de la tumeur sans réaliser de biopsie du cerveau. Au cours d'une chirurgie nous plaçons une sonde dans la tumeur cérébrale de l'animal; celle-ci nous permettra de mesurer la réponse immunitaire durant plusieurs jours. Cette technique permet de réduire considérablement le nombre d'animaux comparé aux techniques traditionnellement utilisées qui necessiteraient la mise à mort de l'animal pour chaque point de mesure. Pour le suivi de l'évolution de la masse tumorale des différents traitements, nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament innovant pour le traitement du glioblastome. La technique de mesure utilisée permettra, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le tissu cérébral, d'obtenir des échantillons de façon dynamique tout en gardant l’animal en vie. Ces échantillons nous permettront un suivi au cours du temps de la réponse immunitaire après traitement du médicament innovant et de la radiothérapie.
Procédures
Implantation dans le cerveau des animaux de tumeurs cérébrales humaines, cette chirurgie dure environ 1h. Implantation d'une sonde de microdialyse : durée de la chirurgie environ 1h30 ; présence de la sonde qui ressort au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal. Prélèvement de liquide cérébral sur animal vigile hébergé en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement. Cette méthode de prélévement sera réalisée du jour 11 au jour 17 sur l'animal conscient; l'hébergement en cage individuelle spécifique au mode de prélèvement induit une restriction des déplacements de l'animal. Protocole de radiothérapie et imagerie pour le suivi de l'évolution de la tumeur sur animal anesthésié
Impact sur les animaux
Implantation au niveau du cerveau de cellules tumorales d'origine humaine : chirurgie classée modérée car seule l’incision de la peau du crane peut provoquer une souffrance à l’animal. Nous utiliserons un analgésique local pour limiter la souffrance des animaux. Implantation de la sonde : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la sonde (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements adaptées au mode de prélèvement avec système de contention. Radiothérapie et imagerie sur l’animal : transport de l'animal jusqu’à la plateforme d'imagerie et de radiothérapie ; afin d’éviter toute nuisance à l’animal, le transport est réalisé en cages filtrées dans un sac de transport isotherme (pour le maintien d’une température optimale, des bouillottes chauffantes sont placées sous les cages si nécessaire). Les procédures de radiothérapie ou d’imagerie sont réalisées sur l’animal anesthésié. L'imagerie est un examen non invasif , il ne produit aucune forme de douleur.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. La mise à mort est réalisée dès l’apparition d’un point limite (altération des déplacements et/ou perte de poids) ou en cas d'efficacité du traiement au maximum 90 jours après le début des expérimentations.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales et les effets du traitement par radiothérapie avec ou sans médicament innovant, dépendent de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
La technique utilisée est une méthode permettant le recueil du liquide cérébral et de ses composants sans avoir à mettre à mort les animaux. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements peuvent être réitérés au cours du temps. Nous n’avons pas de réelle idée des variations attendues entre les différents groupes d'animaux, il est donc compliqué de définir un nombre d’animaux précis nécessaire pour une obtenir une solide étude statistique mais 8 animaux par groupe semble tout à fait pertinent.
Raffinement
Les deux procèdures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress de l'animal et de permettre un réveil rapide. Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la sonde (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment des prélèvements intracérébraux, en effet les animaux seront régulièrement observés pour vérifier que le comportement des animaux n’est pas altéré par le mode de prélèvement et les contraintes de contention. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en cancérologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur et de la sonde de prélèvement plus précise mais également par la nécessité d’obtenir de volumes de prélèvement suffisamment importants. De plus la taille du cerveau de rat offre une meilleur résolution pour l’imagerie. Des rats âgés de 6-8 semaines sont utilisés, à un stade où la taille et la forme du crâne correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Etude de l’effet du probénécide dans des modèles d’épilepsie
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Rats : 14
98 rongeurs, 84 souris et 14 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les souris reçoivent une injection de kaïnate dans l'hippocampe qui déclenche un état de mal épileptique parfois mortel puis des crises récurrentes, avec implantation d'électrodes cérébrales et gavages répétés du produit testé, avant prélèvement du cerveau. Le projet évalue le probénécide, un médicament déjà connu, comme piste de traitement des épilepsies résistantes et des crises d'absence. Le porteur affirme qu'il faut tester l'effet dans un "organisme entier représentatif" et présente les modèles souris kaïnate et rat GAERS comme les modèles de référence.
Objectifs
L’épilepsie est une pathologie neurologique concernant 0.8% de la population. Elle consiste en la récurrence spontanée de crises, reflétant un fonctionnement cérébral anormal sous forme de décharges neuronales excessives. Malgré l’existence de nombreux antiépileptiques, près d’1/3 des patients sont résistants à ces traitements, qui ont de nombreux effets secondaires du fait de leur action sur des cibles impliquées dans l’activité physiologique. Notre équipe a récemment montré que le canal pannexine 1 est une cible thérapeutique d’intérêt en épilepsie de par son rôle dans le déclenchement des crises. Cette démonstration s’est faite ex vivo avec un peptide connu pour agir sur le canal et un agent pharmacologique, le probénécide. Le probénécide est un médicament utilisé pour son action sur des canaux rénaux, mais qui est également actif sur la pannexine 1. Un premier test dans le modèle de souris kaïnate a confirmé l’intérêt du probénécide sur les crises épileptiques après administration unique. Nous cherchons à mieux caractériser son effet pour permettre son développement comme futur traitement. Pour cela, nous devons l’évaluer dans des modèles mammifères représentatifs de la pathologie, tel qu’un modèle de souris générant des crises épileptiques résistantes et un modèle de rat générant des crises épileptiques d’absence. Le modèle kaïnate est un bon modèle préclinique pour évaluer l’effet de potentiels traitements anti-épileptiques car il reproduit différents aspects cliniques et tissulaires des patients ayant une épilepsie focale. De plus il a été montré que notre cible, la pannexine 1, est surexprimée et activée dans ce modèle au moment des crises, comme ce qui est observé dans le tissu cérébral de patients épileptiques. Pour l’absence, il existe un modèle génétique bien caractérisé, le rat GAERS, et des études montrant l’intérêt de la pannexine dans ce type d’épilepsie. Ces deux modèles permettront de tester différentes doses de probénécide et d’évaluer leur effet sur les crises. La distribution du produit après administration orale dans le plasma et le cerveau sera étudiée, permettant de corréler un effet pharmacologique à une concentration spécifique. Enfin, pour mieux caractériser l’effet du traitement, nous évaluerons, l’effet du probénécide sur différents marqueurs tels que la mort neuronale, l’activation des cellules gliales et l’inflammation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet du probénécide sur les crises épileptiques dans un modèle d’épilepsie. Nous voulons avec ce projet évaluer la dose efficace, le temps d’efficacité d’une administration et voir quel mode d’administration (unique et répétée) serait le plus pertinent. A long-terme, ce projet permettra d’évaluer la capacité du probénécide à être développé comme un traitement potentiel des crises épileptiques focales résistantes et/ou des crises d’absence.
Procédures
1) injection d’une molécule (0,1µl/mn) durant une chirurgie réalisée (anesthésie générale) sur l’ensemble des animaux de la procédure réalisée une fois sur chaque animal, l’intervention dure environ 20 minutes par animal. 2) Chirurgie pour implantation d’émetteurs pour enregistrements et mesures de l'activité du cerveau par électroencéphalogramme (EEG) sous anesthésie générale et analgésie sur l’ensemble des animaux (40minutes par animal). 3) Gavage unique (1fois) ou répété de solution (3 fois par jour durant 4 jours), sur animaux vigiles. L’intervention dure environ 1 minute par animal. 4) enregistrement continu d’EEG sur animaux vigiles dans leurs cages allant de 3 à 5 jours consécutifs. 5) Perfusion des animaux profondément sédatés. L’intervention dure environ 40min (injection d’analgésique 30min avant, puis environ 10min de perfusion)
Impact sur les animaux
L’administration de kaïnate intra-hippocampique provoque un état de mal épileptique parfois très important, pouvant entrainer la mort de l’animal. Une fois stabilisé, il entraine surtout des crises récurrentes. L’implantation des électrodes peut entraîner des effets secondaires tels qu’une infection, un œdème, et/ou de la douleur. Aux doses utilisées (doses pharmacologiques et non toxiques) les produits administrés par voie ne sont pas connus pour être irritant et entraîner de gêne lors de l’administration. Le principal risque vient de la voie d’administration (risque de fausse route).
Devenir
Pour toutes les procédures: Euthanasie. L’objectif est de pouvoir récupérer du plasma et le cerveau pour quantifier le produit administré ou de récupérer le tissu cérébral fixé pour effectuer des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Le but majeur du présent projet est d’étudier l’effet du probénécide comme potentiel traitement des crises épileptiques: il est nécessaire d’évaluer cet effet dans un organisme entier représentatif, afin de tester si par la voie orale (voie clinique) le produit est capable d’assurer un effet pharmacologique au niveau du cerveau à des doses compatibles à celles administrables à l’Homme. La souris kaïnate est un modèle mammifère représentatif de l’épilepsie résistante et le rat GAERS de l’épilepsie absence.
Réduction
24 animaux seront utilisés pour étudier la pharmacocinétique aigue ou chronique. Un n de 3animaux/point/groupe. 56 animaux seront utilisés pour l’étude de pharmacologie de notre molécule soit 6 animaux par groupe. Enfin, les mêmes rats GAERS seront utilisés pour étudier tous les produits à toutes les doses, que ce soit de façon aigüe ou sub-chronique. De plus, les mêmes animaux seront utilisés en fin d’étude pour évaluer la pharmacocinétique du produit. Nous nous basons sur un groupe n=12 animaux par groupe. Un risque de perte de 15% a été pris en compte pour les trois parties du projet afin de palier aux aléas expérimentaux et de pouvoir réaliser des tests statistiques. Le nombre total d’animaux pour ce projet est donc de 98.
Raffinement
Après administration du kaïnate, les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout animal montrant un problème de confort à la suite de l’opération sera mis sous surveillance accrue. Une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte, présente une plaie, ou montre des signes de douleurs et un comportement adapté sera mis en place. Durant la procédure de chirurgie pour l’implantation des électrodes, l’asepsie sera maintenue via l’utilisation de matériel propre et stérilisé, un champ et des gants stériles, et la désinfection locale de la plaie afin de prévenir les risques d’infection. La plaie sera surveillée et nettoyée si besoin. Les animaux seront médicamentés durant et après la chirurgie pour assurer une analgésie adéquate, et le traitement sera adapté si besoin. Après l’opération, les animaux seront isolés 7 jours afin d’assurer qu’un congénère ne vienne pas altérer la suture. Tout animal montrant un problème de confort à la suite de l’opération sera mis sous surveillance accrue. Une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte, présente une plaie, ou montre des signes de douleurs et un comportement adapté sera mis en place. L'aspect extérieur et le comportement de l'animal seront évalués après chaque administration : comportement général, niveau d'activité, déplacement et rythme respiratoire. Un animal pourra être sorti de l’étude et euthanasié s’il présente une souffrance (prostration, poil érectile, ...) ou s’il montre une souffrance respiratoire qui serait le signe d’une fausse route (administration du produit dans les poumons plutôt que par voie orale). Les points limites sont définis par des changements dans l'aspect physique/comportement ou si des blessures sont constatées. Les animaux seront euthanasiés si leur bien-être est compromis. Les animaux seront soumis à un rythme d’éclairage de 7h à 19h, avec nourriture et eau ad libitum. De plus, nous utiliserons la grille d'évaluation du bien-être animal validée par le comité éthique pour suivre quotidiennement les animaux.
Choix des espèces
Les rats et souris (rongeurs) sont des espèces mammifères qui donnent une bonne représentation des phénomènes biologiques humains. Les deux modèles utilisés ici sont des modèles reconnus de syndromes épileptiques humains et sont utilisés afin d’évaluer la pertinence d’un traitement avant que celui-ci puisse être testé chez l’Homme. L’un des objectifs du projet est d’évaluer l’effet d’un traitement dans un modèle d’épilepsie du lobe temporale pharmaco-résistante : le modèle souris kaïnate. Pour cela, les animaux seront utilisés à l’âge adulte, dès leur arrivée : 6semaines à réception dans notre laboratoire et seront gardées jusqu’à 12 ou 13 semaines en fonction des expérimentations. Ces souris étant validées comme étant un bon modèle d’épilepsie chez l’adulte, nous induisons cette épilepsie sur un cerveau mature sain, permettant d’obtenir un cerveau épileptique sans risque de remaniements lié à l’âge de l’animal Les rats GAERS sont élevés dans notre laboratoire et utilisés dès l'age de 3 mois. A cet âge, les crises généralisées qui caractérises l'épilepsie absence sont bien définies et le profil EEG bien dessiné. Il est également plus facile de faire l'experimentation sur un modèle adulte.
Evaluation de l’utilisation du sérum physiologique pour l’imagerie endocoronaire en tomographie par cohérence optique (OCT).
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
14 porcs vont être utilisés dans une intervention de deux heures menée sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une ponction artérielle puis un cathétérisme des artères coronaires droite et gauche pour des coronarographies répétées, afin de comparer la qualité d'image obtenue au sérum physiologique et au produit de contraste. Le cœur est ensuite prélevé pour examiner l'endothélium des coronaires. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne peut servir et présente le recours au "gros animal" comme "nécessaire" pour transposer les résultats à l'humain.
Objectifs
Les images obtenues par l’OCT (Tomographie par Cohérence Optique) offrent une résolution supérieure à l’IVUS (IntraVascular UltraSound) lors de la mise en place des stents coronaires. L’utilisation de l’OCT nécessite l’administration d’un produit de contraste ce qui augmente les risques d’insuffisance rénale et contre indique donc son utilisation chez les patients présentant une insuffisance rénale chronique. Le sérum physiologique (NaCl 0.9%) a déjà été utilisé à la place du produit de contraste avec des résultats insatisfaisants en raison d’une mauvaise qualité d’image par rapport au protocole d’imagerie utilisant un produit de contraste, cependant ill n’existe à ce jour aucun protocole validé d’imagerie coronaire par OCT utilisant exclusivement du sérum physiologique. L’objectif de notre étude est de définir le meilleur débit d’injection du sérum physiologique permettant d’obtenir une qualité d’imagerie coronaire similaire à celle obtenues avec l’administration d’un produit de contraste.
Bénéfices attendus
L’utilisation du sérum physiologique à la place du produit de contraste pourrait réduire le risque d’insuffisance rénale post-OCT dans les procédures de coronographie. L’OCT avec sérum physiologique pourrait ainsi être utilisée chez les patients avec insuffisance rénale pré-existante. Il est nécessaire de trouver le débit optimal d’administration de sérum physiologique qui s’associe à une qualité du signal satisfaisante pour que l’imagerie coronaire soit interprétable.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 120 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant en la réalisation d'une ponction artérielle suivi d'un cathétérisme des coronaires droite et gauche pour la réalisation de plusieurs coronarographies successives, à l'issue de laquelle les animaux ne seront pas réveillés. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La seule nuisance sera l'injection intra musculaire permettant d’obtenir une sédation vigile et une tranquiliation avant de réaliser l'anesthésie générale. L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure. Pas d’effets spécifiques connus à l'utilisation de l'OCT dans l’expérience humaine en dehors de ceux inhérents au cathétérisme des coronaires (dissection, spasme coronarien, fibrillation non resorbable ou thrombose).
Devenir
La finalité de l'étude est de comparer la qualité d'imagerie des coronaires lorsque l'on utilise un produit de contraste iodé (PCI) ou avec l'utilisation de sérum physiologique. Afin de vérifier l'absence de lésion coronaire liée au débit d'injection de contraste iodé ou de sérum physiologique, les coeurs seront explantés pour prélever les coronaires et réaliser une étude histologique de l'endothélium.
Remplacement
Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle expérimental in silico ou in vitro pouvant servir à étudier et évaluer la qualité de la visualisation de la circulation coronaire en condition physiologique. L’impact des structures anatomiques (peau, muscle, os) et des caractéristiques hémodynamiques de la circulation coronaire, la rhéologie du sang et de son interaction avec le produit de contraste iodé ou le sérum physiologique sur la qualité d'imagerie des coronaires ne peuvent être étudiés que sur un modèle animal (pas d’alternative in silico ou in vitro). Il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un réseau coronaire d'un système vivant. Par ailleurs seul un modèle sur le gros animal permet d’extrapoler facilement les résultats à l’homme, dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan anatomique et physiologique. Il n’existe pas de sonde endocoronaire d’OCT adaptée pour les petits animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire afin de déterminer le protocole d’acquisition des images coronarographiques qui sera ensuite appliqué (incidence des acquisitions, dose irradiée, quantité d’agent de contraste). Le nombre d’animaux pour l'étude sera fixé à 10 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les résultats obtenus pour les coronaires droite et gauche. Nous utiliserons des modèles d’analyse de la variance pour nos analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux, chaque animal sera son propre témoin, en réalisant une première imagerie coronarographique OCT à l'aide d'un produit de contraste iodé puis trois séries d'imageries coronarographiques avec des débits différents de NaCl . Au total un maximum de 14 animaux (2 animaux pour la phase test + 1 groupe de 10 aniamux + 2 animaux en cas d'échec d'une procédure) seront utilisés pour cette étude. Si les résultats des deux animaux préliminaires sont comparables à ceux obtenus dans le groupe test, ceux-ci seront inclus dans l'étude. Dès que le nombre de 10 animaux interprétable sera atteint, les inclusions seront stoppées.
Raffinement
Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). L'environnement est enrichi (activité de fouissement encouragée, medecine ball, jeux dans le couloir, pesée sousforme de jeux avec récompense, planche à gratter, distributeur d’aliment). Contrôle quotidien par un animalier. Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées (Annexes 2-3). Réalisation des ponctions vasculaires percutanées échoguidées (Vivid E9, General Eletric, Milwaukee, Wis, USA) artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue : moins de souffrance, moins de saignement et risque infectieux réduit.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l’homme (Fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg). Par ailleurs son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation de la coronarographie et des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour la procédure. Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d’animaux tests (échec techniques). Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une anatomie coronarienne semblable à l’Homme et les accès vasculaires périphériques artériels et veineux sont favorables à la réalisation du cathéterisme coronaire nécessaire pour l’OCT.
Effet des enzymes protéases et xylanases sur les performances de croissance des poulets de chair vaccinés à un jour avec un vaccin anti-coccidien
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
300 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester l'effet d'enzymes sur la croissance de poulets vaccinés contre la coccidiose. Ils subissent des prises de sang au sinus occipital sur animal vigile à trois âges, le vaccin provoquant de légères lésions du tube digestif. 60 poulets seront tués pour prélever l'intestin, les 240 autres renvoyés en élevage. Le porteur revendique un enjeu 'économique' pour la filière et présente l'espèce comme non substituable par un modèle in vitro.
Objectifs
En élevage avicole, les coccidioses sont très fréquentes et ont des conséquences sanitaires et économiques majeures. Les additifs coccidiostatiques et les produits de traitement contre les coccidioses sont de moins en moins nombreux et sont confrontés à l’émergence de phénomènes de résistance chez les parasites. Dans ce contexte, de nouveaux vaccins sont mis au point, mais qui peuvent induire des baisses de performance sur la période de démarrage et de croissance. L’objectif du projet est d’améliorer les performances de croissance des poulets de chair vaccinés avec un vaccin anti-coccidien (vaccin vivant) peu utilisé en élevage chez les poulets à croissance rapide (Ross 308) car il diminue les performances (baisse de 7% du poids vif). Il est cependant couramment utilisé avec d’autres souches. L’utilisation d’enzymes connues pour améliorer la digestibilité des aliments pourrait restaurer les performances. Ces enzymes sont couramment utilisées en élevage de poulets de chair.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une thématique importante pour l’élevage de poulets de chair standard. La vaccination contre la coccidiose est un enjeu majeur étant donné que les pertes économioques sont importantes en cas de contamination. L’objectif est de mettre au point une nouvelle stratégie vaccinale associée à une stratégie nutritionnelle qui permettrait de vacciner les animaux avec un vaccin qui n’engendre pas de resistance chez les parasites tout en préservant les performances de croissance.
Procédures
Une prise de sang au sinus occipital sera effectuée sur animaux vigiles, à raison de 20 animaux par groupe à 3 stades de croissance (J18, J24 et J42). Les animaux prélevés ne seront pas les mêmes à chaque date. Un total de 300 poulets subira la procédure au cours de l’essai. Chaque prise de sang dure 10 secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer une réaction de stress à la contention de l’animal et un éventuel hématome. Le vaccin utilisé pour les groupes 3, 4 et 5 et contenant une faible concentration de coccidies entraine une réaction inflammatoire et une adaptation du système immunitaire. Cependant, ces coccidies, même en faible quantité, provoquent de légères lésions au niveau des parois du tube digestif.
Devenir
Les animaux mis à mort à l’issue de la procédure seront prélevés pour récupérer l’intestin.
Remplacement
Compte-tenu de l’objectif du projet qui doit être représentatif des conditions d’élevage de poulets de chair standards, l’espèce aviaire ne peut être substituée par un modèle d’étude in vitro ou in silico
Réduction
Pour le dosage de calcium et de protéines totales dans le plasma, le nombre d’individus nécessaires par traitement a été estimé à l’aide de tests statistiques, et donc 20 animaux par traitement et par date seront soumis à la prise de sang. Pour l’évaluation des muqueuses intestinales, les lésions seront évaluées par histologie. 6 poulets sont nécessaires et suffisants, par traitement et par date. Au total, 60 poulets seront mis à mort et prélevés.
Raffinement
Les animaux resteront en groupe, ils auront la possibilité d’explorer et de gratter la litière (paille broyée). Ils auront également à disposition des perchoirs en carton qui seront disposés dans les parquets (1 module par parquet). Ils permettront aux animaux de se percher, de se cacher et de picorer le carton du module. De plus, les animaux soumis à la procédure prise de sang seront surveillés le jour même et le lendemain. Toute manifestation de symptômes persistants (animal prostré pendant plus de 24h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu à part des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
La poule a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. De plus, les coccidies des volailles sont strictement inféodées aux espèces qu’elles parasitent. Les oeufs embryonnés sont ramassés chez l’éleveur, puis mis en incubation au couvoir. Les animaux seront élevés jusqu’à 42 jours, âge classique d’abattage des poulets standards lourds sexés, majoritaires sur le terrain.
Validation des effets bénéfiques d’ILV01, un composant du sécrétome musculaire, sur la greffe d’îlots pancréatiques.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 167 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie subissant des prélèvements sous anesthésie sans réveil. Un diabète est induit par injection, des cellules pancréatiques sont prélevées chirurgicalement puis réimplantées dans le foie, et chaque animal subit jusqu'à 148 mesures de glycémie, 84 injections d'insuline, 84 injections du traitement testé et 22 prises de sang. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des nécroses de la queue et des hémorragies liées aux prélèvements répétés. Le projet teste une myokine pour réduire le nombre de pancréas nécessaires à une greffe d'îlots, étape présentée comme 'indispensable' avant la clinique.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune induisant une destruction des cellules β pancréatique (sécrétant l’insuline) et une hyperglycémie. L'une des thérapeutiques proposées pour les patients DT1 est l'injection dans le foie d'îlots pancréatiques. En effet, la greffe d'îlots est une approche prometteuse permettant une quasi-normalisation du contrôle glycémique, qui prévient des évènements hypoglycémiques sévères et qui améliore significativement la qualité de vie du patient DT1. Cependant, cette thérapie se heurte à de nombreux obstacles qui la rende encore difficilement proposable à un grand nombre de patients diabétiques. En effet, durant toute la procédure de greffe, c’est-à-dire du donneur de pancréas, à l’isolement des îlots pancréatiques et jusqu’à la période post transplantation, la quantité d’îlots fonctionnelle ne cesse de diminuer. Cette perte peut s’expliquer par l’induction de mécanismes de mort cellulaire, de la perte de fonction des îlots tout au long des étapes de la greffe, par les réactions inflammatoires, par les réactions de rejets et par la trop longue période de revascularisation des îlots post greffe. Il en résulte qu'en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour greffer un patient et améliorer sa régulation glycémique. Ainsi, il est important de développer de nouvelles stratégies pour améliorer cette approche thérapeutique et réduire ce trop grand nombre de pancréas à utiliser afin de la proposer à un plus grand nombre de patients DT1. Dans cet optique, nous nous sommes intéressés aux myokines, qui sont des molécules sécrétées par le muscle et régulées par l’exercice physique. Parmi celle-ci, nous avons identifié ILV01. Lors d'une étude précédente, nous avons montré que cette myokine représentait un candidat d’intérêt pour améliorer l’efficacité de la greffe d’îlots car, in vitro, elle améliore la survie et la fonction des îlots pancréatiques (Rat et humain) et in vivo (Rat), elle améliore la fonction du greffon, elle permet une prise rapide et durable dans le temps de la greffe. Ainsi pour la suite du projet, nous souhaitons, dans un premier temps, déterminer si ILV01 permet de diminuer la quantité d’îlots à greffer pour réverser le diabète. Dans un second temps, en fonction des données obtenues lors de l’étape précédente, nous souhaitons valider in vivo ILV01 dans le cadre d’une greffe d’îlots humain chez le Rat immunodéficient. Enfin, ce projet est indispensable avant de passer en essai clinique.
Bénéfices attendus
La transplantation d'îlots est un traitement prometteur pour le diabète de type 1 car elle assure la stabilisation du métabolisme du glucose, une diminution significative des épisodes hypoglycémiques sévères, la normalisation des niveaux d'hémoglobine glyquée et permet de retarder ou d’atténuer les complications du diabète. Par ailleurs, cette approche thérapeutique est déjà approuvée et remboursable via divers systèmes nationaux de santé dans plusieurs pays, dont le Canada, l'Australie, le Royaume-Uni, la Suisse, l'Italie et la France. Néanmoins, actuellement, en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour réverser le diabète dû à la grande perte de la masse fonctionnelle d'îlots au cours des différentes étapes du processus de la greffe. Au vue de la grande pénurie d'organe, cette approche est encore difficilement proposable à tous les patients diabétiques nécessitant un greffe (raison vitale). Nos premières études in vitro et in vivo ont démontré qu’ILV01 améliorait considérablement la survie et la fonction des îlots chez le rat. Ce nouveau projet a tout d'abord pour objectif de déterminer si le traitement avec ILV01 permet de réduire la quantité d'îlots à injecter pour normaliser la glycémie du rat diabétique. Au vu de nos premiers résultats, nous supposons qu'avec notre traitement nous pourrions transplanter plus de patient que ce qui est possible aujourd'hui et ce projet pourra répondre à cette hypothèse. Par ailleurs, cette étude permettra de valider in vivo l'efficacité de notre ILV01 sur les îlots humain grâce à un modèle de rat immunodéficient. Enfin, ce projet sera le tremplin vers une étude clinique.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Les cellules pancréatiques seront prélevées par approche chirurgicale sous anesthésie/analgésie profonde sans réveil (durée 5 minutes) et seront ensuite réimplantés 24h plus tard dans le foie par approche chirurgicale sous anesthésie et analgésie profonde (durée 10 minutes par animal). Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de la greffe (148 fois/animal). Une partie de l’évaluation de l’efficacité de la greffe nécessitera de réaliser une injection de glucose aux animaux (8 injections/animal sur 84 jours, durée 1 minute). De plus, les animaux recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après greffe (durée 1 minute). Par ailleurs, 296 animaux de l’étude recevront en plus de ce qui est décrit ci-avant 1 injection quotidienne de notre traitement soit 84 injections/animal (durée 1 minute). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement sur la greffe, 22 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (sous anesthésie locale, 2 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de notre traitement et d'insuline. - Douleurs post-opératoires à la suite des chirurgies (laparotomie puis injection intraportale d'îlots pancréatiques). - Risque d’infection post-greffe. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie post section de la queue. - Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. - Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (Mesures de glycémie, injections, prises de sang). - Périodes de mise à jeun.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons valider notre traitement sur la fonction d'une greffe d'îlots pancréatique chez un sujet diabétique. Or, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier la fonction d'un greffon d'îlots, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux nécessaire pour la réalisation des groupes que nous avons indiqué correspond au nombre nécessaire d’animaux à utiliser afin d’obtenir des résultats statistiques. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours des nombreuses études métaboliques réalisées sur des rats rendus diabétiques dans le cadre de transplantation d’îlots pancréatiques. Cette étude nécessitera 1167 rats.
Raffinement
Le raffinement intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Concernant les animaux immunodéficients, ceux-ci seront hébergés en cage ventilée. Par ailleurs, la litière, les cages, les éléments d’enrichissement seront stérilisés avant utilisation. De même, il sera utilisé de la nourriture irradiée et de l’eau filtrée. Toute intervention sur ces animaux sera réalisée sous hotte stérile (changes et expérimentations), avec du matériel stérile et une surveillance augmentée par rapport à des animaux standards sera effectuée (au moins 2 fois par jour). Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. En accord avec cette grille, des points limites prédictifs ont été déterminé afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude. Les actes chirurgicaux et les prélèvements terminaux seront réalisés sous anesthésie analgésie profonde. De plus, la chirurgie et les tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement, ne seront effectués que 2h après avoir placé les animaux dans la salle où aura lieu l’expérimentation, afin de diminuer le stress. Enfin, tout acte sur l’animal sera réalisé par du personnel expérimenté afin de réduire au maximum la durée des interventions et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses études sur le diabète et la transplantation d’îlots pancréatiques. En effet, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, les rats ont été préférés aux souris à cause de leur taille permettant une aisance de manipulations et facilite les interventions chirurgicales. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. Poids idéal pour le prélèvement des pancréas, la réalisation des chirurgies et de nos tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement.
Impact de modes de ventilation mécanique innovants sur la fonction pulmonaire régionale imagée en scanner spectral au cours du syndrome de détresse respiratoire expérimental chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
14 lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque procédure dure 2 h 30 et comprend une préparation chirurgicale puis l'induction d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë, avec une hypoxémie profonde comparable à celle des patients de réanimation. Le porteur affirme que le ressenti de cette hypoxémie est 'nul' sous sédation et que le réveil ne serait pas justifiable. L'étude teste un mode de ventilation mécanique suivi par imagerie scanner, présenté comme une étape 'indispensable' avant un essai clinique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’investiguer si la ventilation oscillatoire multifréquence (MFOV) permet d’assurer une ventilation et la perfusion pulmonaires adéquates et d’en déterminer les paramètres de réglage optimaux, dans un modèle expérimental de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) que nous avons mis au point chez le lapin et le porc représentant un poumon d’adulte. Les connaissances issues de ces expérimentations ont une importance pour le patient car elles permettront de proposer un mode de ventilation mécanique pour prévenir les lésions pulmonaires induites en anesthésie générale ou en réanimation.
Bénéfices attendus
Les données de cette étude permettront d’établir une preuve de concept et d’optimiser les paramètres de réglage de MFOV permettant d’obtenir le meilleur rapport entre surdistension et recrutement pulmonaire d’une part et d’autre part la ventilation et la perfusion. Cette preuve de concept et validation est une étape indispensable avant un essai clinique chez le patient atteint de SDRA. La recherche de nouveaux modes ventilatoires protecteurs tels que le MFOV est nécessaire étant donné que la mortalité chez les patients atteint d’un SDRA et nécessitant une ventilation mécanique reste élevée et que la lésion pulmonaire induite par la ventilation mécanique (Ventilator-Induced Lung Injury ; VILI) est reconnu comme étant une des causes de cette mortalité.
Procédures
Une procédure est prévue sur lapin. Cette procédures se fait sur des animaux sous anesthésie générale, sans réveil. La procédure complète à une durée de 2h30 qui comprendr l'anesthésie, la préparation chirurgicale, des mesures à l'état basal et l'induction de syndrôme de détresse respiratoire aigue.
Impact sur les animaux
Ce protocole comporte une procédure sans réveil. Les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde, comprenant entre autres une analgésie puissante, comparable à celle utilisé chez l’homme pour les chirurgies lourdes, maintenue durant toute la durée du protocole. Les effets néfastes du SDRA expérimental sont une hypoxémie profonde, comparable à celle observée chez les patients de réanimation avec SDRA. Le ressenti de l’hypoxémie est nul sous ces régimes de sédations. A la fin du protocole, ils seront euthanasiés par surdosage des drogues anesthésiques.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le réveil en condition de SDRA n'est pas justifiable expérimentalement compte tenu des objectifs de l'étude et de la souffrance potentiellement engendrée lors du réveil.
Remplacement
Un modèle animal doit être utilisé car il n’est pas possible de valider la technique chez l’homme, le nombre de scanner requis étant responsable d’une irradiation qui serait inacceptable pour les patients. De plus, il est très difficilement envisageable de déplacer un patient de réanimation dans un scanner spectral sans le mettre en danger, en particulier si celui-est dans un état sévère. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non humaine, non animale pour simuler un SDRA.
Réduction
A l’aide de données précédemment obtenues, nous avons réalisé un calcul de puissance afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires à la recherche, en prévoyant d’utiliser une analyse de variance à mesures répétées, ou un test de Kruskal-Wallis, selon la normalité de la distribution des données. La réalisation de mesures répétées chez un même animal permet de diviser par 2 le nombre d’animaux requis.
Raffinement
L’utilisation d’animaux vivants permet l’étude dynamique et cinétique de la ventilation mécanique et la respiration en tant que phénomène physiologique. Elle permet de reproduire expérimentalement de façon assez crédible le SDRA observé chez l’homme. L’utilisation d’animaux permet des mesures scannographiques répétées, inenvisageable chez l’homme du fait de l’exposition aux rayons X, et une quantification en imagerie TEP difficilement réalisable chez un patient de réanimation.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux vivants permet l’étude dynamique et cinétique de la ventilation mécanique et la respiration en tant que phénomène physiologique. Elle permet de reproduire expérimentalement de façon assez crédible le SDRA observé chez l’homme. L’utilisation d’animaux permet des mesures scannographiques répétées, inenvisageable chez l’homme du fait de l’exposition aux rayons X, et une quantification en imagerie TEP difficilement réalisable chez un patient de réanimation.
Evaluation de l’efficacité et de l’impact sur la réponse immunitaire de l’association de radiothérapie avec des immunothérapies, des nanoparticules radiosensibilisantes et/ou de chimiothérapies sur plusieurs modèles de tumeurs syngéniques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour optimiser des combinaisons de radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et immunothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et des prises de sang sous anesthésie, les tumeurs pouvant former des nécroses et ulcérations douloureuses. Le porteur indique qu'environ 75 % des souris seront tuées après un point limite ou une progression tumorale dès la première procédure, le reste à l'issue de la seconde. Le modèle de souris immunocompétente est présenté comme 'indispensable' pour reproduire un 'organisme entier'.
Objectifs
Nous proposons d’optimiser les combinaisons à base de Radiothérapie avec des Nanoparticules et/ou des immunothérapies et/ou des chimiothérapies. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par suivi du volume des tumeurs traitées et par étude de la réponse immunitaire à partir d’échantillons sanguins. L’objectif de ces expérimentations est de constituer des bases solides nécessaires aux développements d’essais cliniques en évaluant l’efficacité des combinaisons présentant les meilleurs efficacités en préclinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont cliniques avec l’optimisation et la sélection des meilleurs schémas de combinaison à base de radiothérapie, nanoparticules et ou immunothérapies pour traiter des cancers localisés ou métastatiques.
Procédures
- Injection sous cutanée de cellules tumorales - Prélèvement sanguin sous maxillaire - Ces deux types d’interventions seront réalisés sous AG gazeuse (Isoflurane 2.5%)
Impact sur les animaux
Les tumeurs formées par certains types de cellules peuvent former fréquemment des nécroses/ulcération en surface qui peuvent entrainer une douleur évaluable par palpation de la tumeur Aucun effet secondaire ou nuisance dû aux prélèvements sanguins en sous maxillaire n’est attendu. Ce geste est couramment réalisé par les membres de notre équipe.
Devenir
A l’issue de la procédure N°1 : environ 75% des animaux auront été mis à mort après atteinte d’un point limite ou parce que leur tumeur est en progression. Les 25 autres pourcents des animaux seront pris en charge dans la procédure N°2 A l’issue de la procédure N°2 : tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet de la radiothérapie sur l’activation de cellules immunitaires, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux présentant un système immunitaire actif. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur des cellules en culture nous a permis de nous affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
La formation de tumeur par les types de souris qui seront utilisés dans ce projet, se fait de façon homogène, permettant l’utilisation d’un nombre d’animaux relativement réduit pour répondre aux questions scientifiques posées. Afin de pouvoir traiter dans un même groupe des tumeurs de tailles comparables, il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules de cancer de souris permet de pouvoir travailler avec des souris au système immunitaire actif sans entrainer de rejet des tumeurs. Ainsi, nous pouvons étudier les effets de nos traitements à la fois sur la croissance des tumeurs mais aussi sur les cellules immunitaires. Afin de garantir la fiabilité de nos résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations 3 fois.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe dans des cages de taille adaptées et en présence d’enrichissement (matériel leur permettant de constituer un « nid »). Les combinaisons des traitements par radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et/ou immunothérapie ont déjà été réalisées dans ces conditions dans notre équipe sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle de souris est indispensable car les expérimentations sur cellules en culture ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme entier, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeur par les souris qui seront utilisées dans ce projet est homogène et maitrisé par notre équipe. Ceci permet de limiter la quantité de souris injectées par des cellules tumorales pour constituer des groupes de traitement avec un volume de tumeur comparable. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.
Etude de l’efficacité anticancéreuse de la synergie entre un traitement aux ultrasons et un traitement de référence en immunothérapie, dans un modèle de cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du pancréas. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, cinq séances d'ultrasons sous anesthésie et cinq injections intrapéritonéales d'immunothérapie, les ultrasons pouvant provoquer une brûlure au niveau de la tumeur. Le porteur décrit des points limites liés aux brûlures, ulcérations et nécroses tumorales, traités par crème ou antidouleur puis par mise à mort si la douleur persiste. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés au 'long terme'.
Objectifs
Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible
Procédures
- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 5 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 5 injections intrapéritonéales d'immunothérapie à raison d’un par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 1 injection sous cutanée d’antidouleur dans l’abdomen (30 secondes) - Au maximum 14 pesées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de deux par semaine.
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut rarement entrainer une gêne à la locomotion. Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine, les ultrasons pouvant induire une brûlure au niveau de la tumeur. Le traitement par anti PD-1 n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris (pas de réaction auto immune).
Devenir
Suite à la procédure les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs soit 48h après le deuxième traitement soit en fin d’étude.
Remplacement
Plusieurs informations ont été données via des études de culture de cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé par un outil statistique et les résultats seront interprétés grâce à des tests statistiques.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles brûlures cutanées à cause de la cavitation, les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute uclération, irritation ou nécrose des tumeurs des animaux, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera en transcutané sur 7 jours de la crème Dermaflon pour soulager la brûlure. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de scoring et via la palpation on administrera à nouveau selon la sévérité soit de la buprénorphine soit du paracétamol sur 48h. Si malgré le traitement antidouleur la douleur est toujours présente alors on euthanasiera les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux sont euthanasiés. Des prélèvements en cours d’étude et en point final (tumeurs) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Tous les animaux présentant une prise tumorale à la randomisation seront intégrés dans l'étude pour pallier d'éventuelles pertes lors des anésthésies ou à cause de l'atteinte de points limites. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements
Choix des espèces
La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. La C57Bl/6 est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature, et donc en action.
Utilisation de capteurs glycémiques chez des porcs en groupe
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
24 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester un capteur de glycémie implanté sous la peau chez des animaux élevés en groupe. La pose se fait sous tranquillisation, le capteur restant en place environ deux semaines, ce qui peut provoquer une gêne ou une inflammation. Les 8 porcs équipés du capteur seront tués pour étudier leur composition corporelle, les 16 autres renvoyés en élevage jusqu'au poids d'abattage habituel, environ 115 kg. Le porteur présente la méthode comme une alternative moins invasive à la pose d'un cathéter.
Objectifs
L'alimentation permet d'assurer le développement et la santé des animaux. Le glucose est l'un des nutriments essentiels au bon fonctionnement des cellules de l'organisme, et sa concentration dans le sang est reconnue comme un bon indicateur de la régulation de l'énergie. Cette mesure nécessite le prélèvement d'un échantillon de sang, souvent de manière répétée au cours de la journée. Chez le porc, le prélèvement de sang requiert une contention de l'animal (acte stressant) et, dans le cas de prélèvements répétés, la pose d'un cathéter réalisée sous anesthésie générale. Le projet vise à tester un capteur miniaturisé implanté en intradermique pour mesurer la concentration circulante de glucose, en temps réel et pendant plusieurs jours. Nous testons un capteur glycémique commercialisé pour les personnes diabétiques. Une première étude a permis de démontrer la capacité du capteur à fournir des données pertinentes sur des porcs maintenus durant 6 jours seuls dans une loge, pour éviter l'arrachement du cathéter. Ce mode de logement sécurisait aussi la position du capteur glycémique. Une deuxième étude est indispensable pour valider le capteur comme une méthode peu invasive de mesures des constantes physiologiques internes pour des porcs élevés en groupe. Si le capteur reste fonctionnel dans ces conditions d'élevage en groupe, cela permettrait de déterminer les relations entre les concentration en glucose dans le sang au cours de la nuit et de la journée, et des différences dans le comportement alimentaire, l'activité physique, ou encore les interactions sociales entre les animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices immédiats attendus seront de fournir une alternative à la technique invasive de pose d'un cathéter pour le suivi des cinétiques des concentrations de glucose en réponse à des changements dans l'environnement (alimentaire, thermique, sanitaire, etc.). Cette méthode permettrait d'identifier les relations entre la régulation de la glycémie (concentration en glucose), le comportement alimentaire et les interactions physiques et sociales de l'animal. Elle pourrait être alors préconisée pour suivre la physiologie de l'animal afin de détecter précocement, par un suivi en temps réel, d'éventuells problèmes d'adaptation à l'envrionnelment d'élevage, avant leur manifestation en terme de santé ou de dégradation de son bien-être.
Procédures
Une injection intramusculaire pour tranquillisation (durant 15 minutes) à une dose pré-anesthésique, une prise de sang réalisée à l'oreille et la pose d’un capteur en intradermique (2 minutes) sur l'encolure et sécurisé par un bandage durant la sédation, puis après réveil, un suivi des animaux en petit groupe par observations pendant 14 jours.
Impact sur les animaux
La présence d'une aiguille en intradermique sur le capteur et la sécurisation du dispositif par une bande adhésive peuvent entraîner une gêne, voir une inflammation durant les 2 semaines où le capteur est positionné sur l'animal.
Devenir
Les 8 porcs concernés par la pose d'un capteur glycémique en intradermique seront euthanasiés à la fin de l'expérience pour étudier leur composition corporelle. Les 16 autres porcs utilisés pour étudier le comportement social au sein des cases collectives n'auront pas subi de procédure particulière autre que la pose d'un bandage autour de l'encolure, et seront replacés dans un bâtiment d'élevage dédié à la fin des 3 semaines d'expérimentation. Ils seront élevés selon les pratiques d'élevage jusqu'au stade usuel de commercialisation (environ 115 kg de poids vif).
Remplacement
Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à identifier une méthode alternative à la méthode de référence pour étudier les mécanismes de régulation des constantes métaboliques face aux défis posés par des changements dans l'environnement (alimentaire en premier lieu, mais aussi thermique, social, sanitaire, etc.) des animaux d'élevage. Il n'est pas possible d'étudier finement le métabolisme du porc au bénéfice de sa santé et son bien-être, avec une application pour la recherche mais aussi à terme en élevage, sans utiliser des porcs de génotype conventionnel (Large White x Landrace x Piétrain). L'utilisation de cellules en culture permettrait de caractériser les mécanismes moléculaires de la régulation du taux de glucose intracellulaire, mais ne renseigne nullement sur les variations quotidiennes de la glycémie (concentration dans le sang) en relation avec l'activité métabolique des nombreux tissus utilisateurs de glucose (muscles, tissus adipeux, intestins) ou du foie (production de glucose), et avec le comportement alimentaire du porc, son efficience alimentaire, son activité physique, et son état de santé. L'utilisation d'animaux vivants est donc nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques, et sujets à une large variabilité entre individus.
Réduction
Chaque porc dit "sentinelle" (n = 8) est son propre témoin durant les 3 semaines d’expérimentation, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des valeurs fiables tout en prenant en compte la variabilité interindividuelle de la consommation alimentaire ou des comportements, et des processus induits (ingestion, digestion). Une analyse des corrélations sera réalisée entre les mesures de concentration en glucose circulant (concentrations maximales ou minimales de glucose circulant, heures des pics, aire sous la courbe, etc...) et les mesures de comportements et d'ingestion d'aliment (quantité, rythme des repas) effectués sur chaque animal. Le nombre de 8 porcs sentinelles à équiper chacun d'un capteur glycémique a été déterminé sur la base de la bibliographie disponible quant à la validation de capteurs glycémiques développés en médecine humaine pour des miniporcs, et selon notre propre connaissance des variations interindividuelles des concentrations de glucose sanguin récemment objectivées pour des porcs du même génotype et de même stade munis des mêmes capteurs glycémiques mais élevés en loge individuelle. La taille des groupes dans chaque case (n = 6 porcs/case) a été déterminée pour fournir des évaluations fiables des interactions sociales entre animaux.
Raffinement
Le projet vise justement à raffiner la méthode standard de suivi des concentrations en glucose sanguin en évitant la pose d'un cathéter jugulaire ou des prélèvements répétés de sang par contention de l'animal et prélèvement à la veine jugulaire. Pour les porcs dits "sentinelles" (n = 8, soit 2 porcs/case), la pose du capteur glycémique est réalisée en tranquillisant l'animal par l'administration d'un mélange médicmenteux à dose pré-anesthésique en intramusculaire. Le capteur est placé sur la face externe de l'encolure, à la base de l'oreille droite, en utilisant l'applicateur fourni dans le kit qui permet l'insertion d'une microaiguille en intradermique et la pose d'un patch sur le capteur. Le capteur permet ensuite des mesures des taux de glucose sans douleur, ni contention ni stress. Le porc sera familiarisé avec les humains grâce aux soins quotidiens durant la première semaine avant la pose du capteur, ce qui permettra la préanesthésie dans le couloir attenant à la loge d'élevage, ceci pour ne pas perturber l'animal (pas de changement d'environnement). Un bandage sera posé également sur les congénères de chacune des 4 loges (n = 16 porcs), si possible sans autres manipulations qu'un isolement temporaire dans un coin de la loge, ceci grâce à la familiarisation à l'humain durant la première semaine. Pour des porcs où cela ne serait pas possible (animal manifestement stressé), la même procédure que pour les porcs "sentinelles" serait alors appliquée en remplacement. Toutes les cases sont équipées de dispositifs d'enrichissements renouvelés régulièrement et au gré des comportements individuels: matériels manipulables (chaînes métalliques , balles en plastique dur, étoiles en plastique et métal, croix en plastique dur, toiles de jute...) qui ne peuvent pas être rongés. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel expérimenté afin de détecter l'atteinte d'un point limite.
Choix des espèces
Le porc est l'espèce cible du projet. Le projet vise à trouver une méthode pour étudier les évolutions des constantes physiologiques du porc face aux défis posés par les changements de son alimentation, les modifications de son environnement ou les évolutions des pratiques d'élevage. Il n'est pas possible d'étudier ces évolutions sans utiliser des porcs de génotype conventionnel (Large White x Landrace x Piétrain). L'utilisation de cellules en culture permettait de caractériser les mécanismes moléculaires de la régulation intracellulaires, mais pas les variations quotidiennes de la glycémie. Les effets mesurés résultent de processus biologiques extrêmement dynamiques, impliquant l'effet de comportements tels que l'activité physique ou le rythme d'alimentation, et l'aptitude à digérer l'aliment et à utiliser les nutriments. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits sur des cellules en culture in vitro. Ils sont soumis à une large variation inter-individuelle. Les porcs pèsent environ 50 kg de poids vif (autour de 3-4 mois d’âge). Cela permet d'étudier les variations de la glycémie chez un animal en croissance, puisque ce projet vise à étudier les évolutions et régulations de la glycémie chez des animaux représentatifs de leurs congénères élevés pour la production de viande et confrontés à des situations de challenges environnementaux rencontrés en élevages. Techniquement, le poids de 50 kg environ est idéal en terme de manipulation, et a été aussi choisi dans notre premier projet visant à valider les valeurs fournies par les capteurs glycémiques pour des porcs élevés en loge individuelle.
Évaluation de l’efficacité d’un traitement contre les infections de prothèse aortique d’origine bactérienne par administration de virus ayant une activité antibactérienne
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Opérés pendant 90 minutes sous anesthésie générale pour recevoir une prothèse aortique et un cathéter veineux central, 24 porcs de 10 semaines doivent ensuite développer une infection de cette prothèse par un staphylocoque, avec une fièvre attendue qui peut durer tout le protocole. Deux fois par semaine, huit prises de sang de quinze minutes passent par le cathéter, sans anesthésie. À J15, les 12 porcs des groupes de phagothérapie reçoivent sous anesthésie générale une injection de virus antibactériens guidée par scanner, et les 12 des groupes antibiotiques de la vancomycine deux fois par jour pendant quinze jours, chaque injection durant en moyenne une heure, sans anesthésie. À J30, une dernière chirurgie de 90 minutes retire la prothèse et les tissus voisins. Les 24 porcs, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sont tous mis à mort pour l'analyse bactériologique de la prothèse, le porteur jugeant "déraisonnable" de rétablir la circulation par une autre prothèse.
Objectifs
L’aorte, plus gros vaisseaux du corps humain, est sujette à de nombreuses pathologies, notamment les anévrismes, une dilation du vaisseau pouvant conduire à sa rupture, à l’origine de 15000 décès/an aux USA. Pour les traiter, le segment dilaté peut être remplacé par une prothèse en tissu. L’une des complications opératoires les plus fréquentes est une infection de cette prothèse vasculaire aortique (IPA). C’est une complication grave, qui peut être traitée en remplaçant la prothèse infectée et en associant une antibiothérapie. Cependant, 20% des patients sont non opérables et sont traités par une antibiothérapie au long cours seule. Ces patients présentent un risque élevé de mortalité. L’utilisation de virus capables de détruire une bactérie (phagothérapie) a montré son efficacité sur les infections bactériennes dans plusieurs études. Devant l’échec de l’antibiothérapie, il est apparu logique d’étudier l’efficacité de la phagothérapie dans les IPA. La sévérité des IPA est une problématique majeure en chirurgie vasculaire. La phagothérapie pourrait présenter un bénéfice majeur en élargissant les possibilités de traitements, et en représentant une alternative/un complément à l’antibiothérapie. Il s’agit du premier projet de recherche sur modèle porcin, évaluant la phagothérapie dans les IPA, et cherchant à proposer une nouvelle thérapie. Les résultats favorables de la phagothérapie dans d’autres infections et l’absence d’étude sur leur efficacité sur les IPA, ont conduit à mettre en place ce projet. Le modèle porcin se rapproche biologiquement le plus du modèle humain pour cette étude. Les objectifs de cette étude sont de valider les aspects techniques de l’administration de la phagothérapie dans notre modèle et d’évaluer l’efficacité de la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques. L'hypothèse principale est que la phagothérapie, dans les infections de prothèses aortiques, exerce une activité anti-infectieuse supérieure à l’antibiothérapie seule. L'objectif ultime est d'évaluer la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques dans les IPA chez des patients non opérables. Le transfert clinique en cas de résultats favorables paraît rapidement envisageable au vu de l’absence de traitement pour les patients.
Bénéfices attendus
Il s'agit de la première étude s'adressant à la phagothérapie dans les infections de prothèse aortique sur un modèle préclinique. L'objectif ultime est d'évaluer la phagothérapie seule ou associée aux antibiotiques en tant que traitement conservateur dans les IPA chez des patients inopérables, voire en tant que traitement adjuvant d’une chirurgie conservatrice. De plus, une application locale de phages est également envisageable chez l'homme, pour traiter les infections de prothèses aortiques par voie mini-invasive, c’est-à-dire libérées à l’intérieur d’un anévrysme pour l’exclure du flux sanguin. Le transfert clinique en cas de résultats favorables paraît rapidement envisageable vu le contexte pathologique de départ. Il s'agit de la combinaison d'un sujet extrêmement actuel, la phagothérapie à l’ère l'antibiorésistance, avec une pathologie sévère résistante aux traitements antibiotiques classiques. Le transfert clinique est aisément envisageable, vu le contexte pathologique.
Procédures
Tout d’abord, les animaux sont soumis à la chirurgie initiale de mise en place d’une prothèse aortique sous anesthésie générale. Celle-ci sera réalisée sur les 24 animaux avec une durée d’intervention de 90 minutes. La pose d’une voie veineuse centrale tunnelisee, sera effectuée sur tous les animaux au cours de cette chirurgie, permettant les prélèvements et l’administration de médicament. Des prélèvements sanguins seront réalisés chez les 24 animaux, sans anesthésie par le cathéter mis en place au cours de la chirurgie initiale. Ils seront effectués 2 fois par semaine, soit 8 fois au cours de la procédure. Un prélèvement sanguin dure en moyenne 15 minutes. Les animaux des groupes traités par phagothérapie seule ou en association aux antibiotiques, soit 12 animaux, recevront une injection locale de virus à activité antibactérienne par ponction guidée par scanner. Cette injection aura lieu une seule fois au cours de la procédure (à J15), elle sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 45 minutes. Les animaux des groupes traités par antibiotiques seules ou en association à la phagothérapie (12 animaux) recevront un traitement antibiotique par vancomycine. Cette injection se fera sans anesthésie à l’aide des cathéters, deux fois par jour pendant 15 jours dès J15. Une injection dure en moyenne 60 minutes. La chirurgie finale sous anesthésie générale permettra le prélèvement de la prothèse et des tissus biologiques. Elle sera réalisée à J30 sur les 24 animaux, avec une durée attendue de 90 minutes.
Impact sur les animaux
Il existe des complications pendant la chirurgie : risque de saignement par lésion d’un vaisseau, risque de lésion des intestins et risque d'embolisation d'un caillot sanguin. Ces complications sont rares. La cicatrice abdominale est à l’origine de douleurs abdominales qui sont courantes, avec une durée attendue de 7 jours. Elle entraine également le risque d’une perte d’appétit avec retard à la reprise du transit, normalement de courte durée (24-48h). Suite à la chirurgie, il existe un risque de saignement post-opératoire, pouvant être lié à une lésion d’un vaisseau, un risque d'obstruction de vaisseaux des membres postérieurs par un caillot sanguin qui s'embolise. Ces deux évènements sont rares mais peuvent survenir pendant toute la durée de l’étude. Il existe un risque rare d’obstruction (embolisation) d'une des artères destinées aux intestins. Cet effet indésirable survient principalement en post-opératoire immédiat (24-48h). L’étude a pour but de créer une infection de prothèse aortique, ainsi une fièvre est attendue, effet qui peut être ressenti pendant toute la durée du protocole. La fièvre se traduit par une perte d’appétit, un ralentissement dans le comportement du porc à type de fatigue associée à un isolement. Pour chaque étape (chirurgie, prélèvements etc), il existe un stress lié à l’isolement de l'animal de ses congénères pour les manipulations. En post-opératoire immédiat, l’isolement se fait pour une durée de 24 heures, pour permettre le repos/la surveillance rapprochée de l’animal et éviter l'arrachage de points de suture.
Devenir
Il est prévu de mettre à mort les animaux à la fin du projet. Le but de cette mise à mort est de prélever la prothèse vasculaire posée initialement ainsi que les tissus biologiques entourant cette prothèse afin d’effectuer l’analyse bactériologique de la prothèse et des tissus biologiques (prélèvements aortiques au contact de la prothèse). Cela permettra également l’analyse histologique de tissus biologiques afin de comparer les degrés d’infection dans les groupes. Par ailleurs, en accord avec les recommandations des vétérinaires, la mise à mort est nécessaire afin d’éviter des nuisances et souffrances inévitables induites par l’ensemble de la procédure. Le rétablissement de continuité vasculaire par une autre prothèse dans ce contexte sceptique est jugé déraisonnable, étant donné les douleurs post-opératoires attendus et le risque attendu infectieux si l’animal était destiné à être réveillé.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode de substitution permettant l’étude d’un traitement infectieux sur une infection bactérienne développé sur une prothèse vasculaire. En effet la prothèse vasculaire doit être dans des conditions d’analyses proches de l’humain, c’est à dire greffé à un tissu organique natif, soumis aux régimes hémodynamiques et sur un terrain susceptible de permettre le développement d’une infection bactérienne in vivo. Une prothèse aortique seule infectée par une culture de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline, ex vivo ne reproduirait pas l’effet sur : les tissus périphériques, l’hémodynamique, l’impact sur l’organisme avec les aspects cliniques, et les modifications histologiques artériels. De plus l’objectif est d’évaluer l’efficacité de la phagothérapie au sein d’un organisme vivant et dont la physiologie est proche de l’homme. De nombreuses études ont été faite pour évaluer l’efficacité de la phagothérapie sur des souches bactériennes en cultures in vitro. De nombreuses études d’efficacité in vivo sur des modèles animaux ont permis de montrer l’efficacité de la phagothérapie sur des pathologies spécifiques. Notamment dans le traitement des infections pulmonaire à Pseudonomas aeruginosa chez des souris atteintes de mucoviscidose par phagothérapie, ainsi que dans le traitement d’infection de matériel orthopédique à Staphylocoque doré résistant à la méticilline. Il s'agit de la première étude visant à évaluer l’efficacité de la phagothérapie sur modèle vivant d'infection de prothèse aortique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats obtenus dans le cadre d'études antérieures. Le nombre de 24 animaux a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le nombre d’animaux « n » nécessaires à l’obtention d’une valeur statistique permettant de conclure à une supériorité de la phagothérapie, a été calculé à l’aide d’un test statistique. Il a été décidé lors d de diminuer la sensibilité de notre test, c’est-à-dire la puissance statistique, afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le test statique sera utilisé pour comparer les différences des charges bactériennes entre les groupes de traitement et de contrôle. Toutes les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du programme statistique. Les choix des groupes expérimentaux et témoins, se sont fait en fonction de modèles expérimentaux préalablement étudiés. Dans les groupes témoins (sans traitement) nécessaires à la réalisation de l’étude, l’effectif a été réduit au strict minimum. Le travail en aveugle pour les injections (le manipulateur ne connait pas le produit qu’il administre, phagothérapie ou antibiothérapie) n’est pas possible, les voies d’administration étant différentes en fonction du traitement. Afin de diminuer le nombre de geste invasif sur l’animal, il ne semblait pas convenable de réaliser des injections placebo. Les analyses des critères infectiologiques, cliniques et biologiques seront effectuées en aveugles.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 7 jours minimum est respectée, permettant l’habituation des animaux au contact et à la manipulation par du personnel expérimenté. L’hébergement des animaux est réalisé en groupes sociaux (contact visuel, olfactif, physique) sur litière de copaux. Les porcs sont hébergés globalement 1 par box mais les boxes communiquent entre eux. Les animaux seront 3 par groupes, pour éviter l’isolement. La nourriture est distribuée au sol afin de favoriser le comportement de fouissage ; Le contact est réalisé à minima 3 fois par jour, pour le change de la litière, la distribution de nourriture et d’eau. Les porcs sont ainsi habitués à la présence de l’Homme dans le box/l’environnement et à son contact (tête, dos…). Des morceaux de pommes et des caresses sont distribués comme récompenses. Quotidiennement sont observés la prise alimentaire et de boisson, le comportement de fouissage, l’absence de bagarre, le temps passé couché pendant la phase d’habituation. Ensuite, tout au long du protocole, la présence/absence de ces mêmes comportements sont observés. Sont contrôlés également l’abattement, la position voussée du dos, la réticence au déplacement pouvant indiquer par exemple une douleur abdominale, de la fièvre... Les animaux sont gardés dans une animalerie avec un cycle d’alternance jour/nuit de 12h/12h. Des jouets en plastique fixés au mur ou ballon en plastique au sol sont mis à disposition. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse avec prémédication incluant anti-inflammatoire et opioïde pour la prise en charge de la douleur. Les animaux sont placés sur tapis chauffant tout au long de la chirurgie. En période post-opératoire, la douleur est prise en charge par des anti-inflammatoires, éventuellement associés à des opioïdes si besoin. Lors de la première chirurgie, un cathéter central sera mis en place pour limiter le nombre de piqûres et de gestes invasifs pour prélèvements sanguins. Les porcs sont surveillés de façon quotidienne au niveau du comportement et de la prise de la température. La surveillance hebdomadaire du poids sera également réalisée.
Choix des espèces
Le modèle de l’infection de prothèse aortique chez le porc est utilisé dans cette étude. Sur le plan scientifique, c’est l’animal le plus utilisé dans les domaines de la recherche en chirurgie aortique, la majorité des techniques chirurgicales sont expérimentées sur le porc. Les mécanismes d’action, au sein de l’organisme, des produits de cette étude, l’antibiothérapie et la phagothérapie, sont proches de celles de l’homme. Le modèle d’infection de prothèse aortique à Staphylocoque (bactérie étudiée dans cette étude) chez le porc est un modèle qui a été standardisé et utilisé dans de nombreuses études expérimentales. Sur le plan technique, le porc se rapproche le plus de l’homme. En termes d’anatomie vasculaire et d’hémodynamique. La technique chirurgicale, le risque de traumatisme chirurgical et infectieux, sont strictement comparables. Sur le plan éthique, cette espèce est la plus susceptible de survivre à une infection sévère comme les infections de prothèses aortiques. Elle présente une résistance étudiée et connue à la chirurgie aortique, et à ses complications. Nous utiliserons le modèle de l’infection de prothèse aortique chez le porc (30- 35 kg). Ils sont âgés de 10 semaines au début du protocole. Le choix s’est orienté vers des porcs de poids peu élevés, et s’explique de plusieurs manières. En effet cela permet de faciliter la manipulation des animaux, et de diminuer ainsi le stress ressenti. Cela permet également de faciliter la chirurgie, avec des conditions anatomiques plus favorables, et donc un meilleur taux de succès chirurgical. L’injection du traitement sous-scanner est également facilité par le choix de porc de petite taille, afin d’être adapté à la taille de la machine.
Déterminisme génétique de la résistance àl’arthrite Encéphalite Virale Caprine (CAEV) chez les caprins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
570 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue. Elles subissent des prises de sang annuelles, soit 2 à 7 prélèvements sur cinq ans, pour rechercher un déterminisme génétique de la résistance à l'arthrite encéphalite virale caprine. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés selon l'avis vétérinaire et que la contention peut provoquer un stress léger et des hématomes. Il revendique que la génétique de la réponse à la maladie 'ne peut être étudiée qu'in vivo'.
Objectifs
Des données récentes de la littérature suggèrent que la prédisposition aux maladies lentivirales, comme par exemple l’Arthrite Encéphalite Virale Caprine (appelée CAEV) des caprins ou son équivalent chez les ovins (appelée Maedi-Visane) a une composante génétique. Dans une ferme expérimentale au Brésil, l’analyse de tests Elisa, sur plus de 500 chèvres de race Saanen et Alpine, a montré que l’héritabilité de l’occurrence du CAEV se situe entre 2.6 et 12.8 % (Bibliographie). Par ailleurs, une équipe américaine a publié la découverte d’une mutation dans un gène impliquée dans la réponse à l’infection par les lentivirus rétroviraux responsables du Visnae-maedi chez les ovins (bibliographie). L’étude portait sur un ensemble 3545 sérologies, dont un sous ensemble de 69 cas-contrôles génotypés avec une puce à ADN haut débit a permis d’identifier le marqueur génétique responsable de la résistance/sensibilité. Ces résultats ouvrent donc des perspectives d’étude et de gestion génétique de cette maladie dans nos populations françaises de caprins. L’objectif de notre projet est de créer un dispositif cas-contrôle dans l’espèce caprine pour une étude d’association tout génome. Pour cela nous phénotyperons une population de 570 chèvres Alpines de l'Etablissement Utilisateur pendant 5 ans. Le phénotypage consistera à réaliser des sérologies CAEV annuelles, et d’observer la présence d’arthrite (gros genoux). L’ensemble des 570 chèvres sera génotypé avec une puce à ADN caprine haut débit. Un sondage sérologique a confirmé la présence du virus dans l’élevage. Avec une prévalence de cas positif présumée de 90%, nous projetons d’obtenir un dispositif d’au moins 55 chèvres négatives et leur contrôle pour conduire l’analyse d’association tout génome.
Bénéfices attendus
CCe projet permet en premier lieu de dresser un état des lieux du statut sanitaire CAEV du troupeau pour aider à sa gestion en local (réforme des animaux séropositifs et cliniquement atteints) Ce projet permet surtout d’initier une première étude du déterminisme génétique de la résistance des chèvres au CAEV. Le cas échéant, les résultats pourront être utilisés par les éleveurs et les organismes de sélection pour sélectionner des chèvres plus résistantes ou résilience (moins de symptômes) au CAEV.
Procédures
Les animaux sont soumis à des prises de sang annuelles, soit 2 à 7 prises de sang maximum en 5 ans. Soit un volume de sang prélevé inférieur à 100 ml maximum correspondant à moins de 2% du volume total de l'animal sur une période 5 ans. La duurée de la prise de sang est inferieure à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang. Une nuisance éventuelle serait l'apparition d'hématome suite aux prises de sang effectuées.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie. Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres ne subissent que des prises de sang Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire et vétérinaire SBEA
Remplacement
La génétique de la réponse au CAEV implique des mécanismes biologiques complexes, qui incluent différents aspects de l’expression de la maladie (sérologie, expression clinique articulaire) qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.
Réduction
Nous demandons une saisine pour 570 chèvres. Cet effectif se justifie comme suit. Les marqueurs génétiques SNP de la puce qui seront étudiés (N~ 50 000) sont bi allélique. La fréquence de ces allèles est de 0.3 en moyenne. Nous voulons observer des différences de 10% de fréquence entre les cas et les contrôles. Pour cela il nous faut un minimum de 55 chèvres cas et 55 chèvres contrôles. Avec 570 chèvres phénotypées et génotypées et une prévalence supposée de 90% de positifs, nous prévoyons donc d’obtenir au moins 55 chèvres négatives que nous pourrons apparier facilement à 55 chèvres contrôle. Les analyses statistiques des marqueurs génétiques, dans les groupes cas et contrôle, s’appuieront sur des analyses d’association tout génome à l’aide de modèle polygénique, incluant l’effet des génotypes et faisant appel aux principes de l’analyse de variance.
Raffinement
Les chèvres seront hébergées en groupe, sur une litière paillée. Le milieu sera enrichi avec des brosses et des plateformes en bois. Elles seront nourries à volonté. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être manipulés. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué, en massage sur les veines, en cas de besoin. Les chèvres ont l’habitude d’être manipulée par des manipulateurs expérimentés et habilités (animaliers) qui côtoient ces animaux quotidiennement.
Choix des espèces
L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. La génétique de la réponse au CAEV implique des mécanismes biologiques complexes, qui incluent différents aspects de l’expression de la maladie (sérologie, expression clinique articulaire) qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo. Nous utilisons des chèvres non gestantes en lactation, afin d’évaluer l’effet de leur génétique sur leur statut sanitaire vis-à-vis du CAEV et évaluer l’éventuel impact sur l’inflammation mammaire et la production laitière.
Etude de l’innocuité d’un peptide chez la souris en vue de son utilisation pour le traitement de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
6 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour vérifier l'innocuité d'un peptide destiné à un futur essai sur la maladie de Parkinson. Chaque animal subit 16 pesées, 10 injections quotidiennes et une sédation sous anesthésie. Les 3 souris ayant reçu le peptide seront tuées pour une autopsie des organes, les 3 autres réutilisées. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour démontrer l'innocuité et n'a prévu aucune analyse statistique vu le faible effectif.
Objectifs
La maladie de Parkinson fait partie des maladies neurodégénératives progressives qui affectent le système nerveux central entraînant la mort des cellules nerveuses. Elle est la deuxième maladie neurodégénérative en France et sa prévalence augmente fortement avec l'âge. Elle est associée à la perte de neurones dans le cerveau et dans les neurones survivants, on observe la présence d’amas de protéines qui perturbent leurs fonctionnements. La plupart des thérapies actuelles n'atteignent pas leurs cibles car elles sont incapables de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (membrane qui protège le cerveau des infections, des hormones et des toxines circulant dans le sang), elles procurent un soulagement temporaire des symptômes mais elles sont aussi accompagnées d’effets secondaires graves. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une précédente étude qui démontrait la capacité ou non de peptides à passer la barrière hémato-encéphalique. Parmi dix peptides testés, nous avons démontré que trois peptides étaient capables de la passer. Parmi ces trois peptides, nous avons sélectionné un peptide candidat en raison de l'intensité et de la stabilité du signal de fluorescence dans le cerveau des souris à plus de 6 heures post-injection. Nous n'avons pas observé d'effets délétères de ce peptide chez la souris lors des études précédentes. Son efficacité thérapeutique va être prochainement testé dans un modèle de souris parkinsoniennes afin de montrer que son interaction, avec les protéines cibles, permet de stopper les symptômes (tremblements, raideur musculaire et instabilité de la posture). Nous souhaitons, avant de démarrer l'étude d'efficacité chez la souris parkinsonienne, confirmer l'innocuité de ce peptide suite à des injections répétées chez une souris non-parkinsonienne. L'objectif est de se calquer sur le schéma thérapeutique qui sera utilisé pour l'étude d'efficacité, nous utiliserons les mêmes modalités d'injection et de durée afin de démontrer l'innocuité du peptide.
Bénéfices attendus
Cette étude a pour but de démontrer l'innocuité du peptide avant d'initier une étude thérapeutique chez des souris ayant la maladie de Parkinson.
Procédures
Les souris seront soumise à un total de 16 pesées d'une durée de 30 secondes (1 pesée journalière de stress léger), à une injection journalière d'une durée de 30 secondes pour un total de 10 injection (stress et douleur légère) et à une sédation par anesthésie d'une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La préhension de l’animal pour les pesées quotidiennes peut induire un stress d'intensité faible d'une durée d'environ 30 secondes, au total les animaux auront 16 pesées. Les injections engendreront un stress et une douleur légère d'environ 30 secondes, au total les animaux auront 10 injections. Nous posons l'hypothèse que des effets indésirables de gravité légère à modérée pourront être observés (modification de l'apparence, perte de poids, inactivité ou une mobilité réduite), ces effets pourront être de durée variable allant de quelques minutes à plusieurs heures.
Devenir
Les 3 souris injectées avec le peptide seront mises à mort pour réaliser une autopsie macroscopique des tissus et organes.
Remplacement
L'objectif étant de démontrer l'innocuité du peptide chez la souris, il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, ceci impose d'avoir recours à des animaux.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux, 3 souris par groupe. Aucune analyse statistique ne sera réalisée.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 4-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. Les animaux seront suivis tout au long de la procédure et le registre de soins complété en se rapportant à la grille de soins.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris sauvages d'un fond génétique défini qui correspond à celui des souris développant la maladie de Parkinson. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 7 semaines, adultes et matures sexuellement, dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors d'étude sur l'innocuité de médicament.