Recherche appliquée

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes d'enregistrement cérébral, puis des stimulations sonores et des injections de composés pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant vingt-huit jours. Le porteur, qui travaille pour un donneur d'ordre, veut identifier des marqueurs cérébraux transposables à l'humain pour tester des molécules contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent pas être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques.

Objectifs

Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Consciente des limites des traitements actuels, l’industrie pharmaceutique investit du temps et de l’argent pour tenter de mettre sur le marché de nouvelles thérapies du Système Nerveux Central avec un axe prioritaire sur les troubles de la mémoire, de la perception ou encore les troubles psychiatriques (en 2013, 287 molécules en développement pour la maladie d’Alzheimer et 110 molécules pour la Schizophrénie). L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des marqueurs biologique des pathologies utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel translationnel de cette méthode. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et utilisation de marqueurs d’évaluation d’efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables entre les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris afin de modéliser des pathologies neurologiques et psychiatriques. Nous cherchons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur des modèles animaux de pathologies neurologiques. Ces marqueurs biologiques translationnels nous permettront également de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée, un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après une administration d’un composé médicamenteux. Lors des tests pharmacologiques en administration longues durée, les injections peuvent être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Afin de prévenir toute douleur lors de cette neurochirurgie, une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Il est possible que les animaux aient un léger sursaut à la première stimulation sonore mais les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress à long terme sur les animaux. Certains animaux subiront également des traitements pharmacologiques ; l'injection peut induire un stress, une douleur au site d’injection mais sur un temps très bref de quelques secondes. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Lors des expériences, les animaux seront installés dans des isoloirs, ils seront libres de leurs mouvements mais dans un espace réduit.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans ce projet, les changements des activités cérébrales enregistrées par éléctroencéphalogramme seront mesurés pour les activités de base. Pour les activités cérébrales induites par des stimulations sonores, nous évaluerons les réponses électriques enregistrées. Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents.

Raffinement

Après une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement, les souris subiront une neurochirurgie. Une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et de définir les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton, maison en carton). Pour les expériences d’enregistrements évoqués, les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédentes réalisées par le client. Les animaux sont manipulés au minimum à l'âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures et présentent des caractéristiques matures.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une injection intratumorale de nanoparticules d'or suivie d'une irradiation laser sous anesthésie, un groupe subissant à la place l'ablation chirurgicale de la tumeur. Le porteur indique que l'hyperthermie du traitement peut provoquer une douleur, gérée par anesthésie et analgésie. Il justifie le recours à l'animal par un microenvironnement tumoral trop complexe pour de simples cellules en culture.

Objectifs

Nous travaillons sur le développement de nanoparticules (NP) d'or pour le traitement par PTT (photothermie plasmonique) de carcinomes basocellulaires. En excitant les NP avec un laser émettant dans l'infra-rouge, on génère une hyperthermie suffisamment importante pour détruire les cellules par apoptose. Des études in vitro et in vivo ont déjà été menées sur nos NP et ont permis de démontrer une efficacité : induction de mort cellulaire, régression partielle ou totale des tumeurs. L'objectif de cette étude est d'optimiser les paramètres du traitement afin d'obtenir la meilleure efficacité possible de notre traitement (idéalement 100% de régression totale) sur ce modèle et d'effectuer une comparaison avec le traitement de référence actuel qui est la chirurgie. Si la chirurgie est relativement efficace pour ce type de cancer, elle a l'inconvénient de laisser des cicatrices inesthétiques. Or comme ce cancer se produit généralement sur les zones exposées au soleil et donc visibles telles que le visage, cela peut avoir un impact important sur la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seront de valider le schéma thérapeutique qui pourra être appliqué en clinique et apporter la démonstration aux cliniciens que la PTT peut être utilisée en remplacement de la chirurgie.

Procédures

Tous les animaux subiront une greffe de cellules en sous cutanés (100μl sur le flanc droit sous anesthésie gazeuse d'une durée d'une à deux minutes). Une dizaine de jours plus tard, les animaux de 7 groupes subiront une injection intratumorale sous anesthésie gazeuse d'une durée d'une à deux minutes suivi 30 minutes plus tard d'une irradiation laser (10 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d'un analgésique en sous cutané), et ce, 1 ou 2 fois à 3 ou 14 jours d'intervalle. Un groupe d'animaux subira une résection chirugicale du volume tumoral. Toutes ces manipulations seront réalisées sous anesthésie gazeuse couplée à une injection d'anlagésique (buprénorphine injectée en sous cutanée).

Impact sur les animaux

Il est possible que l'hyperthermie générée lors du traitement soit la cause d'une douleur, c'est pourquoi le traitement se déroulera sous anesthésie gazeuse et un analgésique sera injecté quelques minutes avant le traitement. Si nécessaire d'autres injections d'analgésiques seront réalisées. Pour les animaux subissant la chirurgie il est possible que les sutures générent un inconfort ou une douleur, si tel est le cas des injections d'analgésiques seront réalisées et des granulés mouillés seront disposés au fond des cages pour faciliter l'accès des animaux à l'eau et la nourriture.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude car elles seront soient porteuses de tumeurs soient présenteront une régression compléte qu'il faudra confirmer en histologie.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées en amont pour démontrer l'efficacité d'un tel traitement mais le microenvironnement tumoral étant plus compliqué que de simples cellules en culture il est nécessaire de passer sur des modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Les conditions à tester ont pu être limitées grâce aux études précedemment réalisées.

Raffinement

Lors de l'irradiation et de la chirurgie, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse et un analgésique sera injecté quelques minutes avant l'irradiation au cas où l'hyperthermie engendrerait une douleur. Par ailleurs, des points limites ont été établis, entrainant la consultation d'un vétérinaire qui décidera soit de la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire ou des soins à lui apporter.

Choix des espèces

Afin de pouvoir évaluer de nouvelles thérapies, les modèles animaux sont un passage obligatoire après l'évaluation in vitro (sur des cellules en culture). Le rongeur est le modèle le plus utlisé actuellement pour l'évaluation de nouvelles thérapies. Le modèle retenu pour cette étude est un modèle murin car il a déjà été documenté et pour le choix des souris il s'agit de souris Athymic nude qui sont immunodéprimées et ne vont ainsi pas rejeter les cellules tumorales humaines qui vont leur être greffées. Pour finir, l'étude ne portera que sur des souris femelles car aucun effet sexe n'a été observé précedemment et ce seront des animaux adultes de 6 à 8 semaines seront utilisés car les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes.

295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation nasale d'adénovirus qui déclenche des tumeurs pulmonaires, puis des injections intrapéritonéales répétées de thérapie ciblée, de chimiothérapie et d'immunothérapie pendant vingt semaines, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs, invisibles de l'extérieur, peuvent provoquer une insuffisance respiratoire et une cachexie, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients atteints de ce cancer du poumon restent au conditionnel, et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'anticorps.

Objectifs

Le carcinome squameux du poumon (LUSC) est un sous-type courant de cancer du poumon. Il est la deuxième cause de décès liée au cancer du poumon, causant environ 400 000 décès par an dans le monde. La grande majorité des patients atteints de LUSC sont de gros fumeurs actuels ou anciens indiquant une forte association de la pathologie au tabagisme. Contrairement à d'autres sous-types de tumeurs du poumon, il n'existe pas encore de thérapies ciblées approuvées pour le LUSC, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise en prérequis à étudier le développement tumoral dans un modèle murin de LUSC. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie ou une immunothérapie sur le développement des tumeurs dans ce modèle murin. Nous analyserons pour cela l’incidence et la progression tumorale. La pertinence de notre thérapie ciblée sera également évaluée par ablation génétique de son gène. De manière secondaire, nous étudierons la biologie de notre cible thérapeutique dans ce même modèle à l’aide de systèmes rapporteurs d’expression.

Bénéfices attendus

Des options thérapeutiques limitées sont disponibles pour le LUSC à un stade avancé. Malgré une compréhension plus approfondie des altérations génétiques qui caractérisent les LUSC et des années de travaux d'essai ciblant ces altérations, les thérapies personnalisées restent peu satisfaisantes. Seule l'immunothérapie a marqué la première amélioration substantielle de la survie globale des patients atteints de LUSC depuis plus d'une décennie, mais moins d’un tiers des patients montrent un bénéfice au traitement. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de notre cible thérapeutique (et de son activité en association avec des chimiothérapie et des immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Prélèvement tissulaire sur animaux vigiles, de 2 mm au niveau de la queue pour génotypage à 4 semaines postpartum. 1X 5 sec. Marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. 1x 5 sec. Pour l'injection de virus: Anesthésie par injection. 1X 20 sec. Durée de l'anesthésie 5 min. Pour l'imagerie intra-vitale: Anesthésie gazeuze. 1X20 sec toutes les 4 sem de 4 à 40 sem post-infection. Durée de l'anesthésie 10 min. Instillation nasale de virus 1X 5 min. Injections intraperitonéales sur animaux vigiles : Thérapie ciblée injections 2X/sem pendant 20 sem, 20 sec. Immunothérapie 2X/sem pendant 5 sem, 20 sec. Chimiothérapie 1x/sem pendant 20 sem, 20 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux sont anesthésiés pour procéder à l’instillation nasale des adenovirus. La manipulation des souris et les diverses injections intrapéritonéales peuvent générer du stress à l’animal. L’instillation nasale des virus peut provoquer de légères lésions au niveau des narines ainsi qu’induire de la toux. Les tumeurs induites par l'adénovirus se développent au niveau pulmonaire. Elles ne sont par conséquent pas visibles de l’extérieur et peuvent occasionner une insuffisance respiratoire. Les contentions lors des pesées et des traitements peuvent générer du stress. Les méthodes d’imagerie imposent des manipulations, du transport et de l’anesthésie par inhalation qui sont autant de stress pour l’animal. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les animaux peuvent présenter des blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ce modèle de souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés pour analyse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’étude de la biologie de notre cible thérapeutique a été réalisée sur des lignées cellulaires au préalable. Des analyses d’expression ont été effectuées sur les données publiques. L’ensemble des résultats obtenus nous a conduit à la nécessité de recontextualiser les cellules tumorales dans leur environnement. La complexité des réponses thérapeutiques de certains traitements anticancéreux rend difficile leur étude sur des lignées cellulaires. Les modèles murins représentent en ce sens un modèle adapté qui intègre la dynamique des nombreux type cellulaires impliqués dans la mise en place de ces réponses. De plus, le modèle génétique utilisé récapitule parfaitement toutes les étapes de développement de ce type de cancer pulmonaire. Son utilisation est donc nécessaire pour évaluer l’effet d’une thérapie sur l’incidence et la progression de la maladie. La présence de tous les différents types cellulaires est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité dde notre traitement. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité de notre anticorps dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Les travaux actuellement publiés sur ce modèle de tumorigénèse n’indiquent pas la variabilité d’apparition des tumeurs chez les individus et ne permet donc pas une évaluation du nombre d’individus par une approche de calcul statistique. Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience sur la réponse aux traitements utilisés dans d’autres modèles et pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Les effectifs seront évalués au regard de la variabilité observée dans les premières expériences de mise en place du modèle. La stratégie de production des animaux et d’entretien la lignée génétiquement modifiée permet de réduire le nombre d’individus avec un génotype non désiré. 40 souriss seront utilisées pour réaliser un suivi longitudinal afin d’identifier l’hétérogénéité et la rapidité du développement tumoral de ce modèle de 20 à 40 semaines. Les temps de mise à mort pour le reste des proédures pourront être redéfinis au regard de ces résultats. L’autopsie des animaux sera réalisée afin de quantifier les lésions pulmonaires et détecter d’éventuelles invasions métastatiques (celles-ci n’ayant pas été décrites aux temps réalisés dans ce modèle). Certaines expérimentations seront faites 2 fois pour permettre différents types de prélèvements tissulaires. Les effectifs tiennent compte de la variabilité des effets de l’immunothérapie et de la chimiothérapie observée dans d’autres protocoles identiques. Dans un but de réduction, la répétition de ces expériences ne sera pas réalisée en cas d’absence d’effet mesuré. Les effectifs évalués prennent en compte la mise au point des protocoles de traitement des échantillons biologiques récupérés.

Raffinement

Dans ce modèle de souris, des petites lésions pulmonaires apparaissent à partir de la semaine 30 post induction avec le virus. 100% des animaux présentent des lésions entre 40 et 50 semaines. Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des expériences, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 30 semaines. Des signes d’insuffisance respiratoire, d'amaigrissement et de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu à partir de 20 semaines permettant un réchauffement des individus seront mis en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifiées utilisé est capable de générer des tumeurs pulmonaires représentatives uniquement du sous-type désiré, dans 100 % des souris et qui récapitulent les aspects génétiques, moléculaires et microenvironnementaux de la maladie humaine. L'administration nasale de virus permet la spécificité d’organe. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis pharmacologique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux, de la chimiothérapie ou de l'immunothérapie. Par ailleurs la posologie des drogues utilisées est bien standardisée (voie, doses, volumes, etc...) contrairement à d'autres modèles tels que le poisson zèbre. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris jeunes adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi. Le développement tumoral pulmonaire commence à partir de 20 semaines suivant l'administration nasale de virus.

200 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements sanguins et des chirurgies d'implantation de dispositifs urologiques pouvant durer plusieurs heures sous anesthésie, avant une mise à mort suivie de nécropsie et d'examen des tissus. Le porteur décrit des suites post-opératoires douloureuses pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité. Il affirme que l'expérimentation sur "organisme entier" est "incontournable" et relève d'une "obligation règlementaire" pour valider ces dispositifs implantables.

Objectifs

La chirurgie uro-néphrologique s’est développée rapidement dans la deuxième moitié du XXème siècle avec par exemple l’avènement de la transplantation rénale (années 60-70), ou encore de l’hémodialyse (années 50-60) permettant de sauver des millions de personnes par an, le développement de nouvelles technologies comme les circuits extracorporels avec filtre de dialyse permettant la déviation du sang vers un filtre externe et ainsi sa purification artificielle. Il est possible dès lors de pallier des dysfonctions importantes du rein par exemple. De même, le traitement des affections prostatiques, tumorales par exemple a fait des progrès immense grâce par exemple à l’avènement de techniques chirurgicales peu invasives. Les progrès diagnostiques et thérapeutiques se développent rapidement pour l’ensemble des organes de l’appareil urinaire et ses annexes. L’évaluation et le développement de nouvelles méthodes, molécules, dispositifs et techniques pour les affections de l’appareil urinaire et ses annexes par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessitent une phase de recherche pré-clinique et développement qui permet de mettre au point ces méthodes et d’en vérifier leur sécurité. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - les suites postopératoires (inflammation, douleur : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), pour cela des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple la protection des plaies, l'usage de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients humains représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être de tous les stades de développement : juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cytokines inflammatoires, dont jusqu'à six injections directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral, pour provoquer une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, puis subissent des tests comportementaux avant d'être tués. Le porteur reconnaît qu'il lui est "impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l'expérience", puisque c'est la douleur elle-même qui est étudiée. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo de l'intégration de la douleur.

Objectifs

La douleur est un processus physiologique nécessaire à la survie : elle prévient l’organisme d’un danger imminent et permet la mise en œuvre de réponses adaptées qui visent à en limiter les effets délétères. Cependant, lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui aparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Les traitements disponibles ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux traitements, et pour ce faire, de déchiffrer les mécanismes responsables de l’apparition de ces douleurs chroniques. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. En condition physiologique, les informations non douloureuses et douloureuses ne sont pas intégrées au même niveau du tronc cérébral, permettant ainsi de dissocier distinctement les deux modalités sensorielles (tact et douleur). Cependant, en condition pathologique, comme dans le cas de l’allodynie, le tact va être capable de devenir douloureux. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans l'apparition de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation de canaux astrocytaires, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Diverses études démontrent que certaines molécules libérées, dont les cytokines, sont capables d’activer les astrocytes. C'est pourquoi nous nous intéresserons à savoir quelle cytokine induit un dysfonctionnement et de déterminer si son blocage a des effets bénéfiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation d'un canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Injections intra-péritonéales : ces injections(

Impact sur les animaux

Injectant des cytokines pro-inflammatoires chez l’animal, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (lésion de notre région d’intérêt lors des injections intracisternales, problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections médullaire et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et immunohistochimiques seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g.Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à J+7 après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg). Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 5 et de 5 à 8 semaines (de 3 à 8 semaines), pour comparer avec les données du laboratoire.

213 rats immunodéficients vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée sous anesthésie, puis ils reçoivent pendant quatre semaines des injections d'un anticorps testé contre les lymphomes T, avec suivi de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut nécroser ou s'ulcérer et devenir douloureuse, l'animal étant tué si elle dépasse 10 % de sa masse corporelle. Il affirme avoir déjà validé l'anticorps in vitro mais juge "nécessaire" de le confirmer dans un environnement "plus physiologique" pour préparer un essai clinique.

Objectifs

Les lymphomes T périphériques appartiennent au groupe des lymphomes non hodgkiniens. Diiférents sous-types de lymphomes T existent mais ils se caractérisent tous par un pronostic sombre. Le pronostic des lymphomes T périphériques traités par polychimiothérapie conventionnelle reste médiocre. L’association Cyclophosphamide, Doxorubicine, Vincristine, Prednisone (CHOP) en reste l’un des traitements de référence mais le taux de lymphomes réfractaires primaires avoisine les 30%. Lors d’un contrôle de la maladie à 5 ans tout type confondu, ce taux n’est d’environ que 20% chez les patients. Il semble primordial de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques, qui pourraient être fondées sur l’administration de thérapies ciblées. Nous avons développé un nouvel anticorps polyclonal dirigé contre un large spectre de cibles antigéniques exprimées à la surface de différents sous-types de lymphomes T.

Bénéfices attendus

Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre anticorps polyclonal et ainsi d’offrir une vraie alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sous anesthésie également. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements avec les anticorps polyclonaux(2 fois par semaine pendant 4 semaines) ou une fois par intraveineuse pour l'admnistration de la chimiothérapie sous anesthésie. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par rat. Les injections intraveineuse ou intra-péritonéale seront également < à 5 min par rat. Les manipulations des rats pour les mesures des tumeurs avec le pied à coulisse se feront aussi sous anesthésie et n'excèderont pas 5 min. Elle seront couplées 2 fois par semaine à l'admnistration des traitements , de manière à ne pas multiplier les manipulations et anesthésies sur les rats

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur devient trop importante (pas plus de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles PTCL peuvent induire une augmentation de la taille de la rate, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des rats seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts (rates, ganlions) ainsi que des prélèvements sanguins pourront être récupérés pour compléter les analyses

Remplacement

L’efficacité de notre anticorps polyclonal a d’abord été validé in vitro par la reconnaissance de biopsies de patients puis la cytotoxicité tumorale a été confirmée par des expérimentations in vitro sur des lignées cellulaires. Cependant Il est nécessaire de confirmer cet effet dans un environnement plus physiologique. Cela nous permettra d’évaluer la biodistribution de notre produit dans les tissus et en intra tumoral, de déterminer la dose nécessaire et la fréquence d’administration chez l’homme dans un essai clinique basée sur les calculs de demi-vie et de pharmacocinétiques obtenus chez le rat.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 8-10 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d'animaux a été déterminé en utilisant un logiciel statitisque permettant de définir le nombre d'animal optimal permettant de répondre à la question biologique posée de manière statistique.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si il n'est pas possible de la supprimer par des traitements médicamenteux. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 3 pour limiter le stress de la surpopulation. Les animaux disposeront d'un igloo en PVC.

Choix des espèces

Le rat RRGS est un rat immunodéficient qui présente un complément actif, indispensable pour le mode d’action de notre anticorps. De plus, ce modèle a déjà été utilisé pour mettre en place des modèles de tumeurs humaines Animaux : 4-8 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge et le poids des rats est encore faible et permet donc de réduire la quantité d'anticorps polyclonaux qui seront admnistrés

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée Harlequin utilisée présente d'elle-même un retard de croissance, une ataxie, une perte de vision et, pour une partie des animaux, hydrocéphalie, prolapsus pénien ou dermatite ulcéreuse, avant même le protocole d'injection intraveineuse d'un gène-médicament et les neuf tests comportementaux. Le porteur indique que 20 souris seront écartées pour anomalies et que la mise à mort sert à prélever cervelet et cerveau. Il affirme que la preuve d'efficacité "ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l'animal", les approches in vitro restant selon lui insuffisantes.

Objectifs

Les maladies neurologiques liés à un gène défectueux sont incurables malgré les progrès de la génétique de ces 35 dernières années. Il a été démontré que des anomalies mitochondriales sont très souvent impliquées dans ces maladies. Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Les pathologies mitochondriales affectent un adulte sur 5000 ; le système nerveux central est atteint dans la grande majorité des patients et à ce jour aucune thérapie efficace n’existe pour améliorer leur qualité de vie. Nous avons pour objectif de développer un traitement conduisant à la surexpression du gène qui code une protéine mitochondriale sur laquelle nous travaillons depuis 12 ans et qui possède des propriétés protectrices de la fonction des neurones. Ce traitement va consister à injecter, grâce à un vecteur approprié, le gène dont nous comptons augmenter l’abondance de notre protéine d’intérêt par voie intraveineuse chez un modèle de souris souffrant d’une maladie mitochondriale qui entraine, entre autres, une ataxie cérébelleuse (trouble de l'équilibre et de la coordination). Le but de notre projet de recherche est donc de démontrer qu’en augmentant la quantité de notre protéine d’intérêt dans le cerveau et cervelet, nous pourrions améliorer l’état de santé générale de nos animaux grâce à la diminution de leurs troubles moteurs. Ainsi, une étude clinique pourrait être développée pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant d'un éventail de maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Toute anomalie des mitochondries est responsable des pathologies graves qui affectent des tissus à forte demande énergétique (cerveau, cœur, muscle, foie) nommées « maladies mitochondriales ». Ces maladies sont très fréquentes (1 adulte sur 5000) et aucun traitement n’existe permettant de les soigner efficacement et de façon pérenne les patients. L'objectif de notre projet de recherche est de développer un traitement conduisant à une expression élevée du gène de notre protéine d’intérêt. Cette protéine se localise dans les mitochondries et possède des propriétés neuroprotectrices ; le traitement vise à augmenter son abondance dans les neurones. Si nous parvenons à montrer le rôle bénéfique de cette protéine pour la survie des neurones chez les souris Harlequin, nous pourrons ensuite montrer son efficacité dans d’autre modèle de maladies mitochondriales et ainsi une étude clinique chez l’Homme pourrait être initiée dans le cadre d’une grande variété de maladies neurologiques. Elle visera à améliorer les conditions de vie de patients pour lesquelles aucune thérapie n’a démontré son efficacité à ce jour.

Procédures

Le modèle expérimental utilisé présente des signes cliniques dommageables de par sa modification génétique : retard de croissance, perte de poids, atrophie musculaire, déficits moteurs, perte de la vision, troubles de l’équilibre et de la coordination. Ils sont dus à la perte des neurones dans le cerveau et le cervelet car ils ne produisent pas l’énergie requise pour assurer leur bon fonctionnement. Le gène médicament que nous testerons sera administré aux souris par voie intraveineuse. Cette injection se fera sous anesthésie générale et ne durera au maximum que 4-5 minutes. Chez certains animaux, un prélèvement de sang, sur l’œil non injecté, sera réalisé deux mois après le traitement pour vérifier l’absence du médicament dans le sang périphérique et permettre la sortie des souris traitées de la zone de confinement. Ce prélèvement se fera sous anesthésie gazeuse et durera 2 à 3 minutes. Des tests comportementaux seront réalisés 2 et 5 mois après la thérapie génique ainsi que sur un groupe d’animaux non traités. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et seront répartis sur 10 jours à raison de 1 ou au maximum 2 tests par jour. Un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test.

Impact sur les animaux

Effets indésirable liés au modèle animal : Dès leur plus jeune âge, les souris étudiées présentent un retard de croissance avec un poids corporel plus faible que la normal et une alopécie importante avec des zones des poils irrégulièrement reparties dans le corps. À partir de 4 mois d’âge, ces souris développent une ataxie qui se caractérise par des troubles de locomotion, des pertes d’équilibre, de l’incoordination des mouvements et la réduction de la force musculaire. En géneral, une perte de la vision survient chez les souris entre 6 à 8 mois d’âge. Un petit pourcentage de ces souris souffre également de : - Hydrocéphalie, excès de liquide céphalo-rachidien dans le cerveau pouvant entraîner des troubles neurologiques (2 souris /100). - Microphtalmie, réduction de la taille du globe oculaire pouvant compromettre la fonction visuelle (2 souris/100). - Prolapsus pénien, gonflement des organes génitaux qui pourrait être douloureux et empêcher l’animal d’uriner normalement (4 souris/100). - Dermatite ulcéreuse, inflammation cutanée avec démangeaison ; elle est fréquente chez la souris Harlequin à cause de leur alopécie. Effets indésirables liés au projet : Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse ; cette dernière pourrait produire de l’hypothermie ou un arrêt respiratoire. Malgré sa rapidité, l’intervention pourrait entraîner du stress chez l’animal enfin dans de rares cas un petit saignement à l’œil pourrait se produire. Huit tests comportementaux seront réalisés, pendant 10 jours puis un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test. Cette série de tests sera effectuée 2 mois après l’injection et avant l’euthanasie, 3 mois plus tard. La réalisation de ces tests pourrait augmenter le stress chez l’animal de par leur fréquente manipulation mais aussi de la fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés lorsque le projet sera terminé pour pouvoir utiliser les cervelets / cerveaux pour les études histologiques, biochimiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

La démonstration de l’efficacité biologique de la thérapie génique avec notre protéine d’intérêt dans le modèle expérimental d’ataxie cérébelleuse ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l’animal. Elle combinera des évaluations morphologiques et fonctionnelles du cervelet mais aussi l’étude des capacités motrices et cognitives des souris traitées pour établir une amélioration de celles-ci suite à la thérapie, amélioration qui indiquera que leur cervelet fonctionne mieux. Les études in vitro ou ex vivo (cultures de neurones cérébelleux ou tranches de cervelet) pourraient être effectuées pour compléter les études histologiques. Cependant, les données récoltées in vitro resteront insuffisantes et ne permettront pas d’aboutir à une preuve de concept robuste dans le cadre de cette étude préclinique pour rédiger une demande d’autorisation d’un essai clinique chez l’homme.

Réduction

Pour ce projet nous allons utiliser au total 560 souris dont 310 souris souffrant de la pathologie : 250 entre elles recevront les différents traitements, 40 ne seront pas traitées pour nous servir de référence et 20 seront exclues car présentant des anomalies. Pour comparer les effets de nos traitements, 250 souris en bonne santé seront également utilisées : 220 recevront les différents traitements et 40 autres ne seront pas traitées. Ces nombres ont été rigoureusement définis en fonction de notre expérience sur le modèle des souris utilisées et grâce à un calcul de puissance et du nombre des souris nécessaires. Ainsi, la taille de chaque groupe de souris incluses dans les procédures a été définie afin de récolter suffisamment de données expérimentales pour appliquer des tests statistiquement robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées entre 2 et 4 par cage dans des portoirs ventilés, nourries et abreuvées ad libitum. Chaque cage comportera un environnement enrichi (maisonnette en plastique ou cellulose et coton). Les pièces de l’animalerie sont maintenues à 20-22 °C avec contrôle d’humidité et un cycle jour/nuit de 12 heures. Les injections intraveineuses de chacun des vecteurs chez les souris seront réalisées sous anesthésie volatile. Si une détresse respiratoire est observée pendant l’anesthésie, la quantité d’anesthésiant sera diminuée pour entraîner ainsi une meilleure oxygénation des souris. Le site d'injection sera examiné pour rechercher un saignement ou autre traumatisme. Chaque animal sera évalué les 2 jours qui suivent l’injection pour confirmer l’absence de blessure / inflammation ou signe de souffrance dans l’œil injecté et la grille d’évaluation sera renseignée. Les souris traitées seront évaluées à deux reprises (2 et 5 mois après la thérapie génique) pour établir leurs capacités motrices et cognitives en les faisant réaliser 9 tests comportementaux. Avant ces séances, les souris auront une semaine pour s’habituer à l’expérimentateur. Le jour du test, les souris seront installées dans la pièce 30 minutes avant celui-ci pour minimiser leur stress et assurer la fiabilité des données obtenues. Huit de ces tests seront répartis sur 10 jours, puis la semaine suivante le dernier test sera réalisé afin d’éviter l’angoisse, la fatigue ou le stress des animaux ; l’ordre de réalisation de tests sera également choisi pour réduire au minimum les nuisances chez les souris testées. Par ailleurs, tous les 2 jours pendant ces séances la grille d’évaluation sera remplie de manière détaillée et avec soin pour chaque souris ; des mesures adaptées seront prises si le bien-être des souris venait à être compromis suite à ces tests.

Choix des espèces

Le modèle de souris sur lequel nous travaillons est particulièrement adapté à notre projet de recherche puisqu’il reproduit fidèlement une maladie neurologique chez l’Homme dont la cause génétique est le dysfonctionnement des structures cellulaires responsables de la production d’énergie, les mitochondries. Comme l’anomalie génétique responsable de la pathologice chez ces souris se localise dans le chromosome X, les souris mâles présentent des symptômes plus graves que les souris femelles. En effet, ces dernières accumulent deux fois plus de la protéine déficitaire chez les mâles ; ceci réduit significativement la gravité de leurs symptômes. Ainsi, des souris mâles âgées de 26-28 jours recevront le traitement par voie intraveineuse. Les souris seront soumises à un ensemble de tests comportementaux et seront euthanasiées cinq mois après le traitement ; les cervelets seront récoltés pour des évaluations morphologiques et fonctionnelles.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par un paludisme murin, elles subissent des prélèvements sanguins à la queue tous les deux jours pendant un mois, une injection de bleu Evans puis une dislocation cervicale sous anesthésie, pour tester comme antipaludiques des molécules déjà employées contre d'autres maladies. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut entraîner une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids, la souche étant retenue justement parce que ces souris resistent bien à ces parasitémies. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit la complexité de l'infection et conclut à l'absence de "solution viable de remplacement".

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un repositionnement médicamenteux. Il vise à déterminer l'efficacité de molécules initialement utilisées pour traiter la tuberculose, des fascioloses ou bien encore des helminthiases, en tant qu'antipaludiques. Lesdites molécules ont préalablement été testées in vitro et sont issues des dernières générations de molécules produites pour les infections précédemment mentionnées. Elles présentent un intérêt chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà utilisées. L’injection au niveau abdominale de bleu evans permet, 1H avant la mort des souris, de marquer les tissus ayant subi des dommages et de les quantifier. Ces tissus sont récupérés après l’euthanasie et soigneusement conservés dans du formamide.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique

Procédures

Un premier lot de 2 souris subit un prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours et à partir de 7% de parasitémie, une anesthésie et un prélèvement rétro orbitaire seront réalisés - la totalité du sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées (durée 30 minutes) et décapitées pour récupérer les cerveaux intacts. Un autre lot de 40 souris subiront des prélèvements veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours accompagnés de pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale permettant de collecter le cerveau, le sang et les autres organes. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g ; tel que : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine.

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des rongeurs ou lagomorphes pour la cytotoxicité et la reprotoxicité et ayant conduit à leur autorisation de mise sur le marché dans le cadre de traitement humain (sutézolide) et vétérinaire (triclabendazole). Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité décrits dans la littérature. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’injection de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux elevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées. L’euthanasie se justifie par le prélèvement de la totalité du sang infecté pour le premier lot de 2 souris - il est également justifié pour le second lot de 40 souris ce qui permet de récupérer rapidement les organes vitaux des souris et le sang pour dosage médicamenteux. Les souris ne peuvent plus être infectée en raison des restes de médicaments et de la prise de poids

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% Nous prenons 8 souris, tq 4 mâles + 4 femelles par groupe afin de prévenir toute perte d'effectif qui rendrait statistiquement nulle l'expérience.

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’Etablissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. La Kétamine (100 mg/Kg) et la Xylazine (10 mg/Kg) avec une injection de 100µL pour 20 grammes de masse corporelle seront utilisés afin de limiter la douleur, notamment pour le retro orbitaire (procédure 1) et les anesthésies avant dislocations cérébrales en fin de procédure 2. De façon générale, Des aiguilles plus fines 29 gauge pourront être utilisées en complément d’une pommade (lidocaine) si les sites d’injection en intrapéritonéal deviennent sensibles pour les souris. En cas de difficulté d'alimentation des croquettes imbibées et des biberons aux tétines plus faciles d'accès peuvent etre également mis en place.

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus muculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. la simplicité et l'efficacité du modèle {BALB/c+Plasmodium berghei} en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique.