Recherche appliquée
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- Recherche appliquée
- Cancers
Une hémorragie, une hyperthermie, un trouble cardiaque ou respiratoire ou une douleur constatés pendant l'opération entraînent l'arrêt de la chirurgie. 12 porcs adultes, issus d'études antérieures, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, tous tués avant tout réveil. Pendant environ quatre heures, des chirurgiens gynécologues leur retirent l'utérus, les ovaires, l'omentum, la rate, une partie de l'intestin grêle et du péritoine, fixent par sutures 16 capteurs de lumière, remplissent l'abdomen d'une solution chauffée à 37 °C puis l'illuminent 30 minutes, pour tester un dispositif de thérapie photodynamique des cancers de l'ovaire étendus au péritoine. Le porteur écrit que l'arrêt doit permettre de "se concentrer sur le rétablissement de l'animal", et justifie l'absence de réveil par la volonté de leur "éviter un réveil difficile".
Objectifs
Des études précliniques ont permis de démontrer l'efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) sur la carcinose péritonéale ovarienne, actuellement en impasse thérapeutique. Trois études cliniques ont également mis en évidence la faisabilité de la PDT dans cette indication. La PDT a pour objectif de détruire les cellules tumorales résiduelles, laissées après retrait des tumeurs visibles à l'oeil nu, disséminées dans la cavité péritonéale afin d'éviter les récidives de la maladie. En pratique, la PDT pourrait être intégrée au standard de traitement en étant proposée durant la chirurgie de retrait des tumeurs, une fois l’intégralité de celles-ci réséquées. Cependant, aucun dispositif ne permet, à l'heure actuelle, l’illumination de façon homogène de la cavité péritonéale. Or celle-ci est essentielle à la réalisation d’une PDT efficace. C'est dans ce contexte que nous avons développé un tel dispositif d'illumination. A ce stade du projet, la dernière étape avant une étude clinique permettant de démontrer l'efficacité de la PDT sur les patientes atteintes de carcinose péritonéale ovarienne à l'aide du dispositif développé par notre laboratoire, est une étude de faisabilité préclinique sur le gros animal. Ainsi, les objectifs de cette étude préclinique de faisabilité sont au nombre de 4. L’objectif principal est de s’assurer de la faisabilité de l’illumination de la cavité péritonéale à l’aide du dispositif lumineux développé en vérifiant que celui-ci peut être installé facilement et rapidement dans la cavité péritonéale. Nous mesurerons également les quantités de lumière que notre dispositif est capable de délivrer à la cavité péritonéale une fois inséré dans le corps de la patiente. Nous nous intéresserons également à la lumière que délivre le scialytique, lampe située au-dessus du corps de la patiente durant la chirurgie, et potentiellement capable de générer un effet de PDT. Ainsi, le second objectif est de mesurer les doses de lumière délivrées par le scialytique en association avec le dispositif développé et le troisième objectif est de mesurer la dose de lumière délivrée par le scialytique durant l’intervention chirurgicale. Enfin, afin de maximiser les quantités de lumière délivrées dans la cavité péritonéale et ainsi l'effet thérapeutique de la PDT, nous souhaitons déterminer si une illumination à l’aide d’une partie du dispositif lumineux est possible pendant la chirurgie sans gêner le chirurgien opérant. Il s'agit du quatrième objectif.
Bénéfices attendus
Les cellules cancéreuses persistant à l’issue de l’intervention chirurgicale de cytoréduction sont responsables du taux élevé de récidives (60 à 70%). La PDT a pour but l’élimination de ces cellules tumorales résiduelles. L’étude préclinique faisant l’objet de cette demande vise à accélerer le positionnement de la PDT comme traitement adjuvant pour les patientes atteintes de carcinose péritonéale. L’objectif à long terme, est de réduire le taux de récidives et ainsi augmenter la survie globale des patientes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale qui durera environ 4h. Durant cette intervention, l’animal subira une série de gestes chirurgicaux (exploration de la cavité, retrait de l'utérus et des ovaires, retrait de l'omentum au niveau de l'estomac, retrait d'une partie du péritoine d’une coupole diaphragmatique, retrait d'une petite partie de l'intestin grêle, retrait d'une partie du péritoine derrière le foie, curage dans les zones dorsale et pelvienne et retrait de la rate) identiques à ceux que subissent les patientes atteintes de carcinose péritonéale d’origine ovarienne. La quantité de lumière délivrée à la cavité sera mesurée durant chaque geste grâce à des capteurs de lumière. Ces gestes ont également pour objectif de permettre la réalisation du test d’insertion du dispositif lumineux dans des conditions identiques à la pratique clinique. Des points de sutures seront réalisés sur le péritoine pour permettre la fixation de 16 capteurs de lumière (11 capteurs isotropiques et 5 photodiodes) et les textiles lumineux qui composent le dispositif lumineux (1 point de suture par élément). Une fois les capteurs de lumière et le dispositif lumineux (textiles lumineux et baguette lumineuse) en place, la cavité péritonéale sera remplie de solution diffusante chauffée à 37°C permettant une diffusion de la lumière dans la cavité péritonéale. S’en suivra une illumination de 30 minutes. A la fin de la procédure, l’abdomen de l’animal sera refermé et l’animal sera euhanasié.
Impact sur les animaux
L'animal, sous anesthésie générale, subira une série de gestes chirurgicaux à savoir : exploration de la cavité, retrait de l'utérus et des ovaires, retrait de l'omentum au niveau de l'estomac, retrait d'une partie du péritoine d’une coupole diaphragmatique, retrait d'une petite partie de l'intestin grêle, retrait d'une partie du péritoine derrière le foie, curage dans les zones dorsale et pelvienne et retrait de la rate. Ces gestes sont susceptibles d'entrainer des douleurs durant la chirurgie. Toutefois, un analgésique sera administré au début de l'intervention et au besoin, au fil de l'intervention, afin que l'animal ne ressente le moins de douleur possible. De plus, il ne sera pas réveillé, on ne prévoit donc pas de nuisances ou d’effets indésirables.
Devenir
Afin de leur éviter un réveil difficile après une procédure chirurgicale, les animaux ne seront pas réveillés de l’anesthésie. Ils seront euthanasiés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Une étude préalable sur un modèle de cavité péritonéale, développé au sein de notre laboratoire, a permis une optimisation des emplacements dans lesquels seront placés les dispositifs lumineux et les capteurs de lumière nécessaires à la réalisation de la dosimétrie. Le banc de mesure optique (capteurs de lumière, photodiodes et puissance-mètres), associé à ce modèle de cavité péritonéale, a également été défini et calibré sur la base de ces essais sur modèle de cavité péritonéale. Cependant, notre modèle ne tient pas compte des propriétés optiques des tissus biologiques et ne permet donc pas une estimation pertinente des quantités de lumière qui seront réellement délivrées au sein de la cavité péritonéale de la patiente en clinique. Ce modèle ne permet pas non plus de mimer une chirurgie de cytoréduction complexe, telle que réalisée sur une patiente. Or, cette chirurgie de cytoréduction est indispensable à l’étude de la faisabilité de l’insertion du dispositif qui doit être faite dans des conditions les plus proches possibles de la réalité clinique. De plus, une étude précise de la littérature nous permet d’affirmer qu’aucun modèle adapté à notre étude, commercialisé ou expérimental, n’existe à l’heure actuelle. Avant d’envisager une étude clinique, il est donc indispensable de réaliser une étude de faisabilité et de dosimétrie sur le gros animal.
Réduction
L’intégralité des animaux destinés à cette étude proviendront d’études antérieures et seront donc réutilisés. De plus, notre protocole, précisément défini, ainsi que les études préalables sur modèle de cavité péritonéale permettent de réduire le nombre d’animaux inclus dans la présente étude au strict minimum permettant une conclusion scientifique. Toutefois, il s’agit d’une étude pilote de faisabilité, ainsi, aucune approche statistique n'a été réalisée.
Raffinement
Une attention particulière sera portée à la santé et au bien-être des animaux qui proviendront d’études antérieures. Durant leur hébergement, des jouets et congs (pour jouer tout en cherchant la nourriture) seront mis à disposition dans leur enclos. L'enclos, qui sera isolé du sol par des caillebotis, leur permettra d'avoir des interactions sociales avec leurs congénères. Durant notre procédure, nous nous assurerons que l’animal ne ressente aucune douleur grâce à une analgésie et une anesthésie profonde adaptées. Les points limites ont été soigneusement définis: durant de la chirurgie, si une hémorragie, une hyperthermie, un trouble cardiaque ou respiratoire ou une douleur est observé, la procédure sera stoppée afin de se concentrer sur le rétablissement de l’animal. Afin de leur éviter un réveil difficile après la procédure chirurgicale, les animaux ne seront pas réveillés. De plus, le protocole des expérimentations prévues a été défini dans les moindres détails et validé par les chirurgiens gynécologues associés à l’étude. Cela permettra notamment de réduire le stress de l’équipe et ainsi le risque d’erreur de manipulation sur le cochon anesthésié. Les chirurgiens gynécologues opérant sur les cochons anesthésiés sont des chirurgiens expérimentés ayant déjà pratiqué de nombreuses chirurgies de cytoréduction sur patientes atteintes de carcinose péritonéale ovarienne. Ils ont également pu s’entrainer à l’installation du dispositif lumineux et des capteurs de lumières sur le modèle de cavité péritonéale développé au sein de notre laboratoire.
Choix des espèces
Nous avons choisi le porc pour deux raisons. Premièrement, l’étude nécessite que la taille de la cavité péritonéale de l’animal se rapproche le plus possible de la taille de la cavité péritonéale de la femme, cible de notre thérapie. Deuxièmement, le porc est l’animal dont l’anatomie (en termes d’organes présents dans la cavité péritonéale et de leurs positions) se rapproche le plus de l’anatomie de la femme. Les animaux utilisés seront adultes car nous avons besoin que les organes de la cavité péritonéale soient complétement formés et qu’ils aient atteint leur taille adulte.
Evaluation thérapeutique, pharmacocinétique et pharmacodynamique d’une molécule prorésolutive dans un modèle inflammatoire cutanée ou de vaccination chez le primate à différentes doses.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Trois prélèvements de moelle osseuse, trois prélèvements de ganglions et jusqu'à 16 prises de sang en 48 jours, dont 6 dans une même journée, s'ajoutent sous anesthésie à l'injection intraveineuse d'un anticorps monoclonal censé favoriser la résolution de l'inflammation. 42 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sans réveil, certains après une inflammation provoquée par des injections intradermiques de bactéries inactivées, d'autres après deux injections d'une protéine de mollusque. Pour décrire les effets néfastes, le porteur ne retient que des anesthésies répétées "inconfortables" et une possible "démangeaison locale". Il exclut aussi les analgésiques anti-inflammatoires, qui perturberaient l'effet de la molécule testée. Le décompte prévoit 40 macaques réutilisés après accord du vétérinaire, et le porteur indique que ceux de l'étude de biodistribution sont tués pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
Les traitements anti-inflammatoires actuels visent à éteindre une inflammation chronique préexistante mais cette atténuation de la réponse du système immunitaire n’est souvent que transitoire et s’accompagne très souvent de rechutes. Les études scientifiques visant à déterminer les mécanismes associés à l’inflammation ont mis en lumière un processus actif de l’extinction de l’inflammation s’appelant résolution de l’inflammation Nous avons déjà démontré dans notre laboratoire que le traitement prorésolutif constitué par notre molécule d'intérêt (anticorps monoclonal ciblant un des récepteurs de la résolution exprimé par les neutrophiles et les macrophages) est cliniquement actif chez la souris dans de nombreux modèles inflammatoires. En effet, dans des modèles de colite induite ou spontanée, nous avons pu apprécier un retour plus rapide ou une stabilisation/amélioration de la colite lorsque les animaux ont été injectés avec ce traitement prorésolutif. Par ailleurs nous avons chez l’Homme, observé in vitro un effet de cette même molécule sur les neutrophiles et les macrophages. En outre, dans une précédente étude chez le primate non humain, nous avons pu apprécier la pharmacocinétique ainsi qu’un effet biologique du produit sur un modèle d’inflammation réalisée par l’injection intradermique de bactéries inactivées aux UV. Ce projet sera dans la continuité du précédent pour évaluer les doses minimales et maximales requises pour observer un effet biologique et évaluer la toxicité du produit ainsi qu’identifier des biomarqueurs d’activité permettant de suivre la pharmacodynamique du produit et orienter les analyses chez l’Homme lors d’essai clinique. En outre, l’étude de biodistribution du traitement n’a pas été réalisée et pourra être évaluée dans cette étude, paramètre indispensable pour l’évolution du produit vers la clinique. Enfin, de manière complémentaire, un modèle de vaccination et rechallenge sera évalué pour répondre à la question d’un éventuel impact du traitement sur la vaccination, notamment la réponse humorale liée aux anticorps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. En outre, la réalisation en parallèle d’un modèle inflammatoire intradermique permettra d’apprécier un effet biologique de la molécule sur un modèle déjà utilisé dans une phase I lors d’essais cliniques et pour lequel nous avons obtenu des résultats préliminaires encourageants nécessitant d’être confirmés. Enfin, l’étude sur la capacité vaccinale après injection de la molécule permettra de mieux appréhender les mécanismes d’action du médicament et s’assurer que l’administration d’une telle drogue de manière concomitante à une vaccination de trouble pas la réponse immunitaire primaire et/ou secondaire.
Procédures
Certains animaux seront soumis sous anesthésie à l’induction d’une inflammation suite à des injections intradermiques (sur 5 min) sur une seule journée. D’autres animaux seront soumis sous anesthésie à une injection intramusculaire (5 min) d’une protéine immunogène de mollusque puis une injection sous-cutanée de cette même protéine (5 min) à 8 jours d’intervalle. Les animaux seront soumis également, sous anesthésie, après injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt (15 min), à plusieurs prélèvements sanguins (au maximum 6 dans une même journée, 16 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 48 jours), notamment lors d’une anesthésie prolongée de 2h, quelques prélèvements de moelle osseuse (N=3, avant traitement, j10 et j21) et de ganglions (N=3, avant traitement, j7 et j21).
Impact sur les animaux
Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Les modèle d’inflammation pourrait créer une démangeaison locale qui sera alors protégée si tel est le cas.
Devenir
Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet après accord du vétérinaire pour une nouvelle procédure légère ou modérée exceptés ceux utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule qui nécessite un prélèvement de différents organes après euthanasie.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.
Réduction
Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum, à savoir 3 animaux par groupe, ce qui rend impossible tout test statistique. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, le nombre de 3 animaux/groupe est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude cinétique dans le sérum de la molécule. De plus, si le modèle d’inflammation cutanée (injection bactéries inactivées) n’a pas d’impact sur la cinétique, l’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux, il s’agit de réutilisation d’animaux dans le cadre strict de la loi après avis vétérinaire.
Raffinement
Toutes les procédures sont réalisées chez le macaques sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique qui devra toutefois ne pas être dans la catégorie des anti-inflammatoires pour ne pas perturber ou annihiler l’effet de la molécule thérapeutique injectée et évaluée. Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Il est en effet fondamental pour ne pas stresser davantage aussi bien l’animal traité que les autres animaux, de pouvoir lui faire facilement (sous anesthésie légère) des injections ou prélèvements qui seraient impossibles dans un environnement commun. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.
Choix des espèces
Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. Différents modèles chez le macaque peuvent être ainsi développés pour mimer des situations cliniques connues, voire des protocoles similaires déjà existants chez l’Homme comme c’est le cas pour cette étude tout en étant moins douloureux, et tester différents protocoles thérapeutiques innovants en conditions précliniques. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes (3 à 4 kg) dont le système immunitaire est alors mature.
Définition du tropisme de nouveaux vecteurs adéno-associés recombinants pour le ciblage de structures spécifiques du cerveau selon la voie d’injection chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
4 224 souris opérées sous anesthésie, la tête fixée dans un dispositif qui repère les coordonnées du cerveau pour y injecter un virus, et 864 autres injectées dans une veine de la queue, éveillées et sous contention après chauffage : 5 088 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort par injection à l'issue. Des prises de sang sont prévues toutes les deux semaines pendant huit semaines pour mesurer leur réponse immunitaire. Le projet doit cartographier les régions du cerveau qu'atteignent de nouveaux vecteurs viraux de thérapie génique selon la voie d'injection, avant des essais sur des lignées de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Le porteur présente ce tri comme un moyen de réduire le nombre d'animaux non-humains utilisés plus tard, et écrit que sa stratégie "permet de limiter le nombre d'animaux utilisés (5088)".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de définir de nouveaux vecteur médicaments pouvant atteindre différentes structures du cerveau, selon différentes voies d’injection. La thérapie génique par vecteur virale (AAV) a démontré durant la dernière décennie son efficacité pour le traitement des maladies d’origine génétique. Ainsi, de nouveaux médicaments ont reçu leur autorisation de mise sur le marché . Néanmoins, de nombreux défis restent à relever. Premièrement, selon la maladie ciblée il est important de redessiner une stratégie. En effet, les essais cliniques nous montrent que la même stratégie par AAV peut avoir des effets opposés et cela même si les maladies sont proches. Deuxièmement, concernant le traitement de maladies du cerveau, le type d’injection (dans le cerveau ou dans le sang) affecte la dispersion du produit et donc, les cibles atteintes. Des études préliminaires ayant démontré l’amélioration de la distribution d’un AAV modifié pour les structures cérébrales en injection locale chez la souris, nous évaluerons l’efficacité de nos autres candidats selon différentes voies d’injections. Ces résultats permettront d’utiliser les meilleurs vecteurs dans les meilleures conditions d’injection lors des études de preuves de concept pour le traitement de différentes maladies neurodégéneratives, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux caractériser les nouveaux vecteurs médicaments. Ainsi, lors des études de preuve de concept dans des modèles de maladies neurodégénératives, seuls les AAVs atteignant les cibles d’intérêt de manière adéquate (temps et quantitativement) seront injectés via la route d’injection la plus pertinente, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la définition des conditions thérapeutiques. Ce projet permettra in fine le développement de médicaments innovants pour les maladies neurologiques.
Procédures
Injection locale dans le cerveau : réalisée sur animal préalablement anesthésié et analgésié et maintenu sous anesthésie. La tête de l’animal est maintenue en position par un dispositif permettant d’établir des coordonnées précises du cerveau. Geste réalisé sur 4224 animaux, une seule fois par animal. Durée totale de la chirurgie : 1h30 pour les phases de pré-chirurgie et chirurgie, puis jusqu’au réveil de l’animal. Injection par voie veineuse : réalisé sur un animal vigile sous contention après dilatation préalable des veines de la queue (chauffage). Geste réalisé sur 864 animaux, une seule fois par animal. Durée totale : maximum de 5 minutes sous contention. Prélèvements sanguins permettant de mesurer la réponse immuniaire : 1 fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
-Chirurgie : risque anesthésique, saignement, risque hypothermique, risque d’assèchement des muqueuses, déshydratation, perte de liquide céphalorachidien, infection. - Injection intraveineuse de l’AAV (voie caudale) : saignement, contention - Prélèvements sanguins multiples : contention, hématome
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par injection
Remplacement
Le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation d’un virus médicament pour véhiculer un gène médicament jusqu’aux cellules à traiter. Les interactions entre le virus médicament et les différentes composantes de l’organisme (système immunitaire par exemple) ne peuvent pas être toutes reproduites simultanément dans les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, le système nerveux est un système complexe ayant une structure tridimensionelle particulière, ne pouvant être reproduite. Parallèlement à l’utilisation d’animaux, nous mettons en place des cultures de tissus qui nous permettront de réaliser une première sélection de nos virus médicaments, limitant ainsi le nombre d’animaux injectés.
Réduction
La stratégie choisie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés (5088). Seuls les virus médicament ayant été décrits comme efficaces dans le cerveau seront testés, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Par ailleurs, des mâles et des femelles seront inclus dans les études afin d’obtenir la meilleure représentativité des réponses biologiques et de réduire le nombre d’animaux sans introduire de biais et permettant ainsi d’optimiser l’élevage des animaux achetés chez les éleveurs agréés. Ces résultats seront ensuites utilisés pour alimenter les programmes d’essais de thérapie génique dans les modèles de maladies neurodégénératives. Ainsi le nombre d’animaux présentant un phénotype délétère dans les prochaines études pourra être réduit.
Raffinement
Des études pilotes permettront de déterminer la dose optimale de virus médicament, la vitesse d’injection et le nombre de points d’injection nécessaires et suffisant pour assurer le meilleur traitement. • Condition de vie des animaux : les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec du matériel de nidification et un abri dans chaque cage afin de limiter le stress. Une période d’acclimation de 7 jours minimum sera respectée. Les souris seront pesées avant injection puis toutes les semaines afin de suivre les variations de poids. Les souris sont manipulées régulièrement pour s’habituer à l’utilisateur • Procédure d’injection locale : les animaux seront traités avec des anesthésiques et analgésiques avant et jusqu’à 3 jours après la chirurgie. Toute suspicion de souffrance animale sera soumise à un examen du vétérinaire présent à l’animalerie qui validera la nécessité de mise à mort ou non de l’animal. • Procédure d’injection systémique : les animaux seront placés dans un appareil de contention, sous lampe chauffante afin de maximiser la dilatation des veines de la queue et de réduire le temps de contention. • Approche statistique : Basé sur les connaissances actuelles dans le domaine de la thérapie génique, nous avons alors utilisé un test statistique définissant un nombre de 6 souris par groupe.
Choix des espèces
Il a été démontré précédement que la souris est un modèle prédictif du potentiel thérapeutique chez l’homme. De plus, les différents modèles de maladies neurodégénératives étants murins, il est nécessaire de valider les différents paramètres dans cette espèce afin de réaliser de façon efficace et optimale le développement de nouveaux traitements. Des animaux de 8 à 10 semaines seront utilisés. Ce stade correspond à un plateau dans le développement du cerveau de la souris couplé à un système immunitaire mature. De plus, la taille des animaux à cet âge est adequate avec un taux de récupération post-chirurgie plus élevé (moins de surcharge pondérale et de maladies métaboliques réduisant ainsi les risques liés à l’anesthésie et à l’analgésie)
Traitement par radiothérapie et imagerie par Bioluminescence et IRM chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une société privée sous-traitant ici l'irradiation et l'imagerie de souris porteuses de tumeurs. Elles subissent l'implantation de cellules tumorales par diverses voies, des traitements répétés et un suivi par imagerie sous anesthésie, avant d'être renvoyées vers l'établissement d'origine. Le résumé précise que ces souris sont considérées en "utilisation continue" et réaffectées à une autre autorisation, sans que leur mise à mort soit établie dans ce projet. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que la souris est l'espèce la plus adaptée à ce modèle d'évaluation de médicaments anticancéreux.
Objectifs
Une société privé réalise des prestations vis-à-vis de ses clients (industries pharmaceutiques, biotechnologies, ect..) quant à l'évaluation de l'efficacité et de l'innocuité de nouveaux traitements anticancéreux en développement. La réalisation de ces études implique l'utilisation d'animaux notamment souris. Pour certaines phases des études mises en oeuvre au sein de l'animalerie de la société, celle-ci sollicite des plateformes d'expérimentation animal pour la réalisation d'étapes clefs (application des traitements par radiothérapie et imagerie par Bioluminescence et IRM).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de différents cancers (sous-cutanées, intra-péritonéal, intra-veineux, intra-cérébraux, ovariens, intra-prostatiques, coliques, hépatiques, pulmonaires, osseux ou encore mammaires). Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Une implantation de cellules tumorales par voie intraveineuse (1x 1min), ou intrapéritonéale (1x 1min), ou sous-cutanée (1x 1min), ou intracérébrale (1x 1min), ou intra-cérébrale (1x 30 min), ou intra-ovarienne (1x 15 min), ou intra-prostatiques (1x 15 min), ou coliques (1x 15 min), ou hépatiques (1x 15 min), ou pulmonaires (1x 1min), ou osseuse (para-tibiale ou intra-fémorale) (1x 5 min) ou encore mammaires (1x 5 min). L'application d'un traitement de référence ou novateur administrés classiquement 1 à 5 fois par semaine pendant 1 à 4 semaines par voies locale ou systémique (orale (2 min), intrapéritonéale (1 min), sous-cutané (1 min), intramusculaire (2 min) ou intraveineuse (1 min) (Il est a noter qu'un même lot d’animaux ne subira qu’une seule voie d’administration). Un suivi par imagerie réalisé une à deux fois par semaine sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne = 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min). Des prélèvements sang limité à 1 par semaine (Volume maximal prélevé = 10% du volume circulatoire).
Impact sur les animaux
Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: perte de poids). De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'implantation induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).
Devenir
Les animaux sont inclus dans une autre demande d'autorisation d'expérimentation déposé par la société. A la fin des expérimentations ils réintégreront cette autre demande d'autorisation. Dans ce contexte les animaux sont considérés en utilisation continue et non en réutilisation.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ces études sont réalisées chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant de répondre aux objectifs scientifiques des études. A noter qu'avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris fait partie des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 10 animaux / par groupe. L’analyse statistique sera de façon générale la suivante : • Comparaison du groupe véhicule avec le groupe produit de référence.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses incluant les étapes d'anesthésies • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites Les expériences de radiothérapie et d'imagerie par Bioluminescence et IRM sont faites en assurant le confinement des animaux pour éviter les contaminations. Pour les analyses IRM, l’examen étant d’une durée de 30 à 60 min, la fréquence respiratoire des animaux est suivi tout au long de la procédure. Après les manipulations, les animaux sont replacés dans leur cage et observés jusqu’au réveil complet. Après la réalisation des expérimentations les souris sont ramenées au sein de l’établissement d’origine où le suivi tumoral est assuré.
Choix des espèces
Les souris font partie des espéces les plus couramment utilisé dans les études visant à évaluer l'efficacité et l'innocuité de nouveaux candidats médicaments Animaux adultes (généralement 6 à 18 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Evaluation du tropisme et de l’expression de vecteurs adéno associés selon leur mode d’administration chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié reçoit une injection intraveineuse, l'autre une injection intracérébrale par craniotomie sous anesthésie, pour cartographier la distribution de vecteurs de thérapie génique. Le porteur signale des risques de détresse respiratoire, d'hémorragie et d'hypothermie liés à l'anesthésie et à la chirurgie du crâne. L'activité relève en partie de prestations pour des start-ups, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier cette distribution dans l'"organisme entier".
Objectifs
Notre unité de développement et d’innovation technologique est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et développement mais aussi de la prestation de service pour des start up. Ainsi nous sommes amenés à tester différents vecteurs Adeno-associés (AAV) via 2 voies d’administration : intraveineuse ou intracérébrale afin de déterminer leur tropisme chez la souris dans un premier temps sans modification génétique autrement dit contrôle ou sauvage. Ces vecteurs AAV peuvent contenir différents transgènes, soit des gènes rapporteurs fluorescents soit directement le gène d’intérêt thérapeutique pour la maladie neurodégénérative d’intérêt. Au total le projet utilisera 600 souris sur les 5 prochaines années avec des groupes de 5 à 10 individus pour l’évaluation des différents vecteurs avec une répartition variable aux environs de 300 souris pour la voie intraveineuse et 300 souris pour la voie intracérébrale.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’établir la biodistribution de vecteurs adeno-associés codant différents transgenes et valider leur expression après injection intraveineuse ou intracérébrale chez la souris afin de pouvoir ensuite mener les étapes translationnelles chez le gros animal en vue de proposer des essais cliniques de phases I et II chez l’Homme et ainsi de disposer de toutes les données requises pour le dépôt d’un dossier à l’agence du médicament.
Procédures
- Les animaux seront utilisés soit pour une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5min) soit une injection intracérébrale sous anesthésie générale (durée 40min) et analgésie Les animaux seront euthanasiés après la période d’expression du gène. Les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - Une injection sous anesthésie avec un risque de décompensation respiratoire et un risque de saignement - un risque cardio-respiratoire, d’ hypothermique à l’anesthésie - un risque chirurgical (anesthésie, hypothermie, déshydratation, hématome, non récupération de la vigilance) lors de la procédure d’injection intracérébrale par stéréotaxie (craniotomie ciblée avec ouverture minime au site d’injection)
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de bio distribution et de tolérance.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier la biodistribution et l’expression des vecteurs AAV dans l’ensemble de l’organisme. Cet organisme doit être comparable à la complexité que l’on retrouve chez l’Homme. Choisir la souris permet de collecter des données d’intérêt en terme de bio-distribution pour les vecteurs et la voie d’administration choisie qui sont transposables ensuite dans le modèle murin de la pathologie (pour une preuve de concept) puis chez le gros animal (pour les études de toxicologie) puis l’Homme pour application clinique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 5 à 10 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 600 souris sera nécessaire pour ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions SOPF (sans pathogene ni opportunistes) pour la zone d’élevage et SPF (sans pathogene) pour la zone expérimentale. Entre 3 à 6 souris par cage au maximum; Cycle nycthémèral de 12h (8h-20h jour et 20h-8h nuit) Hygrométrie controlée;Température comprise entre 20C et 24C ;Litière : copeaux de tronc d'arbre. Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation etallaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés. Le change de la litière/abreuvement/nourriture est réalisé 1 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction des besoins de la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de carré de coton de bâtonnet de bois à ronger et si nécessaire supplémenté de lanières de kraft, et de maison de type celldom. Les animaux seront hébergés par 3 à 6 souris de moins de 30g par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) Toutes les procédures sont réalisée sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la biodistribution et l’expression des AAV recombinants suivant leur mode d’administration et ceci ne peut se faire que chez la souris contrôle comme petit animal qui nous permet de prédire la cartographie d’expression et anticiper les études d’efficacité dans le modèle murin des pathologies concernées. Les souris entre 3 et 16 semaines suivant le projet et la maladie ciblée et en rapport avec les étapes suivantes qui seront menées dans le modèle murin de la pathologie, afin d’utiliser des animaux d’âges comparables (jeunes pour des traitements précoces et plus âgés pour les traitements à un stade symptomatique
Vaccination du veau contre le virus respiratoire syncytial bovin : optimisation d’un candidat vaccin sous-unitaire aux capacités immunitaires en période néonatale (avenant DAP 30899)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
30 bovins, veaux et génisses, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent deux vaccinations intramusculaires, sept prises de sang et trois prélèvements par poche, puis des écouvillonnages nasaux, pour tester un candidat vaccin contre le virus respiratoire syncytial bovin. À la fin, tous sont tués pour prélever des tissus lymphoïdes et du sang. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour évaluer la réponse vaccinale et relie l'intérêt du projet à la réduction des antibiotiques en élevage.
Objectifs
La vaccination contre le virus respiratoire syncycial (VRS) bovin a été identifiée comme une priorité en élevage en raison de la prévalence de cette infection virale (qui touche les veaux dans leur première année) et de la morbidité et mortalité qu’elle occasionne. De plus, le VRS bovin peut favoriser la survenue de surinfections bactériennes et pour prévenir ce risque, les éleveurs traitent fréquemment avec des antibiotiques dès l’apparition de troubles respiratoires dans leur troupeau. Un vaccin efficace dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux. Un enjeu majeur de la vaccination contre le VRS chez le veau est d’induire une immunité protectrice dans les premières semaines de vie, en présence des anticorps d’origine maternelle (acquis par la buvée du colostrum). Notre candidat vaccin est une protéine virale, la protéine de fusion F, produite in vitro sous une forme stabilisée dite préfusion (preF). Un candidat vaccin similaire est également en cours de développement pour protéger contre le virus respiratoire syncytial humain responsable des bronchiolites infantiles. Or il a été montré chez l’homme que les déterminants antigéniques portés par cette protéine preF qui sont reconnus par les anticorps neutralisant l’infection virale, diffèrent entre les nouveau-nés (0-2 mois) et les enfants plus âgés (6 mois et au-delà). Pour les bovins, nous avons déjà fait la preuve de l’efficacité du vaccin preF pour protéger contre l’infection virale après une seule administration par voie intramusculaire avec un adjuvant vétérinaire classique. Le projet actuel a pour premier objectif d’identifier les déterminants antigéniques qui sont dominants en réponse au vaccin preF chez les veaux de 2-3 semaines et qui sont mineurs chez les veaux plus âgés (6-9 mois). Notre deuxième objectif est de concevoir un nouveau candidat vaccin ne comportant que ces déterminants antigéniques dominants en période néonatale puis de l’évaluer chez des veaux de 1 mois pour son efficacité meilleure par comparaison avec preF en présence des anticorps d’origine maternelle.
Bénéfices attendus
- Un vaccin efficace contre le VRS dès le plus jeune âge en élevage aura un impact fort sur la santé et le bien-être des veaux qui sont fortement affectés par des infections respiratoires. Un vaccin efficace réduira l’utilisation des traitements antibiotiques par les éleveurs lorsque des troubles respiratoires apparaissent dans leur troupeau et que les éleveurs veulent prévenir le risque de sur-infections bactériennes. - Comprendre comment élaborer des vaccins efficaces dans la période néonatale en présence des anticorps d’origine maternelle est une avancée majeure en vaccination pour les animaux d’élevage, de compagnie et aussi pour le nourrisson.
Procédures
Les 30 animaux du projet seront soumis aux 3 gestes techniques suivants : 1) Vaccination 2 fois en intramusculaire J0 et J30 post-vaccination et moins de 5 minutes par animal. 2) Prise de sang/poche : 7 prises de sang une fois par semaine en moyenne et 3 poches de sang à 20 jours d'intervalle entre 5 à 10 minutes par animal. 3) Ecouvillonage nasal non invasif et moins de 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les vaccins évalués dans ce projet sont de type protéique sous-unitaire (inerte, non réplicatif) et adjuvés avec un adjuvant vétérinaire classiquement utilisé pour les bovins. De ce fait les réactions locale et systémique attendues sont faibles (évenutellement douleur locale et fièvre), et la durée de la phase inflammatoire sera limitée à quelques heures. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire. La contention de l’animal pour les prises de sang engendre du stress et que la prise de sang peut également engendrer un hématome.
Devenir
Tous les animaux (n = 30) seront mis à mort à la fin de l’étude. Des tissus lymphoides seront prélevés et des poches de sang pour collecter pour récupérer les cellules immunitares.
Remplacement
Il n'a pas de modèles in vitro alternatifs pour évaluer la réponse vaccinale.
Réduction
Des effectifs de 5 génisses de 6-9 mois et 5 veaux mâles ou/et femelles de 3-4 semaines seront suffisants pour isoler des lymphocytes B du sang ou des ganglions en réponse à la vaccination. Des expériences antérieures nous ont en effet permis de valider la quantité d’antigène preF, l’adjuvant et la voie de vaccination pour générer des réponses anticorps robustes. Trois individus dans chaque groupe avec les réponses les plus fortes seront sélectionnées pour l’analyse des répertoires. Ce sont également nos données antérieures qui nous ont permis de déterminer le n=5 par groupe de veaux de 2-3 semaines pour avoir des comparaisons statistiquement significatives. Ce nombre d’animaux permettra de réaliser des tests statistiques non paramétriques. Les bovins pourront recevoir un traitement si nécessaire lors de la vaccination car il y a un risque de réponse inflammatoire locale modérée avec une légère fièvre pendant 24h.
Raffinement
Les bovins sont hébergés en groupe dans une animalerie conventionnelle fermée, avec un environnement enrichi (pierre de sel, brosse, paille, aire d’exercice). Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour (enrichissement social) pour détecter les signes cliniques précoces et afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites. Les bovins pourront être traités avec des anti-inflammatoires ou des antalgiques en cas de réaction à la vaccination. Une réaction cliniquement détectable de plus de 24 h entrainerait la mise en place d’un traitement anti-inflammatoire à base de méloxicam (voie sous-cutanée), éventuellement répétée après 48h. Il sera mis en place une récompense positive, type céréales ou boucons de paille, après chaque prise de sang.
Choix des espèces
Le bovin est l'hôte naturel du virus respiratoire syncytial bovin et le veau doit être protégé par la vaccination. Veaux de 2-4 semaines : période néonatale avec présence d’anticorps circulants spécifiques du virus respiratoire syncytial bovin et d’origine maternelle. Génisses de 6-9 mois : stabilisation d’un répertoire B de type adulte
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Mtm1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Selon les cohortes, elles reçoivent une injection intramusculaire ou intrapéritonéale de thérapie génique, passent des tests de suspension et d'actimétrie, puis une mesure chirurgicale de la force musculaire sous anesthésie. Le porteur décrit un phénotype sévère de myopathie, avec perte de poids, apathie, paralysie progressive des membres postérieurs et dos arrondi, tout en affirmant qu'aucune douleur n'y serait associée. Il conclut que seul le modèle animal permet d'étudier la maladie dans sa globalité.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions d’une protéine impliquée dans certaines myopathies ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 240 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 3 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge. Les 390 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 8 semaines d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
La souris atteinte de myopathie myotubulaire présente un phénotype sévère. Des points limites pour nos souris incluent des signes de douleurs comme la perte de poids, l’apathie, les yeux fermés et une paralysie progressive des membres postérieurs avec l’apparition d’une cyphose (dos arrondi). Cependant, les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutant et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. De la nourriture en gel sera déposé dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement après l’injection intramusculaire afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance éventuels comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et les difficultés ambulatoires. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et la mise à mort des animaux par dislocation cervicale. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré (buprénorphine à la dose de 0.1 mg/kg). Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous traiterons ces animaux à des stades très précoces (premier jour post natal) pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également au stade adulte (4 semaines) pour étudier l’effet après l’apparition des symptômes.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 80
Moutons : 80
Bovins : 20
200 chiens, cochons, moutons et bovins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent des prélèvements de sang répétés puis une ou deux chirurgies sous anesthésie, parfois précédées de la création d'une lésion par anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux, pour évaluer des dispositifs de robotique chirurgicale. Le porteur indique une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours. Il affirme que l'expérimentation sur l'organisme entier est incontournable et relève d'une obligation réglementaire avant l'usage de ces dispositifs chez les patients.
Objectifs
La chirurgie assistée par ordinateur (CAO) regroupe un ensemble d'outils informatiques destinés à aider le chirurgien dans la préparation et la réalisation d’une opération, particulièrement en chirurgie des tissus mous (chirurgie viscérale, urologique ou cardiaque) et en chirurgie orthopédique avec implantation de dispositif ou non. Elle a pour objectif de faciliter la réalisation des gestes diagnostiques ou thérapeutiques par le chirurgien, afin qu’ils soient les plus précis, les plus efficaces et les moins invasifs possible. On entend par dispositif implantable tout dispositif destiné à être implanté de façon invasive en totalité dans le corps humain ou à remplacer une surface épithéliale grâce à une intervention chirurgicale et à demeurer en place après l'intervention. Jusqu'à une dizaine de dispositifs pourront être évalués dans ce projet. Ce projet de recherche a pour objectif la validation de robots ou d'éléments robotiques innovants, l’apprentissage des personnels de santé, le développement de nouvelles stratégies pouvant réduire le traumatisme tissulaire, améliorer le diagnostic et pallier une dysfonction. Ces dispositifs innovants doivent être étudiés sur des modèles animaux vivants pertinents, dans le but de valider leur faisabilité, leur innocuité et leur efficacité. Ces nouvelles techniques moins invasives et ces approches originales permettront de mettre à profit pour les patients et les équipes soignantes les avancées de la robotique dans un environnement chirurgical et interventionnel. L'évaluation et le développement des nouveaux dispositifs/méthodes et techniques en robotique chirurgicale par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives requièrent une phase de recherche et de développement. Les différentes versions de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Les objectifs du projet sont doubles : raffiner les prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) dans la phase initiale du projet, puis elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs/méthodes/techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés du projet sont : - Une amélioration de la sécurité et/ou de l'efficacité des machines, dispositifs et techniques évalués. - Pour les aspects thérapeutiques, une réduction du tremblement et de la fatigue du chirurgien, une amélioration de la précision et de la technicité du geste chirurgical par un traitement informatisé de l’image, une vidéo 3D nette pendant toute la durée de l’intervention et une fiabilité du système plus importante, entrainant une plus grande précision du positionnement des prothèses et des implants et permettant par exemple d’éviter les ré opérations parfois multiples des patients. La réduction de l'invasivité du geste chirurgical et des temps opératoires (permettant par exemple la réduction du traumatisme tissulaire et du risque infectieux secondaires, corollaires de ces interventions) sont d'autres bénéfices attendus du projet. - Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients, une amélioration des capacités diagnostiques de la pathologie visée peut également être obtenue. - Les avantages peuvent aussi être éducationnels, avec des applications dans la formation des chirurgiens à des techniques opératoires complexes, la planification précise d’interventions chirurgicales délicates et la téléassistance en opérations extérieurs (OPEX) dans le cadre de la chirurgie et la médecine militaire.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'évaluation de dispositif en robotique d'assistance chirurgicale avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'évaluation de dispositif robotique d'assistance chirurgicale associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif robotique, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type anastomose, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs et techniques testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs robotiques d’assistance chirurgicale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Cela impose l’expérimentation de ces dispositifs sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille, d’où la nécessité de tester sur les espèces citées ci-dessus. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les ovins sont par exemple, le modèle le plus pertinent pour la durabilité des stratégies opératoires et dispositifs testés dans ce projet. Leur intérêt principal réside dans le fait qu’ils ne sont pas en croissance et sont particulièrement robustes. Les porcins sont par exemple, un modèle très pertinent pour la durabilité de l’ancrage des dispositifs (feuillets valvulaires épais par exemple lorsque le dispositif est implanté dans le cœur). Les porcs sont également le modèle plus proche de l’homme pour ce qui est chirurgie viscérale et seront privilégiés, de ce fait, pour la robotique utilisée en chirurgie viscérale. Les bovins sont par exemple, un modèle très pertinent pour leur grande taille et le débit élevé des dispositifs cardiovasculaire potentiellement testés dans ce projet (robotique chirurgicale utilisée pour la chirurgie cardiovasculaire). Les canins ne seront utilisés que plus rarement, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’homme. Par exemple les canins sont le seul modèle à présenter un auricule gauche avec ostium comme chez l’homme, un comportement du tissu de conduction cardiaque proche de l’homme, etc. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Evaluation des propriétés pharmacologiques de nouveaux composés antipaludiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Elles sont infectées par le paludisme au moyen d'une injection de globules rouges parasités, reçoivent des composés à tester, puis subissent des prélèvements de sang à la queue. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hypothermie, puis, en cas de paludisme cérébral, une ataxie, une paralysie partielle et un coma irréversible, les animaux atteints étant mis à mort. Il conclut que la souris reste le modèle de routine faute de modèles humanisés moins coûteux.
Objectifs
Notre projet vise à mettre au point une molécule antipaludique par voie orale pour le traitement du paludisme. L'objectif est de sélectionner un candidat pour la phase pré-clinique parmi des composés développés par notre laboratoire en collaboration avec des équipes de chimie médicinale. Les composés testés in vivo seront sélectionnés parmi les composés très actifs in vitro contre le parasite du paludisme et montrant une faible toxicité contre les cellules de mammifères. Nous évaluerons en premier lieu l’efficacité de ces molécules contre Plasmodium in vivo chez la souris. En effet, une molécule qui est active in vitro peut être moins efficace in vivo car éliminée rapidement par l'organisme ou générer des effets secondaires. La dose nécessaire ainsi que le nombre d’administration pour obtenir une guérison complète seront déterminés. Dans un second temps, les paramètres pharmacocinétiques du ou des meilleurs candidats in vivo seront évalués chez la souris saine et infectée afin de sélectionner le candidat correspondant le mieux aux critères définis par l’organisation mondiale de la santé.
Bénéfices attendus
Le paludisme (malaria) est une maladie parasitaire qui touche une centaine de pays en voie de développement et 40% de la population mondiale vit dans des zones à risque. Les estimations les plus récentes font état de plus de 200 millions de cas cliniques dans le monde. La maladie a causé 627 000 morts en 2020 dont 90% en Afrique sub-saharienne. Elle touche, en particulier, les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes. L'arsenal thérapeutique actuellement disponible pour lutter contre le paludisme étant insuffisant et de plus menacé par l'augmentation de la résistance des parasites aux derniers antipaludiques, il est urgent de trouver de nouvelles thérapies efficaces afin de tendre vers l'élimination de la maladie. Les efforts doivent privilégier des mécanismes d'action nouveaux et innovants par rapport aux molécules existantes afin de retarder au maximum l'apparition de résistances. C’est le cœur de notre projet, qui vise à développer de nouveaux composés à activité antipaludique en se focalisant sur des molécules visant des métabolismes parasitaires non encore ciblés par les médicaments actuels. Le projet devrait permettre la sélection d’un candidat à un développement clinique. L’obtention d’un antipaludique original permettra d’une part de lutter efficacement contre le paludisme et de sauver la vie de milliers d’enfants chaque année mais contribuera aussi, en diminuant le nombre de cas, à améliorer la qualité de vie (diminution des épisodes fébriles, des séquelles notamment neurologique, des jours d’école ou de travail perdus, …) des habitants des pays touchés.
Procédures
Prélèvement de sang sur les souris donneuses après euthanasie des souris. Pour les tests d’activité antipaludique : - Infection par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles, injection unique. La procédure prend moins d’une minute. - Administration d'un composé ou du véhicule. Les animaux sont vigiles. Administration unique ou une fois par jour pendant 4 jours. L’administration du composé prend moins d’une minute. - Prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue : 1 fois par jour pendant plusieurs jours. Les animaux sont vigiles. Chaque prélèvement prend 5 secondes. Pharmacocinétique/pharmacodynamie : - Infection par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles, injection unique. La procédure prend moins d’une minute. - Prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue : 1 fois avant le début de l’expérience et 1 fois avant le prélèvement de la totalité du sang. Les animaux sont vigiles. Le prélèvement d’une goutte de sang prend 5 secondes - Traitement : administration du composé ou du véhicule. Les animaux sont vigiles. Administration unique. L’administration du composé prend moins d’une minute. - Prélèvement de la totalité du sang. Les animaux sont sous anesthésie profonde. Le prélèvement prend moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Léger stress lors de la contention pour l'infection et l’administration du composé. Un prélèvement de sang sur animaux vigile sera effectué au bout de la queue après l’infection de la souris; possibilité de développer les signes cliniques suivants à partir de 50% de parasitémie :poil hérissé, isolement, dos courbé, urine rouge, hypothermie. En cas de neuropaludisme ou paludisme cérébral, les souris montrent les signes cliniques suivants : ataxie, puis paralysie partielle puis coma irréversible. La parasitémie reste faible. Si des signes de toxicité apparaissent le traitement est suspendu et les souris sont euthanasiées si besoin.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés. Pour les tests d'activité, les animaux non guéris par les composés sont euthanasiés pour éviter les souffrances liées à l'infection. Les animaux guéris ne peuvent être réutilisés d'une part parce qu'il ont subit une procédure sévère et d'autre part car ils ont développé une immunité contre le parasite. Pour les tests de pharmacocinétiques, les animaux sont euthanasiés pour récupérés le sang et les organes.
Remplacement
Afin de minimiser le recours au test sur les animaux, nous avons adopté une stratégie de criblage en entonnoir. Une première phase (la plus importante) se situe en amont de la partie expérimentation chez l’animal. Toutes les nouvelles molécules sont testées in vitro à la fois sur des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum (le Plasmodium humain le plus dangereux) pour leur activité antipaludique contre le parasite et sur des cellules de mammifères pour leur activité toxique. Ceci permet de déterminer l’index de sélectivité de chaque molécule. Cet index de sélectivité doit être d’au moins 10 (10 fois plus actif contre P. falciparum que contre des cellules humaines) pour envisager d’être testées dans un modèle du paludisme in vivo chez la souris. Cette première phase très sélective permet de réduire considérablement le nombre de molécules à tester chez l’animal. Les molécules testées in vivo chez la souris impaludée seront choisies parmi les molécules présentant une bonne activité antipaludique, une faible toxicité ainsi qu’une bonne stabilité.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, nous avons choisi d’effectuer un criblage en entonnoir, ce qui permet de diminuer le nombre de molécules testées à chaque étape et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé en fonction des expériences. Une simulation statistique a été réalisée afin d’évaluer le nombre minimum de souris par groupe nécessaire pour observer des effets significatifs. Elle est basée sur les expériences précédemment réalisées au laboratoire ou publiées dans la littérature. Plusieurs molécules seront testées dans la même expérience afin d’utiliser un seul lot contrôle pour plusieurs molécules. Pour la pharmacocinétique, si la méthode de dosage de la molécule qui sera testée permet une quantification dans un faible volume sanguin, nous réduirons le nombre de souris de moitié. L’utilisation de souris exclusivement femelles pendant toutes les premières étapes permet de diminuer le nombre de souris nécessaires de moitié puisque nous regardons l'effet de la drogue sur le parasite et non sur l'animal. Nous testons ensuite l’incidence du sexe uniquement avec la ou les meilleures molécules.
Raffinement
Avant l’expérimentation, les souris sont manipulées régulièrement pour les habituer à être manipulées et éviter un stress lors de l’expérience. Les souris sont hébergées dans des cages avec des igloos et des copeaux pour améliorer leur bien-être. Les animaux sont surveillés pendant toute la durée de l’expérimentation qui dure un mois pour les tests antipaludiques. Dans le cas d’apparition de premiers signes de neuropaludisme (ataxie, paralysie partielle) avant la fin du test (jour 5) des granulés mouillés de nourriture peuvent être ajoutés dans la cage pour être sûr que ces animaux auront accès à la nourriture. En cas de signes cliniques sévères, les animaux sont euthanasiés.
Choix des espèces
La recherche de nouveaux antipaludiques est principalement dirigée contre le plasmodium humain P. falciparum. Les seuls modèles animaux permettant l’étude de ce parasite sont les singes Aotus ou Rhesus splénectomisés ou la souris humanisée, deux modèles animaux compliqués et coûteux. L’étude in vivo de l’activité antipaludique de composés est donc réalisée en routine chez le modèle souris contre des plasmodium murins. En effet, le cycle de vie ainsi que la morphologie et le métabolisme des différents stades de développement de tous les parasites du paludisme chez les mammifères sont comparables. Les plasmodium murins sont non-pathogènes pour l’homme et ne sont transmissibles entre rongeurs qu’exclusivement par piqûre d’une espèce spécifique de moustique du genre Anopheles, absent en France métropolitaine. Les souris seront âgées de plus de 5 semaines. A cet âge le système immunitaire de la souris est bien en place et permet d’obtenir des réponses aux médicaments reproductibles. De plus l’infection par Plasmodium est aussi très reproductible.
Etude du rôle de Bob1 dans la réponse immune allogénique dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intramusculaire puis jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant dix jours, et un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie avant leur mise à mort. Le porteur indique un inconfort et un stress liés aux injections répétées, sans attendre d'autre effet des molécules testées. Il affirme que le modèle murin est le seul modèle préclinique adapté pour étudier la réponse immunitaire après une greffe de poumon.
Objectifs
BOB1 est un facteur exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients transplantés le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associé au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de « calmer » les lymphocytes activés qui devraient moins agresser le greffon.. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique (qui se met en place après une greffe). Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune allogénique, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique in vivo chez la souris au préalable. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une greffe de poumons.
Bénéfices attendus
D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.
Procédures
Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 1 minute, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intra-péritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro, et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.
Remplacement
Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables, et à l'aide de tests statistiques. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.
Première étape du Développement d’une approche de thérapie génique pour la neuropathie à axones géants chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
90 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs organes pour analyse. Le porteur indique des risques de dépression cardio-respiratoire, d'hypothermie, de saignement et de toxicité liée au traitement. Il décrit cette étape comme préliminaire, la preuve d'efficacité contre la neuropathie à axones géants devant être menée ensuite par un collaborateur sur des souris malades.
Objectifs
La neuropathie à axones géants (GAN) est une maladie sévère du cerveau et des nerfs due à une perte de fonction d’une protéine bien identifiée (gigaxonine), conduisant au décès des patients et pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle pas de traitement pour prévenir ou stopper les symptômes. L’objectif de ce projet est de réaliser les étapes préliminaires de la mise au point d’une approche de thérapie génique chez des souris normales, non malades . Tout d’abord par le choix de la construction génétique et virale à utiliser puis de la dose permettant une expression suffisante de la protéine d’interet. Ces données seront reprises chez notre collaborateur (pour l’étude d’efficacité thérapeutique dans le modèle murin présentant un déficit sur la protéine responsable de la maladie (gigaxonine).
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est de réaliser les étapes préliminaires de la mise au point d’une approche de thérapie génique chez des souris normales, sans pathologie pour ces premières étapes afin de mener ensuite chez nos collaborateurs une étude de preuve de concept de l’efficacité de cette approche thérapeutique dans le modèle murin de la maladie et à plus long terme un essai chez l’Homme pour proposer une solution thérapeutique qui n'existe pas à ce jour.
Procédures
Les effets indésirables possibles sont: - Une injection sous anesthésie avec un risque de dépression cardio-respiratoire et par conséquent une douleur ou lesion sans autre geste avant l'euthanasie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont: - Une injection sous anesthésie avec un risque de dépression cardio-respiratoire - un risque d’hypothermie - un risque de saignement à l’injection - un risque éventuel de toxicité lié au traitement
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés , car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem.
Remplacement
Toutes les études préalables possibles en culture ont été réalisées afin de valider la surexpression de gigaxonine comme molécule thérapeutique. Cependant, les étapes finales de choix de promoteur pour évaluer les niveaux d’expression et la toxicité associée ainsi que la dose à administrer en vue de l’etude thérapeutique ne peux être remplacée et doit être menée chez la souris. Les étapes pour choisir la meilleure construction génétique a utiliser et notamment le choix du promoteur nécessite un passage dans un individu vivant, la souris étant le modèle de choix. Cette étude va nous permettre d’apprécier les niveaux d’expression ainsi que la toxicité associée à notre thérapie génétique au sein d’un organisme mammifère dans son intégrité. Ces données vont nous aiguiller sur la dose à administrer qui sera à utiliser pour débuter la phase thérapeutique
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en prenant en compte la fiabilité statistique des échantillons. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 10 souris par groupe a été choisi pour la première étape et valider les niveaux d’expression à 1 mois, et 15 souris par groupe pour la seconde étape sur un suivi de 5 mois . Ceci va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 90 souris est nécessaire pour ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement avec des tests adaptés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (et prise en compte des points limites éventuels) et de soins adaptés si nécessaire. Les animaux seront hébergés dans des conditions très protégeés pour la zone d’élevage et sans pathogène pour la zone expérimentale (portoirs ventilés en pression positive ; Entre 3 à 6 souris par cage au maximum ; Cycle nycthémère de 12h ; Hygrométrie et température contrôlés), ainsi que de l’enrichissement répondant aux besoins physiologiques des souris (nidification, cachette et matériel à ronger). Les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Notre étude doit déterminer les niveaux d’expression et sera ainsi menée sur des souris C57BL6J possédant le même fond génétique que les souris qui seront utilisées par la suite par notre collaborateur. Les souris (mâles et femelles) seront utilisées à l’âge d’un mois correspondant à l’âge de traitement nécessaire pour la suite dans les souris modèle de la pathologie et suivi sur 1 mois ou 5 mois post injection intraveineuse. Cet âge correspond de plus à un individu développé et myélinisé similaire à l'âge de traitement des enfants GAN par le futur
Prélèvements sanguins ponctuels pour les mises au point, la calibration de techniques, les dépistages ou la réalisation de test préliminaires in vitro chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
200 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés après une période de repos, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils subissent des prélèvements de sang répétés au niveau des veines et artères fémorales ou céphaliques, le plus souvent sans anesthésie, jusqu'à 20 % de leur volume sanguin par ponction. Le porteur indique que ces prélèvements peuvent provoquer stress, hématomes et anémie transitoire, et plus rarement une fistule entraînant une boiterie. Il présente ces prélèvements de matériel biologique comme un moyen de mettre au point des tests et de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de répondre à un besoin en mettant à disposition d’un donneur d’ordre du matériel biologique (sang ou dérivés) afin de pouvoir mettre au point des tests, calibrer des appareils souvent nécessaires avant une étude ou encore réaliser une série de dépistages avant l’entrée en étude d’animaux. La mise au point de ces tests doit fréquemment passer par la stimulation de cellules immunitaires présentes dans le sang frais, évaluer les effets non-spécifiques portés par les protéines de matrices biologiques (sang, plasma, urine…), ou encore évaluer le statut sérologique d'un animal. Il est donc nécessaire de fournir les matrices correspondantes provenant des espèces d'intérêt, de manière à améliorer la qualité des tests lors d'étude in vivo et ce faisant diminuer la quantité d'animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Des prélèvements sont quelques fois nécessaires pour la mise au point de techniques, la calibration de matériel, la sélection de paramètres. Ces mises au point peuvent servir pour une étude chez le primate non humain (PNH). Ces prélèvements servent également à la réalisation de test in vitro préliminaires, évitant ainsi le recours à l’animal pour des tests préliminaires. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés vont permettre d’améliorer les techniques et ainsi de raffiner les méthodes utilisées et également de réduire le nombre d’animaux.
Procédures
La majorité des animaux sera soumis à des prélèvements sanguins au niveau des veines et/ou artères fémorales et ou céphaliques sans anesthésie d'une durée de quelques secondes (de 10 secondes à 30 secondes) en fonction du nombre de tubes à remplir. En cas de besoin (pour la contention d’un animal de plus de 5kg par exemple) les prélèvements pourront se faire sous sédation. Les prélèvements de sang seront réalisés à hauteur du volume maximum prélevable en fonction du % du volume sanguin circulant (VSC), selon les recommandations généralement acceptées et établies par Diehl et al.,2001 soit 7,50 % du VSC suivi d'une période de repos de 7 jours (par exemple 15,8 ml pour un animal pesant 3 Kg); 10% du VSC suivi d'une période de repos de 2 semaines (par exemple 21 ml pour un animal pesant 3 Kg); 15% du VSC suivi d'une période de repos de 3 semaines (par exemple 31,5 ml pour un animal pesant 3 Kg); 20% du VSC suivi d'une période de repos de 4 semaines (par exemple 42 ml pour un animal pesant 3 Kg).
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress et/ou l’apparition d’hématome(s) au niveau de la zone de ponction. Lors de prélèvements fréquents ou en grande quantité, une anémie transitoire peut également apparaître. Très rarement, une fistule artério-veineuse peut apparaître et entraîner une boiterie ou gêne chez l’animal.
Devenir
Les animaux pourront être réutilisés après une période de repos suffisante après un examen vétérinaire avant d'entrer dans une nouvelle procédure. Le degré de gravité réel sera pris en compte.
Remplacement
Les animaux ne peuvent être remplacés car ces études vont permettre de mettre au point des tests sur des animaux de même espèce ou alors vont permettre de selectionner des animaux parmi un groupe d'animaux de la même espèce. Indirectement l'utilisation des ces prélèvements peut permettre de remplacer l'animal. Par exemple, des prélèvements de sang total peuvent permettre d’évaluer de façon préliminaire la toxicité ou l’efficacité d’une ou plusieurs molécules (par exemple lors de tests de stimulation immunologiques), ou de différentes doses d’un candidat médicament.
Réduction
Ce nombre est évalué à partir des données de réalisation des années précédentes de l’installation d’essai pour ces mêmes procédures. Ces données sont présentées annuellement à la structure de bien-être animal. Ce nombre prend en compte le besoin de réaliser des screening d'animaux concernant leur taux d'anticrops contre un pathogène particulier, dans le cadre d'étude de challenge viral ou de biodistributions d'une thérapie génique par vecteur viral. La réalisation de trois études de ce type par an nécessite le screening d'une vingtaine d'animaux en moyenne. Les autres animaux correspondent à des demandes fréquentes de matrices biologiques (sérum, plasma, sang), dans le but de validation ou de mise au points de méthodes de bioanalyses ou des tests in vitro (immunostimulation). L’utilisation de matrice biologique, tel que le sang, de l’animal cible pour faire des mises au point ou des calibrations de techniques permet par exemple la sélection de la fenêtre de lecture pour les analyses cytométriques et permet in fine de réduire le nombre d’animaux utilisés. Aucun test statistique ne sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets seront mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises seront distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et en fin de journée) dans la litière et dans des dispostifs à friandises (tube, jouets...). Les animaux bénéficieront de séances d'approches associées à du renforcement positif afin de les préparer et de réduire le stress lié aux actes contraignants (contention, prise de sang...). Un score du stress et de la douleur accompagné de points limites permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. Les prélèvements seront réalisés selon les recommandations éthiques européennes en termes de quantité prélevée et de délai de réutilisation. Une observation du site de prélèvement pendant quelques minutes sera réalisée après chaque prélèvement. Le plus possible, les prélèvements seront réalisés sur animaux non-anesthésiés et non-sédatés afin de préserver leur état physiologique naturel et de ne pas perturber leur rythme quotidien. La sédation peut en effet impacter l'appétit des animaux, causer des nausées, etc.
Choix des espèces
L’utilisation du singe cynomolgus est nécessaire pour les mises au point et calibration des techniques qui seront utilisées dans le cadre d’étude in vivo chez cette même espèce. Aussi les dépistages sérologiques/recherche d’anticorps spécifiques seront effectués sur un panel de singe cynomolgus préselectionné pour être inclus en étude (une demande d’autorisation spécifique pour ces études sera faite). Les animaux seront des animaux juvéniles ou matures selon l'ojectif des études subséquentes.