Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Identification de régions chromosomiques associées à la durée de la gestation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont mises en reproduction, échographiées chaque semaine sous anesthésie puis isolées en cage individuelle jusqu'à la mise bas sous surveillance vidéo, et une soixantaine subit un prélèvement sanguin et une amniocentèse avant d'être tuée, pour repérer les régions chromosomiques liées à la durée de gestation. Le porteur ne déclare comme atteinte que le stress lié à la manipulation et à l'isolement, alors que l'effectif dépasse largement les animaux décrits dans les procédures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut étudier cette question.
Objectifs
Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause de morbi-mortalités périnatales et dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de mortinatalité ou de décès néonatal et de dysmaturité fœtale, ainsi qu’un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de morbidité maternelle aiguë sévère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux souches consanguines murines (FVB/N et Balb/c) montrant plus de 30h d’écart dans la durée de gestation pour identifier des régions chromosomiques affectant la durée de la gestation. Nous obtiendrons également des données de l’expression des gènes à l’interface fœto-maternelle chez les cas les plus extrêmes avec des technologies de dernière génération. La combinaison de ces deux analyses et la puissance de la génétique de la souris ouvrent la possibilité d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans le déterminisme de la durée de la gestation, question non résolue actuellement dans de nombreuses espèces de mammifères, incluant l’espèce humaine.
Bénéfices attendus
L’étude des déterminants génétiques de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de la cascade de la parturition. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine et de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré.
Procédures
Toutes les souris (414 souris) : - seront mises en accouplement - auront une échographie par semaine pour la détection de la gestation (deux fois pendant la gestation). Pour cet acte, les souris seront sous anesthésie générale et rechauffée par une platine chauffante. La durée de l’échographie est d’environ 5 minutes. - seront mises seules dans un cage si elles sont gestantes, dans la mesure où nous avons besoin de connaître précisément la durée de gestation de chaque femelle. Une surveillance vidéo en continu (Infra-rouge, non invasive) de la cage permettra de dater précisément la mise bas. Les souris seront isolées dès le diagnostic de gestation par échographie et jusqu’à la mise bas. Pour quelques souris seulement (60 souris): En fin de gestation, un unique prélèvement sanguin (200μl prélevés à la veine sous-mandibulaire avec une lancette, ainsi qu’un unique prélèvement de liquide amniotique (amniocentèse) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie, avant la mise à mort. L'analgésie se fera par injection d'un traitement antidouleur. L'injection dure quelques secondes et les effets antidouleurs plusieurs minutes. Le prélevement sanguins durent moins d'une minute et le prélèvement de liquide amniotique dure environ 1 minute par unité foeto-placentaire. Il est prévu un total de 15 minutes pour effectuer le prélèvement sanguin et le prélèvement de liquide amniotique
Impact sur les animaux
Stress potentiel due à la manipulation et à l’isolement.
Devenir
Mise à mort des animaux en fin de procédure afin de limiter la souffrance animale potentielle.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle alternatif (organoïde, culture cellulaire) pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.
Réduction
Utilisation de croisement de différentes lignées de souris dont le fonds génétique est stable. Utilisation de l’échographie pour le suivi de gestation qui permet de détecter les gestations de façon précoce et de diminuer le nombre d’animaux à utiliser dans la phase d’élevage. Les gestations courtes et le fait qu’il y ait une dizaine de petits par portée permet de réduire aussi le nombre de croisement nécessaire pour obtenir les effectifs nécessaires pour les études statistiques. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la deuxième génération. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données et ont été utilisés pour ajuster le nombre minimal d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux disposent de rouleaux de cartons et du coton compacté comme enrichissement. Les femelles gestantes sont surveillées en continu par des cameras infrarouges. Les échographies sont réalisées sous anesthésie générale. Les souris endormies sont placées sur une plaque chauffante et leur température sera surveillée pendant toute la durée de l'échographie (durée de 5 minutes). Un traitement antidouleur sera administré avant le prélèvement sanguin et de liquide amniotique.
Choix des espèces
Une meilleure connaissance du déclenchement du travail permettrait de mieux prédire, voire de contrôler l'accouchement, afin de limiter la prématurité. Une des difficultés d'étude cette question dans l’espèce humaine est l'impossibilité pratique d'établir le moment exact de la parturition et ainsi d'effectuer des études longitudinales chez la femme. Nous pouvons lever cette barrière en utilisant des modèles de souris, où nous pouvons surveiller avec précision la progression de la gestation à l'aide de mesures par échographie et prédire et enregistrer l'accouchement. Des composants de la cascade de la mise en travail et de l'accouchement sont partagés chez la souris et l'homme, comme l’inflammation sans infection, dont l’origine est inconnue. De plus, la durée de gestation est génétiquement déterminée dans les souches consanguines, ce qui favorise l'étude de la génétique chez la souris. Nous utiliserons des souris sexuellement matures, à savoir dès 8 semaines de vie.
Caractérisation de molécules myorelaxantes par la méthode de l’activité de course volontaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
3 504 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire puis sont hébergées en cages à roues pour mesurer leur activité de course, dispositif servant à comparer des molécules myorelaxantes destinées à la dystonie et à la spasticité. Le porteur annonce n'attendre aucun signe clinique après l'injection et justifie le projet par les recommandations de l'agence du médicament ainsi que par la politique de sa société, qu'il présente comme un gage de "respect de l'animal". À l'issue, les muscles injectés sont prélevés pour analyse histopathologique.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser des produits myorelaxants à effet rapide et durable pour traiter les maladies neuromusculaires telles que la dystonie et la spasticité chez l’homme. Conformément aux recommandations de l’Agence Européenne du Médicament, nous devons mettre en évidence les propriétés pharmacologiques et pharmacodynamiques de ces molécules avant la mise en place d’essais cliniques chez l’homme. De plus, ce projet a été initié, évalué et validé par la direction de notre société dont la politique est basée sur un gage de qualité, de professionnalisme, d’intégrité et de respect de l’animal.
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des pathologies neuromusculaires, souvent chroniques, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces pathologies neuromusculaires implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène…Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents (somnolence, nausée, fatigue). Une solution pour diminuer ces effets secondaires consiste à administrer le baclofène via une pompe intrathécale ; cette approche est toutefois invasive. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces pathologies : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente de clairs avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Toutefois, cette approche peut encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. Il n’existe à ce jour pas de test in vitro qui permette de tester la pharmacologie
Procédures
Injection des composés : 1 injection x 1 minute / animal Pesée tout le long de l'étude : minimum 5 pesée x 30 sec / animal = 2.5 min / animal. Mesure du DAS tous les jours : 30 sec / animal pendant environ 28jours soir 14 min/ animal. Mesure de l'activité roue : les rats sont continuellement herbergés dans les cages à roues.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette procédure, aucun signe clinique n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Cependant, dans le cas où l’injection serait mal réalisée les signes observés et les mesures mises en oeuvre sont décrits dans le tableau fourni dans l’annexe jointe.
Devenir
Les animaux seront euthanasié à la fin de procédures. Nous prélévrons les muscles injectés pour des analyses histopathologiques
Remplacement
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test de la course volontaire sur une roue en accès libre chez le rongeur, a été développé pour comparer les myorelaxants, et a permis par le passé de développer de nouvelles molécules.
Réduction
Pour chacun des protocoles, 6 animaux par groupe seront étudiés afin d'obtenir des résultats qui soient statistiquement comparables et qui permettent d'apporter des conclusions fiables qui ne peuvent être remis en question ce qui nécessiterait la réalisation d'un nouveau protocole pour confirmer les résultats. En plus des groupes impliquant les traitements avec les principes actifs, un groupe avec un produit de référence seront ajoutés aux protocoles.
Raffinement
les animaux seront hébergés en groupe avec enrichissement du milieu (bille en verre, et roue), et surveillés quotidiennement. L’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, diminuant le stress pour les animaux. De plus, de la réception jusqu'à la fin du protocole, une observation quotidienne des animaux sera réalisée (état général, comportement, souffrance, stress et détresse, inconfort, réponse aux stimuli externes). De J0 à jusqu'au jour de l'euthanasie, il conviendra de suivre : - l’état général de l’animal (plusieurs fois la première semaine après l’injection), puis à chaque suivi clinique (1 à 2 fois par semaine) - la réaction à l’administration des principes actifs et du produit de référence - le poids (2 fois la première semaine, puis 1 fois par semaine jusqu’à la fin du protocole.
Choix des espèces
Afin d’évaluer l’activité myorelaxante sur ce modèle, nous souhaitons avoir recours au test de la course volontaire sur une roue libre d’accès chez le rongeur. En effet, la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Au contraire, ce test est un modèle pertinent pour évaluer l’efficacité de molécules myorelaxantes. Par souci de continuité avec les premières études, nous utiliserons le rat, afin de pouvoir réutiliser certains paramètres déterminés et optimisés dans les études précédentes. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6-7 semaines en début d’expérimentation et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation. Des animaux juvéniles seront choisis par souci de continuité avec les études précédentes.
Développement de la thérapie génique pour la surdité chez le primate non humain (PNH)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
72 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de l'oreille interne d'une à deux heures sous anesthésie, une injection de vecteur viral, des prises de sang et des prélèvements de liquide cérébrospinal, pour tester une thérapie génique de la surdité avant un passage chez l'Homme. Le porteur indique des effets possibles comme une perte d'équilibre et un nystagmus transitoires, et décrit ce projet comme "indispensable" au dossier réglementaire de première administration humaine. Il affirme que la souris ne permet pas cette translation et conclut à la "nécessité" du primate.
Objectifs
Le projet est réalisé pour vérifier et optimiser la transduction du vecteur viral (soit le composé d’intérêt de la thérapie génique développée), d’en évaluer l’impact sur la fonction auditive ainsi que sa sécurité chez le PNH afin de préparer, chez l’Homme, la restauration de la fonction auditive, en cas de surdité profonde héréditaire, à l’aide du vecteur précédemment sélectionné. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme et fait partie des dossiers présentés aux autorités.
Bénéfices attendus
Suite à ce projet, le traitement pourra être testé en clinique, avec l’objectif ultime de palier la surdité tout en préservant la structure de l’oreille interne, laissant ainsi la possibilité pour le patient d’avoir ultérieurement un autre traitement tel que la pose d’un impant cochléaire par exemple.
Procédures
Chirurgie : sur animaux sous anesthésie générale, tous les animaux de l’étude, selon les protocoles d’usage vétérinaire. Considérant que la procédure chirurgicale commence avec l’anesthésie de l’animal et se termine au réveil de l’animal, la durée de chirurgie est estimée entre 1 heure (traitement unilatéral) et 2 heures (traitement bi-latéral). Prises de sang : sur animal vigile, tous les animaux de l’étude, contention manuelle, nombre de prélèvements selon les études mais toujours 1) dans le respect du volume maximal prélevable et 2) avec un temps de récupération des animaux entre 2 prises de sang. Les prises de sang, incluant la durée de contention de l’animal, sont de courte durée (environ 1 à 2 minutes) Liquide de l’oreille, liquide cerebrospinal : sur animal sous anesthésie générale ou à la nécropsie, tous les animaux de l’étude, 1 prélèvement par occasion, au maximum 2 occasions par animal (à la chirurgie et à la nécropsie)
Impact sur les animaux
Les nuisances correspondent essentiellement à la chirurgie et aux conséquences de la chirurgie. Suite à la chirurgie, et selon sa durée (si traitement uni- ou bi-latéral, durée entre 1h et 2h), les animaux peuvent présenter une phase de réveil plus ou moins longue (variabilité inter individuelle), toujours sous surveillance étroite des techniciens et l’appui des vétérinaires. Il est possible qu’après la chirurgie, les animaux présentent une baisse légère et ponctuelle de leur prise alimentaire et de leur poids. Les effets indésirables potentiels sont une perte d’équilibre et/ou un nystagmus (mouvement d'oscillation involontaire et saccadé du globe oculaire) transitoire(s). Dans tous les cas, une analgésie et une surveillance péri-opératoire sont mis en place (ex : les animaux sont suivis quotidiennement avec plusieurs examens quotidiens sur au moins 10 jours post-chirurgie avec contrôle vétérinaire).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour permettre la collecte de tissus, fluides pour évaluer la toxicité du test item, la biodistribution du test item.
Remplacement
Il n'existe pas de système in vitro à l'heure actuelle pour la validation de l’efficacité et de la sécurité de la transduction des différents sérotypes de vecteurs viraux présélectionnés dans le modèle murin. Nécessité d’optimiser la chirurgie, la dose et le sérotype viral chez le PNH afin de pouvoir ensuite transférer cette stratégie à l’humain.
Réduction
Le nombre d'animaux est estimé en fonction de la variation attendue concernant les différents paramètres explorés : transduction du vecteur dans les cellules ciliées, modification des seuils en PEA. Cette estimation du nombre a été déterminée pour permettre la détection d'une différence de 10% minimum de transduction virale entre les cellules ciliées des cochlées et pouvoir détecter une éventuelle variation de 10 dB à deux fréquences sur les PEA des oreilles injectées et non injectées afin de vérifier l'absence d'effets indésirables de la technique et/ou du virus pouvant causer une perte de l'audition. Les tests statistiques seront choisis en fonction des paramètres comparés. Cette procédure permet d'optimiser le nombre d'animaux utilisés dans chaque série, soit en utilisant les deux oreilles avec une condition différente pour chacune, soit en utilisant à chaque fois l'oreille controlatérale comme témoin expérimental.
Raffinement
Pendant la phase pré-opératoire et de réveil et ensuite pendant au moins 10 jours après la chirurgie, sont surveillés étroitement : l’activité et la mobilité dans les volières des animaux, les interactions sociales et les expressions faciales, l’apparence physique (aspect de la fourrure traduisant les phases de toilettage entre congénères, poils drus), les éventuels écoulements nasaux et/ou oculaires, les postures inhabituelles, la réponse aux stimuli, la consommation alimentaire, le poids, le clignement des yeux/mobilité des paupières (signes cliniques de paralysie faciale, en raison de la chirurgie intracochléaire), par les techniciens avec l’appui des vétérinaires. A chaque paramètre évalué est associé un score de sévérité. La somme permet de définir un score total. Selon le résultat, le vétérinaire est consulté pour mise en place des soins pour soulager l’animal (ex. traitement anti-inflammatoire). Par exemple, en cas de dessèchement de l’oeil, une pommade (Ocrygel ou équivalent) sera utilisée. Egalement, suite à la chirurgie, des rations additionnelles de fruits et de légumes peuvent être proposées aux animaux pour favoriser la prise alimentaire dès 24 heures après la chirurgie afin d’éviter la perte de poids, et les animaux peuvent être regroupés dès leur réveil complet après chirurgie pour permettre les interactions physiques entre congénères et favoriser le retour au comportement physiologique, dont la consommation de fruits/légumes. S’ajoute également le suivi quotidien de la fréquence cardiaque et de la température corporelle sur ces 10 jours (et plus si l’état de l’animal l’exige). Afin de limiter la douleur et la souffrance des animaux, toutes les interventions chirurgicales sur les animaux se feront sous anesthésie générale, renforcée par des compléments analgésiques et antiinflammatoires appropriés, selon les procédures vétérinaires approuvées. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites, qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.Les animaux seront hébergés au minimum par deux et un programme d'enrichissement adapté est mis en place tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Les études préalables menées chez la souris ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’Homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’oreille comparable à celle de l’Homme. Le choix de macaca fascicularis est justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système auditif, une dimension et une structure de l’oreille moyenne et interne comparable à celles de l’Homme. Des études préalables ont également mis en évidence une différence morphologique critique entre l’oreille moyenne de souris et celle de macaque. Seuls ces derniers présentent une structure de la fenêtre ovale similaire à ce que l’on retrouve chez l’Homme (absence d’artère stapédienne qui existe chez la souris) et permet de rendre possible la translation de la technique d’injection locale dans l’oreille interne à l'Homme. Animaux (2 à 6 ans). La nécessité de travailler avec des animaux de cet âge est de pouvoir avoir un système auditif bien développé au moment de l’étude.
Mise au point d’un modèle de nécrolyse épidermique toxique chez la souris et évaluation préclinique d’un anticorps dans ce modèle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le protocole vise à créer chez elles un modèle de nécrolyse épidermique toxique, une réaction cutanée grave, par des injections répétées et un transfert de cellules, puis à tester un anticorps. Le porteur indique attendre un œdème cutané puis un décollement de l'épiderme, des atteintes des muqueuses et des conjonctivites, les animaux étant mis à mort dès le décollement, et pratique chaque jour un test de Nikolsky qui consiste à presser la peau pour voir si l'épiderme se détache. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne peut reproduire ce qui se passe dans un "organisme entier" et juge le modèle in vivo "obligatoire".
Objectifs
Les réactions d’allergie médicamenteuse, appelées également toxidermies médicamenteuses, sont des effets secondaires fréquents chez les patients hospitalisés (1‐3%). Il s’agit de réactions de type d’hypersensibilité retardée dues à des lymphocytes T, au cours desquelles la prise de médicament est l’élément déclencheur. Ces réactions allergiques peuvent être de sévérité très variée. Les plus sévères sont connues sous le nom de nécrolyse épidermique toxique . Il s’agit d’une réaction rare (2-4 patients/million d’habitants/an) mais extrêmement sévère, avec décollement et nécrose de la partie supérieure de la peau, parfois sur l’ensemble du corps. Ces réactions sont potentiellement mortelles (~30%) ou entraînent fréquemment de graves séquelles (>50% des patients). Malheureusement il n’existe à ce jour aucun traitement ayant fait preuve de son efficacité dans cette pathologie, et la seule prise en charge consiste à arrêter le traitement responsable et à prendre en charge la cicatrisation des patients dans un centre de grands brûlés. Des études réalisées chez les patients atteinds de toxidérmie sévères ont permis d’identifier un biomarqueur qui est exprimé de façon prédominante sur les cellules immunes responsables de la maladie. Ce biomarqueur constitue une cible de traitement nouvelle et prometteuse. Avant toutefois de passer chez l’homme, des études précliniques chez l’animal sont indispensables. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de nécrolyse épidermique toxique chez la souris. Aussi ce projet a pour but dans un premier temps de mettre en place un modèle murin susceptible de mimer les atteintes cutanées observées au cours de la maladie, puis dans un 2e temps, de tester l’efficacité d’un anticorps thérapeutique à bloquer ce biomarqueur, ceci afin de prévenir ou retarder l’apparition de symptômes cliniques dans ce modèle.
Bénéfices attendus
1-Développement d’un nouveau modèle expérimental susceptible de mimer la nécrolyse épidermique toxique, et qui pourra par la suite être utilisé pour mieux comprendre le développement de cette affection. 2-Faire la preuve de concept que l'utilisation d’un anticorps thérapeutique permet de bloquer la réponse immune et d’inhiber le développement des symptômes cliniques chez l’animal, ouvrant de nouvelles perspectives pour l’évaluation d’un anticorps similaire (déjà commercialisé) chez les patients atteints d’allergie médicamenteuse.
Procédures
Les animaux seront injectés en vigiles par injections à plusieurs reprises (selon les animaux=1 ou 2 injections tous les 5 jours, soit 3 ou 6 injections au total, durée 30sec). Le transfert des cellules sera fait par injection sur des animaux anesthesiés (1 injection, 40sec). Des tests de Nikolsky (legère pression de la peau avec le doigt) seront réalisés sur les animaux quotidiennement sous anesthésie (30 sec). Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en vigile (15sec). Les oreilles des animaux seront egalement mesuré quotidiennement 5jours/7 sous anesthesie (durant 21 jours maximum, durée 30 sec)
Impact sur les animaux
Les anesthésies peuvent entrainer du stress chez les animaux. Les injections générent un stress et une légère douleur. Pour les animaux qui vont developper une réaction mimant les symptômes de la nécrose épidermique toxique avec des atteintes cutanées : on s'attend à ce que les premiers symptômes arrivent entre 7 et 10 jours après le début de la procédure, et a ce que les animaux développent dans un premier temps un léger œdème cutanée (qui sera suivi par l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille) ce qui pourra engendrer de l'inconfort, peux être des grattages chez ces animaux. Puis dans un deuxième temps on devrait observer un détachement de l’épiderme par endroit. Celui-ci sera suivi quotidiennement par la réalisation d’un test de Nikolsky sur des animaux anesthesiés (en exerçant avec un doigt une très légère pression / frottement sur la peau afin de voir si l’épiderme se détache). A noter que des atteintes des muqueuses , et des conjonctivites sont possibles ainsi qu’une modification significative de l’activité.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort en vue de réaliser des analyses sur la peau. Ces analyses permettront d'analyser les populations de cellules qui infiltrent le tissus et de bien les caractériser afin de valider le modèle et egalement de pouvoir confirmer au niveau cellulaire l'efficacité ou non de l'anticorps d'intérêt.
Remplacement
La finalité du projet est de tester un nouveau traitement susceptible de bloquer la réponse immune et d’inhiber le développement des symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique. Le signe clinique clé de la pathologie est le détachement de la membrane basale suite à l’activité cytotoxique de cellules spécifiques qui vont infiltrer le tissus. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour évaluer ce traitement.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique. Il a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que la 2e partie de ce projet ne sera réalisée qu'en fonction des résultats obtenus pour le développement du modèle expérimental.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront maintenus entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, pour prévenir tout stress et limiter la survenue de symptômes douloureux ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 7jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dès l’apparition des premiers symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique (décollement de l'épiderme), les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour explorer les maladies immunologiques, telles que l’allergie ou l’inflammation cutanée, en raison des nombreux outils qui ont été développés pour caractériser les réponses immunitaires. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. Les souris entrent dans les procédures à l’âge de 5-22 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.
Rémission de la pathologie cardiaque pour un vieillissement de qualité : recherche et validation d’acteurs moléculaires dans un modèle murin EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet jumeau d'un même protocole multicentrique impose à chaque animal deux chirurgies cardiaques espacées de quatre semaines, des séances d'imagerie sous anesthésie, des courses forcées sur tapis roulant et des prélèvements sanguins, pour caractériser la récupération du cœur après un stress pathologique transitoire. Les bénéfices avancés pour l'Homme restent formulés au conditionnel et à long terme, l'objectif immédiat étant le séquençage des gènes exprimés dans le cœur. Le porteur décrit l'insuffisance cardiaque comme une atteinte de l'"organisme entier" et affirme la "nécessité" du modèle murin.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du cœur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de cœurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront déployées dans 2 zootechnies disposant d'outils et compétences complémentaires.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbi-mortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.
Procédures
La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Elles constituent les sources de douleur (chirurgies et période post-opératoire) mais toutes les mesures d’analgésie nécessaires et validées seront prises pour l'empecher. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.
Devenir
Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en œuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances et techniques acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible thérapeutique identifiée lors de la réalisation du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur et l'inactiver.
Rémission de la pathologie cardiaque pour un vieillissement de qualité : recherche et validation d’acteurs moléculaires dans un modèle murin EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cardiaques, une pour induire la pathologie puis une pour la corriger quatre semaines plus tard, suivies d'échographies et de scanners sous anesthésie, de courses forcées sur tapis roulant et de prélèvements sanguins répétés, pour étudier le remodelage inverse du cœur. Les retombées annoncées pour les patients, un vieillissement en meilleure santé et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, alors que l'objectif immédiat reste de décrire des mécanismes moléculaires. Le porteur affirme que l'insuffisance cardiaque touche l'"organisme entier", ce qui rendrait une approche in vivo "indispensable", et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles, d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du coeur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de coeurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront conduites dans 2 zootechnies disposant d'outils et de compétences complémentaires.
Bénéfices attendus
traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.
Procédures
La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Toutes les mesures d'anesthésie et d’analgésie nécessaires pour prévenir et empecher la douleur sont prises. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.
Devenir
Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico (modélisation informatique) et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en oeuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible identifiée au point 1 du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur qui l'inactiverait.
Étude de la dynamique des modifications de l’expression des gènes au cours de la tumorigenèse dans le cancer du sein triple négatif
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
956 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines développent spontanément des tumeurs mammaires, d'autres subissent l'ablation du coussin adipeux et une greffe sous anesthésie, puis des traitements, avant prélèvement des échantillons. L'objectif est d'étudier les modifications épigénétiques précoces de la tumeur du sein triple négatif. Le porteur affirme utiliser en priorité des cultures d'organoïdes mais conclut que celles-ci ne reproduisent pas le développement tumoral complet in vivo.
Objectifs
Le cancer du sein est une maladie qui touche 1 femme sur 8, en France. Un des sous-types le plus agressif est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui représente 17% des cancers du sein. Des raisons génétiques peuvent être la cause du développement de ce cancer mais l’analyse des gènes ne permet pas à elle seule d’expliquer l’initiation et la progression de la maladie. Une mutation peut empêcher ou activer l’expression d’un gène. Mais d’autres mécanismes peuvent également perturber l’expression de ces derniers : ce sont les mécanismes épigénétiques. Ils régulent la structure de l’ADN (la chromatine), modifiant ainsi son état de compaction et donc la capacité d’un gène d’être exprimé ou non. Notre projet consiste à étudier les modifications du paysage épigénétique dans les cellules pré-tumorales et tumorales, afin d'étudier leur potentiel rôle dans la transformation des cellules saines en cellules cancéreuses au cours de la tumorigenèse. Plusieurs applications cliniques peuvent découler de ce projet, identifier et caractériser les cellules pré-tumorales est en effet un enjeu majeur pour améliorer la prise en charge et le diagnostic des patientes à risque. Ce projet présente un défi majeur : comment étudier une population de cellules rares avant l’apparition de tumeur ? L'accès à des échantillons pré-tumoraux humains est évidemment très rare, il est donc indispensable de travailler sur un modèle murin qui développe des TNBC. En prélevant des échantillons à différents moments de la croissance tumorale, nous pourrons alors cartographier l’identité des cellules à chaque stade de la tumorigenèse (avant apparition de tumeur, pendant transformation des cellules saines en cellules tumorales, à différents stades de croissance de la tumeur). L’objectif général est donc de caractériser et d’identifier les modifications non génétiques – i.e les modifications sur la chromatine et d’expression des ARNs - qui participent à tumorigenèse du cancer du sein triple négatif.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre une compréhension détaillée de la mise en place des tumeurs mammaires depuis les premières altérations d’une cellule d’origine à la formation d’une tumeur entière qui déstructure le tissu. Ces étapes initiatrices sont inaccessibles chez la femme, car les patientes arrivent à l’hôpital avec un cancer déjà apparu. L’étude moléculaire complète à haute résolution temporelle de la tumorigénèse mammaire chez l’animal va nous permettre de déterminer les éléments clefs qui mènent à la formation des tumeurs dans la glande mammaire. A plus long terme, ce projet pourrait ouvrir des perspectives pour l’interception et la détection des tumeurs mammaires de manière extrêmement précoce. Grâce à nos études chez l’animal, nous espérons à long terme avoir un impact sur la prise en charge et le traitement du cancer du sein triple négatif. En effet, un objectif est d’identifier des marqueurs de transformation précoce, pouvant servir de biomarqueurs de détection, ainsi que des voies de signalisation activées dès les premières étapes de la transformation mammaire, pour proposer de les cibler par des approches thérapeutiques chez les femmes à risque.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet sera injectée (1 fois) dans l’abdomen (injection intrapéritonéale sur animaux vigiles) avec un produit non toxique et non douloureux (durée du geste inférieur à 10 sec). Une autre partie des animaux sera anesthésiée puis opérée (ablation du coussin adipeux mammaire puis injection de cellules mammaires ou de fragments fragments mammaires) (durée de l’anesthésie inférieure à 20 minutes). Une autre partie des animaux recevront un traitement test anti-cancéreux par voie orale ou directement dans l’abdomen. En fonction des molécules le traitement pourra être administré de 1 fois toutes les 3 ou 4 semaines à 1 fois par jour pendant 3 à 6 semaines (durée du geste inférieure à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les 4 lignées d’animaux transgéniques vont spontanément développer des tumeurs mammaires sous-cutanées (1 ou plusieurs). Des méthodes non invasives seront utilisées pour évaluer l’apparition de ces tumeurs. Les nuisances expérimentales se limiteront aux stress de la contention et de la manipulation des animaux et les nuisances modérées sur les animaux seront donc la conséquence de l’apparition des tumeurs Les animaux greffés avec des cellules tumorales dans la glande mammaire développeront des tumeurs qui seront mesurées quotidiennement. Les nuisances attendues suite à l’injection de produits dans l’abdomen des animaux sont les douleurs liées à la piqûre.
Devenir
Toutes les souris sont mises à mort au terme de l’expérience pour récupérer les échantillons d'intérêt.
Remplacement
Nous avons développé différents systèmes d’analyse en culture cellulaire de la glande mammaire et des cellules tumorales (système de culture organoïde – où les cellules de la glande mammaire se cultivent en 3D et s’organisent en mini-glandes - ces cultures sont mises en place à partir d’échantillons de glandes mammaires pré-tumorales ou contrôles). Ces essais permettent d’obtenir des informations très importantes sur les capacités de prolifération et de différenciation des cellules saines et tumorales. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo, notamment pour faire tous les tests fonctionnels. Toutefois, aucun d’entre eux ne permet d’analyser dans leur ensemble les processus complexes du développement et transformation de l’épithélium mammaire à partir de cellules isolées ou de fragment tissulaire, comme il est possible de le faire après transplantation dans le coussin adipeux de souris hôtes. De la même façon, seuls les modèles transgéniques permettent d’analyser in vivo l’impact de la perturbation de molécules régulatrices sur le développement et la tumorigénèse mammaire.
Réduction
Pour l’étude du développement tumoral dans les lignées transgéniques, la stratégie d’accouplement a été optimisée pour obtenir le maximum de souris de génotype adéquat et ainsi réduire l’élevage. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Nous limitons également le nombre d’animaux utilisés en réalisant les expériences fonctionnelles ex vivo, à partir de culture organoïdes de la glande mammaire animale.
Raffinement
Pour limiter le stress, les femelles sont regroupées à raison de 6 femelles maximum par cage. Les souris transgéniques pour lesquelles le développement de tumeurs est attendu seront surveillées 2 fois par semaine. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. Les animaux qui subiront des procédures chirurgicales recevront des anesthésiques et analgésiques. La chirurgie et le réveil seront réalisés sur plaque chauffante pour éviter tout risque d’hypothermie. Des aliments gélifiés seront mis à disposition des animaux pendant les 2 semaines suivant l’opération. Les animaux seront surveillés 2 fois par semaine pendant 8 à 12 semaines après la transplantation. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. Le modèle souris est le plus approprié à l’expérimentation sur la glande mammaire, en biologie du développement comme en cancérogenèse. Les souches murines sont parfaitement définies et permettent l’obtention de modèles génétiquement modifiés. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Les souris génétiquement modifiées pour lesquelles le développement de tumeurs est attendu seront utilisées à l’âge adulte (stade de développement des tumeurs). Les souris utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles prépubertaire âgées de 3 semaines, âge nécessaire car à ce stade l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du coussin adipeux resté intact.
Génération d’anticorps chimériques humains à l’aide de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à dix injections, avec adjuvant de Freund, et douze prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever la rate, les ganglions et la moelle osseuse. L'objectif est commercial, produire des anticorps humains à partir de souris génétiquement modifiées pour remplacer les produits d'origine humaine dans des kits de diagnostic. Le porteur affirme qu'une réponse immunitaire in vivo est "nécessaire" et présente une "offre sur mesure" à ses clients.
Objectifs
Le but est de générer des anticorps humains à l’aide de souris génétiquement modifiées et de les mettre à disposition pour la clinique humaine. A ce jour, les kits cliniques détectent un anticorps spécifique d’une cible donnée (bactérie, virus, allergène…). Ils nécessitent un sérum humain et des anticorps de référence pour contrôler la qualité des kits. Pour des raisons légales et éthiques, la production d’anticorps à partir de produits d’origine humaine a pour but d’être supprimé. La limite est aussi l’absence de standardisation car le taux d’anticorps varie d’un patient à l’autre. De plus, les besoins croissants en produits d’origine humaine sont aujourd’hui difficilement pourvus. Pour certaines pathologies, il est parfois difficile d’obtenir un sérum humain ayant la spécificité souhaitée. La production d’anticorps humains permettrait : - une absence de contamination d’agents pathogènes - une production robuste et respectueuse des contraintes règlementaires - une évolution dans la production d'anticorps au vu de la suppression des produits d’origine humaine - une standardisation garantissant de reproductibilité des tests - une offre « sur mesure ». Afin d’obtenir des anticorps ayant la plus forte affinité pour l’antigène, une réponse immunitaire in-vivo est requise. Après une première réponse immunitaire in-vivo chez l’animal, nous prélèverons les organes d’intérêt et effectuerons ensuite la production d'anticorps entièrement in vitro. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire une réaction immunitaire humaine et obtenir des anticorps très proches de ceux des patients. 3 lignées seront utilisées pour cibler entre autres les pathologies suivantes : otite, sinusite, bronchite, pneumonie, infections pulmonaires chroniques, allergies, diarrhée chronique, maladies auto-immunes, maladies gastro-intestinales, rhinite, asthme et infections parasitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise au point de la production de larges lots d’anticorps humains à partir de souris. Chez la souris nous pourrons moduler la réponse immunitaire pour permettre la génération d’anticorps spécifiques au traitement de maladies infectieuses et utiles dans le cadre d’auto-immunité, d’inflammations chroniques, de cancers, d’allergies, voire de troubles hématologiques.
Procédures
Les animaux subiront au maximum 10 injections intrapéritonéales (ou intramusculaire ou intra-veineuse dans de rares cas), durée moins de 30 secondes. 12 prélèvements sanguins maximum seront aussi effectués, chacun durant environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
La répétition des injections intrapéritonéales (ou intramusculaire ou intra-veineuse dans de rares cas) pourrait engendrer un léger inconfort chez les souris. De plus, un adjuvant de Freund sera utilisé lors des injéctions d'antigène.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure afin de collecter des cellules de la rate, des ganglions ou de la moelle osseuse pour créer les banques d'anticorps.
Remplacement
Une réponse immunitaire in-vivo est nécessaire afin d’obtenir des anticorps spécifiques. Des anticorps de synthèse seraient à l’inverse moins spécifiques. C’est pourquoi l’utilisation de la souris est nécessaire. Les souris génétiquement modifiées permettent de reproduire une réaction immunitaire équivalente à ce qui est observé chez l'Homme et donc d’avoir des anticorps très proches de ceux retrouvés chez des patients.
Réduction
Nous utiliserons 10 souris par projet, en immunisant 2 lots successifs de 5 souris, afin de garantir la production des livrables dans le cadre de projets de prestation de service. Ce nombre théorique pourra être réduit si au moins une souris parmi le premier lot de 5 développe la réaction immunitaire souhaitée. Nous prélèverons les organes d'intérêt et pour ensuite réaliser la production de l'anticorps in vitro. Ainsi, les animaux seront utilisés seulement pour la phase de développement initiale. Une fois les anticorps créés, l’utilisation d’animaux ne sera plus requise. Nous évaluerons la production d’anticorps chez toutes les souris en fin de protocole. La méthode ne vise pas le calcul d’une valeur précise d’anticorps et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur la présence ou non d’anticorps chez les animaux.
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les antigènes seront injectés sur des animaux vigiles afin de réduire au minimum le nombre de manipulations sur les animaux. De plus, les tests préalablement faits avec ces antigènes ne mettent pas en évidence de dommage quelconque subi par les animaux.
Choix des espèces
La génétique ainsi que le système immunitaire des souris sont bien caractérisés. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux comme la souris permettra d’induire une réponse immunitaire caractéristique et facilement identifiable. Nous utiliserons des souris adultes entre 2 et 12 mois. Durant cette période, le système immunitaire est bien développé et fonctionnel et son efficacité de production d’anticorps n’est pas impactée par l’âge des animaux. De plus, cette large fenêtre d’utilisation nous permettra d’éviter la surproduction d’animaux pour le maintien des lignées.
Evaluation de différentes stratégies nutritionnelles sur la physiologie du porcelet sevré élevé dans différentes conditions d’élevage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
720 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 540 poursuivant ensuite leur cycle de production et 180 tués pour prélèvements. Ils subissent des prises de sang jugulaires, des collectes de fèces et d'urine, et peuvent être exposés à des températures de 16 à 33 °C et à un jeûne allant jusqu'à 24 heures. L'objectif est commercial, tester des solutions nutritionnelles et des additifs de croissance pour porcelets sevrés en vue d'une mise sur le marché. Le porteur affirme que la complexité des régulations physiologiques ne permet pas de recourir à des modèles in vitro.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets de différentes stratégies alimentaires et conditions d’élevage sur différents paramètres physiologiques et sur les performances de croissance des porcelets sevrés (de 21 à 70 jours d’âge).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la meilleure connaissance de la physiologie du porcelet permettant in fine la mise en marché d’une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs permettant d’améliorer la santé et/ou les performances de croissance des porcelets pendant la phase de post-sevrage.
Procédures
Au maximum, 2 séries de maximum 3 prises de sang par ponction à une veine jugulaire ou à la région caudale pourront être réalisées. Les prises de sang seront espacées d'au moins 30 minutes et les séries de 3 prises de sang seront espacées d'au moins 7 jours. Par ailleurs, des mesures répétées (5 en 4 heures) à l’aide d’un dispositif de biologie déportée pourront être réalisées avec deux gouttes de sang par prélèvement sur les porcs. Un maximum de 3 prélèvements de fèces pourra avoir lieu par application de la procédure. De plus, jusqu’à 3 collectes d’urine pourront avoir lieu, espacées d’au moins 7 jours. La collecte se fera grâce à une poche de récolte d’urine collée sous l'abdomen des porcelets mâles, gardée maximum 7 heures, afin d’obtenir un volume suffisant d’urine. Les prélèvements de fèces, de sang et d’urine pourront être réalisés indépendamment les uns des autres. Les porcs pourront être soumis à des conditions dites « dégradées », représentatives des conditions rencontrées en élevages : déviation de températures de 16 à 33°C. Les porcs pourront être soumis à une mise à jeun n’excédant pas 24h.
Impact sur les animaux
Les prélèvements d’échantillons biologiques peuvent induire un stress lors de la manipulation des animaux. Afin de réduire le stress ou la douleur, le nombre de tentatives de collecte d’échantillons biologiques sera limité, les animaux seront manipulés le moins possible et le nombre d’animaux exposés à la procédure sera préalablement défini en respectant le principe de réduction.
Devenir
Les animaux ayant reçu un additif non autorisé au sein de l’Union européenne seront euthanasiés et exclus du circuit de consommation humaine. De plus, au maximum 3 essais avec 60 porcelets soit 180 porcelets au total pourront faire l’objet d’euthanasie afin de prélever des échantillons biologiques. Les autres animaux seront maintenus en vie et continueront leur cycle de production.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre comment les stratégies nutritionnelles et/ou méthodes d’élevage mises en œuvre affectent la santé, le bien-être et les performances du porcelet sevré par la compréhension des mécanismes physiologiques (dosage de biomarqueurs dans le sang, les fèces et les urines). L'effet d'une solution nutritionnelle ou d'un changement de conditions environnementales sur la santé et les performances de croissance des porcs est la résultante d'une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet pas d’utiliser de modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d’études in-vitro.
Réduction
L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse physiologique des porcelets à une ou plusieurs stratégies nutritionnelles et/ou soumis à différentes conditions d’ambiance. La variabilité observée pour les biomarqueurs est généralement plus faible que celle observée pour les performances de croissance. Cela implique de fait un nombre plus faible d’animaux impliqués dans chaque essai. Toutefois, la variabilité dépend du biomarqueur, ce qui nécessite d’adapter le nombre de porcelets par traitement expérimental à chaque mise en oeuvre de la procédure. (=essai). Un exemple de calcul de « la puissance statistique du test » prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, une différence de 5% de GMQ (=Gain Moyen Quotidien) entre les traitements et un coefficient de variation de 4,3% donne un nombre minimal de 12 répétitions (=individus) par traitement expérimental avec un maximum de 5 traitements expérimentaux par essai. Toutefois, s’il s’agit d’une étude de prévalence, 60 porcelets peuvent être nécessaires afin d’obtenir au moins 5 individus par modalité de traitement. La méthode de calcul de « la puissance statistique du test » est robuste et est couramment utilisée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à la mise en évidence d'une différence significative entre deux groupes dans un essai. Lorsque plusieurs traitements seront comparés, les essais seront réalisés sur des animaux homogènes (poids vif, sexe et origine génétique) et en bonne santé afin de réduire la variabilité individuelle en début d’essai. La distribution des données sera évaluée selon qu’elles se situent, ou non, dans l’intervalle moyenne ± 2 écarts types afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques seront soumises à des analyses de variance avec le traitement expérimental en effet fixe. La mortalité et les évènements sanitaires seront évalués selon des tests d’indépendance. Le niveau de significativité est fixé à P
Raffinement
L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’EU. Si un porc présente des signes de stress, ou des douleurs (boiteries, blessures…), alors il sera écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux.
Choix des espèces
L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. De plus, la spécificité des conditions d'élevage de cette espèce de rente ne permet pas de la remplacer par une autre espèce modèle. Enfin, le porc est l’espèce cible des traitements testés. Les animaux utilisés seront des porcelets sevrés âgés de 21 à 70 jours.
Rôle de deux enzymes dans l’épileptogenèse chez la souris atteinte de la sclérose tubéreuse de Bourneville sur le cerveau. 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour la pose de transmetteurs, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et le porteur anticipe des crises d'épilepsie potentiellement mortelles pour 10 % des animaux. L'objectif est de créer des souris porteuses de deux gènes inactivés pour étudier la sclérose tubéreuse de Bourneville. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire le développement cortical et l'épilepsie.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Mesures d’ingestion et de digestibilité in vivo de rameaux issus d’arbres fourragers.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
12 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis rendus au pâturage. Ils sont placés à l'attache dans des stalles individuelles sur caillebotis pendant deux périodes de six jours, pour mesurer l'ingestion et la digestion de rameaux d'arbres fourragers avec collecte des fèces et des urines. L'objectif est de documenter la valeur nutritive de fourrages issus d'arbres, peu étudiée en Europe. Le porteur affirme que les méthodes in vitro existent pour classer les aliments mais restent "moins fiables" que la mesure sur animal vivant.
Objectifs
Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont, ici des moutons castrés. C'est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux).
Bénéfices attendus
La valeur alimentaire des fourrages issus des arbres est peu étudiée ainsi que leur appétence, acceptabilité et l'ingestion par les animaux. Les études scientifiques sur le sujet sont encore peu nombreuses en Europe et portent plutôt sur des zones pastorales ou tropicales. Le manque de références sur la valeur nutritive des essences d’arbre en milieu tempéré constitue un frein pour le développement de leur utilisation. Les résultats obtenus dans ce projet permettront de compléter des études précédentes réalisées sur la valeur alimentaire des feuilles uniquement. Cette expérimentation permettra d'apporter des références et de caractériser la ressource fourragère dans sa globalité à l'échelle du rameau (feuilles, jeunes tiges et brindilles) consommable par les animaux et portera également sur de nouvelles essences d'arbres. Ces données viendront compléter les tables de production des arbres (hors forêt).
Procédures
Au cours de l'expérimentation, les animaux seront soumis à deux périodes de digestibilité d'une durée de 6 jours.
Impact sur les animaux
La procédure de mesure de digestibilité implique une période d’adaptation des animaux à leur régime de 7 jours qui sur un dispositif de case individuelle sur caillboti. Ensuite, les animaux sont installés à l’attache dans des stalles à digestibilité individuelles sur caillebotis en bois, permettant de mesurer les quantités ingérées et de collecter toutes les fèces et urines. Le premier jour de mise en stalle, aucune mesure n’est prévue. Les collectes de fèces et d’urines sont réalisées durant 6 jours, durée indispensable à la précision requise pour la mesure chez le ruminant, compte tenu de la longue durée de résidence des digestas dans le tractus digestif. Toutes les stalles individuelles sont installées dans une même pièce pour limiter l’isolement des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure et conduit en lot au pâturage.
Remplacement
La mesure in vivo de digestibilité est la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages. Des méthodes alternatives (in vitro) existent pour classer différents aliments sur leur digestibilité mais sont moins fiables.
Réduction
Pour la mesure d’ingestibilité puis la digestibilité, la variabilité entre animaux est plus importante pour l'ingestibilité que pour la digestibilité (la variabilité entre animaux de l’ingestibilité est de l’ordre de 9 % alors que celle de la digestibilité est de l’ordre de 3 %), il est recommandé d’utiliser un minimum de 6 animaux. La digestibilité mouton est réalisée classiquement pendant 6 jours, avec 6 moutons nourris ad libitum.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d'élevage éclairé naturellement. Les parcs d'élevage adjacents seront séparés par des barrières en bois à claire-voie permettant un contact visuel entre animaux de différents parcs et diminuant l’angoisse possible liée au cloisonnement. La taille des stalles à digestibilité est adaptée au gabarit de l’animal. Elle lui permet de se lever et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir et de s’entendre. Les animaux seront préalablement habitués aux stalles pendant la période pré- expérimentale. Les animaux seront alimentés à volonté, deux fois par jour, et disposeront d’eau à volonté et d’une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les fèces et les urines seront récoltées tous les jours dans les bacs situés sous le caillebotis, pesées, et échantillonnées. Les moutons seront suivis tous les jours lors de la distribution de l’alimentation par un animalier habilité, responsable de la mise en oeuvre du protocole.
Choix des espèces
Le mouton castré, de race Texel est un modèle animal de référence pour établir les valeurs de digestibilité et d’ingestibilité des aliments pour ruminants, et pour comprendre les processus digestifs afin de les modéliser. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux). Dans ce type d'études l'animal modèle que nous étudions est à l'entretien, sans besoin de croissance, et donc adulte (24 mois et plus). Nos équations de prédictions sont basées sur des animaux adultes sur ce principe si nous voulons extrapoler nos résultats à d'autres modèles animaux.
Evaluation préclinique de microsuture après implantation autour du système nerveux périphérique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque lapin est opéré sous anesthésie pour placer un fil de microsuture autour du nerf sciatique, puis suivi une quinzaine de jours, avec surveillance des automutilations et de la locomotion. Il s'agit d'évaluer, pour des donneurs d'ordre industriels, la tolérance de fils de suture destinés à la microchirurgie humaine, en vue d'une mise sur le marché. Le porteur affirme qu'aucune méthode ex vivo ne peut recréer ces interactions et que le nombre d'animaux, fixé par les normes, ne fait l'objet d'aucun calcul statistique.
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle animal adéquat pour étudier la tolérance locale (évaluation de la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger). Ce type de modèle animal permettra de répondre à des besoins scientifiques et cliniques actuels pour les produits de santé en microchirurgie. Ces études entreront dans la constitution de dossiers précliniques, étape nécessaire à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché et à l’utilisation clinique de ces produits chez l’humain. L’obtention d’un modèle animal de suture sur le nerf sciatique est nécessaire afin d’évaluer les produits de santé utilisés pour réaliser des microsutures sur les tissus en microchirurgie, opthalmologie, microchirurgie vasculaire et en neurochirurgie. Des modèles animaux mammifères suffisament grands (exemple : lapin) sont nécessaires pour pouvoir réaliser ce genre de microsuture. L’ensemble de ces données permettra de réduire les risques de complication lors des phases de tests.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’obtenir un modèle animal fiable et reproductible pour l’obtention de données de performance et de sécurité des produits de santé utilisés pour réaliser des microsutures sur les tissus en microchirurgie, opthalmologie, microchirurgie vasculaire et en neurochirurgie. Ainsi avec ce projet, il est possible d’analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l’obtention d’une mise sur le marché. Ce modèle animal pourra être utilisé en vue de sélectionner un produit parmi un panel de produits en développement (essais de screening), en comparant leurs données de performance et de sécurité. Ces essais de screening sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas les qualités de sécurité ou de performance satisfaisantes. Par la suite des essais de screening, ce modèle animal permet aussi de mener des essais de confirmation de performance et de sécurité d’un produit en développement, en le comparant à un autre produit déjà commercialisé, afin de s’assurer qu’il présente un bénéfice au moins égal ou supérieur.
Procédures
L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le fil de microsuture autour du nerf sciatique. Une intervention chirurgicale par animal sera réalisée. L’intervention chirurgicale aura une durée d’environ 20 à 40 minutes par site. Les animaux seront ensuite manipulés pendant la phase post-opératoire (envrion 14 jours) pour pouvoir apprécier la bonne guérison du site chirurgical et évaluer les signes de douleur. Enfin, pour évaluer l’efficacité et l’absence d’effet indésirable, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux en cours d’étude. Celles-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude).
Impact sur les animaux
A l’instar des effets secondaires possibles chez l’humain lors de microsutures, les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : - douleur et stress liés à l’implantation du fil de microsuture auour du nerf sciatique, controlée par la prise d’analgésique (morphonique) et par la réalisation d’une anesthésie générale.
Devenir
Afin de s’assurer de la sécurité des fils de suture, une observation des tissus environnant la zone d’implantation est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées sur ce modèle animal. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces facteurs explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
Les essais in vivo de sutures de microchirurgie sont nécessaires car les interactions complexes s’établissant entre le fil de microsuture et le nerf sciatique ne peuvent être recréées ex vivo. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives pour prouver l’efficacité et les performances des produits de sutures de microchirurgie. Des mesures ex vivo (tests de sutures sur nerf sciatique d’un animal euthanasié) peuvent être réalisées en amont des études in vivo, et permettent d’estimer les meilleures conditions pour disposer le fil de microsuture autour du nerf sciatique à injecter chez l’animal. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l’ensemble des réponses nécessaires à l’évaluation de la performance et de la sécurité des produits de sutures de microchirurgie en vue de leur utilisation chez l’humain. Les études in vivo sont donc nécessaires pour répondre aux exigences réglementaires et de qualité dans le but de mettre sur le marché les produits de sutures de microchirurgie.
Réduction
Le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit, avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d'animaux étant réglementé par les normes, aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
- Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie d’implantation du fil de microsuture au niveau d’un nerf périphérique, une période d’habituation aux actes spécifiques (contention,…) peut aussi être réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) -La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire immédiate, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements (si applicable), désinfection des sites chirurgicaux …). -Point limites stricts et spécifiques du projet : Les animaux seront suivis quotidiennement à l'aide du grille de bien-être animal portant spécifiquement sur l'alimentation, le transit et l'apparition d'automutilations. Un suivi de la locomotion des membres inférieurs sera également mis en place.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de plus en plus utilisé pour réaliser des expériences sur le nerf sciatique. En effet, cela fait plus de 20 ans que ce modèle est proposé pour remplacer le modèle rat qui présente de nombreux inconvénients par rapport à la taille des nerfs de ce modèle. Le lapin présente un potentiel pour les tests de dispositifs médicaux sur le nerf sciatique puisque sa taille est équivalente avec les nerfs que l’on peut retrouver au niveau du poignet ou des mains chez l’Homme (diamètre compris entre 2 et 4 mm, longueur inférieure à 30mm). L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5kg lors de la chirurgie est également recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en œuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.