Recherche appliquée

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux plaies cutanées sur le dos sous anesthésie, une infection par le staphylocoque doré pour une partie d'entre elles, puis des applications d'amibes répétées, avec des anesthésies cinq jours sur sept pendant quinze jours, avant d'être tué pour des biopsies. Le porteur décrit une possible démangeaison à la cicatrisation et un léger stress lié aux anesthésies répétées. Il affirme qu'un modèle in vitro a déjà montré l'activité antibactérienne mais ne rend pas compte de l'effet thérapeutique réel sur l'infection.

Objectifs

En réponse à la propagation préocupante du phénomène d’antibiorésistance, l’OMS a érigé une liste d’espèces bactériennes multirésistantes aux antibiotiques pour lesquelles il est primordial de développer de nouveaux composés antibactériens ou thérapies alternatives à l’usage de ces derniers. Les bactéries antibiorésistantes, et notamment Staphyloccus aureus pour la plus importante, sont à l’origine d’un nombre croissant d’infections nosocomiales et de divers types (respiratoires, urinaires, cutanées, etc). En 2019, 200 000 décès liés à des infections cutanées causées par des souches bactériennes antibiorésistantes ont été recensés de par le monde. De telles souches sont également responsables d’infections chez l’animal et représentent une véritable menace pour le traitement des infections en médecine vétérinaire. Une des alternatives aux antibiotiques actuellement à l’étude est la phagothérapie, utilisant des virus, les phages, capables de lyser spécifiquement certaines bactéries cibles. Bien que cette approche soit prometteuse, notamment pour le traitement de plaies infectées, il n’est pas à exclure que les bactéries puissent échapper à l’action des phages (systèmes de défense anti-phages, mutations). De plus, le spectre d’activité des phages est très réduit, souvent spécifique d’une seule souche bactérienne, limitant ainsi leur usage en première intention. Récemment, il a été démontré que des cellules environnementales naturellement prédatrices de bactéries, les amibes libres, sont capables d’éliminer efficacement des souches bactériennes antibiorésistantes et responsables d’infections nosocomiales. Ces résultats ont suggéré le fait que les amibes possèdent un spectre de prédation large et qu’elles pourraient être utilisées afin de contrôler les populations de bactéries antibiorésistantes se développant au niveau de sites infectieux, comme certaines plaies cutanées ou brûlures. Lors de précédents tests réalisés sur modèle murin, il a été démontré que l’application répétée d’amibes sur peau saine ou sur plaie cutanée ne génère pas de réaction inflammatoire et ne perturbe pas le processus normal de cicatrisation. Dès lors, l’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle murin d’inflammation de plaie cutanée générée par l’application topique d’une souche clinique de S. aureus et d’évaluer ainsi la capacité de souches amibiennes à contrôler la survenue d’une réaction inflammatoire par leur activité antibactérienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra dans un premier temps d’obtenir un modèle murin reproductible d’inflammation de plaies cutanées qui sera utilisé pour des expérimentations ultérieures. Ce projet permettra ensuite d’évaluer les propriétés antibactériennes et anti-inflammatoires de souches amibiennes lors de leur application sur plaies cutanées et plus largement d’avoir une idée de leur potentiel d’application dans un cadre thérapeutique, afin notamment de traiter des réactions inflammatoires et/ou infections cutanées chez l’Homme ou l’animal.

Procédures

Le premier jour des expérimentations, deux petites plaies cutanées circulaires seront réalisées sur la peau du dos de chaque animal. L’intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale (durant 20 minutes), après avoir administré un antalgique en sous-cutané 30 minutes avant. Les souris recevront 2 doses d'antalgique/ jour les 2 jours suivant la chirurgie (30 secondes). Toutes les applications de suspension de bactéries et/ou d’amibes seront réalisées sous anesthésie générale (durée = 30 secondes). Un seul dépôt de bactéries sera effectué sur les plaies (1 goutte) au cours des expérimentations, le premier jour (durée 30 secondes) et pendant les 3 jours suivants 1 goutte de suspensions amibiennes sera déposée chez les animaux traités avec ces cellules (durée 30 secondes). Les mesures (photographies) seront réalisées sous anesthésie générale (2 minutes par animal). Les expérimentations dureront 15 jours.

Impact sur les animaux

Sur le dos des animaux sera réalisée des plaies cutanées qui répresenteront environ 5% de la surface totale du dos de la souris. Ces plaies seront suivi pour certains animaux, de l'application d'une bactérie, le saphyloccoque dorée ce qui engendrera une infection de la plaie. Les animaux recevront un antalgique et cela ne generera donc pas de douleur. La cicatrisation de la plaie pourrait engendrer une légère démengeaison. L'application de bandage ne genant pas les animaux dans leur mouvements, sera disposé sur les plaies afin d'eviter des grattage qui pourrait conduire à une augmentation de la taille des plaies. D’après notre expérience, il n’est donc pas attendu de troubles importants des fonctions corporelles. Les anesthesies répétées 5x/semaine pendant 15 jours pourront entrainer un leger stress chez les animaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem. Des biopsies de peau seront prélevées afin de réaliser des analyses histologiques. Des ganglions lympathiques seront également prélevés afin d’analyser la réponse inflammatoire et l’effet anti-inflammatoire des souches amibiennes testées.

Remplacement

L'objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité antibactérienne et anti-inflammatoire d’amibes libres, et ce dans l'objectif de leur utilisation thérapeutique pour traiter des infections cutanées d’origine bactérienne et résistantes aux antibiotiques. Un remplacement in vitro (application d'amibes sur matrice solide à l'interface liquide/air recouvert de bactéries) a déjà été utilisé et a permis de démontrer l'activité antibactérienne des amibes considérées ici. Un remplacement ex vivo (épiderme reconstitué) a été envisagé. Si ce remplacement permettrait de vérifier l'activité antibactérienne, il ne permettra pas de déterminer l'impact réel de cette activitée sur la résolution de l'infection et la cicatrisation (effet thérapeutique recherché). Enfin, nous disposons d'ôres et déjà de données démontrant l'inocuité de l'application d'amibes sur des plaies non-infectées. Aussi, seule la conduite d'étude in vivo sur plaies infectées permettra de déterminer le potentiel des amibes testées à un usage thérapeutique, tel que proposé dans la demande de brevet déposé au European Patent Office.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront hébergés par groupes d'individus compatibles et dans des conditions contrôlées. Lors des expérimentations, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress pour l’animal. Des mesures seront mises en œuvre afin de limiter la douleur (anesthésie et injection d’un antalgique) et le stress des animaux.Ceux-ci seront endormis par anesthésie générale lors des procédures (formation des plaies, applications de bactéries et/ou d’amibes, mesures) et des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. Un antalgique sera administré en sous-cutané, sur animaux vigiles, 30 minutes avant d’effectuer l’acte chirurgical ainsi que les 2 jours suivants. Afin d'eviter un grattage dû à la cicatrisation et/ou l'application des composés et qui pourrait conduire à une augmentation de la taille de la plaie, les plaies seront bandées aprés la chirurgie ainsi qu'aprés chaque application. Les animaux seront surveillés quotidiennement et notamment au moment des mesures du suivi de cicatrisation 5fois/semaine. Nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux.

Choix des espèces

La souris est un petit animal à cycle de reproduction rapide qui s’adapte bien à ce type d’expérimentations, selon notre expérience et celle de l’équipe collaboratrice. Le suivi clinique de l’inflammation a été éprouvé par l’équipe à travers des expérimentations visant à mieux comprendre l’allergie cutanée. Le protocole que nous projetons de réaliser est très proche de celui ayant déjà été mis en œuvre précédemment sur plaies cutanées et ayant permis de vérifier l’innocuité de l’application de l’amibe Vermamoeba vermiformis M-2 B4 dans ce contexte. Par ailleurs, différentes études disponibles dans la littérature démontrent que la souris est un animal adapté afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement favorisant la cicatrisation cutanée. Les souris provenant du fournisseur arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d’entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.

1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la capsule du rein, des traitements par voies multiples et des séances d'imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant produire des métastases pulmonaires et une perte de poids, avant d'être tué. Le porteur, société "prestataire de services en recherche préclinique", décrit son offre de modèles tumoraux destinés à sélectionner des molécules pour l'industrie. Il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction de tumeurs en 3D reste "marginale".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre International de Recherche contre le Cancer. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Les modèles de ce projet sont des modèles orthotopiques rénaux ou des modèles dont la prise tumorale est faible dans des tissus communément utilisés (sous cutané par exemple) et dont la greffe en sub-capsulaire rénale améliore la prise tumorale, grâce à la forte vascularisation du rein. Pour certains modèles, les masses tumorales primaires greffées peuvent disséminer et créer des métastases. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme dans le cas des tumeurs de rein greffées par voie orthotopique, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tumorale tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

Il pourra être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. La greffe tumorale en subcapsulaire rénal (réalisée sous anesthésie générale et analgésie) pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner un développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2 jours. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie intra-musculaire (avec analgésie), intradermique (avec analgésie) , sous-cutanée, intraveineuse (bolus), orale, intranasale, intra tumorale, intrapéritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Les prélèvements de sang peu invasifs (veine faciale, jugulaire, caudale) seront effectués sous anesthésie générale à l’Isoflurane. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans certains cas, comme par exemple pour le prélèvement à la veine caudale ou à la veine saphène, le geste pourra être effectué sans anesthésie, uniquement sous contention. Cela pourra entrainer un stress modéré pendant le prélèvement. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation

Devenir

Etant porteurs de tumeurs les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, il sera en général nécessaire d’inclure au moins 10% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe (en général 6 à 15 animaux) est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront placés au fond de toutes les cages dès qu’une perte de poids >15% sera observée sur certains animaux en étude. La greffe subcapsulaire rénale, la pose d’implants hormonaux ou la thoracotomie seront réalisés sous anesthésie profonde avec injection pré-opératoire d’un opiacé et un alpha2 agoniste. Suite à la greffe du matériel tumoral en subcapsulaire rénal ou suite à la pose d’un implant, les animaux recevront 2 injections d’opiacé pendant 48, et éventuellement sur 24 heures supplémentaires si besoin. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (intraveineuse, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire, intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable, et sous anesthésie si besoin. Les points limites concernant le poids sont adaptés en cas de tumeurs cachectiques. Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus pouvant causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus suite à l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal, un arbre décisionnel validé par la SBEA (structure chargée du bien-être animal) sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou induites) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation).

12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dix-huit injections de thioacétamide sur six semaines, une hépatotoxine qui provoque une fibrose puis une cirrhose du foie, avec une perte de poids et une mortalité pouvant atteindre 15 % des animaux traités. Le porteur indique tuer les souris par ponction cardiaque pour prélever le foie, l'objectif étant de mettre au point une méthode d'imagerie 3D de la fibrose sur foie rendu transparent. Il affirme qu'aucun modèle de fibrose hépatique in vitro n'existe et qu'il est "contraint" de recourir à l'animal.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la première cause de maladie chronique du foie et sa prévalence ne cesse d’augmenter. La NAFLD inclus différents stades allant de la simple stéatose à la stéatohépatite non-alcoolique (NASH) caractérisée par de l’inflammation et une progression rapide de fibrose. Les patients atteints de NASH présentent un risque accru de développer une cirrhose ou un hépato- carcinome. De nombreux facteurs augmentent le risque de progression de la NAFLD à la NASH, mais les mécanismes sont encore peu connus. Il n’existe d’ailleurs actuellement aucun traitement contre la NASH. Les modèles précliniques d’étude de la NASH sont encore peu nombreux et ne récapitulent pas parfaitement les lésions observées chez les patients. Dans l’objectif de mieux caractériser le développement de réseau de fibrose, et avec l’émergence des nouvelles technologies d’imagerie, nous proposons de mettre en place une méthode pour caractériser et quantifier le réseau de fibrose hépatique en 3-dimensions par microscopie bi-photonique sur foie transparisé, c’est-à-dire rendu transparent. Pour rendre le foie transparent, nous utiliserons un protocole décrit nommé CUBIC pour « clear unobstructed brain/body imaging cocktails » ou cocktail pour l’imagerie du cerveau/corps clair et non obstrué. Suite à cela, nous visualiserons le réseau de fibrose en 3-dimensions sur des coupes d’organes de plus de 2 mm d’épaisseurs avec un microscope multi-photonique. Le projet vise ensuite à publier cette méthode dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Avec les prélèvements de foie fibrosé, nous envisageons de développer une méthode de transparisation de foie murin avec le réactif CUBIC, suivie de visualisation des fibres de collagène en microscopie multi-photonique en 3 dimensions (sur foie jusqu’à 2 mm d’épaisseur). La microscopie bi-photonique est une méthode d’imagerie basée sur la propriété de certaines molécules à générer des signaux seconde harmonie (SHG, pour second harmic generation) lorsqu’elles sont excitées à une longueur d’onde spécifique. Le collagène, la molécule caractéristique de la fibrose est une molécule décrite comme étant propice à la microscopie SHG. Ainsi, la méthode que nous souhaitons développer devrait permettre : 1) Une caractérisation spatiale du réseau de fibrose plus sensible et plus complète que les analyses classiques actuellement utilisées. 2) Une meilleure connaissance de la nature des fibres, avec la possibilité d’orienter l’angle de polarisation du laser pour discriminer différentes fibres. La microscopie bi-photonique avec le SHG est une méthode « label-free », c’est-à-dire qu’elle n’utilise pas de colorants ou d’anticorps. Cela implique donc qu’en plus de réduire les coûts, d’éviter l’exposition à des colorants et produits chimiques nocifs, cette méthode d’imagerie pourrait être couplée à des méthodes d’immunofluorescences classiques sur le même échantillon. On peut donc imaginer d’étudier la colocalisation entre les fibres de collagène hépatique et l’expression de protéines d’intérêt. A la suite de la mise au point de cette méthode, nous envisageons de la publier dans un journal à comité de lecture afin que celle-ci soit accessible à toute la communauté scientifique.

Procédures

Pour mettre au point cette nouvelle méthode d’imagerie en 3 dimensions, nous proposons d’utiliser du foie de souris issues d’un modèle de fibrose hépatique induite par hépatotoxine à savoir la thioacétamide (TAA). Le TAA est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. Les souris seront soumises à 3 injections intra-péritonéales de TAA par semaine pendant 6 semaines (18 au total). Ces injections visent à induire une fibrose hépatique dans le but de notre étude. A la fin du protocole, un prélèvement de sang sera effectué par ponction cardiaque après anesthésie/analgésie chimique.

Impact sur les animaux

Le thioacétamide (TAA) est un organosulfure (formule chimique C2H5NS), anciennement utilisé comme fongicide, qui est maintenant couramment utilisé comme hépatotoxine pour induire un stade avancé de fibrose et de cirrhose chez le rongeur. L’administration de TAA provoque des lésions hépatiques, celles-ci peuvent atteindre le stade de cirrhose, avec ses complications associées. Cependant, celles-ci sont rarement sources d’inconfort pour les animaux. Une perte de poids modérés peut être observée. La mortalité peut atteindre 15% des souris traitées au TAA.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le foie.

Remplacement

La fibrose hépatique est un processus physiologique complexe, multi-cellulaire et dont la spatialisation du réseau de fibrose dans le foie a un impact physiologique (la fibrose péri-portale et différente de la porto-centrale). Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de fibrose hépatique in vitro, c’est pourquoi nous sommes contraints d’utiliser un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. L’injection de TAA ne nécessite pas d’injection d’analgésique. Les souris sont hébergées par 2 à 5 par cage pour limiter l’isolement, et les cages seront enrichies en frisotis et d’un dôme en carton. Une observation quotidienne des souris et une pesée hebdomadaire seront effectuées. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délai. Si un seul signe clinique spécifique ou 2 signes notables sont détectés alors le responsable du SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délai.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose hépatique induite par TAA chez les C57Bl/6J mâles est un modèle de choix et reconnu pour le développement de fibrose. Avec ce modèle, il est très probable que la totalité des animaux traités au TAA soient atteints de fibrose hépatique après 6 semaines de traitement ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 8 semaines au début des injections. Les injections de TAA s’étaleront sur 6 semaines. Ce sont les durées généralement utilisées dans la littérature pour induire de la fibrose hépatique au TAA.

195 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie et une IRM, une partie enchaînant une batterie de tests comportementaux étalée sur trois semaines, dont le détail n'est pas précisé, pour modéliser une démence vasculaire par microinfarctus. Le porteur indique que les nuisances tiennent surtout à la chirurgie, douloureuse, et que l'IRM sous anesthésie peut provoquer détresse respiratoire et hypothermie. Il affirme qu'un tel projet de neurosciences intégratives ne peut être mené in vitro, le cerveau étant prélevé après la mise à mort.

Objectifs

L’incidence des démences augmente progressivement avec l’âge à partir de 65 ans et atteint 28,5% de la population après 90 ans, dont 20% des formes sont dites « vasculaires ». La démence vasculaire est caractérisée par un déclin lent et progressif de la mémoire, de la pensée, du jugement et de l’apprentissage, dû à un défaut d’apport sanguin. Diagnostiquée radiologiquement, la maladie vasculaire cérébrale comprends deux types de lésions tissulaires qui sont majoritairement retrouvées chez les patients atteints : (i) les micro-infarctus, et (ii) les lésions lacunaires, caractérisées par une absence de tissu. Les études post-mortem indiquent que 64% des patients déments vasculaires présentent ces lésions, contre 24% dans la population générale. Ces deux lésions sont engendrées par l’occlusion, transitoire ou définitive, d’artères cérébrales. Les vaisseaux concernés sont des artères qui partent de l’extérieur du cerveau (cortex) pour en gagner le centre, la substance blanche, constituée de faisceaux de fibres nerveuses. Outre les conséquences locales sur la structure cérébrale, les lésions entraînent chez l’Humain une désorganisation des tissus, une diminution des zones contrôlant les fonctions et des altérations du fonctionnement de certains structures. Les modèles génétiques de la maladie sont peu reproductibles et pas adaptés à l’étude radiologique. Les modèles préexistants comme les injections carotidiennes de particules synthétiques provoquent principalement des lésions lacunaires, et la destruction d'artères par laser nécessite une technologie peu accessible. Aussi, les objectifs du projet sont : (i) d'établir un nouveau modèle de microembolies (caillots sanguins) cérébrales chez le rat permettant la génération des microinfarctus, se rapprochant ainsi de la physiopathologie de la démence vasculaire humaine, et (ii) de comparer ce modèle aux données de la clinique humaine en imagerie par IRM, en histologie, par des tests de mémoire et de comportement (anxiété et dépression). Des outils pharmacologiques (antidépresseur, anxiolytique) seront administrés aux animaux pour ce dernier volet lors des tests de dépression et d’anxiété.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux appréhender les mécanismes d'apparition des troubles fonctionnels, neurocomportemenaux et cognitifs dans la pathologie microembolique cérébrale, d'en évaluer leur rôles dans l'évolution vers la démence cérébrale, et d'y tester des approches thérapeutiques. Ce modèle à l'avantage d'utiliser des thrombus naturels, qui n'ont jamais été utilisés jusqu'à présent et se rapprochant donc de la clinique humaine.

Procédures

Tous les animaux subissent : une chirurgie sous anesthésie générale de 20 minutes, une IRM post-chirurgie d'une heure sous anesthésie générale, une ponction de LCR sous anesthésie léthale. Les animaux de la procédure 2 subissent, en sus : une batterie de test comportementaux répartis sur 3 semaines, à raison de 1 test par jour d'une durée variable de 10 à 120 minutes. Cette batterie est appliquée à J0 et à 3 mois post chirurgie; Une IRM d'une heure sous anesthésie générale. Pendant les tests comportementaux, 45 animaux receveront une dose unique de carbamazépine avant chaque test, 45 autres animaux receveront une dose unique de desipramine avant chaque test.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux seront essentiellement dues à la chirurgie, qui entrainera une douleur, et la pathologie qui peut entrainer les troubles fonctionnels. L'imagerie en IRM sous anesthésie peut provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie chez certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur l'impact de microembolies sur le fonctionnement cérébral et l'apparition de toubles comportementaux, un tel projet de neurosciences intégratives ne peut pas être mené avec des méthodes alternatives in vitro et nécessite l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 195 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études neurocomportementales et la réponse aux différentes conditions présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie. L'utilisation de l'imagerie par résonnance magnétique permet un suivi non invasif des lésions et de fait, l'économie de 135 animaux.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air), avec enrichissement. Des mesures de cocooning seront mise en place afin de diminuer au maximum la douleur, et l'anxiété des animaux. Des mesures de surveillances post-anesthésiques seront mise en place afin de s'assurer que les animaux ne présentent pas de stress majeur dans les 48 heures suivants la chirurgie à raison de 2 visites par jours, les animaux seront ensuites évalués une fois par jour. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés. Ils seront analysés au cas par cas, et les animaux seront mis à mort en fonction des points limites décrits.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces très employées dans le cadre de l'étude des maladies neurodégénératives. Les caractéristiques anatomiques et physiologiques vasculaires sont similaires à celle de l'Humain. Les rats ont une taille d'encéphale permettant une étude approfondie en imagerie. Les animaux de la phase 1 de l'étude seront inclus à l'äge de 10 semaines. Les animaux de la phase 2 seront inclus à l'âge de 6 semaines. Compte tenu du conditionnement opérant d'un mois pour le test du Touchscreen, ils seront ainsi opérés à l'âge de 10 semaines.