Recherche appliquée
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- Autres troubles humains
- Bien-être animal
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- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
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- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
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- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Développement de modèle de fibrose évoluant vers la cirrhose hépatique chez le rat. Application à l’évaluation de propriétés thérapeutiques de composés dans la décompensation aigue de la cirrhose.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une vingtaine de gavages, une injection de bactéries ou de LPS et une chirurgie abdominale avec ligature et perforation du caecum, pour reproduire une cirrhose décompensée et tester des composés. Le porteur indique s'attendre à des animaux en état de choc et en détresse cardio-respiratoire, et reconnaît limiter l'analgésie parce que la buprénorphine s'est révélée délétère et introduirait un biais. Il affirme que l'évaluation finale des composés reste "nécessaire" chez l'animal vivant.
Objectifs
La décompensation de la cirrhose est caractérisée par la jaunisse, l’œdème, l’ascite et des troubles du système nerveux central, elle conduit à la mort dans un délai de 5 ans. La transplantation hépatique doit être envisagée pour maintenir le patient en vie. Chez un malade chronique du foie, elle est appelée défaillance hépatique aigüe, elle provoque des défaillances d’autres organes (reins), qui sont souvent fatales. La décompensation aigue est provoquée par une inflammation induite par une infection microbienne ou prise abondante d’alcool. La recherche de moyens médicaux est nécessaire et nécessite des modèles animaux pour les développer. Notre projet vise donc à développer le modèle décrit proche de la situation vécue par les malades de cirrhose et à évaluer la capacité de nouveaux médicaments à améliorer leur état général. Pour satisfaire à la règle des 3 R, nous avons estimé le nombre d’animaux pour chaque procédure pour avoir une réponse statistiquement analysable. Les procédures seront appliquées par des personnes habilitées, dans un hébergement adapté et bénéficiant de l’enrichissement du milieu, respectant au maximum le bien-être des animaux. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires et de ne pas altérer les résultats de l'étude, des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de totalement remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro mais la sélection des composés est effectuée in vitro ce qui participe partiellement à l’emploi de méthodes alternatives. Ainsi le nombre total de souris prévu est de 1380 animaux sur 5 années.
Bénéfices attendus
Lors de défaillance hépatique aigue, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les multiples troubles qui affectent les autres organes le plus précocement possible. Aujourd’hui on utilise des traitements qui vont agir sur la pression sanguine, l’infection, les hémorragies du système digestif, ou le dysfonctionnement des reins à l’aide de corticoïdes. Le but est de préserver les fonctions vitales dans les meilleures conditions afin de conserver les chances de succès de la greffe du foie. Les traitements que nous espérons proposer visent à agir simultanément très tôy sur les mécanisme qui sont à l’origine des défaillances multiples des organes. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Les animaux recevront 20 gavages par sonde oro gastrique (volume de 2ml/kg), chaque gavage prendra 15 secondes au cours d’une période de 12 semaines. Les animaux subiront 1 seul prélèvement sanguin intermédiaire à la fin de la période d’induction de la fibrose (en 10 semaines) et un second prélèvement sanguin à la fin de la procédure ( à la douzième semaine), ils seront pratiqués sous anesthésie, la durée totale d’un acte (anesthésie et prise de sang) prend 5 minutes. Les animaux recevront 1 injection intrapéritonéale au moment du déclenchement de l'ACLF (injection LPS ou Bactéries à la fin de la douzième semaine), elle sera pratiquée sur animaux vigiles contraints. La durée d’un acte est de 30 secondes. Les gestes suivants seront réalisés aux animaux qui subiront une chirurgie abdominale : • rasage de la fourrure (état vigile) durée 3 minutes • 1 injection péritonéale d'agents anesthésiques (la durée d’un acte est de 30 secondes) • laparotomie, ligature et percement du cécum, suture du plan musculaire et du plan cutané (sous anesthésie). La durée totale de l’acte chirurgical sur l’animal anesthésié est de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La rupture des fonctions hépatiques représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez l'animal présente dans sa phase finale des signes cliniques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure au moment du prélevement terminal pour recueil des organes en vue d'analyses.
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée in vitro, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/repression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Ces études pilotes permettent sur la base des effets et résultats obtenus d'établir une approche statistique du choix des effectifs par un calcul de la puissance statistique.
Raffinement
L'utilisation du phénobarbital en temps qu'agent sensibilisateur à l'agent hépatotoxique à pour but d'homogénéiser, raccourcir le délai d'exposition et réduire les riques de mortalité, permettre de réduire le nombre d'animaux et la durée d'inconfort des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur introduirait un biais expérimental. Nous avons fait l'étude des effets de buprénorphine dans un de ces modèle qui se sont avérés délétères. Dans un premier temps une étude bibliographique plus approfondie sur l'emploi de moyen analgésique d'autres classes médicamenteuses est menée. Pour le modèle chirurgical , nous employons en prémédication la lidocaine localement et la buprénorphine pour la prise en charge de la douleur causée par l'acte chirurgical, la médication permet d'améliorer le bien être de l'animal en phase post-op et de réduire la durée de la période de récupération.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Très jeunes rats à l’arrivage (environs 21 jours, âge du sevrage), la taille optimale du rat pour commencer le traitement au phénobarbital a été déterminée à 100 g dans la littérature scientique.
Caractérisation in vivo des effets aigus et à long-terme des stimulations magnétiques dans un modèle rongeur d’épilepsie-absence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 85 d'entre eux étant maintenus sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort sans réveil. Une partie subit une trépanation et l'implantation d'un dispositif d'enregistrement cérébral, avec les risques de douleur et d'infection que le porteur mentionne, pour tester une stimulation magnétique sur un modèle d'épilepsie-absence de l'enfant. Le porteur décrit la stimulation elle-même comme indolore et renvoie l'usage en clinique au long terme. Il affirme que ces enregistrements in vivo sont "indispensables" et ne peuvent pas être remplacés.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer les effets thérapeutiques de la stimulation magnétique transcrânienne sur l’épilepsie dans un modèle rongeur d’épilepsie-absence de l’enfant, le rat GAERS (‘Genetic Absence Epilepsy Rat from Strasbourg’). Par le passé, les neurones à l’origine des crises chez le GAERS ont été identifiés, i.e. une sous-population de neurones présentant une hyperactivité et une hyperexcitabilité. Il a par ailleurs été mis en évidence chez des rats témoins que la stimulation magnétique avait pour effet de diminuer l’activité et l’excitabilité des neurones de la même région corticale que les neurones initiateurs des crises. En admettant qu’elle ait les mêmes effets inhibiteurs sur les neurones corticaux des rats épileptiques, elle pourrait bloquer la genèse des crises et ainsi constituer un nouvel outil thérapeutique prometteur pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
L’épilepsie-absence est une épilepsie généralisée non-convulsive affectant principalement les enfants et les adolescents. Cette épilepsie se traduit lors des crises par une perte soudaine de conscience associée à un arrêt comportemental. Les crises d’absence sont de courte durée mais surviennent très fréquemment ce qui handicape lourdement les jeunes patients qui souffrent de déficits de perception et de mémorisation. Nous espérons pouvoir corriger l’hyperexcitabilité des neurones corticaux à l’origine du déclenchement des crises d’épilepsie-absence à l’aide de la stimulation magnétique transcrânienne. Notre projet consistera à mettre en évidence les effets de cette stimulation sur les crises chez l’animal vigile et d’en identifier les mécanismes cellulaires chez des animaux anesthésiés à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques multi-échelle non réalisables sur les animaux vigiles. A long-terme, on peut envisager que ces stimulations soient utilisées en clinique pour diminuer la fréquence de récurrence des crises chez les jeunes patients.
Procédures
Pour l’étude des effets aigus de la stimulation magnétique cérébrale sur les crises d’épilepsie dans un modèle rongeur de la maladie, des enregistrements de l’activité cérébrale à différentes échelles (au sein d’une région cérébrale et au niveau des neurones individuels) seront réalisés chez des animaux sous anesthésie générale complémentée par une injection d’analgésiques avant et pendant la chirurgie. Au cours des actes chirurgicaux, les animaux seront anesthésiés. Une fois la chirurgie terminée (environ 2h), l’activité cérébrale sera enregistrée de façon à calculer le nombre, la durée et la fréquence des crises d’épilepsie et de recueillir l’activité des neurones (environ 8h). Une session unique de stimulation magnétique transcrânienne indolore sera alors appliquée et les effets de cette stimulation sur les crises d’épilepsie sera étudiée. Un total de 85 animaux sera utilisé recevant une stimulation réelle (n = 50) ou fictive contrôle (n = 35). Cette étude nous permettra d’étudier les effets potentiellement thérapeutiques de ce type de stimulation sur les neurones à l’origine des crises d’épilepsie. Pour l’étude des effets d’un traitement chronique de la stimulation magnétique sur les crises d’épilepsie dans un modèle rongeur de la maladie, les animaux épileptiques et témoins seront stimulés 10 minutes par jour pendant 10 jours. Cette procédure comprend 75 animaux au total (45 rats épileptiques et 30 rats témoins). Pour étudier les effets de ce traitement, durant les 10 jours de stimulation, seront réalisés des enregistrements (1 heure/jour) de l’activité cérébrale en temps réel sur les animaux éveillés. Pour ce faire, des électrodes d’enregistrement seront placées sur la surface du cortex sous anesthésie générale complémentée par une injection d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. A l’issue de ces 10 jours de traitement par stimulation transcrânienne indolore, seront réalisés des enregistrements comme décrits précédemment. Cette partie de l’étude nous permettra de comparer les effets sur les crises d’un traitement aigu ou chronique.
Impact sur les animaux
Il n’existe pas de nuisances ou d’effets indésirables liés à la stimulation magnétique puisqu’elle est sans bruit, sans vibration et sans douleur hormis un éventuel stress lié à la manipulation des rats lors des séances de stimulation. Les nuisances ou effets indésirables liés aux chirurgies d’implantation pour les enregistrements chez les animaux éveillés sont la trépanation ainsi que les éventuels risques liés à ces chirurgies (douleur, infection, fatigue). Sont à prévoir également les contraintes liées au système d’implantation et à l’hébergement individuel une fois l’implantation réalisée. Enfin, les enregistrements quotidiens nécessiteront un changement d’environnement (aller-retour quotidien entre la cage d’hébergement et la cage d’enregistrement). Les nuisances ou effets indésirables au cours des enregistrements chez les animaux anesthésiés sont liés aux procédures chirurgicales (trachéotomie, trépanation, points d’incision et de contention), à l’anesthésie prolongée lors des enregistrements (manque ou excès d’anesthésiques) et à la mise sous ventilation artificielle après curarisation (blocage de la canule par des sécrétions, volume d’air inspiré insuffisant).
Devenir
A l’issue de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés en raison d’analyses post mortem supplémentaires afin de déterminer les caractéristiques morphologiques des neurones enregistrés et leur localisation au sein du cortex cérébral.
Remplacement
Nos expériences d’enregistrement de l’activité cérébrale in vivo sont indispensables à la réalisation de ce projet et ne peuvent pas être remplacées puisque c’est la seule préparation permettant de caractériser de façon précise les changements d’activité et d’excitabilité induits par la stimulation magnétique transcrânienne. Cependant, les expériences que nous avons précédemment réalisées chez des rats témoins nous ont permis de déterminer la fréquence de stimulation optimale pour diminuer l’excitabilité des neurones ciblés. Nous nous servons donc de cette base d’études pour restreindre le nombre de fréquence de stimulation à tester et ainsi n’effectuer que les expériences nécessaires pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Une stratégie expérimentale méthodique a été mise en place pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous nous baserons sur nos études précédentes qui nous permis de déterminer la fréquence optimale de stimulation à appliquer pour réduire l’excitabilité corticale. Nous combinerons également différents protocoles (différents tests sur l’activité et les propriétés des neurones à l’échelle unitaire, enregistrements de longue durée et si possible de plusieurs neurones/animal) au sein d’une même expérience, ce qui nous permettra de n’utiliser que les animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et reproductibles. Enfin, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance (160 animaux au total) et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Après la chirurgie, l’animal sera isolé dans une cage enrichie afin d'éviter toutes morsures du connecteur par un congénère. Pour faciliter l’hydratation, de l’hydrogel et des croquettes seront placés dans la cage. Une surveillance sera effectuée durant 72h par un personnel compétent afin de s'assurer de l'absence de points limites. Nous réaliserons une pesée quotidienne des animaux pendant ces 72 h, puis de façon hebdomadaire afin d’éviter une perte de poids supérieure à 10%/24h comparé au poids précédent la chirurgie. Un antalgique sera administré après la procédure. Cependant, si des points limites étaient observés, nous mettrons en place un traitement analgésique supplémentaire. Enfin, en cas d'observation de léthargie, d’inconscience, d’immobilité ou de perte excessive (> 10 %) ou prolongée (> 3 jours consécutifs) de poids, l’animal sera euthanasié. Des enregistrements électroencéphalographiques d’une heure/jour seront effectués dans des cages d’enregistrements adaptées permettant un accès libre à l’eau et à la nourriture. Ces enregistrements seront précédés d’une période d’acclimatation de 30 minutes, afin de réduire le stress. La température de la pièce et le comportement de l'animal seront monitorés par un système d’enregistrement vidéo et pourront être visionnés à distance. En amont de la période d’enregistrement et de la chirurgie, les animaux seront habitués à la cage d’enregistrement à raison d’une heure par jour durant 5 jours. Les stimulations (indolores et sans bruit) seront appliquées 10 minutes chaque jour durant 10 jours. L’animal sera donc maintenu par l’expérimentateur. Afin d’habituer les animaux à la manipulation humaine, une semaine avant la chirurgie d’implantation, les rats seront quotidiennement manipulés à raison de 15 minutes par jour. Un soin tout particulier sera apporté à la réduction de l'inconfort, de la douleur ou du stress des animaux grâce à une surveillance constante des paramètres physiologiques (activité cérébrale, fréquence cardiaque, température, oxygénation du sang) et la mise en place de protocoles d'interventions spécifiques (utilisation appropriée d'anesthésiques généraux ou locaux et myorelaxants, analgésie) pour chaque indicateur de souffrance (sensibilité au pincement de la patte, réflexes musculaires, variation de température ou de la fréquence cardiaque, modification de l’activité cérébrale). Avant l’enregistrement, 30 à 40 minutes d’acclimatation sera observée.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées sur des rats épileptiques ainsi que sur des rats témoins « normaux », âgés de deux à six mois, pesant de 250 à 450 g. La souche de rat épileptique utilisée ici est reconnue comme étant un excellent modèle d’épilepsie-absence parce qu’elle présente une très forte homologie (propriétés des crises) avec la pathologie humaine. Les rats témoins constitueront les rats « contrôles » non-épileptiques. Nous utiliserons des rats GAERS adultes, stade auquel ils présentent des crises matures typiques et des rats Wistar du même âge comme contrôles pour que l’âge ne puisse pas biaiser nos résultats.
Etude des conséquences des troubles métaboliques dans le contexte de l’accident vasculaire cérébral dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 188 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après trois mois de régime enrichi en graisses, elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, puis des tests de comportement et de l'imagerie, pour étudier la réparation cérébrale liée à l'âge et aux troubles métaboliques. Le porteur indique que le modèle induit une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une prise de poids importante et une possible déshydratation. Les bénéfices pour l'être humain restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que l'étude ne s'envisage que dans un "organisme entier" et juge le passage à l'animal "indispensable".
Objectifs
Cette étude a pour objectif de caractériser le rôle de l’âge et des perturbations métaboliques qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans les pathologies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans le monde dont l’accident vasculaire cérébral (AVC) fait partie. L’étude s’intéressera particulièrement à comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse et la réparation cérébrale et vasculaire suite à un AVC, en prenant en compte ces facteurs de risques. A terme, l’objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour offrir des possibilités adaptées d’améliorer les résultats cliniques suite à un AVC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités). Il pourra en découler l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Après 3 mois d'alimentation enrichie en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (1 injection de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie toutes les 30 min pendant 2h). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale (chirurgie sous analgésie et anesthésie gazeuse d'une durée de 15+5 min, suivie de 2 injections d'analgésiques 2 fois par jour pendant 3 jours). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés 48h, 7 et 21 jours après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement (3 tests d'une durée de moins d'1 min par test) et de l’imagerie (méthode non invasive).
Impact sur les animaux
L’âge et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). La douleur induite par l’injection dans l'abdomen de glucose peut également être une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude protéique, moléculaire et de tri cellulaire.
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques dons le calcul de puissance est effectué en utilisant le logiciel in vivoStat. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse par isoflurane). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle murin pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Après une étude in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions angiogéniques et sécrétoires des cellules endothéliales, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, représentant un enjeu majeur de santé publique, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC et du vieillissement vasculaire. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime (âge nécessaire pour avoir un vaisseau mature et qui peut subir un vieillissement vasculaire semblable au vieillissement vasculaire humain).
Effets d’une consommation de larves d’insectes sur les performances de croissance, la santé digestive et la qualité de la viande chez le poulet de chair mâle
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
162 poulets de chair mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent une prise de sang au sinus occipital à l'état vigile, geste que le porteur décrit comme pouvant provoquer un stress de contention, un état de choc transitoire et un hématome, pour mesurer l'effet de larves de mouche soldat noire sur leur croissance et leur viande. Les oiseaux sont élevés jusqu'à l'âge d'abattage, autour de 36 jours. Le porteur affirme que ces effets ne peuvent être étudiés ni in vitro ni in silico et met en avant l'intérêt des insectes pour réduire l'importation de soja.
Objectifs
Les insectes sont décrits comme une source de protéines d’intérêt pour l’alimentation animale. En particulier, certaines espèces comme la mouche soldat noire ont la capacité de convertir des substrats organiques variés, non valorisables directement par les animaux de rente (ex. déchets de l’agroalimentaire) en une source de protéines de qualité. A ce titre, leur utilisation en alimentation animale permettrait de limiter la compétition entre l’alimentation animale et humaine, et de réduire (voire de supprimer) l’importation de soja produit en Amérique du Sud (déforestation, production OGM…). L’objectif du projet est donc d’évaluer l’utilisation de produits « insectes » dans l’alimentation des poulets de chair, sur les performances zootechniques (croissance, efficacité alimentaire), la santé digestive, le bien-être des animaux et la qualité de la viande.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra notamment de compléter les connaissances sur l’utilisation d’insectes pour nourrir les poulets de chair, en particulier en apportant sur l’utilisation des larves entières (vivantes ou séchées), qui sont encore très peu étudiées. En outre, nous proposons d’étudier le potentiel de ces produits par une approche multicritère (effets sur les performances zootechniques, le système digestif et immunitaire, le microbiote, ainsi que sur la qualité des produits). Par ailleurs, les données collectées permettront également de réaliser une multicritère de la durabilité (évaluation environnementale, sociale et économique) de l’utilisation de ces produits afin de préciser leur intérêt pour l’ensemble de la filière avicole.
Procédures
Une prise de sang unique au sinus occipital sera réalisée sur un total de 162 animaux vigiles (72 et 90 prises de sang sur des animaux âgés respectivement de 14 et 35 jours). Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer une réaction de stress à la contention de l’animal. L’animal peut également présenter un état de choc transitoire.
Impact sur les animaux
Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer une réaction de stress à la contention de l’animal et un éventuel hématome.
Devenir
Tous les animaux soumis à procédure seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur.
Remplacement
Les connaissances sur l’utilisation des larves entières de mouche soldat noire pour nourrir les volailles sont encore très éparses dans la littérature, en particulier les effets sur la croissance des animaux et la physiologie/santé digestive. Dans le cadre de ce projet, l’utilisation des animaux ne peut donc être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.
Réduction
Les animaux seront nourris à volonté à l’aide de mangeoires électroniques permettant la mesure individuelle automatique du poids et de la consommation alimentaire des animaux. Ce dispositif permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet d’un facteur 4 environ. Les variables mesurées sur les échantillons de sangs collectés seront des marqueurs du métabolisme et des statuts antioxydant et inflammatoire.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard. Le milieu sera enrichi avec des perchoirs permettant aux animaux de grimper et de se cacher (Perch'up). De plus, l’apport de larves contribue lui-même à enrichir le milieu de vie des animaux. Les effets sur le comportement et l’activité des animaux pourront être évalués à l’aide d’une méthode d’évaluiation du bien-être développpée par l’Institut Technique de l’Aviculture (EBENE®). Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les animaux seront nourris à volonté à l’aide de mangeoires électroniques permettant la mesure individuelle automatique du poids et de la consommation alimentaire des animaux.
Choix des espèces
Le projet est un programme de recherche finalisée qui vise à étudier les effets (performances, santé digestive) de différentes sources d’insectes (farine, larves entières vivantes ou séchées) pour nourrir des poulets de chair. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. La possibilité d’expérimenter chez l’animal cible du projet (poulet de chair) est la plus adaptée. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet sur des poulets à croissance rapide de différentes sources protéiques à base d’insectes sur toute la durée d’élevage. Ainsi, nous utiliserons des animaux de 1 jour, fourni par un couvoir commercial, et nous élèverons les animaux jusqu’à l’âge classique d’abattage soit 36 jours et un poids d’environ 2,4-2,5 kg pour un poulet de souche à croissance rapide.
Identification du rôle d’une hormone dans le psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées puis enduites d'une crème à l'imiquimod provoquant des lésions cutanées, elles reçoivent des injections sous-cutanées et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale, avant la mise à mort pour prélever la peau et divers organes. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 %, une peau rouge, squameuse et lésée après 48 heures, et un stress lié à la contention quotidienne. Il vise à comprendre le rôle d'une hormone du fer dans le psoriasis et à tester des pistes thérapeutiques.
Objectifs
Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement la peau et est associée à des comorbidités importantes. C'est une maladie courante qui touche 2 à 3 % de la population mondiale, sans distinction d'âge, de sexe ou d'ethnie. Les différents types comprennent notamment le psoriasis en plaques (ou psoriasis vulgaire), le plus répandu et le psoriasis pustuleux (PP), considéré comme plus résistant. Le PP, caractérisé par des pustules riches en cellules immunitaires, ne représente qu'une petite fraction des cas, mais peut mettre la vie des patients en danger lorsqu'il est étendu. Malgré des avancées majeures dans la compréhension de sa pathogenèse et dans son traitement, le psoriasis reste une maladie chronique courante dont les causes ne sont pas encore totalement élucidées. Le PP est particulièrement difficile à traiter. Des études ont montré une augmentation des niveaux de fer dans la peau de patients atteints de psoriasis. Le fer est indispensable au niveau cellulaire mais peut être toxique lorsqu’il est en excès. Il existe une hormone, principalement produite par le foie, qui régule les niveaux de fer dans l’organisme. Ce petit peptide est, de manière inattendue, exprimé dans la peau de patients atteints de psoriasis. Des données montrent que l'accumulation du fer et de "l'hormone du fer" dans la peau de patients souffrant de psoriasis est néfaste. Le projet visera à comprendre les mécanismes par lesquels cette hormone induit des effets délétères chez ces patients, mais également visera à tester différents agents thérapeutiques (médicaments ciblant le fer ou l'hormone) dans un modèle murin de psoriasis.
Bénéfices attendus
Dans la peau, l’hormone de régulation du fer pourrait avoir un rôle pro-inflammatoire en induisant d’une part la rétention de fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus physiopathologiques du psoriasis) mais également en recherche appliquée en porposant de cibler l’hepcidine ou le fer comme alternative thérapeutique au traitement du psoriasis.
Procédures
Les souris seront rasées au dos avec une tondeuse sous anesthésie (1 minute par souris). Une crème est appliquée (temps d’application : 30 secondes) sur des animaux vigiles suite à une prise en contention 1 fois/jour pendant 1 à 5 jours. Le poids des animaux est pris chaque jour après l’application de la crème. Une injection en sous-cutané (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes) est réalisée 2 fois (Jour 0 et jour 3 suivant l’application de la crème).30 minutes avant le prélèvement de sang, les souris seront injectées avec un analgésique (temps de réalisation impliquant la contention : 30 secondes); 500µl de sang seront prélevé par voie rétro-orbitale. (1 minute par souris).
Impact sur les animaux
Les animaux perdent du poids jusqu’au 3ème jour (environ 10% de leur poids) puis commencent à récupérer à nouveau. La peau traitée par l’imiquimod devient rouge après 48h avec des lésions et des écailles. Un stress est généré par la contention quotidienne et les injections.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélever la peau et d'autres organes à des fins d'analyse immunohistochimique, d'expression génique, d'expression protéique et de cytométrie en flux.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de psoriasis.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Pour respecter le principe des 3R, la durée et la dose de traitements utilisée seront réalisées selon les protocoles préétablis. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance quotidienne et des soins adaptés. Le raffinement comprend l'utilisation d'anesthésie (pour rasage et avant exsanguination) et d'analgésie (avant exsanguination) et la surveillance quotidienne des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoires et pour évaluer l’infiltrat immunitaire. Seule cette espèce possède des modèles murins génétiquement modifiés permettant l’étude de ce gène au cours de ces pathologies. De plus, la peau murine est similaire à la peau humaine (consituée de 3 parties : épiderme, derme, hypoderme). Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge la repousse du poil est la plus lente, donc adéquate pour le rasage du dos des souris. De plus, à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude du psoriasis.
Étude de l’efficacité de vecteurs viraux (AAV) sur un modèle d’épilepsie du lobe temporal (ELT) chez la souris SWISS
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une épilepsie chronique leur est provoquée par des injections répétées, suivies d'une évaluation comportementale non précisée, d'une chirurgie d'injection intracérébrale, de l'implantation d'électrodes puis d'une perfusion terminale pour prélever l'encéphale, afin de tester une thérapie génique par vecteurs viraux. Le porteur décrit les crises comme "dommageables au bien-être animal" et prévoit une mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Les bénéfices annoncés pour les patients pharmacorésistants restent au stade de la preuve de concept préclinique.
Objectifs
L’épilepsie chronique représente une des causes majeures de troubles neurologiques dans le monde, dont le type le plus répandu est l’épilepsie du lobe temporal (ELT). Elle se caractérise par des crises récurrentes et spontanées provoquées par une hypersynchronie excessive et incontrôlée de l’activité neuronale. Les molécules pharmacologiques antiépileptiques actuellement utilisées visent essentiellement à soulager les symptômes associés à l'épilepsie chronique en réajustant l'équilibre entre excitation et inhibition de l'activité neuronale. Cependant, ces traitements n'agissent pas directement sur les processus sous-jacents responsables de la progression de la pathologie, dont l'origine provient souvent de gènes défaillants. Le projet a pour objectif de tester l'effet de nouveaux traitement basé sur la thérapie génique dans un modèle in vivo de souris reproduisant fidèlement les manifestations histologiques et comportementales d'ELT observés chez les patients. Le projet est focalisé sur l'une des structures du lobe temporal, l'hippocampe et/ou le cortex, qui jouent un rôle central dans la génération des crises d'épilepsie et les troubles du comportement associés. Ainsi, l'analyse des effets bénéfiques de la thérapie génique sur les souris épileptiques seront réalisés à partir d’analyse comportementales, électroencéphalographiques et histologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements basés sur la thérapie génique sur les troubles électroencéphalographiques, les troubles comportementaux associés et les altérations histologiques dans un modèle rongeur d'épilepsie du lobe temporal. Une fois la preuve de concept validée à partir de ces études pré-cliniques, ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être proposées pour des essais cliniques chez des patients pharmacorésistants souffrant d'épilepsie chronique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux subissent 4 types d’intervention. Durant la 1ère intervention du protocole, les souris subissent une série d'injections (4-6) par voie intrapéritonéale de plusieurs molécules afin d'induire un état d'épilepsie chronique (durée de l'intervention: 2h30-3h30 environ). Les animaux sont ensuite immédiatement hébergés dans les cages enrichies de manière individuelle pour toute la durée du protocole expérimental (i.e. 4 mois). Après une période de 2 mois, la seconde intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris par des tests simples, spontanés, non-invasifs et non associés à une privation d'eau ou de nourriture (durée d’intervention : 20 min environ). Une semaine après, durant la 3ème intervention, ces mêmes souris subissent une chirurgie dans le but de réaliser des injections intracérébrales du composé thérapeutique à tester. Deux à trois semaines plus tard, les souris sont implantées avec une électrode afin de réaliser des enregistrements électroencéphalographiques. A la dernière étape du protocole expérimental, l'animal est euthanasié par une anesthésie profonde terminale (par perfusion transcardiaque : durée de 30 à 60 min) afin de prélever l'encéphale.
Impact sur les animaux
L’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants: - Le maintien des souris de manière individuelle pour observation durant de 2h30 à 3h30 pouvant générer de l'inconfort et du stress – Des injections répétées en intrapéritonéal pouvant induire du stress et de la douleur ; afin de réduire la souffrance, la zone injectée est préalablement traitée en topique avec une crème anesthésiante de type emla® - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - Des anesthésies et interventions chirurgicales (craniotomie) afin de réaliser des injections intracérébrales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux – Les sutures de la peau du crâne pouvant provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation.
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
L'objectif du projet étant de tester l'efficacité du candidat médicament sur une échelle multidimensionnelle et notamment sur les mécanismes pathologiques handicapants (crises, altérations du comportement) de l'épilepsie du lobe temporal afin d'améliorer la qualité de vie des patients ainsi que sur les caractéristiques histologiques, il n'est donc pas possible de substituer les souris par des modèles alternatifs (e.g. modèles in vitro). De plus, les rongeurs sont un excellent outil pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices), et sont un très bon modèle animal pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurologiques humaines, en l'occurrence l'épilepsie du lobe temporal. En ce qui concerne cette dernière pathologie, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de ce type d'épilepsie chez l'homme.
Réduction
Le protocole choisi pour induire une épilepsie chronique est basé sur une méthodologie récemment raffinée et publiée ayant permis une forte diminution du taux de mortalité lors de l’induction de la pathologie. Cela permet donc d'augmenter très significativement le taux de réussite et de limiter de façon importante le nombre d'animaux utilisé. Par ailleurs, chaque lot de souris utilisé pour ce projet subit toutes les étapes expérimentales à savoir l'induction de l'épilepsie chronique, l'évaluation comportementale, les injections intracérébrales, les enregistrements électroencéphalographiques, ainsi que les prélèvements de l'encéphale. Cela permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. Par ailleurs, le calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N) est basé sur les données antérieures obtenues en prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Ainsi, l'utilisation d'un design expérimental optimisé incluant des analyses statistiques appropriées permette de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
La planification séquentielle du travail avec réévaluation constante de la stratégie en fonction des résultats. L’utilisation d’un nombre minimal d’animaux par groupe en s’appuyant sur des données statistiques. L’analgésie locale et anesthésie générale au moment des chirurgies et mesures particulières pour en minimiser l’impact (administration d’anti-douleurs, réveil sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée, enrichissement de l’environnement…). Après l’induction de la crise, l'état de récupération dans les jours qui suivent est étroitement surveillé (récupération sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée et récupération comportementale, enrichissement de l’environnement…). Les animaux ayant subi une chirurgie et/ou présentant une épilepsie chronique sont maintenus dans des cages individuelles enrichies afin de diminuer le risque de blessures inter individus et les souffrances associées. La formation continue du personnel scientifique et de soin permet de repérer immédiatement les premiers signes cliniques d’inconfort chez les animaux. La mise en place d’une grille de suivi, ainsi que la prévision d’actions spécifiques dès les premiers signes d’inconfort ou de douleur (voire l’euthanasie, selon leur gravité) complètent le dispositif. Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet et des points limites spécifiques à chaque procédure sont appliqués tout au long du projet.
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux des patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeur) mais reproduisent également des manifestations histologiques d'épilepsie du lobe temporal (mort neuronale, remodelage anormal du réseau, etc.). Ils sont donc un excellent modèle pour cette pathologie humaine. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la poursuite du projet.
Evaluation de l’efficacité d’un nouveau composé chez une souris modèle de dégénérescence rétinienne
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à une lumière intense de 20 000 lux pendant une heure et demie pour provoquer une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent un composé par gavage et subissent un électrorétinogramme sous anesthésie, avant le prélèvement des yeux. Le porteur décrit les dommages rétiniens attendus, la perte de l'intégrité et de l'activité des photorécepteurs. Il présente ces essais comme "indispensables" pour prouver l'efficacité du composé sur un organisme complet, une preuve de concept d'un traitement préventif.
Objectifs
Il s’agit de faire la preuve de concept d’un traitement préventif de la perte de fonction visuelle par un nouveau principe actif avec une nouvelle formulation par voie orale dans une situation de dégénérescence rétinienne chez la souris modèle de la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA). Il permet également d'évaluer l'impact de la formulation sur l'amélioration potentiel de l'efficacité du composé à protéger de la perte de la fonction visuelle en comparant des souris traitées avec la formulation vs sans formulation.
Bénéfices attendus
La rétinopathie regroupe plusieurs pathologies de la rétine qui sont soit génétiques, comme la rétinite pigmentaire et la dystrophie maculaire de Stargardt, qui touchent respectivement la périphérie et le centre (macula) de la rétine, soit multifactorielles, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous voulons apporter à ces patients un traitement préventif contre la progression de ces maladies. Ce projet est donc à profil santé publique avec une échéance à moyen terme applicable à l'échelle clinique.
Procédures
Gavage voie orale : durée : 30 secondes Exposition à la lumière à 20 000lux : 1h 30 Mise à l’obscurité : 5 jours ERG (éléctrorétinogramme) : 10min par souris
Impact sur les animaux
La nuisance attendue sur les souris est l’exposition lumineuse. les souris sont placées dans l’obscurité 24 h avant l’exposition à la lumière pour minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs minimiser le temps et l’intensité lumineuse. Les dommages rétiniens engendrés sont la perte de l’intégrité et de l’activité des photorécepteurs
Devenir
A l'issue de cette procédure, les souris seront euthanasiées. Une analyse histologique et/ou biochimique pourra être effectuée après la mort après prélèvement des yeux.
Remplacement
Toutes les approches in cellulo ne peuvent pas se substituer aux essais chez l’animal qui restent plus proche du patient. L'approche animale est la suite logique des résultats précédemment obtenus sur cellules rétinienne qui nous ont permis de prouver l'efficacité du composé. Ces études précliniques sont indispensables pour prouver l'efficacité sur un organisme complet.
Réduction
Cette quantité d’animaux a été réduite le plus possible sans compromettre les résultats expérimentaux et les études statistiques Comme ces 77 souris se répartissent en 11 lots de 7 souris, en cas d’atteinte de la significativité avant l’utilisation de tous les lots, les souris restantes pourront être réutilisées.
Raffinement
A l’arrivée dans le laboratoire, les animaux sont hébergés au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation d'une semaine. Celle-ci leur permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période qu’ils pourront être inclus dans cette étude. L’hébergement des souris se fait obligatoirement en groupe d’étude dans des cages de stabulation sous une lumière (90 lux) faible qui n’affecte pas la réponse rétinienne. Comme de nombreuses souches de souris construisent des nids, la présence de matériaux de nidification est un impératif dans les cages. La nidification permet aux souris de réguler leur température et de gérer leur exposition à la lumière. Dans le déroulement de cette étude, on administre aux animaux un produit dont on souhaite connaître les effets. On en connaît déjà les caractéristiques physico-chimiques ainsi que l’activité sur des extraits biologiques et des cellules (études in vitro), ce qui permet d’éviter d’administrer aux animaux des substances non biocompatibles. L’examen spécialisé (électrorétinographie) nécessite une anesthésie. Celle-ci est réalisée en conformité avec les pratiques vétérinaires et par des personnes formées.
Choix des espèces
La souris de laboratoire (Mus musculus) représente 60% du total des animaux utilisés en recherche. Ce rongeur est devenu le modèle expérimental de prédilection des scientifiques. Sur le plan génétique, la souris est très similaire à l’homme : 99 % de ses gènes présentent un gène homologue chez l'humain. De plus, elle possède tous les atouts pour l’élevage en laboratoire : une descendance nombreuse, un développement rapide et une taille réduite. L'utilisation de souris non génétiquement modifiées allège l'aspect réglementaire qui est très bien respecté par le fournisseur agréé. La souris est une lignée consanguine albinos couramment utilisée dans la recherche biomédicale. En ophtalmologie, elle est très sensible à la lumière fluorescente blanche, ce qui constitue un trait intéressant pour mimer la rétinopathie à évolution rapide. Stade adulte jeune (2-3 mois). La rétine est bien développée à ce stade et la réponse rétienne à la lumière est optimale
Modulation des niveaux de BIN1 et DNM2 dans le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Les souris qui perdent 20 % de leur poids en une semaine sortent du protocole, et une grille de score prévoit jusqu'à une "douleur intense", traitée par buprénorphine toutes les douze heures. 1 246 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue, pour tester la modulation de deux gènes contre la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le projet utilise trois lignées qui présentent, selon le porteur, les anomalies de la myéline de cette maladie, et 584 souris reçoivent entre leur premier et leur vingt-et-unième jour des injections de virus, certaines dans le nerf sciatique sous anesthésie. À six mois puis à un an, 720 passent un test d'agrippement où l'expérimentateur tire sur la queue, un tapis roulant, un cylindre rotatif surélevé, une immersion de la queue dans un bain-marie et une plaque chauffée à 52 °C. Le porteur affirme que ces lignées ne présentent "aucun signe de douleur", et déclare un niveau de souffrance sévère pour une partie des souris.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d'atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l'injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Procédures
Pour réguler l'expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d'injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des AAV) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d'un dynamomètre et la force d'agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d'enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chaude à 52°C et la latence de réaction sera notée avant de sortir l'animal avec un temps limite de 30 secondes. Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l'activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux Mtmr KO âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n'engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l'animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l'animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure.
Devenir
Nous feront une première étude préliminaire où les animaux seront euthanasiés à 6 mois pour étude histologique du nerf sciatique et vérification des phénotypes décrits dans la littérature scientifique. Nous nous formerons à l'injection intracérébroventriculaire et les animaux utilisés seront mis à mort le premier jour (P1) après formation. Nous nous formerons à l'injection intrathécale et les animaux seront euthanasiés 15 minutes après formation. Pour l'évaluation de phénotype dommageable et étude histologique à six mois après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort entre 8 et 11 semaines, 2 mois après injection d'AAV pour étude histologique du nerf sciatique (signal GFP). Pour la caractérisation comportementale des animaux après modulation de l'expression de Bin1 ou de Dnm2 par injection d'AAV, les animaux seront mis à mort à 1 an après caractérisation comportementale pour étude histologique du nerf sciatique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l'étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d'animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré (buprénorphine à la dose de 0.05 à 0.2 mg/kg selon l'intensité de la douleur) et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l'aide d'un score. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas de la buprénorphine sera administrée quotidiennement par i.p. à dose de 0.05 mg/kg. Niveau 2 : douleur modérée, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.1 mg/kg sera administrée quotidiennement par i.p.. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas de la buprénorphine à dose 0.2 mg/kg sera administrée toutes les 12 heures. L'étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D'une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d'administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l'apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s'aggravent avec l'âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d'une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.
Efficacité thérapeutique de nanoparticules dans un modèle murin de cancer du sein HER2+. ( EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 011 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de médicament et de cellules cancéreuses, une incision de la glande mammaire sous anesthésie, de nombreux prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie, pour comparer des nanoparticules censées mieux cibler les tumeurs du sein HER2 positives. Le porteur reconnaît des nuisances tumorales, perte de poids et nécrose, et prévoit une mise à mort selon des points limites. Il qualifie la recherche de nouveaux traitements d'"indispensable" et renvoie les bénéfices pour les patientes, une toxicité réduite, au conditionnel.
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer chez la femme en France, dont 10 à 20% sont HER2 positifs (protéine exprimée à la surface des cellules positives). Cependant, des résistances aux traitements proposés actuellement se développent, et la toxicité systémique (toxicité qui affecte l’ensemble de l’organisme) des traitements existants reste problématique. Il reste donc indispensable de chercher de nouveaux traitements contre le cancer du sein. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules associées à des nanoparticules ciblant HER2, réduisant les effets secondaires dans le traitement du cancer du sein. Nous espérons ainsi ouvrir de nouvelles pistes pour résoudre cette problématique de santé publique.
Bénéfices attendus
Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanoparticules dans l’arsenal thérapeutique actuel du cancer du sein. La comparaison des différentes nanoparticules ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanoparticules sur le ciblage de la tumeur, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanoparticules pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer du sein humain grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.
Procédures
- Un groupe de 700 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis 2 prélèvements sanguin à deux jours d’intervalle, sous anesthésie (durée : environ 30 secondes). Les souris subiront cette séquence d’une semaine sur 4 semaines (4 injections et 8 prélèvements au total). - Un groupe de 2100 souris subira 1 injection du médicament sur animal vigile d’une durée de 10 secondes, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie terminale (sans réveil) (durée : 30 secondes). - Un groupe de 210 souris subira 2 injections de cellules cancéreuses (10 secondes chacunes) sur animal anesthésié, puis une injection du médicament (7 à 15 jours après) sur animal vigile d’une durée de 10 secondes ; puis sera observée à 7 temps différents par imagerie sous anesthésie (durée : 30 secondes) réparties sur 3 jours. - Un groupe de 1001 souris subira 1 incision sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes) suivie d’une injection de cellules cancéreuses dans la glande mamaire sous anesthésie et analgésique (durée 10 secondes), puis 10 à 20 jours plus tard, huit injections du médicament (10 secondes) sur animal vigile, et deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude (4 mois maximum), une injection de la luciférine (nécessaire à l’imagerie) sur animal vigile (durée 10 secondes) suivie de l’examen en imagerie (durée 1 min) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il n’y a pas de nuisances attendues sur les souris saines autre que la toxicité éventuelle de la molécule à haute dose (perte de poids, perte de poils). Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Les nuisances attendues pour l’incision du flanc sont des douleurs au niveau de la zone incisée. Les nuisances attendues pour les souris porteuses de tumeurs sont la nuisance due à la tumeur : perte de poids, nécrose, etc. Le poids, le comportement et l’apparence physique de la souris sera alors contrôlée quotidiennement pour l’euthanasier selon des points limites prédéfinis. Après injection intraveineuse, des irritations au point d’injections peuvent apparaître et seront surveillés.
Devenir
Les souris sont prélevées post-mortem pour des analyses ultérieures, elles seront donc toutes mises à mort. Les souris dont la pousse tumorale n'a pas prise seront mises à mort car elles ont étés injectées avec des cellules tumorales.
Remplacement
Nous avons préalablement réalisé des études in vitro afin de remplacer en partie l’expérimentation in vivo autant que possible, mais à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. En effet, cette étude préclinique, visant à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanoparticules pour le traitement du cancer du sein nécessite obligatoirement l’utilisation d’animaux entiers pour déterminer la biodistribution des nanoparticules, leur pharmacocinétique et leur efficacité.
Réduction
Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible grâce au suivi par imagerie non invasive et non irradiante (croissance tumorale et biodistribution des formulations dans les modèles de souris porteuses du cancer du sein). Une étude préliminaire, avec un nombre restreint de groupes conditionnera la suite du projet, le nombre d’animaux annoncé est donc un nombre maximum.
Raffinement
Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Un analgésique sera localement appliqué sur les sites d’ouverture de la souris. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs sera mesurée tous les 3 jours. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la structure du bien-être animale.
Choix des espèces
La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. La plupart des antécédents génomiques de la souris sont similaire à ceux de l’homme (env. 95%), ce qui rend les souris particulièrement utiles pour la recherche sur les maladies humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6-8 semaines, âge adulte de manière à avoir un poids corporel plutôt stable d’environ 20g.
Modulation du niveau de BIN1 par croisement génétique dans le traitement des myopathies centronucléaires liées au gène SPEG
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie centronucléaire, elles développent une faiblesse musculaire et cardiaque, subissent des tests de force et de coordination (suspension, agrippement, rotarod), des mesures contractiles et une échographie cardiaque sous anesthésie, ainsi qu'un perçage d'oreille, avant le prélèvement d'organes. Le porteur indique que le phénotype cardiaque, progressif, deviendrait "potentiellement sévère" si les souris étaient maintenues en vie, ce qui motive leur mise à mort. Il vise une preuve de concept d'une stratégie de compensation génétique, conditionnée à des résultats hypothétiques.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris X- déficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X.
Procédures
Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.
Impact sur les animaux
Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux X- déficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.
Remplacement
Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris X-défcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.
Evaluation de l’effet dose-réponse d’un vaccin vivant atténué contre Flavobacterium psychrophilum chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss).
- Recherche appliquée
- Maladies animales
630 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Vaccinées par immersion puis infectées par injection avec une souche virulente de Flavobacterium psychrophilum, elles servent à mesurer une dose létale 50 et l'efficacité du vaccin, le critère retenu étant la survie ou la mort. Le porteur indique que les poissons atteignant le point limite, défini par une détresse terminale (nage erratique, nécrose, animal ne répondant plus aux stimuli), sont mis à mort. L'objectif affiché est commercial, la mise sur le marché d'un vaccin pour la pisciculture de la truite.
Objectifs
Flavobacterium psychrophilum est une bactérie et l'agent responsable de la flavobactériose d’eau froide aussi connue comme syndrome de l'alevin de la truite arc-en-ciel qui revêt une importance économique notable . Cet agent pathogène est l'une des causes les plus courantes de maladie bactérienne dans la production aquacole en eau douce de la truite arc-en-ciel. Aucun vaccin commercialisé contre cet agent pathogène et ses manifestations cliniques n'est actuellement disponible. Le partenaire de ce projet a l'intention de commercialiser un vaccin vivant atténué contre Flavobacterium psychrophilum afin de contribuer à la prévention de la flavobactériose chez la truite arc-en-ciel. La souche vaccinale a conféré une protection significative à la truite arc-en-ciel lors d’épreuves d’infection réalisées avec la souche mère virulente isolée aux Etats-Unis. Plusieurs essais de vaccination de truites arc-en-ciel par immersion ont été réalisés à l'Université de l'Idaho. L'utilisation du vaccin a permis d'obtenir une protection significative par rapport au groupe ayant reçu le contrôle. Avant une mise sur le marché, il est nécessaire de valider l’efficacité du vaccin sur des souches responsables d’épisodes infectieux en Europe. Dans le contexte de la maîtrise de la pathologie infectieuse en production aquacole, ce projet vise à évaluer l’effet dose-réponse du vaccin vivant atténué contre l’infection par une souche virulente de la bactérie pathogène Flavobacterium psychrophilum isolée en France. Les poissons après avoir été vaccinés par immersion seront infectés dans des conditions contrôlées afin d’évaluer leur résistance et l'efficacité du vaccin.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre au point le protocole d’administration d’un vaccin (dose et temps de contact) et d’évaluer le potentiel protecteur de ce vaccin. Si les résultats sont positifs, le partenaire poursuivra les essais dans le but de mettre sur le marché et de commercialiser ce vaccin.
Procédures
Les deux étapes de vaccination (primo et rappel) sont réalisées par immersion pour répondre aux contraintes de la filière (praticité d’administration à l’échelle industrielle). Les infections expérimentales sont réalisées par injection. Elles sont réalisées sous anesthésie (par bain) et une seule injection par poisson est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. Les animaux sont mis à jeun 48 heures avant l’infection. Cette mise à jeun prévient toute régurgitation en cours d’anesthésie, diminue les besoins en O2 des poissons au cours des manipulations.
Impact sur les animaux
Le critère utilisé pour évaluer l’efficacité du vaccin est la résistance au pathogène suite à un challenge infectieux. La réponse est binaire : mortalité (avec précision du temps post-contamination avant la mort) ou survie. L’inocuité de la souche vaccinale a été démontrée lors d’expériences précédentes sur la truite arc-en-ciel menées par le partenaire du projet, aucun effet indésirable de l’étape de vaccination n’est attendu. Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert) et à injection lors du challenge sont compensés par anesthésie par bain (tricaïne à 100 mg/l).
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires car il est nécessaire, pour évaluer l’efficacité du vaccin de soumettre les poissons à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des critères d'appréciation quantitative de leur résistance.
Réduction
La mesure de la dose létale 50 (DL50) est un protocole de référence en expérimentation animale nécessitant 6 doses avec 10 poissons par condition. La mise en évidence de différences significatives entre les conditions de vaccination (dose et durée d’immersion dans le vaccin) nécessite 30 poissons par aquarium. Des effets dépendants du bac d’élevage étant classiquement observés lors des épreuves infectieuses, il est indispensable de dupliquer les groupes infectés. Les effectifs proposés sont ceux utilisés récemment pour les analyses statistiques lors de l’évaluation de vaccins contre F. psychrophilum. Dans un but de réduction, la mesure de la DL50 sera mutualisée dans d’autres projets employant le même lot d’animaux et les mêmes conditions du challenge infectieux (même souche, mode d’infection).
Raffinement
Les animaux sont observés au moins deux fois par jour afin de surveiller l'apparition du point limite qui sera suivi par une grille de scoring et défini par une détresse terminale par l’observation cumulée de 2 signes cliniques minimum correspondant à : une nage erratique, hyper ou sous ventilation, nécrose au point d’injection pouvant conduire à un choc osmotique (dérégulation des pressions), caudale rongée, animal ne répondant plus aux stimuli (épuisette). Une anesthésie par bain de tricaïne (100 mg/L) est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales (60g/l) sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau (T°C = 10°C, O2>7 mg/l, pH = 8, NO2
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d'élevage en France et c'est l'hôte naturel de Flavobacterium psychrophilum. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine l’evaluation de la protection du vaccin. Pour l'évaluation de la résistance à l’infection par Flavobacterium psychrophilum, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (5 g) où la sensibilité à des infections par Flavobacterium psychrophilum est maximale. De plus, c’est à ce stade que les animaux sont le plus sensibles à cette pathologie dans les élevages. L’objectif commercial est donc de vacciner les animaux sur ces stades précoces (1 g).
Création de lignées murines originales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Mâles isolés tués au CO2 avant douze mois, femelles donneuses tuées par dislocation cervicale pour récolter leurs embryons, receveuses tuées au CO2 après un unique transfert : la création de lignées de souris génétiquement modifiées passe par la mise à mort de chaque catégorie d'adultes. 15 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère. 5 625 femelles impubères de quatre semaines reçoivent deux injections d'hormones pour une superovulation, 2 250 receveuses subissent sous anesthésie un transfert d'embryons dans l'oviducte, et 325 mâles, dont 200 vasectomisés, vivent isolés entre deux nuits d'accouplement, un isolement qui peut, selon le porteur, "générer de l'anxiété". Les 7 220 souriceaux nés de ces transferts sont suivis pour de possibles "phénotypes dommageables", et le résumé ne dit pas ce qu'il advient d'eux.
Objectifs
Les équipes des instituts utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients , à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. Ce projet a pour objectif la génération de modèles murins transgéniques, via l'utilisation de nucléases spécifiques
Bénéfices attendus
L'utilisation de nucléases spécifiques sur l'embryon de souris permet l'obtention de souris d'intérêt génétiquement modifiées dans des délais courts, en utilisant peu d'animaux, et ce directement dans un fonds génétique d'intérêt donné.
Procédures
+ 200 mâles vasectomisés et 125 mâles reproducteurs seront herbergés en situation d'isolement sur 5 ans + 5625 femelles donneuses seront soumises à une stimulation hormonale (2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 5 secondes) à 48h d'intervalle) + 2250 femelles receveuses recevront des embryons par transfert d'embryons dans l'oviducte sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 40min) + 7220 souriceaux seront suivis pour de potentiels phénotypes dommageables
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement, ces accouplements n'ayant lieu que sur des périodes courtes (une nuit) pour permettre le contrôle et la synchronisation de l'initiation des pseudo-gestations (dans le cas des mâles vasectomisés) ou pour permettre la production d'embryon un jour donné (dans le cas des mâles reproducteurs). L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent être sujettes à de la douleur post chirurgie, suite à la réimplantation des embryons. A propos des animaux dits "fondateurs" obtenus après réimplantation des embryons modifiés, ceux-ci peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. Une fiche de suivi sera attribuée à chacun d'entre eux
Devenir
+ Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs en situation d'isolement seront mis à mort par inhalation de CO2 via un système dédié avant qu'ils aient 12 mois + les femelles donneuses sont mises à mort par dislocation cervicale afin de récolter les embryos post-mortem + les femelles receveuses ne peuvent pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons, elles sont donc mises à mort par inhalation de CO2 via un système dédié en fin de procédure
Remplacement
Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveurs d'embryons.
Réduction
La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. Une seule série de production - électroporation/microinjection - réimplantation sera effectuée dans un premier temps par projet. La deuxième et éventuellement troisième série ne sera programmée qu'en cas d'absence d'un fondateur d'intérêt. Lors de ces éventuelles deuxièmes et troisièmes séries, plusieurs paramètres liés à l'efficacité du système Crispr/Cas9 seront modifiés (changement d'ARN guide, variation des concentratrion en ARN guide et Cas 9 etc) L'estimation des nombres maximum d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique, notamment "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition" (Richard Berhringer and al.)
Raffinement
La technique chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie per et post opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. L'anesthésie est réalisée par injection intra-périonéale d'une combinaison de zoletil (40 mg/kg) et xylazine (5 mg/kg) sous un volume de 300 μl. L'analgésie per et post opératoire est réalisée par l'injection intrapéritonéale de buprenorphine 0,1 mg/kg sous un volume de 100 μl.
Choix des espèces
Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses,les males vasectomisés et les mâles reproducteurs, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.